DE2751589C3 - Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen MediumInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
Bei einem derartigen Verfahren werden die freien (nicht gebundenen) Antigene an Adsorbentien gebunden, die durch Zentrifugation ausgefällt werden können.
Pulverisiertes Talkum (Magnesiumsilicat), Kaolin (Alumiiiiumsilicat), Mikrokömer von Siliciumdioxid, CeIIuIosepulver usw. sind einige einfache Adsorbentien, die
angewandt werden können. Viele Trennungen werden durchgeführt unter Anwendung von adsorbierender
Aktivkohle, die mit Dextran überzogen ist Das Dextran verhält sich eher wie ein Sieb, das es den kleineren
Molekülen des freien Antigens erlaubt, hindurchzugehen, die dann an die Aktivkohle gebunden werden,
wobei das gebundene Antigen in Lösung bleibt, nachdem die Aktivkohle durch Zentrifugieren oder
Filtrieren entfernt worden ist, vgl. Principles of Competitive Protein-binding Assays, Herausgeber: W.
D. Odell und W. H. Danghaday, Philadelphia und
Es ist ferner bekannt, Ionenaustauscher und andere
Harze anzuwenden, um freie Antigene durch elektrostatische Kräfte zu binden, und dieses Verfahren wurde
bisher hauptsächlich angewandt zur Bestimmung kleiner Moleküle, wie Thyroidhormonen (T-3 und T-4).
Beispiele für derartige Verfahren sind in den US-PS 36 59 104,37 10 U7und3961 894angegeben.
Bei den erwähnten Verfahren zur Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von freiem Antigen
wird eine Säule, die mit einem Material gefüllt ist, das
vorzugsweise entweder das freie Antigen oder den Antigen-Antikörper-Komplex adsorbiert, angewandt
Das inkubierte wäßrige Reaktionsgemisch wird von oben auf eine solche Säule aufgebracht und die Säule
dann eluiert Die Radioaktivität entweder der Säule oder des Eluats wird dann bestimmt und der Gehalt an
Antigen in der Ausgangslösung aus dieser Zählung berechnet
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für ein spezifisches Bindungsverfahren der beschriebenen Art
einen Feststoff als Adsorptionsmittel zu finden, der billiger und leichter zugänglich ist als die bisher
bekannten und auf eine größere Anzahl unterschiedlicher Bestimmungsverfahren anwendbar ist
Diese Aufgabe wird dadurch gelGst, daß man als Feststoff einen nicht-ionenaustauschenden vernetzten
Polyvinylalkohol verwendet
Das neue Adsorbens ist vorzugsweise Polyvinylalkohol, der mit Glutaraldehyd vernetzt ist und findet
hauptsächlich Anwendung zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines nicht proteinhaltigen Haptens, wie
Thyroxin, Trijodthyronin, östriol, Vitamin B,2 und
Digoxin.
Bei den beiliegenden Zeichnungen ist F i g. 1 eine Standardkurve, wie sie angewandt wird zur Bestimmung
von Thyroxin nach einem radioimmunologischen Konkurrenzbindungsverfahren,
Fig.2 eine Standardkurve zur Anwendung bei der Bestimmung von östriol nach einem radioimmunologischen Konkurrenzbindungsverfahren, und
Fig.3 eine Standardkurve zur Anwendung bei der
Bestimmung von Thyroxin nach einem radioimmunologischen Konkurrenzbindungsverfahren.
Im Rahmen dieser Beschreibung haben die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: »Ligand« ist die
Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium
bestimmt werden soll; »bindendes Mittel für den Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von
Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen
besitzt, und »Bindungs-Analoges des Liganden« ist
irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich in bezug auf die Bindungsaffinität zu dem
bindenden Mittel für den Liganden im wesentlichen wie der Ligand selbst verhält.
Das neue Adsorbens kann zur Trennung bei verschiedenen Arten von heterogenen spezifischen
Bindungsbestimmungen angewandt werden, wie bei Konkurrenzbindungsverfahren, oder den aufeinanderfolgenden Sättigungsverfahren, bei denen die ligandenhaltige Probe mit einem Überschuß an Bindemittel
zusammengebracht wird und die auftretenden, ungesättigten freien Stellen des Bindemittels mit einem
markierten Liganden oder einem Analogen davon Bindungen eingehen, indem die Probe anschließend
einem Überschuß der markierten Komponente ausee-
setzt wird. Die verbleibende Menge an freier markierter Komponente wird abgetrennt und steht direkt in
Beziehung zu der Menge an unbekanntem Liganden in der Probe.
Nach Beendigung der Bindungsreaktion wird das Reaktionsgemisch mit dem neuen Adsorbens zusammengebracht,
wobei die freie Form der markierten Komponente selektiv daran adsorbiert wird und das
Adsorbens, an dem diese Form adsorbiert ist, wird physikalisch von dem Reaktionsgemisch abgetrennt
Anschließend wird die Markierung in dem verbleibenden Reaktionsgemisch oder an dem Adsorbens
gemessen. Das Zusammenbringen des Adsorbens mit dem Reaktionsgemisch und die anschließende Trennung
kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden.
Bei einer Ausführungsform kann das Adsorbens in
feinteiliger Form, wie in Form von Pulver, Perlen,
Körnern, Kristallen, Fäden usw, vorliegen. Das teilchenförmige Adsorbens kann einfach als solches zu
dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, und die Trennung kann durchgeführt werden durch Zentrifugieren,
Filtrieren u. ä. Wahlweise kann das teilchenförmige Adsorbens in einer Säule enthalten sein und das
Zusammenbringen und die Trennung können durchgeführt werden, indem das Reaktionsgemisch durch die
Säule geleitet wird. Ein solches »Durchleiten« kann z. B.
ein Perkulieren und/oder Durchspülen von oben durch Schwerkraft des Reaktionsgemisches durch die Säule
oder Einziehen des Reaktionsgemisches in die Säule sein.
Bei einer anderen Ausführungsform kann das. Adsorbens in Form eines festen zusammengesetzten
Körpers vorliegen, z. B. als fester Träger, der gegenüber dem Reaktionsgemisch inert ist und mit dem Adsorbens
imprägniert oder überzogen ist Bei der Anwendung wird die Vorrichtung aus Adsorbens und Träger in das
Reaktionsgemisch getaucht und nach einer festgesetzten Zeit einfach daraus entnommen, wodurch die
notwendige Trennung erreicht wird. Diese Ausführungsform ist besonders günstig zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens, da sie in jedem beliebigen Laborgefäß, wie einem Reagensglas, durchgeführt
werden kann. Bei dieser speziellen Ausführungsform kann der zusammengesetzte Körper mit dem
Adsorbens mit einem Handgriff vercihen sein, der damit
fest oder abnehmbar verbunden sein kann. Der Körper kann jede gewünschte Form besitzen. Wenn er
innerhalb von Säulen verwendet werden soll, liegt er vorzugsweise in Form einer Scheibe oder eines
Zylinders vor. Bei dieser Ausführungsform hängt die Zahl der einzelnen Körper, r*ie in eine Säule gepackt
sind, ab von der Adsorptionskapazität des Körpers und der Konzentration des Liganden in dem Reaktionsgemisch.
Der Körper kann durch übliche Imprägnier- und Beschichtungsverfahren hergestellt werden. Vorzugsweise
wird der Träger zunächst mit dem Adsorbens imprägniert oder überzogen, z. B. durch Eintauchen in
ein Bad einer geeigneten Lösung und anschließendes Zusammenbringen des so imprägnierten oder überzogenen
Trägers mit einer Lösung, enthaltend ein Vernetzungsmittel, wiederum am besten durch Eintauchen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung wird die Trennung erreicht durch Anwendung
von Adsorptionssäulen, die mit einer teilchenförmigen Form des Adsorbens gefüllt bzw. gepackt sind.
Zur Herstellung derartiger Säulen ist ts z. B. möglich, Zylinder von Kunststoffspritzen zu verwenden. Jeder
Zylinder wird vorher mit einem Mittel zum Verschließen des Bodens, z. B. einer abnehmbaren Kappe,
versehen, und eine Rückhaltescheibe aus einem gesinterten porösen Äthylenpolymer (Homopolymer
5 oder Copolymer), das mit Detergens behandelt worden ist, wird koaxial auf den Boden des Plastikzylinders
gepreßt Nach Einbringen des gekörnten Adsorbens in den Spritzenzylinder wird es, wenn nötig, mit einem
Puffer gewaschen und kann sich dann so setzen, daß es
H) frei ist von Luftblasen, woraufhin eine andere poröse
Scheibe aus mit Detergens behandeltem gesintertem Äthylenpolymer (Homopolymer oder Copolymer) ähnlich
der ersten in den Spritzenzylinder eingeführt und koaxial in festen Kontakt mit dem körnigen Adsorbens
is gebracht wird. Die Menge an Adsorbens in der Säule
hängt ab von der Art des Adsorbens und der Art des
Tests, für den die Säule hergestellt wird. Die so hergestellte Säule wird dann mit einem entsprechenden
Puffer gewaschen. Zur Durchführung ::iner Messung mit
dieser Säule wird das Reaktionsgembch hergestellt und
inkubiert im oberen Teil der Säule. Die Abdichtung am unteren Ende der Säule wird dann entfernt, so daß die
wäßrige Phase durchfließen kann, und die Säule wird mit Puffer gewaschen, um restliche Mengen der nicht
adsorbierten gebundenen Form des Reagens auszuwaschen.
Aus der Gesamtradioaktivkät (»Anfangs-wzählung)
und der Radioaktivität des abgetrennten Adsorbens nach Beendigung der Bestimmung (»End-«zählung)
wird die prozentuale Rückhaltung (Retention) nach der folgenden Gleichung berechnet:
Prozentuale Rückhaltung = —■
Endzählung
Anfangszählung
Zur Bestimmung der unbekannten Menge z. R. eines Haptens ist es zunächst nötig, eine Reihe von
Bestimmungen mit unterschiedlichen bekannten Men· gen an Hapten durchzuführen und dadurch eine Kurve
zu bilden, bei der die prozentuale Standardrückhaltung gegen die Konzentration aufgetragen ist Diese Kurve
wird dann angewandt zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration aus der prozentualen Rückhaltung,
die aus den Radioaktivitätszählungen berechnet worden ist.
Im Prinzip wird die Gesamlradioaktivität bestimmt durch die Menge des radioaktiv markierten Haptens
oder Analogen, die angewandt wird zur Herstellung des Reaktionsgemischei. Um jedoch Ungenauigkeiten zu
vermeiden, die durch ein ungenaues Aufbringen bzw. Zugeben der markierten Komponente auftreten können,
kann es günstiger sein, die Gesamtradioaktivität experimentell zu bestimmen. Das kann erfolgen
entweder vor oder nach der selektiven Bestimmung der Radioaktivität des abgetrennten Adsorbens. Die Gesamtradioaktivität
kann bestimmt werden nach Inkubation und vor der !^'.sächlichen Trennung der Adsorbenssäule
von dem restlichen Reaktionsgemisch.
bö Das erfindüngsgemäße Verfahren ist auch geeignet
zur Bestimmung der Liganden-Bindungikapazität in
einem flüssigen Medium. Bei einer solchen Bestimmung wird von dem flüssigen Medium angenommen, daß es
ein Bindungsmitlel für den Liganden enthält. "*ui
b> Beispiel kann das erfindüngsgemäße Verfahren modifi
ziert werden zur Durchführung des sogenannten »T-3-Aufnahmetests«. Bei diesem Test wird das
Thyroidhormon im Serum indirekt bestimmt dnrrh
Bestimmung der verfügbaren Bindungsstcllcn von Thyroid-bindendem Globulin (TBG), das in dem Serum
vorhanden ist. Bei diesem Versuch wird angenommen, daß die Menge an TBG in normalen Sera verhältnismäßig
konstant ist und daß es den größten Teil des verfügbaren Thyroidhormons bindet. Wenn markiertes
T-3 (Trijodthyronin) zu einer Serumprobe zugesetzt wird, wird es von dem TBG gebunden irn Verhältnis zu
den restlichen verfügbaren Bindungsstellen. Wenn eine gioße Menge an markiertem T-3 von dem Serum
gebunden wird, zeigt das eine große Zahl verfügbarer Bindungsstellen und damit einen geringen Gehalt an
Thyroidhormon an und umgekehrt. Die Messung des ungebundenen markierten T-3 kann damit in Zusammenhang
gebracht werden mit der Schilddrüsenfunktion. Bei der klinischen Anwendung des T-3 Aufnahmetests
reicht es in vielen Fällen, das Verhältnis der T-3 Aufnahme im Vergleich mit einem normalen Standardserum
zu bestimmen. Dieses Verhältnis kann erhalten werden durch Teilung der Anfangszählung (wie oben
definiert), die von der unbekannten Probe erhalten worden ist, durch die Anfangszählung einer Standardserumprobe,
die einem parallelen identischen Bestimmungsverfahren unterworfen worden ist.
Eine Analyseneinheit zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren umfaßt erstens den Liganden oder ein Bindungs-Analoges davon, der (bzw. das) mit einer
Markierung, wie einem radioaktiven Atom, versehen ist, zweitens ein Bindungsmittel für den Liganden, wie einen
Antikörper, und drittens einen festen nicht ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol. Zur Bestimmung
der Liganden-Bindungskapazität eines flüssigen Mediums, enthält eine Analyseneinheit erstens den Liganden
oder ein Bindungs-Analoges davon, der (das) mit einer Markierung, wie einem radioaktiven Atom, versehen ist,
und zweitens einen festen nicht ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol. Die Analyseneinheiten
enthalten den Polyvinylalkohol, vorzugsweise in Teilchenform und in einer Säule oder in einer Trägermatrix,
wie oben beschrieben.
näher erläutert:
Herstellung des vernetzten Polyvinylalkohols
5 ml konz. Salzsäure wurden unter Rühren zu einer Lösung von 10 g in kaltem Wasser löslichem kristallinen
Polyvinylalkohol (PVA) Typ II (Katalog Nr. P 8136 der Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, USA) in 600 ml
Wasser gegeben. Die entstehende viskose Lösung wurde mit einem Ruhrer mit hoher Kraft gerührt und
auf 650C erwärmt Dann wurden 10 ml einer 25%igen
wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd zugegeben und das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 650C gerührt Der
entstehende unlösliche vernetzte PVA wurde abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die
Waschflüssigkeit neutral war. Der nasse Filterkuchen wurde mit Äthanol oder Aceton gewaschen und an der
Luft getrocknet. Die Ausbeute an körnigem weißen Polymer betrug 11,0 g. Beim Erhitzen auf 260° C wurde
kein Schmelzen, Erweichen oder Zersetzung beobachtet Das Produkt erwies sich als in Wasser und
organischen Lösungsmitteln, einschließlich unter Rückfluß siedendem Dimethylformamid (DMF), unlöslich.
Hersteilung der Säulen
Es wurden Säulen hergestellt indem 100 mg des wie oben hergestellten körnigen vernetzten Polyvinylalkohols
(PVA) in Zylinder von 5 ml Plastikspritzen gegebei wurden, die vorher mit einer abnehmbaren Bodenkappi
und einer Scheibe aus mit Detergens behandelten gesintertem porösem Copolymer aus Äthylen um
Vinylacetat versehen worden war. 2 ml Barbitalpuffe (2,33 g Natriumbarbital und 0,724 g Äthylendinitrilte
traacetat in 150 ml Wasser, pH 8,6) wurden zugegeber
und anschließend eine zweite mit Detergens behandelt! gesinterte poröse Scheibe, wie oben, parallel zu de
ersten mit einem Stopfen aufgedrückt. Die Bodenkappi wurde entfernt und die PVA-Säulen mit 3 ml Barbital
puffer gewaschen und anschließend die Kappe wiede aufgesetzt.
Beispiel 1
Radioimmunologische Bestimmung von Tyroxin (T-4)
Radioimmunologische Bestimmung von Tyroxin (T-4)
Um eine radioimmunologische Bestimmung von T-*
durchzuführen, wurden die folgenden Reagentien zi den mit Barbitalpuffer gewaschenen PVA-Säuler
gegeben (alle Reagentien wurden in Barbitalpuffei gelöst):
1. 100 μΙ ANS-Lösung (8-Anilin-l-naphthalin-sulfon
säure-ammoniumsalz,4,0 g/l)
2. 100 μΙι2Μ-Τ-4 (ungefähr 40 000 cpm)
3. 100 μΙ T-4 Standard (im Konzentrationsbereich von
6-36 „g/1) oder eine 1:5 verdünnte klinische Serumprobe
4. 100 μΙΑηη-Τ-4-Antikörper
Die Säulen wurden leicht geschüttelt, um ein gründliches Vermischen der Reagentien sicherzustellen
und nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Bodenkappe entfernt und das
Reaktionsgemisch konnte in das PVA-Bett eindringen. Die Radioaktivität in jeder Säule wurde bestimmt
(Arifangszählung). Jede Säule wurde dann mit 3,0 ml Puffer gewaschen und eine zweite Bestimmung der
Radioaktivität der Säule vorgenommen (Endzählung). Die »prozentuale Rückhaltung« jeder Säule wurde nach
der folgenden Gleichung bestimmt:
Prozentuale Rückhaltung =
Endzählung
Anfangszählung
Anfangszählung
χ 100
Eine Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen die entsprechende
so Konzentration an Thyroxin des T-4 Standards (Fig. 1x
Die mit bekannten Vergleichssera erhaltenen Ergebnisse waren:
" Bekannte Konzentrationen an Konzentrationen an T4.
T-4 in Vergleichssera wie sie entsprechend dem
T-4 in Vergleichssera wie sie entsprechend dem
Beispiel erhalten wurden
(.Mg/100 ml) (iig/lOOml)
Lederle I 8-12a)
Lederle II 16-243)
NMS II 16-19")
Lederle II 16-243)
NMS II 16-19")
8,9; 8.6
16,0; 16,7; 16.0; 16.0
19,0; 20,6; 18,7
19,0; 20,6; 18,7
a) Lederte Diagnostics, American Cyanamid Company, Pearl
River, N.Y., U.S.A.
b) Nuclear Medical Systems. Inc., 515 Superior, Newport Beach,
Ca.. U.S.A.
Klinische Proben mil unter | Konzentrationen an T-4. |
suchten T-4-(ichalten | wie sie entsprechend dem |
Beispiel erhallen wurden | |
(■ig/H)U ml) | |
2.2 | 2,3 |
3.3 | 3.8; 3,7 |
4.5 | 5,5; 4,8 |
7.2 | 6,9; 7,5; 8,0 |
15,0 | 15,4; 14,5 |
17.7 | 16,0 |
18.0 | 17,6 |
20.0 | 18,0; 18,2 |
Beispiel 2
Radioimmunologische Bestimmung von östriol
Radioimmunologische Bestimmung von östriol
Der bei diesem Versuch angewandte Puffer wurde hergestellt durch Lösen von 1,57 g Natriumbiphosphat
und 0,78 g Natriumäthylendiamimetraessigsäure in 120 ml destilliertem Wasser (pH 7,4). Die Säulen mit
vernetzten! PVA wurden wie oben hergestellt und mit dem Puffer (6 ml) gewaschen.
Der Versuch wurde durchgeführt durch Aufbringen der folgenden Lösungen auf das obere Ende der Säule
mit vernetztem PVA:
1. 0,5 ml '«J-Östriol (ungefähr 10 000 cpm)
2. 0,25 ml Antiöstriol-Antikörper (1 :150)
3. O1J ml östriol Standard (in Konzentrationen von
2,0, 5,0 und 20 ng/ml) oder der unbekannten zu untersuchenden Probe
Das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend konnte es
in die Säule eindringen. Die Radioaktivität jeder Säule wurde gemessen (Anfangszählung), 1 ml Puffer wurde
durch jede Säule gegeben und die Radioaktivität erneut gemessen (Endzählung). Die Eichkurve wurde erhalten
durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung (wie in Beispiel 1 berechnet) gegen die Konzentration an
Östriol (F ig. 2).
Unbekannte Mengen an Östriol, z. B. Serum, können
auf ähnliche Weise .nit Hilfe der Kurve der Fig.2
bestimmt werden.
Beispiel 3
Radioimmunologische Bestimmung von Thyroxin (T-4)
A. Herstellung von mit vernetztem PVA
aberzogenen Scheiben
Ungefähr 6000 Scheiben mit einem Gesamtgewicht von 500 g, jeweils mit einem Durchmesser von 10 mm
und einer Dicke von 2 mm, aus Folien eines Copolymers
aus Äthylen und Vinylacetat (EVA) (Porvair Ltd, King's Lynn, Norfolk, England) wurden in eine Lösung von
240 g PVA in 2400 ml Wasser bei 65° C gegeben und die Lösung 45 Minuten stehengelassen. Die Seheiben
wurden dann von der wäßrigen Lösung abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Scheiben
wurden in eine Lösung von 96 ml Glutaraldehyd und 8 ml konz. Salzsaure in 2400 ml Wasser bei 65° C
gegeben und 15 Minuten in der Lösung gelassen. Die Scheiben wurden von der Lösung abfiltriert, von
etwaiger anhaftender Lösung freigewaschen und getrocknet
B. Bestimmungsverfahren
Zwei mit PVA überzogene Scheiben, die wie oben hergestellt worden waren, wurden in dem Zylinder einer
Kunststoffspritzc mit entfernbarer Kappe am Boden aufeinander gelegt. Die Bodenkappe wurde entfernt und
die Säule mit 0,1m Tris-maleat-Puffer, pH 7,4 (hergestellt durch Lösen von 285 g Tris-hydroxymethylaminomethan,
1,2 g Maleinsäure und 0,43 g Äthylendiamintetraessigsäure
in 290 ml destilliertem Wasser), gewaschen. Der Boden der Säule wurde dann mit der Kappe
dicht verschlossen und die Säule bis zu einer Höhe oberhalb der oberen Oberfläche der oberen Scheibe mit
dem gleichen Pulver gefüllt.
Um eine radioimmunologische Bestimmung für T-4 durchzuführen, wurden die folgenden Reagentien von
oben auf die Pufferlösung in der Säule gegeben (alle Reagentien waren in dem 0,1m Tris-maleat-Puffer,
pH 7.4. ijelfist).
1. 100 μΙ ANS-Lösung (8-Anilin-i-naphthalin-sulfonsäure-ammoniumsalz,
4,0 g/l)
2. KX^I'"J-T-4(ungefähr40000cpm)
3. 100 μΙ T-4 Standard (im Konzentrationsbereich von
6-36μg/l) oder eine 1 :5 verdünnte klinische
Serumprobe
4. 100 μΙΑηύ-Τ-4-Antikörper
Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten am oberen Ende der Säule inkubieren, und die erste
Zählung der Radioaktivität (Anfangszählung) wurde durchgeführt Die Säulen konnten ablaufen und wurden
dann mit 1 ml 0,1m Tris-maleat pH 7,4, gewaschen und
eine zweite Zählung der Radioaktivität vorgenommen (Endzählung).
Die »prozentuale Rückhaltung« jeder Säule wurde berechnet nach der Gleichung:
Prozentuale Rückhaltung = _ χ
Anfangszählung
Eine Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Ruckhaitung gegen die entsprechende
Konzentration der T-4 Standards (F i g. 3).
Die mit bekannten Vergleichsseren erhaltenen Werte waren:
Die mit bekannten Vergleichsseren erhaltenen Werte waren:
Bekannte Konzentration T-4
in Vergleichssera
(ag/100 ml)
(ag/100 ml)
Konzentrationen an T-4,
wie sie entsprechend dem
Beispiel erhalten wurden
wie sie entsprechend dem
Beispiel erhalten wurden
ml)
Lederle I 8-12a) 11,0
Lederlen 16-24a) 19,2
NfMS II 16-19") 20,8
') Lederle Diagnostics, American Cyanamid Company. Pearl
River, N.Y., U.S.A.
b) Nuclear Medical Systems Inc., 515 Superior, Newport Beach,
CA., U.S.A.
Unbekannte Mengen an T-4 (z. B. in Serum) können
auf die oben angegebene Weise mit Hilfe der Standardkurve der F i g. 3 bestimmt werden.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
030 240/402
Claims (7)
1. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen
Medium durch spezifische Bindung, wobei das flüssige Medium mit dem Bestinraungsreagens,
umfassend eine bindende Komponente, die mit einer Markierung versehen ist, unter Bildung eines
Reaktionssystems, bei dem die gebundene und die freie Form der markierten Komponente vorhanden
ist, zusammengebracht wird, die gebundene Form
von der freien Form durch selektive Adsorption der freien Form der markierten Komponente an einen
Feststoff getrennt wird und die Markierung in der ib
gebundenen oder freien Form der markierten Komponente gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Feststoff einen
nicht-ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit Glutaraldehyd vernetzten Polyvinylalkohol verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nicht proteinhaltiges
Hapten bestimmt
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyvinylalkohol
in Teilchenform vorliegt
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, c'^ß man die Trennung durchführt, indem
man den teilchenförmigen Polyvinylalkohol zu dem Reaktionsgemisch zugibt und anschließend durch
Zentrifugieren oder Filtrieren ^htrennt.
6. Verfahren nach Ansprucn 4, dadurch gekenn- J5
zeichnet, daß man den teilchenförmigen Polyvinylalkohol in einer Säule verwendet und die Trennung
durchführt, indem man das Reaktionsgemisch durch die Säule leitet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Polyvinylalkohol zusammen mit einer Trägermatrix verwendet
und die Trennung durchführt, indem man die Trägermatrix mit dem Reaktionssystem zusammenbringt und anschließend daraus entfernt.
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ID=26320590
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