DE1517934A1 - Mit Molekularsieb ueberzogenes Adsorbens aus kleinen Teilchen und Verfahren mit dessen Anwendung - Google Patents

Mit Molekularsieb ueberzogenes Adsorbens aus kleinen Teilchen und Verfahren mit dessen Anwendung

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Description

Mit Molekularsieb überzogenes Adsorbens aus kleinen Teilchen und Verfahren mit dessen Anwendung.
Priorität; U.S.A.; 26. März I965,
U.S. Serial No. 443 075. U.S.A.; 25.Februar 1966 U.S.Ser.No. 530 175
Die Anmeldung ist eine teilweise Portsetzung der gleichzeitig laufenden Anmeldung der gleichen Anmelder, Serien-Nr. 44^ 075, eingereichtam 26. März I965 und nunmehr aufgegeben.
Die Erfindung bezieht sich auf neue und nützliche Verbesserungen an Holzkohlen- und anderen Teilchenadsorbentia, die mit Molekularsiebverbindungen überzogen sind, und versucht, fein zerteilte Holzkihlenteilchen zu schaffen, die mit Tierplasma, Blutteilchen, Plasmadehnern und anderen Proteinen von hohem Molekulargewicht, Kohlehydraten oder Fetten überzogen sind, um ein Molekularsieb
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des Überzuges auf dem festen Mikroschwamm der Holzkohle zu bilden, um große Moleküle und Komplexe abzuweisen» es aber kleinen Molekülen und Komplexen zu gestatten, durch das Sieb hindurchzudringen und auf den Holzkohlenteilchen adsorbiert oder von ihnen desorbiert zu werden.
Holzkohle ist bekannt für ihre Adsorptionseigenschaften gegenüber vieler Materialien und wird für viele Zwecke benutzt, die sich diese Eigenschaft zunutze machen. Da jedoch so viele Materialien von Holzkohle adsorbiert werden, wird sie im allgemeinen nicht verwendet, um ein Material vom anderen selektiv zu adsorbieren, wenn die Moleküle der beiden Materialien nicht sehr stark in ihrer Gestalt, d.h. der Kombination von Gewicht, Größe und Form voneinander abweichen. Andere Verbindungen, die ähnliche Adsorptionseigenschaften haben, sind aktivierter Ton (Bentonit, Kaolin), Tonerdegrundmaterialien, Bittererdegrundmaterialien, Knochenkohle, Silikagel, Ionenaustauschharze usw. Obwohl also Holzkohle das bevorzugte Adsorbens oder Mikroschwamm ist, sind viele andere Materialien bekannt und für besondere Anwendungsgebiete sogar erwünschter.
Das Molekularsieb- oder Überzugsmateriai kann jede * beliebige Substanz sein, die das Adsorbens auf der Basis von Moleküldicke überzieht, wodurch eine Molekularsiebschicht geschaffen wird. Die Wahl von Uberzugs-
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materialien gestattet die selektive Adsorption einer Verbindung gegenüber einer anderen, d.h. im allgemeinen dringen Moleküle, die kleiner sind als die Überzugsmoleküle, durch das Sieb und werden adsorbiert, während die Moleküle, die genauso groß oder größer sind als die Uberzugsraoleküle, nicht durch das Sieb dringen und darauf schweben bleiben. Demgemäß wird die Auswahl des Überzugsmaterials in erster Linie durch die zu trennenden Verbindungen bestimmt, da ein geeigneter Überzug zur Trennung der meisten von zwei beliebigen Verbindungen gefunden werden kann. Abhängig von den besonderen Materialien, die als Überzug verwendet werden, und den Materialien, die getrennt werden sollen, kann eine einzige Verbindung, ein Komplex, eine Fraktion oder eine Gruppe ähnlicher Verbindungen durch das Molekularsieb hindurchgelassen werden.
Es ist besonders wünschenswert bei biochemischen Versuchen, in der Lage zu sein, freie Moleküle von gebundenen Molekülen zu trennen, z.B. freies B12 von serumgebundenem B.p oder von grundmolarfaktorgebundenem B12* freies Thyreoidhormon von serumgebundenem Thyreoidhormon, freies Eisen von serumgebundenem Eisen, freies Insulin von Insulin, das an Antikörper gebunden ist, sowie Moleküle verschiedener Molekulargewichte. Einige dieser Beispiele mit ionischer Ladung wurden mit Polyurethanschaum
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getrennt, der ein wirksames Ionenaustauschharz enthält, aber dieses Verfahren ist auf geladene Teilchen beschränkt, benötigt mehrere Stunden und unterliegt einer Verschlechterung der Schaum-Ionen-Austauschmischung.
Es ist eine allgemeine Aufgabe der Erfindung, ein Erzeugnis und Verfahren zu schaffen, um durch "Sofortdialyse" Materialien mit einem gewissen Unterschied in Molekulargröße, -gewicht oder -form, d.h. allgemeiner Gestalt, zu trennen.
Es ist eine weitere Zielsetzung der Erfindung, solch ein Erzeugnis und Verfahren zu schaffen, das schnell arbeitet, verwendbar ist, um einen großen Bereich von Materialien zu überprüfen, z.B. Vitamine, Mineralien, Hormone und andere Plasmabestandteile, unabhängig von der Ladung und mit Hilfe einer wirtschaftliehen, geeigneten und stabilen Basis, die während langer Zeiträume gelagert werden kann.
Es hat sich gezeigt, daß Holzkohle und andere Adsorbentia, wenn sie mit tierischem (einschließlich menschlichem) Plasma, Blutfraktionen, anerkannten Plasmadehnern oder anderen Molekularsiebüberzügen bedeckt sind, nur einige der Medien selektiv adsorbieren, die sonst adsorbiert würden, da augenscheinlich der Überzug
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als Molekularsieb über dem Mikroschwamm der Kohle wirkt, um gewisse Moleküle oder Komplexe daran zu hindern, die Kohle zu erreichen. Dies hängt selbstverständlich von der Beschaffenheit der Uberzugsmoleküle ab und kann durch die Verwendung verschiedener Überzüge für eine besondere Trennung, die erwünscht ist, abgestimmt werden. In der Tat können gewisse Uberzugsmaterialien selbst, z.B. Gelatine, Dextran, Polyvinylpyrrolidon usw. bezüglich des Molekulargewichts und damit auf ihre Wirksamkeit als Sieb eingestellt werden.
Weiterhin kann ein Medium, das von überzogener Holzkohle adsorbiert worden ist, im Verhältnis zu den relativen Kräften der Anziehungskraft für die Holzkohle und einem entsprechendem Desorbierungsmedlum desorbiert werden. Diese Anziehungskräfte können durch viele physikalische und chemische Faktoren beeinflußt werden, wie etwa Temperatur, pH-Wert und lonenkraft.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung mehrerer in den beigefügten schematischen Zeichnungen dargestellter Ausführungsbeispiele.
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Pig. 1 ist eine Kurve, die die abnehmende Desorption von I ■* -Τ-, durch 0,5 ml von drei Gruppen normaler Seren zeigt, wenn die Menge der verwendeten überzogenen Holzkohle von 12,5 auf 50 mg gemäß der Erfindung erhöht wird,
Fig. 2 ist eine Kurve, die die lineare Erhöhung der Desorption von I ^ -T-, durch 0,5 ml von zwei Gruppen normaler Seren zeigt, v/enn das Verhältnis
131
von I ^ -T-, zu überzogener Holzkohle von 10 ng:12,5 mg auf 40 ng:12,5 mg steigt,
Pig. J3 ist eine Kurve, die zeigt, daß die Desorption von I ^ -T- durch 0,5 ml von drei Gruppen normaler Seren (mit der Bezeichnung A, B und C) besser ist, wenn das Hormon vorher überzogener Holzkohle beigegeben wird, anstatt später überzogener oder nicht überzogener Holzkohle,
Fig. 4 ist eine Kurve, die zeigt, daä die Molekulargröße und Gestalt des Holzkohlenüberzuges wichtig ist, um den Austritt des radiojodinierten Hormons zu erleichtern. Während alle vier Molekularüberzüge die Erythyreoid- und Hypothyreoid-Gruppen trennen,/ gestattet Dextran niedrigen Molekulargewichtes die größte Desorption des Hormons, während die Unterschiede beibehalten werden, die in diesen beiden Gruppen erwartet werden;
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Pig. 5 ist eine Kurve, die die Anzahl pro Minute (Z/min)
von I ^ "T7 zeigt, das von 0,5 ml Schwangerschafts-, Hypothyreoid-, Euthyreoid- und Hyperthyreoidserengruppen desorbiert wird, wenn eine Inkubation während 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen erfolgt, wobei die Zahlen in Klammern die Verhältniszahlen der Z/min der Testseren im Vergleich zu den Z/min der Euthyreoidseren darstellen, und
Fig. 6 ist eine Kurve, die die Z/min von I ^ -T, zeigt, desorbiert von 0,5 ml Schwangersehafts-, Hypothyreoid-, Euthyreoid- und Hyperthyreoidserengruppen bei einer Inkubation von JiJ0C von 0 bis 120 Minuten, wobei die in Klammern gezeigten Verhältniszahlen den in Fig. Ί, abgetragenen iüinlich sind.
Diese Erfindung, wie sie in den folgenden Beispielen dargestellt ist, bezieht sicn um rtxbumin. Dextran oder * HSmoglobinüberzüge von Holzkohle für gewisse Versuche, aber der Gedanke'ist selbstverständlich auf zahlreiche Adsorbentia, Überzüge und Versuche anwendbar, die für den Faohmann auf der Hand liegen.
Pharmazeutische Holzkohle "Norit A" der Amend Drug ft Chemical Co., "Darco" Qualität "G-60" Aktivkohle der Atlas Ohemical Industries und "Mallinckrodt ^294"
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"National Formulary" (NF) Pulver-Aktivkohle der Mallinckrodt Chemical Works wurden mit gleichem Erfolg und ohne Reaktivierung vor der Benutzung verwendet.
"Armour" Fraktion V Rinderserumalbumin von Armour & Co., Fraktion I Rinder-Fibrinogen von Armour & Co., Fraktion IV-I alpha-Globulin von Nutritional Biochemical Corp. und Dextran 00 von Pharmacia, Inc., wurden verwendet, um die verschiedenen Kohlearten zu überziehen. Theoretisch ist der beste Überzug ein Molekül oder ein Komplex, der dem aus der Holzkohle auszuschließenden Molekül oder Komplex sehr ähnlich ist. Das Ziel ist, ein Molekularsieb zu schaffen, dessen Poren genügend groß sind, um das Durchlassen eines Moleküls zu gestatten, aber genügend klein, um ein anderes Molekül auszuschließen, z.B. ein freies Molekül kann hindurchgelassen werden, aber zurückgewiesen werden, wenn es mit seinem Träger kombiniert ist. Aus diesem Grunde wäre eine Mischung von alpha- und beta-Globulin (gesättigt mit nicht-radioaktivem B12) vorzuziehen, um die Holzkohle zum Prüfen der Kapazität zur Bindung von ungesättigtem B12 zu überziehen. Jedoch waren die Ergebnisse mit Rinderserum-Albumin, das billiger und leichter zu beschaffen ist, ausgezeichnet. Hämoglobin 1st sogar noch billiger und wurde bei jedem hier genannten Beispiel für Albumin mit ausgezeichneten Resultaten verwendet. Andere Überzugsmaterialien sind
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beta- und gamma-Globulin, Gelatine, Hämoglobin, Glukosepolymeralkohol mit Molekulargewicht ^00.000, ("Picoll" von Pharmacia, Inc.)j Polyvinylpyrrolidon usw.
Eine mit Albumin überzogene Holzkohle wurde hergestellt durch Mischen gleicher Volumen von 5$iger wässeriger Aufschwemmung von "Norit A" Holzkohle und einer l$igen wässerigen Lösung von Rinderserumalbumin. Dieses Erzeugnis kann wochenlang im Kühlschrank gelagert und somit nach Bedarf verwendet werden. Die Holzkohle adsorbierte ungefähr 10$ ihres Gewichtes an Rinderserumalbumin. Wenn I ^ -bezeichnetes Albumin einem gleichen Gewicht an Holzkohle beigegeben wurden, adsorbierte die Holzkohle 11,2$ ihres Gewichtes an Albumin und hielt dies auch noch nach dem Waschen zurück. Von weiteren 2$ wurde angenommen, daß sie festgeklemmt seien, da sie durch drei Salzauswaschungen entfernt wurden. Um eine vollständige Sättigung der Holzkohle zu erreichen, wurde die doppelte Menge an Albumin (10 mg) für 50 mg Holzkohle verwendet. Das überschüssige Albumin in der obenauf schwimmenden Schicht hatte eine unbedeutende Bindefähigkeit für B12. Während sich Aufschwemmungen von Ilolzkohl schnell absetzen und schwierig mit der Pipette zu bearbeiten und von Glas zu entfernen sind, bewirkt der Albuminüberzug, dai3 die Holzkohle sLch we.sfmt.Li oh langsamer absetzt, u!.ch eLnfacher mit der l'ipeLt■■> bearbeiten liuit und beträchtlich weniger fitih'ti'l ·)<) wird. Das f;l'!'f'hi; ti'l. i'i't i'i'u' I'fvO-ran und -'■υ. !·:. r iibe.-rzUpfi zu,
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Magensaft (MS)-Proben wurden von normalen Patienten entnommen (NMS) und von Patienten mit perniziöser Anämie (PAMS). Diese Proben wurden entpepsiniert und bei -2O0C bei einem pH-Wert von 7 gelagert. Alle Magensäfte wurden auf Grundmolarfaktor(GF)-Aktivität sowohl durch eine Mlkromodifikation der Dialysemethode nach Abels u.a. als auch nach dem Meerschweinchendarmhomogenat-Prüfsystem untersucht. Der normale NMS, der beim Testen unbekannter Seren verwendet wird, stammt aus einer umfangreichen Sammlung, die von einem einzigen Patienten abgenommen wurde.
Serum oder Plasma wurde von normalen Erwachsenen beschafft, von Patienten mit verschiedenen hämatologischen und nicht-hämatologischen Störungen und von Patienten mit perniziöser Anämie mit und ohne Antikörper gegen GF. Alle Proben werden bei -2O0C gelagert. Alle Seren wurden auf Antikörperaktivität geprüft, wie unter MS beschrieben. Der normale Antikörper, der beim Testen von unbekannten MS verwendet wurde, wurde durch Plasmapherese von einem Patienten mit perniziöser Anämie mit Autöantikörper gegen GF erhalten.
Mit Co-3' und Co bezeichnetes Vitamin B1 der
1 £_
firok oharp and Dohrne P.esearch Laboratorien wurde
-Tl benutzt. Dio npezifIsche AktivLtüt Oos Co-1FJ,., fj;!.ng /on 4 bis 11 uc/uf· (MU:ro':ur!.e7'kI.Ια'ο^τΓϋΐιϋι) "und
Original
-Iu ■
O O 9 H I 1 / 1 I I1J
die von Co B12 betrug ungefähr 1 uc/ug. Jedes dieser Präparate ergab ungefähr 1 Z/min/pc (picocurie) Aktivität in einem Flimmermesser.
BEISPIEL I.
Verauoh mit der Maftensa,ft- und GF-Kanazität zur Bindung von ungesättigtem B. o.
Nacheinander werden in ein 10 ml Reagenzglas, das 0,9# Salzlösung enthält, 0,1 ml eines unbekannten Magensaftes und 0,1 ml aerum eingebracht, das einen Antikörper gegen OP enthSlt, wonach 10 Bekunden lang gut gemischt wird« Dann werden 7,5 ng (Nanogramm) Co B12 eingegeben und das Misohen wird wiederholt. Nach 10 Sekunden ist keinerlei merkliche weitere Aufnahme von B12 durch Ma oder aerum feststellbar. 2 ml mit Albumin überzogene Holzkohle werden hinzugefügt und der Inhalt sorgfältig gemischt, indem das Reagenzglas dreimal umgedreht wird und ansohliessend zentrifugiert wird. Die Aufnahme von freiem B12 durch mit Eiweiß überzogene Holzkohle ist fast unmittelbar und innerhalb 10 Sekunden vollständig. Die Radioaktivität des obenauf schwimmenden Materials oder des Niederschlages wird mit den Kontrollproben (Tabelle I) verglichen. Die Kapazität zur Bindung von ungesättigtem B1P von 0,1 ml Ma ist die ng-Kenge von B.„ in dem obenauf schwimmenden Material, und der GF-Gehalt des Ma wird
009811/1113
mit der ng-Menge an B12 angegeben, durch die der Antikörper die Kapazität des Ma zur Bindung von ungesättigtem B,p verringert. Die Ergebnisse werden ausgedrückt mit: die "Kapazität dieses Ma zur Bindung von ungesättigtem B12 is χ pg von B12 je ml, wobon ζ Pß auf GF zurückzuführen sind". Das obenauf schwimmende Kontrollmuster hält weniger als I^ des hinzugefügten Co B.p zurück.
B1 ρ Tabelle 1 Grundmolarfaktor *
Ma Nr. id
Pß		 Pß 72,6
2,406 20,8
NH 22 6,101 1,^09 96,5
NH >0 6,576 61,4
NH21 * 7,21ö 4,496
im yj 1,020 O+ 2,1 ++
PA2 2,725 85
PAo C51 O+
PA12 26
PA2a
x normaler liagensaft (NKS)
+ Die Werte gingen über die Kapazität des HS zur Bindung von unoesätti^te.r, B1C leicht hinaus und spiegelten das Hinzufügen der Kapazität normalen Plasmas zur Bindung von ungesättigten B12 zu der Kapazität des Ma wider, ungesättigtes E1- zu binden.
++ '/iederhclversuch unter Verwendung von 0,2 ..1I Ma führte zu einer Verrin^er-un^ ur;. nur O,1;,', an Kapazität des Mö Kurnr.'.er 3 zur rindut.- von ungesättigtem B12 und zu einer ^rhchun^ u:r. 1^,'^/. an Kapazität des Ma Nummer 23 zur Bindung von ungesättigte:.; I?i2, "as einen Mangel an GF in
009811/1113 BADORK3INAL
diesen beiden Mö-Proben bewies. Diese und ähnliche Untersuchungen bewiesen, dass eine Verringerung von weniger als 5$ der Kapazität von 0,1 ml Md zur Bindung von ungesättigtem B12 durch Antikörper bei Mb auftreten kann, der keinen GF-Gehalt aufweist.
Tabelle 1 zeigt die Versuche über die Kapazität zur Bindung von ungesättigtem B12 und über GP in dem MS von 4 normalen Personen und 4 Patienten mit perniziöser Anämie. Es wurde festgestellt, dass sich falsche negative Ergebnisse einstellen, wenn der Ma eine ausreichende Menge an einem von GF verschiedenen Bindemittel enthält, um den grössten Teil oder die Gesamtheit des hinzugefügten.radioaktiven B 12 zu binden.
Dies hatte sich früher in dem Dialyseversuch als richtig
des Mö
erwiesen. Wenn demnach die Kapazität/zur Bindung von ungesättigtem B12 so gross ist, dass sie nahe bei 7*5 ng B^0 je 0,1 ml Mö oder darüber liegt, muss der Versuch wiederholt werden, indem entweder weniger Mö oder mehr radioaktives B.o verwendet wird. Wenn der GF-Gehalt niedrig ist, sollte der Versuch mit der doppelten oder dreifachen Menge an Ma wiederholt werden. Wie bei allen Versuchen für GF unter Verwendung von radioaktivem B12 (einschliesslich des achillin--Tests) wird derjenige kleine Bruchteil an GF, der bereits "kaltes" B12 bindet, wahrscheinlich nicht gemessen.
De Is I)LG1I II.
■/ersuch über Antikörper ,;ejen GF in serum.
iiat;heLnandt?r werden in ein 10 ml Rea;;,en.?,£;lns, dns 0,9/'
009811/1113
BAD ORlQWAL
salzlösung enthalt, 0,1 ml normaler NMb, 0,1 ml unbekanntes Serum, 7,5 ng Co 0Bj0 und 2 ml albuininUberzogene Holzkohle gegeben. Das Verfahren ist anscnsten wie oben für den Versuch über GP in Beispiel I beschrieben. Die Antikörperaktivität des üerums wird in Mengen an GF aufgezeichnet, die durch das serum an der Bindung von B12 gehindert werden.
Tabelle 2
Nr.
B12
Pg
Antikörperaktivität
/J
N146 6,263 0Λ ψ—-
N147 6,263 0* —
N148 6,263 ox —
PA21 6,263 468 7 r- +
It'J
PA26 6,263 5,377 85,9
PA35 6,263 5,917 94,5
PA201A++ 6,263 5,908 94,3
X Der V/ert überschritt leicht die Kapazität von Ha zur Bindung von ungesättigtem B-,ο und spiegelte das Hinzufügen von öerurn zur Kapazität 5es i-\ü zur Bindung von ungesättigtem B, ρ wider.
t- Ein v/JiöerhoLversuch unter Verwendung von 0,2 ml serum Nummer 21 führte zu einer Verringerung der· Kapazität den normalen Ka zur Bindung von ungesättigtem B1^ uu 2'1,4;J, wobei das Voi-handeriaein vri Antikörper/'in dem öeruiü bowieaen vmi'do.
1-1· Utanduril-
BAD ORIQiNAL
0 0 9 0 1 I - I MJ
Die Tabelle 2 zeigt die Versuche mit Seren von 4 Patienten mit perniziöser Anämie mit Autoantikörpern gegen GF und von J normalen Personen· Ein falsches positives Ergebnis für Antikörper ergibt sich, wenn das untersuchte serum eine grosse Menge Vitamin B12 infolge einer Injektion dee Vitamine innerhalb der vorangegangenen 40 stunden enthält. Derartige falsche positive Ergebnisse treten auf, wenn die Menge des niohtradioaktiven B12 im Serum über die Kapazität dee aerume zur Bindung von B12 hinausgeht. In diesem Fall verdünnt das überschüssige "kalte" B12 das hinzugefügte radioaktive B.g und verursacht die anscheinende Verringerung der Kapazität des NMs zur Bindung von ungesättigtem B12* Wenn die Antikörperaktivität sehr schwach ist, sollte der Versuch mit der doppelten oder mehrfachen Menge an serum wiederholt werden, wie etwa serum Nummer 21. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Anzahl der GF-MolekUle, die durch die Antikörper an dem Binden von B12 blockiert werden, eher logarithmisch anstatt arithmetisch erhöht wird, wenn sbh das Antikörper-Antigen-Verhältnls verbessert. Von den ersten 18 seren von Patienten mit perniziöser Anämie, die unter Verwendung von mit Albumin überzogener Holzkohle untersucht wurden, wiesen 9 Antikörper auf.
BEIaPIEL III.
Versuch mit dgr Kapazität von aeren. um ungesättigtes B 1^.
zu binden.
Nacheinander werden in 10 ml Reagenzglas, das 0,9Ji Salzlösung enthält, 0,5 ml eines unbekannten serums und 2,5
009811/J14)
ng Co^'B12 hinzugegeben. Das Testserum und das Co^B werden 10 Sekunden gemischt und 2 ml mit Albumin überzogene Holzkohle hinzugefügt. Nach dem Zentrifugieren wird die Radioaktivität des darüber schwimmenden Materials gezählt. Die Kapazität des öerums ungesättigtes B12 zu binden, 1st diejenige Menge a B12, die durch daß Serum gehindert wird, von der Holzkohle adsorbiert zu werden.
Tabelle 5 710 gesättigt
Nr. Pg B1O ' Pg B1O ot
Lt- χ ι"
angesättigt total		 940 37
NI5I 1,226 820 45
N I52 I.I38 1.100 48
NI54 902 3.350 30
MI35 2,61b 5.000 58
M1J>6 2.460 Versuch unter Verwendung 35 ++
HI5O 4.742 + von
χ mikrobiologischer
iiUßlena nracilis.
+ Ein Jiederholversuch mit 5 ng Co^'Bi2/0,5 ml aerum ergab eine ungesättigte Bindekapazität von 9*274 pg/ml.
++ Basierend auf Kapazität von 9,274 pg ml zur Bindung von ungesättigtem B12.
Tabelle 3 zeigt die Versuche über die Kapazität des aerums ungesättigtes B,o zu binden, bei 3 normalen Personen und ^ Personen mit Kyelovmcherungsstorungen. In Fällen von
_ 16 - BAD ORIGINAL
009811/ ill;
übermäßig hoher Kapazität zur Bindung von ungesättigtem B12* wie bei Serum Nummer I50 der Tabelle 3, muß diese Messung gemacht werden, indem entweder die Menge an Serum verringert wird oder die Menge an radioaktivem B^2 in dem Versuchsprotokoll erhöht wird.
Das Verfahren zur Prüfung des Antikörpers besteht lediglich darin, eine durch Serum verhinderte Bindung von B12 durch Magensaft zu zeigen. Es können NichtAntikörper-Inhibitoren vorhanden sein und nicht alle Antikörper blockieren notwendigerweise die Bindung von Bjp durch GP; der Ausdruck "Antikörper" wird hier also mit diesen Vorbehalten verwendet.
BEISPIEL IV.
Versuch über die Kapazität des Serums zur Bindung von Eisen und des Serums zur Bindung von ungesättigtem Eisen (UIBC).
CQ
Das Serum wurde mit Eisen, das mit Fe^*7 bezeichnet wurde (5 ug Eisen/ml Serum), in einem Tris-Puffer (tris-buffer) bei alkallnem pH gemischt (Holzkohle gibt Eisen bei niedrigem pH frei), 2 ml 2,5#ige Norit A Holzkohle 0,125 % Hämoglobin beigegeben, 10 Sekunden geschüttelt,
CQ
zentrifugiert und die Menge an Fe^-7 in dem darüber-
schwimmenden Material gezählt. Die Ergebnisse waren dem
-17-
009811/1113
UTBC ähnlich, das mit dem Schade-Verfahren bestimmt wurde. Serum-Eisen wurde bestimmt durch Hinzufügen von 1 ml 0,25 N HCl zu 1 ml Serum, da bei einem pH-Wert unter 5 der Eisenproteinkomplex dissoziiert wird. 5 ug Radioeisen wurden hinzugefügt, und die Mischung mit 1 ml 0,25 N NaOH neutralisiert, um eine Chelierung von Eisen durch Siderophilin zu gestatten; und wurden dann zu 2 ml Hämoglobin-Holzkohlesuspension bei alkallnem pH beigegeben, 10 Sekunden geschüttel, . zentrifugiert und die Menge an Fe-^ in dem oben schwimmenden Material wurde gezählt. Das Serum-Eisen wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Serum-Eisen =
(Z/min darüberschwlmmend) (ug Fe hinzugefügt - UIBC)
Z/min hinzugefügt - Z/min darüberschwimmend.
Die folgende Tabelle zeigt sowohl die Serum-Eisenals auch UIBC-Versuche mit dem Sofortverfahren und das Schade-Verfahren:
Tabelle 4.
ug/lQO ml Serum
- UIBC
Schade Holzkohle
Fe 300 ^
Fe 4θ 28
Fe ΐ4θ 14O
Fe 1^2 138
UIBC 310 320
UIBC 270 240
UIBC 18O 162
-18-
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BEISPIEL V. Bestimmung des Verhältnisses von freiem zu
gebundenem TrI .Iod thy ronin (T,) In Serum.
Diese Untersuchung berechnet die Fähigkeit Proteinüberzogener Holzkohle, andere Medien in einem T,-Aufnahmetest zu ersetzen, wobei die Proportion von freiem zu gebundenem Hormon In Serum widergespiegelt wird. 99# von 10 ng freiem T-, werden von 50 mg unüberzogener oder mit. Albumin überzogener Norit A Holzkohle aufgenommen und durch 3 Salzauswaschungen nicht entfernt. In de« Harzschwammtest mit I1^1-T, ergaben Hypothyreoidseren Verhältnisse unter 0,7 und Hyperthyreoidseren Verhältnisse über 1,3, wenn ein Vergleich mit normalem Serum erfolgte. Wenn 10 ng von I1^1-T, in 0,5 ml dieser Seren während 15 Nlnuten bei O0C inkubiert werden, 50 mg Norit A-plus 5 mg Albumin hinzugefügt wurden und danach zentrifugiert wurde, ergab die Menge von in dem darUberschwlmmenden Material Verhältnisse,
die fast identisch mit denjenigen im Harzschwaramtest sind, aber mit höheren Prozentsätzen von I ^ -T^ in dem gezählten Material und mehr Reproduzierbarkeit und Genauigkeit. Demnach kann Holzkohle verwendet werden, um hypothyreoide, euthyreolde und hyperthyreoide Personen schnell zu trennen. T1. kann auoh bei Raumtemperatur benutzt werden, trennt die drei Gruppen aber nicht so
-19-009811/1113
so gut wie T,. Die folgende Tabelle vergleicht Kunststoffschwamm- und Albumin-Holzkohle-Ergebnisse für Ty
Tabelle 5
T7-Verhältnis
Nr. Schwamm Holzkohle
1 0,6 0,48
2 0,64 0,44
1,0 1,0
4 1,1 1,12
5 1,5 1,7
BEISPIEL VI. Radioimmunitätsversuch für Flasmalnsulln.
Ein Radioimmunitätsversuch für Plasmainsulin wurde von Berson und Yalow entwickelt unter Verwendung einer Radioisotopen-Verdünnung und einer festgelegten Menge von insulinbindendem Antikörper, der, anscheinend um die Stabilisierung von Antigen-Antikörper-Komplexen zu gestatten, 4 Tage Inkubationszeit bei 4°C benötigt, und danach einen Papier-hydrodynamischen Fluß oder / und Chromatoelektrophorese, um freies Insulin von an Antikörper gebundenem Insulin zu trennen. Durch Verwendung überzogener Holzkohle kann der Versuch in weniger als 3 Stunden fertiggestellt werden.
-20-
0 0 9 811/1113
2 ml von 2,5 gm # Norlt A pharmazeutischer Holzkohle, überzogen mit 0,25 gm % Dextran 00 (Pharmacia, Inc.) adsorbiert freies Insulin aus Albumlnlösungen Innerhalb von 10 Sekunden, aber weist Insulfv-Antlkörperkomplexe zurück, die in dem darUberschwimmenden Material verbleiben, Das Zählen der Radioaktivität in dem darUberschwimmenden Material nach Niederschlag der Holzkohle durch Zentrifugleren ergibt Verhältnisse von gebundenem zu freiem I Insulin, die gegen unbezeichnete Insulinkonzentrationen abgetragen werden, die im wesentlichen identisch mit denjenigen sind, die durch Standardmethoden erreicht wurden, wenn die gleichen Antikörper- und
131
I ^ -Insulin-Konzentrationen verwendet werden.
Die folgende Tabelle vergleicht Insulinversuche durch das Berson- und Yalow-Verfahren und mit Dextran-Holzkohle:
Tabelle 6.
Mikroeinheiten Insulin / ml von Plasma B & Y Holzkohle
52 130 i4o 130
6 62
9 136
10 i6o
11 150
12 40
13 50
14 50
-21-
009811/1113
BEISPIEL VII. Wachstumshormon-Versuch.
Dieser Versuch Ist identisch mit dem oben erwähnten für Insulin und die folgende Tabelle vergleicht Versuche mit dem B & Y Verfahren:
Tabelle 7*
Wachstumshormon Holzkohle
No. ng/ml Serum 2,2
5,0
5,1
15
16
17 		BftY
2,1
5,0
5,2
BEISPIEL VIII. Chortonisches "Wachstumshormon-Prolaktin".
Dieser Versuch ist ebenfalls identisch mit dem oben für Insulin berichteten, mit der Ausnahme, daß die Ergebnisse mit der vorangegangenen Versuchsmethode nach Kaplan und Grumbach in der folgenden Tabelle verglichen werden:
Tabelle 8.
Chorlonisches "Wachsturnnhortnon-Prolaktin"
WS/ml von Serum No. K & G Holzkohle
Io ci,b 3,0
19 14,0 14,1
20 29,0 29,0
00981 1/1113
-22-
BEISPIEL IX.
Vitamin Β« η Versuch. —»——"■"—■■~^^i i.
Das Prinzip der Radioisotopen-Verdünnung wird angewendet, Indem die unbekannte Menge von von dem Serum zur Verdünnung der Radioaktivität einer bekannten Menge an Co^'B12 freigegebenem nicht-radioaktivem B12 angewendet wird. Eine Lösung des Orundmolarfaktorkonxentrata (OFK) mit einer Kapazität zur Bindung von B12 von weniger als der Menge an hinzugefügtem Co*"B*2 wird benutzt, um einen Teil der Mischung von radioaktivem und nicht-radioaktivem B12 zu binden, d.h. um die B.g-Qruppe zu "blopsieren". Das nioht an OFK gebundene B12 wird durch Hinzufügen von mit Protein Überzogener Holzkohle entfernt. Dl· Menge an radioaktivem B12* das an OFK gebunden ist, wird mit den QFK-Kontrollmuster verglichen, und das B12-Nlveau des unbekannten Serums wird dann durch eine einfache Oleiohung erhalten.
, Horlt "A" Holzkohle wurde mit ungefähr 5 Gewichts-Prozent Hämoglobin überzogen. C B12 mit einer spezifischen Aktivität von k bis 11 uc/ug wurde mit HgO auf 1000 pg Co^'B12/ml verdünnt. Eine Lagerlösung von 0,9J( Salzgehalt von 10 ug NFIF mit einer Kapazität zur Bindung von B12 von ungefähr bOO pg/nl wurde hergestellt.
-25-009811/1113
1 ml eines unbekannten Serums wird 3 ml 0,9$ Salzlösung hinzugegeben. Die Reagenzgläser zur NFIF-Kontrolle und zur Kontrolle des darüberschwimmenden Materials enthalten 4 ml Salzlösung. Diese werden parallel geführt, um Volumenveränderungen zu korrigieren, die durch die Erwärmung verursacht werden. Jedem Reagenzglas wird 1 ml 0,25 N Salzsäure hinzugegeben. Die Gläser werden mit Baumwolle verschlossen, in einem
kochenden Wasserbad 15 Minuten lang erhitzt und dann mit Leitungswasser abgekühlt. 1 ml normales CoP'B,2 wird jedem Reagenzglas beigegeben und der Inhalt wird 10 Sekunden lang gemischt. 1 ml NFIF wird dem unbekannten Serum und dem NFIF-Kontrollmuster hinzugegeben. Ein gleiches Volumen an Salzlösung wird dem darUberschwimmenden Kontrollmuster hinzugefügt. Der Inhalt wird gemischt, bevor und nachdem 2 ml von mit Hämoglobin überzogener Holzkohle hinzugefügt wurden. Die Reagenzgläser werden mit ^.000 U/min 15 Minuten lang zentrifugiert, das darüberschwimmende Medium wird in Zählgläser dekantiert und die Radioaktivität des darüberschwimmenden Mediums in einem brunnenartigen Flimmerzähler gezählt.
Die Anzahlen Je Minute (Z/min) für die Kontrolle des obensehwimmenden Materials werden von denen für das unbekannte und das NFIF-Kontrollmuster abgezogen, um reine Anzahlen zu erhalten. Das Niveau des Serums B,^ wird aus der folgenden Formel berechnet:
0 0~9 8~1 1/1113
pg B12 je ml Serum =
1000 (reine Z/min des NFIF-Kontrollmusters) _ inoo reine Z-min des unbekannten
57
Die Menge an Co^1B12, die bei der RadioverdUnnungsmethode benutzt wird, bestimmt ihre Empfindlichkeit innerhalb des jeweiligen Bereiches. Um diese
57
^1B
Anforderungen zu erfüllen, werden 1000 pg
bei dem beschriebenen Verfahren verwendet. Diese Menge an
Co-3'B12 übersteigt die Kapazität von NFIF zur
Bindung von B12 um 20$, um eine vollständige Sättigung
der Stellen an dem Grundmolarfaktorkonzentrat zur Bindung von B12 sicherzustellen. Für die größte Genauigkeit beim Messen von B,2-Pegeln zwischen
null und 200 pg je ml kann die Menge des Serums erhöht
57
werden, oder die Menge an Co B12 hoher spezifischer
Aktivität auf 100 pg verringert werden, bei einer
proportionalen Abnahme von NFIF. In gleicher Weise kann
die Menge des verwendeten Serums verringert werden
57
oder die Menge an Co B-, ^ erhöht werden, wenn B12-Pegel
geprüft werden, die größer sind als 10.000 pg je ml. (Letztere Erhöhung bei einer proportionalen Erhöhung von NFIF). Die erhöhte Genauigkeit, die durch solche Änderungen geschaffen wird, ist zur diagnostischen Interpretation von Serum-B^-Pegeln unnötig.
Die Vorteile dieses Versuches gegenüber den früher beschriebenen radioisotopischen Verfahren und den klassischen Bioversuchsverfahren sind: größere
0 0 9 8 11/1113
-25.
Einfachheit, Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit. Der Empfindlichkeitsbereich scheint sich von den niedersten zu den höchsten B12-Werten normaler und pathologischer Seren zu erstrecken.
Die Ergebnisse wurden mit konventionellen B12-Versuchen mit dem Euglena-Verfahren verglichen und sind genügend ähnlich, um die gleiche diagnostische Interpretation zu gestatten. Werte unter 100 pg je ml waren beim Holzkohlenversuch wesentlich niedriger. Dies kann auf die verringerte Empfindlichkeit des Euglena-Verfahrens in diesem Bereich zurückgeführt werden. Duplikatmuster schwanken um bis zu 200 pg bei dem Euglena-Versuch, jedoch weniger als 30 pg bei dem Holzkohleversuch. Die folgende Tabelle zeigt repräsentative Versuche:
Tabelle 9.
Vitamin B-, 2
No. Pg/ml Serum
Euglena Holzkohle
21 62 216
22 220 1038
23 1000
-26-
ORIGINAL INSPECTED
009811/1113
'IF-"
FUr die Beispiele X bit XV waren die Verfahren wie folgt:
überzogene Holzkohle, wurde tiergestellt durch Mischen gleicher Volumen von 5 g % wässriger Suspension von Norit-A neutraler pharmazeutischer Holzkohle und
0,5 %/% Wässriger Lösung von Dextran oder einem
anderen gewünschten MolekUlUberzug und bei 5°c gelagert.
I '-Trijodthyronin, in Mengen von 100 qc bei Abbot Laboratories, Chicago, Illinois, gekauft, wurde als eine Lagerlösung von 100 ng je ml in-isotonischem,
salzigem Azetat-Veronäl-Puffer pH 7,4 (Michaelis Puffer) hergestellt mit einem Gehalt von 350 mg/ % normalem menschlichen Serum-Albumin (gekauft als 5# U.S.P. Albuminsol
ο
bei Nerck Sharp & Dohme) und gelagert bei 5 C. Arbeits- lösungen der gewünschten Konzentration, im allgemeinen 20 ng je ml, worden durch Verdünnen der Lagerlösung in einem Mlohaelis-Albumin-Puffer hergestellt.
•Überzogene, mit I ^ -T-* imprägnierte Holzkohle wurde durch Hinzufügen von 20 ng (1 ml) einer I ^ -T-, Lösung für je 12,5 mg (0,5 ml) von überzogener Holzkohlensuspension hergestellt. Dieses Präparat wurde eine Minute lang gemischt und dann bei 5°C gelagert.
-27-
ORtQINAL
009811/1113
Um 7-mm Reagenzgläser zu duplizieren, wurden 1,5 ml mit Dextran überzogene, mit I ■* -T-* (1,25 mg Dextran 10: 12,4 mg Holzkohle: 20 ng T1^1-T,) imprägnierte Holzkohle hinzugefügt. Die Reagenzgläser wurden bei 3.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert und das klare darüberschwimmende Material dekantiert, wobei sich ein Pellet an mit Dextran-10 überzogener Holzkohle mit
15I
einem Gehalt von I ^ '-T7 ergab. Ein Waschen der Holzkohle zum Entfernen von "lose anhaftendem" oder eingefangenem I ■* -τ, war nicht notwendig, da nur 0,2 bis 0,3$ der Radioaktivität aus der Holzkohle durch jedes Waschen entfernt wurde. Diese Pellets wurden bis zur Verwendung bei 5°C gelagert.
0,5 ml Testserum wurde jedem Holzkohlen-Pellet hinzugegeben und der Inhalt sorgfältig gemischt, indem die mit Parafilm abgeschlossenen Reagenzgläser dreimal umgedreht wurden, und zwar vorsichtig, um ein Aufschäumen zu vermeiden (was auf Beschädigung des Proteins hindeutet). Die Reagenzgläser v/urden dann bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert und bei 3000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert. Die klare, darüberschwimmende Flüssigkeit,
die an die Serum-Proteine gebundenes, desorbiertes
I ^ -T, enthielt, wurde in Zählgläser dekantiert und die Radioaktivität in einem brunnenartigen Flimmerzähler bestimmt.
00981 1/1113
Sieben verschiedene Holzkohlearbeiten wurden überprüft,
um festzustellen, ob eine von ihnen besondere Eigen-
131 schäften für die Desorption von I ^ -T^ durch ein
"Molekularsieb" aufweist. Diese Holzkohlenarten schwankten in der maximalen Partikelgröße von < 44 Mikron bis >
ρ 16ÖO Mikron; im Oberflächeninhalt-von 935 bis l400 m je Gramm; und an pH im Wasser von 4,5 bis 11,0. Norit A, neutrale pharmazeutische Qualität, U.S. Sieb-
Nr. 270, maximale Teilchengröße 55 q, Oberflächen-
p
inhalt 955 m je Gramm, funktionierte am besten, wenn
Serum als Desorptiönsmedium verwendet wurde.
BEISPIEL X.
131
Die Menge an κ -T^, die aus überzogener Holzkohle durch 0,5 ml normalem Serum desorbiert wurde, stand in einem linearen Zusammenhang zu der Menge an Isotop, je feste Menge an Holzkohle. Wenn demnach die an 12,5 mg überzogene Holzkohle gebundene Menge an I ^ -Tv von 10 auf 4o ng erhöht wurde, wurde die durch Serum entfernte Menge proportional erhöht, wie in Fig. 1 gezeigt.
BEISPIEL XI.
Bei dem Standardverfahren wurde 20 ng gewählt, da dies eine geeignete Zählgeschwindigkeit für 2 bis 3 Halbwert-
131 zeiten von T ^ bietet. In gleicher Art und Weise
wurde die Menge an zu verwendender überzogener Holzkohle
-29-
009811/1113
bestimmt, indem die Menge an Holzkohle von 50 auf 12,5 mg je festgesetzte Menge (20 ng) an I ver-
15I
ringert wurde. Die Menge an I -T7, die durch 0,5 ml Serum entfernt wurde, erhöht sich mit abnehmenden Mengen überzogener Holzkohle. So zeigte sich, daß 12,5 mg überzogener Holzkohle, imprägniert mit
1^l
20 ng T -T. , die beste Desorption ergab, während ein Holzkohlenpellet geschaffen wurde, das groß genug war, um ein Dekantieren des darüberschwimmenden Mediums zu gestatten, ohne das Pellet wegzuschwemmen, wie in Fig. 2 gezeigt.
BEISPIEL XII.
Wenn I J -Tv entweder unüberzogener Holzkohle oder Holzkohle vor dem Hinzufügen eines besonderen molekularen
Überzuges (späterer Überzug) hinzugefügt wurde, war die
131 Desorption geringer als im Vergleich, zu I -T-, , das vorher überzogener Holzkohle hinzugefügt wurde, wie in Fig. 2 gezeigt. Im Falle unüberzogener Holzkohle kann dies deshalb sein, weil ein gewisser Teil der das Serum T, bindenden Proteine an die Holzkohle adsorbiert wird . Irr, Falle von Holzkohle, die nach der Hinzufügung von T, überzogen wurde, kann dies deshalb sein, weil
ein nach dem T ^ -T-, aufgetragener Molekularüberzug
15I
auf dem I ^ -T, lagert und das nachfolgende Austreten
von Τ, verhindert. Vorher überzogene Holzkohle würde ein freies Austreten von später hinzugefügtem I ^ -T gestatten, da nichts von dem Überzug auf dem T ^ -Tv lagern würde.
0 0 9 811/1113 ORJQlNAL INSPECTED
-30-
BEISPIEL XIII.
Der besondere molekulare überzug, der auf die Holzkohle zur Einwirkung gebracht wird, ist wichtig für die Einfachheit, mit der die Desorption stattfindet, wahrscheinlich weil es die einzige Schicht zwischen dem desorbierenden Medium und dem I ^ -T-, ist. Fig. 4 zeigt die Wirkung von vier verschiedenen überzügen: Dextran Durchschnittsmolekulargewicht 2 χ 10 , Ficoll (ein polymerisierter Alkohol) Durchschnittsmolekulargewicht 4 χ 5 , menschliches Hämoglobin
Durchschnittsmolekulargewicht 6,8 χ 10 und
4 Dextran Durchschnittsmolekulargewicht 1 χ 10 . Aus der graphischen Darstellung 1st klar, daß Dextran von niedrigem Molekulargewicht (Durchschnittsmolekulargewicht 10 χ 10 ) , wenn es als überzugsmittel verwendet wird, ein ausgezeichnetes Austreten von
131 *
I ' -T^ gestattet, mit genügender Trennung von
Euthyreoid- von Hypothyreold-Seren, um von diagnostischem Wert zu sein. Moleküle von Dextran sind in ihrer Gestalt lang und schlank, die Hämoglobinmoleküle sind ziegelsteinförmlg und die 'FicollmolekUle sind kugelförmig. Es wird daran gedacht, daß die molekulare Auflagerung von Dextran,
h
DuiOhschnlttsmöLekulargewicht 1 χ 10 , es den
Anziehungskräften des Serums am besten gestatte,
I ^ -T-, von der Holzkohle zu desorbleren. Wenn Dextran
von niederem Molekulargewicht als überzugsmittel
-31-
009811/1113 ORIGINAL !N3PEC1
verwendet wurde, wurden ungefähr 15% von I -x in der Holzkohle durch normales Serum entfernt.
BEISPIEL XIV.
Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Prüfung des Desorptionsgrads von I ^ -T-* durch 0,5 ml Serumgruppen schwangerer hyperthyreoider, euthyreoider und hypothyreoider Personen.»Die Anzahlen je Minute in dem daraufschwimmenden Material der vier Serumgruppen werden gegen einen Temperaturbereich von O0C bis 560C abgetragen, mit einer Inkubationszeit von einer halben Stunde. Die Trennung der verschiedenen diagnostischen Serumgruppen erfolgt am besten bei 37°C, obwohl die Trennung der hyperthyreoiden Seren von den anderen innerhalb des Bereichs von 00C bis 37°C ausgezeichnet ist,
BEISPIEL XV.
Fig. 6 zeigt die Wirkung der Inkubationszeitlänge auf die Trennung der vier diagnostischen Gruppen, wenn
der Test bei ^70C durchgeführt wird. Bei 30 Minuten ist
genügend differentielle Desorption vorhanden, um diagnostische Gruppen zu trennen.
Die Methoden der Beispiele X bis XV hängen von der relativen Affinität für T, von endogenen Proteinen zur Bindung von Thyreoidhormonen ab und dem in dem
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Test verwendeten Bindemittel, genauso wie von der auswählenden Fähigkeit des Bindemittels, Proteine zur Bindung von T-, zurückzuweisen. Eine breitere Anwendung des Verfahrens mit oberzogener Holzkohle, wie hier beschrieben, besteht in der Reinigung verschiedener Materialien auf der Grundlage ihrer molekularen Größe und Gestalt, unter Verwendung geeignet überzogener Holzkohle zur Gruppentrennung, mit einer nachfolgenden Desorption des Materials aus der überzogenen Holzkohle. Es wurden vom Erfinder nacheinander sogar verschiedene Überzüge verwendet, um "Fraktionsschnitte" durchzuführen, je nach der Molekulargröße des Mediums, das aus einer Mischung herausisoliert werden sollte.
Überzogene Holzkohle kann, indem sie eine "Sofortdialyse" schafft, sich in einem weiten Bereich von Verfahren als nützlich erweisen, die normalerweise eine erschöpfende Dialyse oder Säulenchromatographie benutzen, um große Moleküle von kleinen zu trennen. Die hierin benutzten Verfahren sind empfindlich, genau, reproduzierbar und können im allgemeinen leicht innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden. Die Einfachheit und die leichte Beschaffung der Reagenzien und der Geräte gestatten es, sie ohne weiteres besonders -in jedem klinischen Laboratorium zu verwenden, das Radioisotopen benutzt.
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Das Überzugsmaterial liegt vorzugsweise innerhalb des Bereiches von im allgemeinen 4 bis 30 Gewichtsprozent der Holzkohle, aber die wichtige primäre Norm ist die Sättigung der Holzkohle mit dem Uberzugsmaterlal, d.h. Anwendung von Überschuß und wahlweisem Auswaschen von allem Überzug. Die Holzkohle liegt vorzugsweise innerhalb eines Porengrößenberelchs von 10 bis 100.000 S, und eine geringere Maschenweite als 10, nämlich 100 bis 400 wird bevorzugt. Das Überzugsmaterial hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von mindestens 10.000 bis hinauf zu 2 MLllionen. Die hierin verwendete Holzkohle entspricht Aktivkohle und soll jegliche adsorbierende Form von Kohle einschließen.
Es ist ersichtlich, daß die überzogene Holzkohle verschiedene Materialien aus der und in die darüberschwimmende Lösung selektiv adsorbiert und desorbiert, sowie auf die oder von der überzogenen Holzkohle, wobei diese Trennung der wesentliche Gedanke der Erfindung ist. Dabei werden die getrennten Materialien dann quantitativ durch Isotopenindikatoren und Flimmerzähler' analysiert. Es ist selbstverständlich, daß viele andere quantitative oder qualitative Mittel benutzt werden können, um die getrennten Bestandteile zu analysieren, wie etwa Kolorimetrie, grav!metrische Analyse, usw.
-54- ORIGINAL INSPECTED
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Claims (22)

Patentansprüche :
1. Selektives adsorbierendes Mikrosehwammaterial, dadurch gekennzeichnet, dass es
' eine adsorbierende Teilchenbasis aufweist und einen Molekularsiebüberzug darauf, wodurch nur ausgewählte Moleküle durch das genannte Sieb dringen können, um von der genannten Basis adsorbiert oder desorbiert zu v/erden.
2. Mikroschwammaterial nach Anspruch I0 dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Überzug aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Blutbestandteilen, Plasmaersatzstoffen und einem Sucrosepolymeralkohol mit einem Molekulargewicht von ungefähr 400.000 besteht.
3* Mikroschwammaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte überzug aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Albumin, Alpha-, Beta- und Ganma-,globulin, Dextran, Fibrinogen, H'jno£lobin und Gelatine besteht.
k. . Miki'oschwummaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte überzug eine organische Verbindung ist, deren Molekulargewicht zv/ischen 10.000 und 2 Millionen liegt.
5« - ? 'Mikrasehwaumaterial nach Anspruch 1, dadurch ge-
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kennzeichnet, dass die genannte Unterlage zusätzlich mit einem biologischen Material überzogen ist, das durch das genannte Molekularsieb gedrungen ist.
6. Mikroschwammaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage Holzkohle ist.
7. Mikroschwammaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage zusätzlich mit einem biologischen Material überzogen ist, das durch das genannte Molekularsieb gedrungen ist.
8. Mikroschwammaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage mit Dextran als Überzug gesättigt ist.
9. Mikroschwammaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage mit Hämoglobin als Überzug gesättigt ist.
10. Mikroschwammaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage mit Albumin als Überzug
gesättigt ist.
11. Hikr'osoh.-.'amrr.cterial nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, '"ci.-s -"ie Ϊberζu,rsverbindung Rinderalbumin
BAD
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. τ
12. Mikroschwammaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Holzkohle eine Porengrösse zwischen 10 und 100000 /P aufweist und eine Maschengrössenzahl, die grosser als 10 ist.
13. Mikroschwammaterial nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Maschenzahl zwischen 100 und 400
liegt.
14. Verfahren zur Trennung verdünnter Molekularkomplexe einschliesslich von Molekülen, mit verschiedenen Molekulargestaltungen, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung einem adsorbierenden Teilchen-Mikroschwammaterial nach Anspruch 1 ausgesetzt wird, wobei das Molekularsieb so ist, dass es eine der Molekülformen, die von der Basis clesorbiert oder auf sie adsorbiert v/erden soll, hindurchlässt und den Durchtritt einer anderen Molekühlform verhindert.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass C1Ie Unterlage zusätzlich mit einem biologischen Material überzogen wird, das durch das Molekularsieb gedrungen ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexe nach der Trennung geprüft werden.
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17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage Holzkohle ist.
18. Verfahren nach Anspruch IJ, dadurch gekennzeichnet, dass die Holzkohle eine Porengrösse zv/ischen 10 und 100.000 Ά und eine Maschengrössenzahl von mehr als 10 aufweist.
19» Verfahren nach Anspruch l8, dadurch gekennzeichnet, dass die Maschenzahl zwischen 100 bis 400 liegt.
20. Verfahren nach Anspruch 1"{, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexe nach der Trennung durch Verv/endung von Radioisotopen für mindestens einen Komplex geprüft v/erden.
21. Verfahren nach Anspruch I7, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexe nach der Trennung durch Verv/endung von radioisotopischer Verdünnung für mindestens einen Komplex geprüft v/erden.
j
22. Verfahren nach Anspruch I7, dadurch gekennzeichnet, dass der Überzug aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Blutbestandteilen, Plasmaersatzstoffen, Zinnoxyd, Dimethylsilan, Siliziumdioicyd und Sucrosepolymeralkohol mit einem Molekulargewicht von ungefähr 400 besteht.
23. Verfahren nach Anspruch I7, dadurch gekennzeichnet, dass der Überzug aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus
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ORlQfNAL INSPECTED
Eiweiss, Alpha-, Beta- und Qammaglobulin, Dextran,
Fibrinogen, Hämoglobin und Gelatine besteht.
24. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterlage mit Hämoglobin als dem genannten Überzug gesättigt ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte eine Molekularform freies Vitamin B12
ist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte andere Molekularform ein grundmolarfaktorgebundenes Vitamin B^? ist.
ir,
*
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,
*■■■ . *
dass die eine Molekularform freies Eisen ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die -niere Molekularform serumgebundenes Eisen ist.
29. _. Verfahren nach Anspruch I7, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Unterlage mit Albumin als Überzug gesättigt ist.
50. Verfärben nach Anspruch .29, ra^urch gekennzeichnet, dass die genannte eine Molekularform freies Vitamin B1 ^ ist,
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- - BAD ORIGINAL
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekularform grundmolarfaktorgebundenes Vitamin B12 ist.
32. Verfahren nach Anspruch 30,, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte andere Molekularform serumgebundenes Vitamin B,„ ist. ,
33. Verfahren nach Anspruch 29* dadurch gekennzeichnet, dass die genannte eine Molekularform freies Trijodothyronin ist.
j J4. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte andere Molekularform serumgebundenes
j Tx-ijodothyronin 1st.
35. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Basis mit Dextran als Überzug gesättigt ist.
36. Verfahren nach Anspruch 35* dadurch gekennzeichnet,
j dass die genannte eine Molekularform Insulin ist.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte andere Molekularform ein Insulinantikörperkomplex ist.
. 6 009811/1113
38. Verfahren naoh Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte eine Molekularform Wachstumshormon ist.
39. Vierfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte andere Molekularform Wachstumshormonantikörperkomplex ist.
40. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte eine Molekularform chorionisches "Wachstumshormon- Prolakt in" ist.
41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte andere Molekularform ein chorionischer
"Wachstumshormon-Prolaktin"-Antikörperkomplex ist.
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