DE2815510C3

DE2815510C3 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz

Info

Publication number: DE2815510C3
Application number: DE2815510A
Authority: DE
Inventors: Stephen Kenneth Elkhart Ind. Carpenter
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-04-11
Filing date: 1978-04-10
Publication date: 1981-12-10
Also published as: AR219938A1; IL54193A0; IT1102578B; DE2815510A1; GB1584137A; SE7803364L; CA1108530A; FR2387452A1; AU514859B2; AU3430178A; DE2815510B2; IL54193A; FR2387452B1; IT7848825A0; SU735153A3; BR7802225A; JPS53127823A; US4145406A

Description

35 ein Antigen oder Hapten und der spezifische Bindungspartner ein Antikörper dazu ist

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz Hepatitis-B-Oberfiächenantigen (HB₅-Antigen) ist

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Antikörper zu Hepatitis-B-Oberflächenantigen ist

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Teilchenform in einer Säule verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens ein anionisches Ionenaustauschermaterial, insbesondere ein diäthylaminoäthylsubstituiertes Polymer ist

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Polysacchand ist

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Ionenaustauschermaterial eine diäihylaminoäthy-substiuiierte Cellulose (DEAE-Cellulose) ist

16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der pl-Wert des markierten Antikörpers höher als 8,0 ist und die Stufen (a) und (b) bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 6 und 8 durchgeführt werden.

17. Verfahren nach Anspruch {0, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Vorliegen des HB_S-Antigens in Form seines '.mmunokomplexes mit einem Antikörper die Probe mit einem eine immunochemische Bindung schwächenden Mittel und dem Adsorbens für HB_S-Antigen zusammenbringt und darauf das die Bindung schwächende Mittel von dem Adsorbens abtrennt, bevor man das adsorbierte Antigen mit dem markierten spezifischen Bindungspartner zusammenbringt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als dis Bintang schwächendes Mittel ein chaotropes Mittel verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als chaotropes Mittel Harnstoff, Guanidin oder Thiocyanat verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das die immunochemische Bindung schwächende Mittel in einer Konzentration von 2 bis 8 m verwendet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz in einem flüssigen Medium. Die Erfindung betrifft somit immunologische Bindungsbestimmungen zur Bestimmung von Antigenen und Haptenen oder ihren Antikörpern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung radioimmunologische Bestimmungen (RIA) und die Bestimmung von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB,) in Serum- und Plasmaproben.

Es besteht ein ständig zunehmendes Interesse an einer Verbesserung der Verfahren der spezifischen Bindungsbestimmungen und der dafür angewandten Prüfmittel. Klassische RIA-Verfahren umfassen die Konkurrenz zwischen dem Antigen der Probe und einem radioaktivmarkierten Antigen um die Bindung mit einem spezifischen Antikörper. Die Radioaktivitätsmenge, die sich mit dem Antikörper verbindet, ist eine Funktion

der Antigenkonzentration in der Probe und kann bestimmt werden durch Ausfällen und anschließendes Abtrennen des radioaktiven Antigen-Antikörper-Komplexes oder bequemer durch Anwendung einer unlöslichen Form des Antikörpers, wie eines Antikörpers, der an feste Teilchen oder Matrizes gekuppelt ist. In letzter Zeit ist über verschiedene alternative Markierungssubstanzen berichtet worden zum Ersatz der Radioisotopen, wie Enzyme, Coenzyme, Enzymsubstrate, fluoreszierende Moleküle, Moleküle, die imstande sind, an lichterzeugenden Reaktionen teilzuneh-* men, und Enzymmodulatoren.

Es besteht ein spezieller Bedarf an einem vorteilhafteren spezifischen Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen (HB₅) in Proben von Serum oder Plasma. Es ist bekannt, daß ein Patient nach einer Transfusion von Blut, das HB_S-Antigen enthält, Hepatitis entwickeln kann. Bis vor kurzem wurde eine Vielzahl von Techniken routinemäßig in Krankenhauslaboratorien und Blutbanken angewandt, um HB_S-Antigen irn Blut nachzuweisen, das für Transfusionszwecke verwendet werden sollte. Derartige Verfahren umfaßten die tnmunodiffusion, Komlementfixierung, Gegenelektrophorese, Latexagglutination, Hämagglutination und RIA. In letzter Zeit haben die Vereinigten Staaten die Forderung gestellt, daß Blut, das für Transfusionszwecke angewandt werden soll, mit Hilfe des empfindlichsten zur Verfügung stehenden Bestimmungsverfahrens auf Hepatitis untersucht werden muß. Seitdem sind RIA-Verfahren am verbreitetsten zum Nachweis von HB_S-Antigen.

Es wurden verschiedene spezifische Bindungsbestimmungsverfahren entwickelt, die nichtspezifische Bindemittel oder Adsorbentien anwenden. Derartige spezifische Bindungsbestimmungen mit Hilfe von Adsorbentien zerfallen in zwei verschiedene Gruppen.

1. Anwendung von Adsorbentien zur Abtrennung der freien vor der gebundenen Markierungssubstanz

Beispiele für dieses Verfahren sind die in den US-PS 34 14 383, 39 37 799 und 39 38 953 angegeben und diese Verfahren werden üblicherweise angewandt zum Nachweis von kleinen Molekülen, wie Hormonen, besonders markierte Thyroxin durch eine Säule eines Adsorbens geleitet werden und anschließend ein löslicher Birdungspartner, thyroxinbindendes Globulin. Die Menge an radioaktivmarkiertem Thyroxin, die aus der Säule eluiert wird, ist proportional zu der Menge an Thyroxin in der Probe.

Unspezifische Adsorbentien wurden auch angewandt als Stellen, um die der Ligand der Probe und der markierte Ligand in Konkurrenz treten, besonders beim ίο Nachweis von Hormonaufnahmewerten. Die Anwendung dieser Verfahren zur Bestimmung von Trijodthyronin (T-3) Aufnahmewerten ist in den US-PS 34 51 777, 37 10 117 und 38 23 001 beschrieben.

In dem Bericht Nr. PB 241 333 des United States Departement of Commerce, National Technical Information Service (NTIS) vom 27. Januar 1975 und in der US-PS 40 20 151 sind immunologische Bestimmungsmethoden zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern auf einer festen Oberfläche beschrieben. Eine weitere Möglichkeit bezüglk.·.. der Anwendung von nichtspezifischen Adsorbentien be^: analytischen Verfahren und insbesondere für spezifische Bindungsbestimmungen ist angegeben in Principles of Competitive Protein-Binding Assays. Herausg. Odell und Daugha-uay, Kap. IX und XI, J. B. Lippincott Company (1972) und Clinical Chemistry 19 (2): 146-186 (1973). In der DE-OS 26 07 149 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Immunstoffen beschrieben, bei dem die zu bestimmende Substanz zunächst an ein^r festen Phase adsorbiert und anschließend durch immunochemische Verfahren bestimmt wird.

Alle der zur Zeit verfügbaren RIA-Verfahren zum Nachweis von HB_S-Antigen wenden ein zwei-Stellen — radioimmunologisches oder sogenanntes »Sandwich«- j5 Verfahren an. Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende Serumprobe mit einem unlöslich gemachten Antikörper gegen ΗΒ,-Antigen (Anti-HB_S), z. B. in Form von Anti-HB₅, das auf die Innenseite von Reagenzgläsern oder auf die Oberfläche von Plastikperlen aufgebracht ist, inkubiert. Ein Teil des unlöslich gemaciiten Anti-HB_S wird durch das HB_S-Antigen der Probe, soweit solches vorhanden ist, gebunden. Das unlöslich gemachte Material wird dann gewaschen und radioaktivmarkiertes Anti-HB_S zugegeben. Nach einem

Thyroxin. Bei diesen Verfahren wird die Konkurrenz 45 weiteren Waschvorgang wird die Radioaktivitätsmenge

bzw. Kompetition in Lösung zwischen dem Liganden der Probe und dem markierten Liganden um einen spezifischen Bindungspartner, wie ein hormonbindendes Protein oder einen Antikörper, eingeleitet. Nach Beendigung der Konkunenzreaktion wird der freie markierte Ligand von dem markierten Liganden abgetrennt, der &n den Bindungspartner gebunden ist, durch Zugabe eines unspezifischen Adsorbens für den freien Liganden.

2. Anwendung von Adsorbentien, um den Liganden aus der Probe vorher zu extrahieren

Bei diesem Verfahren wird ein unspezifisches Adsorbens zu der Probe zugesetzt, um den interessierenden gemessen, die mit dem unlöslich gemachten Anti-HB₅ verbunden ist. Beispiele für ein derartiges RIA-Verfahren sind die in den US-PS 38 68 517 und 39 49 064 angegebenen Verfahren.

Obwohl sie verhältnismäßig spezifisch und empfindlich gegenüber HB_S-Antigen sind, können die bekannten »Sandwiehw-RIA-Verfahren noch bezüglich ihrer Handhabung und Anwendung bzw. Herstellung der Prüfmittel weiter verbessert werden. Die Sicherung der gleichmäßigen Herstellung und Qualität de«, unlöslich gemachten Anti-HB_S ist verhältnismäßig kostspielig und zeitraubend. Ferner erfordert das Bestimmungsverfahren zwei längere Inkubationsstufen von 30 min oder mehr, und zwar eine für die Wechselwirkung zwi-

Liganden zu extrahieren. Das Adsorbens wird dann von 60 sehen dem Hbs-Antigen der Probe und dem unlöslich

der Probe entfernt, der adsorbierte Ligand von dem Adsorbens eluiert, und der freigesetzte Ligand kann mit einem markierten Liganden um einen spezifischen Bindungspartner in Konkurrenz treten. Dieses Verfahren ist beispielhaft in den US-PS 37 76 698, 38 16 076 und 39 47 564 angegeben. Eine Variation dieses Verfahrens ist in der US-PS 36 Ji 104 beschrieben zum Nachweis von Thyroxin, wobei die Probe und das radioaktivgemachten Anti-HB_S und die zweite für die Wechselwirkung mit dem markierten Anti-HB_S. Ftrner ist das unlöslich gemachte Anti-HB_S verhältnismäßig instabil und erfordert spezielle Bedingungen beim Versenden ι:,'-) und der Lagerung.

Ein weiterer Nachteil dieser bekannten RIA-Verfahren ist ihre Unfähigkeit, ΗΒ,-Antigen in Form seines ImmunkomDlexes mit Anti-HB, in der zu untersuchen-

den Probe nachzuweisen. Die Art des bei den bekannten Verfahren angewandten unlöslich gemachten Aitti-HB, ist so, daß es nur freies HB,-Antigen bindet, das freie Antigendeterminanten besitzt und nicht einen ΗΒ,-Antigen-Antikörper-Komplex. Dadurch bliebe die Gefahr von Hepatitis nach einer Transfusion aufgrund des Vorhandenseins eines ΗΒ,-Immun-Komplexes in dem übertragenen Blut unentdeckt bei Anwendung der üblichen Bestimmungsverfahren.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes spezifisches Bindungsverfahren zu entwickeln, welches ausgeht von einem Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz in einem flüssigen Medium, durch a) Zusammenbringen der /u untersuchenden flüssigen Probe mit einem festen Adsorbens und mn einem spezifischen Bindungspartner zu der zu bestimmenden Substanz, wobei der Bindungspartner markiert ist und das Adsorbens mit der zu bestimmenden Substanz unspezifische Bindungen eingeht, und b) Bestimmung entweder Her Menge an Markierungssubstanz, die durch Bindung an die adsorbierte zu bestimmende Substanz mit dem Adsorbens verbunden ist oder der Menge an Markierungssubstanz, die nicht mit dem Adsorbens verbunden ist.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man (1) einen solchen markierten Bindungspartner auswählt, dessen pl-Wert von demjenigen der zu bestimmenden Substanz verschieden ist; (2) als Adsorbens ein lonenaustauschermaterial verwendet, und zwar einen Anionenaustauscher. wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz niedriger liegt als derjenige des Bindungspartners, oder einen Kationenaustauscher, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz höher liegt als der des markierten Bindungspartners und (3) die Stufe (a) bei einem pH-Wert zwischen dem pl-Wert der zu bestimmenden Substanz und demjenigen des Bindungspartners durchführt.

Unter unspezifischer Bindung ist eine allgemeine physikalisch-chemische Anziehung zu verstehen, wie eine ionische oder hydrophobe (van der Waals) Bindung, die zwischen dem Adsorbens und der zu bestimmenden Substanz auftritt.

Es ist bevorzugt, daß die Stufe (a) durchgeführt wird, indem man (i) die Probe mit aem Aasomens zusammenbringt, (ii) gegebenenfalls das Adsorbens von dem nichtadsorbierten Teil der Probe abtrennt und (iii) anschließend das Adsorbens mit dem markierten Bindungspartner zusammenbringt. Das Adsorbens kann jedoch auch, wenn das erwünscht wird, mit der Probe und dem markierten Bindungspartner im wesentlichen gleichzeitig zusammengebracht werden.

Die Stufe b) kann durchgeführt werden, indem man von dem Adsorbens im wesentlichen den gesamten markierten Bindungspartner abtrennt, der nicht durch Bindungen mit der zu bestimmenden adsorbierten Substanz daran gebunden ist und die Menge an Markierungssubstanz mißt, die entweder an dem Adsorbens verbleibt oder davon abgetrennt wird. Dieses Verfahren ist besonders günstig, wenn die Markierungssubstanz eine radioaktive Substanz ist Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit einen Konzentrationseffekt zu erzielen, indem man das Volumen des Adsorbens mit einem Volumen der Probe mehrmals, vorzugsweise zweimal, zusammenbringt. Das Verfahren ist anwendbar auf eine Vielzahl von Substanzen und ist besonders geeignet zum Nachweis von HB_S-Anti^en und A.p.ti-HS.

Die Anwendung eines lonenaustauschermaterials als Adsorbens ergibt ein Bestimmungsverfahren, das besonders geeignet ist zur Bestimmung von wasserlöslichen Substanzen mit einer positiven oder negativen elektrischen Ladung. Der ausgewählte, markierte Bin- > dungspartner besitzt einen isoelektrischen Punkt (pl-Wcrt), der sich von demjenigen der zu bestimmenden Substanz unterscheidet. Das lonenaustauschermaterial und die pH-Bedingungen können dann ausgewählt werden, wobei das Adsorbens imstande ist, den markierten

κι Bindungspartner unspezifisch zu binden. Die pH-Bedingungen werden so gewählt, daß sie zwischen dem pl-Wert der zu bestimmenden Substanz und demjenigen des markierten Bindungspartners liegen. Dann wird, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz nied

■i riper ist als derjenige des markierten Bindungspartners, ein lonenaustauschermaterial vom aiiionischcn Typ ausgewählt. Wenn die Beziehung zwiscnen den pl-Werten umgekehrt ist, wird ein kanonischer Ionenaustauscher gewählt.

ι. Rei Anwendung auf den Narhweis von Hentatitis-R-Oberflächen (HB,)-Antigen, das eine negative Ladung und einen pl-Wert von weniger als ungefähr 5 besitzt, umfaßt ein bevorzugtes Bestimmungsverfahren die folgenden Stufen:

"' a) Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe mit einem festen Anionenaustauschermaterial bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8;

b) Waschen des Anionenaustauschermaterials mit c;»icr Flüssigkeit mit einem pH-Wert zwischen 5

"' und 8;

c) Zusammenbringen des Anionenaustauschermaterials bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 mit Anti-HB,. das markiert ist und einen pl-Wert von mehr als ungefähr 8 besitzt und

^!' d) Bestimmung der Menge an markierter Substanz, die entweder (i) mit dem Anionenaustauschermaterial verbunden ist durch Bindung des markierten Anti-HB, an adsorbiertes ΗΒ,-Antigen oder (ii) nicht an das Anionenaustauscherharz gebunden ist.

Vorzugsweise ist das Anionenaustauschermaterial ein Diäthanolaminoäthyl-substituiertes Polymer, wie DEAE-Cellulose, vorzugsweise in Form von Teilchen und besonders günstig in einer Dunjiiiauibäuie.
j-, Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von HB_S-Antigen in Form seines immunologischen Komplexes mit Anti-HB,. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:

a) Zusammenbringen der zu untersuchenden Probe ^>n mit einem Mittel, das immunochemische Bindungen schwächt, vorzugsweise einem chaotropen Mittel, wie Harnstoff und mit einem solcht.i Ionenaustauscher, der imstande ist, ΗΒ,-Antigen unspezifisch zu binden und unter solchen Bedingungen,

" die eine solche Bindung begünstigen, vorzugsweise mit einem Anionenaustauscher;

b) Abtrennen des gebundenen Mittels, das die Bindungen lockert von dem Adsorbens und

c) Bestimmung des an das Adsorbens gebundenen HB_S-Antigens, vorzugsweise nach den oben beschriebenen Verfahren.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. Dabei ist

F i g. 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielhaft zum Nachweis eines Antigens (Ag):

Fig.2 eine auseinandergezogene, perspektivische

Ansicht eines säulenförmigen Prüfmittels, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, und

F i g. 3 eine graphische Darstellung der Affinität verschiedener Adsorbentien für H B,-Antigen unter verschiedenen pH-Bedingungen.

Der bevorzugte Mechanismus, nach dem das erfindungs»jemäBe Verfahren durchgeführt werden kann, ist scheinitisch in F i g. 1 der Zeichnungen dargestellt. Diese Figur bezieht sich nur beispielhaft auf den Nachweis (bzw. Bestimmung) eines Antigens (Ag) unter Anwendung eines markierten Antikörpers (Ab*). Die in dem Diagramm angegebene physikalische Form des Ionenaustauschers (Ad) ist nur illustrativ, da er eine Vielzahl verschiedener Formen annehmen kann, wie später näher erläutert wird.

Entsprechend F i g. 1 wird eine Probe, von der angenommen wird, daß sie ein interessierendes Antigen (Ag) enthalt, mit dem Ionenaustauscher (Ad) zusammengebracht, wie durch die Stufen a) und b) angegeben ist. Ein Anteil des in der Probe enthaltenen Antigens wird an diesen gebunden. Dann wird ein Oberschuß an markiertem Aniikörper (Ab*) mit dem Ionenaustauscher zusammengebracht, wie durch die Stufen c) und d) angegeben ist, wobei eine Verbindung (Assoziation) des markierten Antikörpers mit den Ionenaustauscher durch Bindung an das adsorbierte Antigen eintritt. Wie in Stufe e) angegeben, wird der Überschuß an markiertem Antikörper von dem Ionenaustauscher abgetrennt, wobei die Menge an markiertem Antikörper, die daran gebunden bleibt, eine direkte Funktion der Antigenmeiige ist, die in der zu untersuchenden Menge vorhanden war. Dieses Verfahren kann auch zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Antikörpern angewandt werden, wobei anstelle des markierten Antikörpers in den Stufen c) bis e) ein markiertes Antigen verwendet wird und entsprechende ionenaustauscher und Bestimmungsbedingungen ausgewählt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß die nachzuweisende Substanz einen isoelektrischen Punkt (pl-Wert) besitzen, der sich von demjenigen des markierten spezifischen Bindungspartners unterscheidet.

ionisch ist, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz größer ist als derjenige des markierten Bindungspartners und die Bestimmung unter pH-Bedingungen durchführt zwischen den pl-Werten der zu be- > stimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners.

Im folgenden sind verschiedene lonenaustauschermaterialien angegeben, die erfindungsgemäß angewandt werden können.

Anionenaustauschermaterialien

Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-cellulose ζ. B. Whatman Arten DE-1®, Flocken ι, DE-11®, Pulver

DE-22* Fasern DE-23®, Fasern DE-32®, trocken, mikrokörnig DE-52® naß, mikrokörnig :o DE-81®, Papier

r. B. Bio-Rad Art Cellex® D, faserig

Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-agarose z. B. Bio-Rad Art DEAE Biogel® A

r> Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-dextran

z. B. Pharmacia Art DEAE Sephadex®, Perlen

Aminohexyl-Sepharose® 4B (Pharmacia)

ECTEOLA-cellulose in ζ. Β. Whatman Arten

ET· 11«, Pulver

ET-41®, Pulver (hohe Reinheit) ET-81®. Papier z. B. Bio-Rad Art Cellex® E, Fasern

Triäthylaminoäthyl-(TEA2)-cellulose z. B. Bio-Rad Art Cellex® T, Fasern

Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-amino-(QAE)-cellulose z. B. Bio-Rad Art Cellex® QAE. Fasern

Diäthyl-(2-hydroxypropy')-amino-(QAE)-dextran z. B. Pharmacia Art QAE-Sephadex®

stimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners sollte üblicherweise mindestens 0,5 und vorzugsweise mehr als 2,0 betragen. Der isoelektrische Punkt einer Substanz ist der pH-Wert, bei dem die Substanz keine nach außen wirksame elektrische Ladung besitzt In Lösung hängt die wirksame Ladung einer solchen Substanz von dem pH-Wert der Umgebung ab. In einer Lösung mit einem pH-Wert oberhalb des pl-Wertes einer Substanz nimmt eine derartige Substanz eine negative Ladung an. Umgekehrt nimmt eine solche Substanz insgesamt eine positive Ladung an in einer Lösung mit einem pH-Wert unter dem pl-Wert Die geladene Substanz in Lösung besitzt eine Affinität für ein lonenaustauschermaterial, das die entgegengesetzte Ladung trägt So wird eine negativ geladene Substanz von einem Anionenaustauschermaterial angezogen und eine positiv geladene Substanz von einem KationenaustauschermateriaL Daher wird bei Durchführung des erfindungsgemäßens Verfahrens die zu bestimmende Substanz von einem lonenaustauschermaterial adsorbiert, während der markierte Bindungspartner nicht adsorbiert wird, wenn man ein lonenaustauschermaterial auswählt, das (i) anionisch ist wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz niedriger ist als derjenige des markierten Bindungspartners oder (ii) kat-

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z. B. Bio-Rad Art Cellex® BD, Fasern

Kationenaustauschermaterialien

Cellulosephosphat

z. B. Whatman Arten P-1®, Flocken P-11®, Pulver

P-41®, Pulver (hohe Reinheit) P-81®, Papier

Cartxjxymethyl-cellulose z. B. Whatman Arten

CM-1®, Flocken

CM-Il* Pulver

CM-22», Fasern

CM-23» Fasern

CM-32® trocken, mikrokörnig

CM-52®, naß, mikrokörnig

CM-82·, Papier z. B. Bio-Rad Art Cellex® CM, Fasern

Carboxymethyl-dextran

z. B. Pharmacia Art CM-Sephadex®

Phosphoryl-cellulose

z. B. Bio-Rad Art Cellex® P. Fasern

ίο

Carboxymethyl-agarose

ζ. B. Bio-Rad Art CM Biogel® A

z. B. Pharmacia Art CH-Sepharose® 4B

Sulfopropyl-dextran

z. B. PharnVcia Art SP-Sephadex®

Eine Tabelle, die verschiedene Paare von spezifisch bindenden Substanzen mit unterschiedlichen pl-Werten auf zählt, ist im folgenden angegeben.

Rr'le Substanz	Pl	Zweite Substanz	Pl
HB,-Antigen	3.5-5	Anti-HB,	7-8
Thyroxin-bindendes Globulin	4.5	Anti-TBG	7-8
(TBG)
Albumin	4.5	Anti-Albumin	7-8
IgG	7-8	Carbamyliertes Anti-IgG	5
Thyroid-stimulierendes Hormon	9.5	Carbamyliertes Anti-TSH	")
(TSH)
F'errilin	5.4	Anti-Ferritin	7-8
Alkalische Phosphatase (AP)	4J-5	Anti-AP	7-8
F-'ibrinogen	5.5	Anti-Fibrinogen	7-8
F-ollikel-stimulierendcs Hormon	3.0	Anti-FSH	7-8
(FSH)
Insulin	5.6	Anti-Insulin	7-8
l.ysozym	10-11	Anti-Lysozym	7-8
Plasminogen	6.5-8	Carbamyliertes Anti-Plasminogen	5
Prothrombin	4.6	Anti-Prothrombin	7-8
Thyroglobulin	4.5	Anti-Thyroglobulin	7-8
Transcobalamin	6.2	Anti-Transcobalamin	7-8
Thyroxin	7.5	Thyroxin-bindendes	4.5
		Globulin (TBG) oder
		Anti-Thyroxin	7-8
l.uteinisierendes Hormon (L.Hl	5	Anti-LH	7-8

Das erfindungsgerrtäße Verfahren ist anwendbar auf den Nachweis bzw. die Bestimmung der ersten und/ oder zweiten Substanz durch entsprechende Auswahl von anionischen bzw. kationischen Ionenaustauschermaterialien nach den oben angegebenen Richtlinien.

Der Ionenaustauscher kann irgendeine physikalische

Austauscherstellen und den entsprechenden nichtspezifischen Bindungsstellen der nachzuweisenden Substanz erlaubt und die ferner eine Wechselwirkung der adsorbierten zu bestimmenden Substanz mit dem markierten Bindungspartner ermöglicht. Er kann eine Vielzahl von Formen von festen unlöslichen Materialien, üblicherweise polymerer Natur, annehmen. Teilchen, wie z. B. Pulver, Perlen, Fäden und Kristalle, sind bevorzugt aufgrund der verhältnismäßig großen verfügbaren Oberfläche. Es können jedoch auch Schwämme, Folien, Streifen, Kissen u. a. Matrizes und Gitterstrukturen angewandt werden, und die Bestimmung kann auch in einem Gefäß, wie einem Reagenzglas oder auf einer Tüpfelplatte durchgeführt werden, wobei das Gefäß oder die Platte ganz oder teilweise aus dem Ionenaustauscher besteht Neben der großen Oberfläche kann ein teilchenförmiges Produkt bequem in ein Reaktionsgefäß oder eine Reaktionskammer eingebracht werden und leicht in einer Säule, durch die die Reagentien hindurchfließen, angewandt werden.

Ein Beispiel für ein säulenförmiges Prüfmittel, wie es erfindungsgemäß bevorzugt angewandt wird, ist in F i g. 2 der Zeichnungen angegeben. Dieses säulenförmige Prüfmittel umfaßt einen zylindrischen rohrförmigen Körper 11, der an einem Ende eine konische Spitze

12 besitzt. Der Körper besteht aus Polypropylen oder einem anderen geeigneten Material und ist mit Ventilen (Verschlußvorrichtungen) versehen, wie einer Kappe

13 am unteren Ende, die über den Spitzenbereich 12 paßt und diesen verschließt. Ein Bett 14 aus dem lonenaustauschermaterial in Teilchenform, wir»' zwischen

ark tζ ImH Ift im linieren -

Teil des Körpers 11 festgehalten. Oberhalb der Scheibe

15 ist in dem Körper 11 ein Reservoir 17 vorgesehen. In F i g. 2 ist eine Menge eines flüssigen Puffers innerhalb des Reservoirs 17 angegeben. Eine abnehmbare obere Kappe 18 ist vorgesehen, um das obere Ende des Körpers 11 abzuschließen, wobei man eine integrale.

ίο geschlossene Einheit für den Versand und die Lagerung erhält. Das Volumen des gepackten Bettes beträgt vorzugsweise zwischen 0,25 und 2,0 ml. Der Körper 11 besitzt vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 5 und 30 mm und eine Höhe zwischen 50 und 150 mm.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, daß der Ionenaustauscher mit der zu untei-suchenden Probe in Berührung gebracht, von nichtadsprbierten Teilen der Probe abgetrennt und dann mit dem markierten Bindungspartner in Berüh rung gebracht wird. Das Abtrennen der nichtadsor- bierten Teile der Probe von den am Ionenaustauscher adsorbierten stellt eine Entfernung von möglicherweise störenden Substanzen aus der Probe sicher, die, wenn sie während des Zusammenbringens mit dem markier ten Bindungspartner in der Probe blieben, die Reprodu zierbarkeit negativ beeinflussen könnten, indem sie zu einer unspezifischen Bindung der markierten Substanz führen wurden oder auf andere Weise. Diese Abtren-

nung wird bequemerweise erreicht durch Waschen des lonenaustauscherharzes mit einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen den pl-Werten der zu bestimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners.

Die Bestimmung der Menge an markierter Substanz, die entweder (i) mit dem Ionenaustauscher verbunden ist durch Bindung des markierten Bindungspartners an die adsorbierte zu bestimmende Substanz oder (ii) nicht mit dem Ionenaustauscher verbunden ist, kann auf zwei verschiedene Arten erreicht werden. Erstens kann, wenn die Bindung des markierten Bindungspartners an die adsorbierte zu bestimmende Substanz meßbare Eigenschaften der Markierungssubstanz meßbar ändert, das Ausmaß der Änderung dieser Eigenschaft direkt in dem Gemisch bestimmt werden, das bei Zugabe des ii markierten Bindungspartners zu dem Ionenaustauscher entsteht, und zwar im wesentlichen entsprechend der »homogenen« Bindungsbestimmung, wobei die »gebundene« von der »freien« Form der Markierungssubstanz nicht getrennt werden muß. Eine soiche Situation kann auftreten, wenn die Markierungssubstanz ein Enzym oder Coenzym oder eine andere Substanz ist, die überwachbare Eigenschaften besitzt und die Bindung des markierten Bindungspartners und der adsorbierten zu bestimmenden Substanz, entweder durch Hemmung oder durch Verstärkung die enzymatische oder coenzymatische Aktivität oder eine andere Eigenschaft der Markierungssubstanz beeinflußt.

Bei der zweiten Arbeitsweise wird die Trennung zwischen dem Ionenaustauscher unc ^!m wesentlichen dem )o gesamten, nicht mit ihm über Bindungen mit der adsorbierten zu bestimmenden substanzverbundenen markierten Bindungspartner durchgeführt und die Menge oder eine veränderliche Eigenschaft der Markierungssubstanz entweder in Verbindung mit dem Ionenaus- s> tauscher oder in der abgetrennten Menge bestimmt. Dieses Verfahren ist erforderlich, wenn die Markierungssubstanz durch die Bindung zwischen dem markierten Bindungspartner und der zu bestimmenden adsorbierten Substanz nicht beeinflußt wird. Es kann jedoch auch angewandt werden, wenn Eigenschaften der Markierungssubstanz angegriffen werden. Beispiele für dip pr«tp Art von Markipnina Hip hpcnnHprc für riac

erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, sind radioaktive Substanzen, wie ³H, ¹³¹J und ¹²⁵J. Es kann jedoch irgendeine der bekannten Markierungssubstanzen angewandt werden, wie sie üblicherweise bei Bindungsbestimmungen angewandt werden. Die bei diesem Verfahren erforderliche Abtrennung wird beqüemerweise durchgeführt, indem man den Ionenaustauscher wie in oben angegeben wäscht. Die Menge an Markierungssubstanz, die mit dem gewaschenen Ionenaustauscher verbunden bleibt oder in den Waschflüssigkeiten enthalten ist, kann in Zusammenhang gebracht werden mit dem Vorhandensein oder der Menge der zu bestimmenden Substanz in der untersuchten Probe durch einen Vergleich mit einer negativen Probe bzw. einer Standardkurve. Es können auch andere Verfahren angewandt werden, um die gewünschte Trennung zu erzielen, wie ein Zentrifugieren oder Filtrieren. ω

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HB₅) in flüssigen Proben, wie Serum oder Plasma. Der pl-Wert für HBs-Antigen fällt grob gesagt in den Bereich von 3,5 bis 5 und liegt für Anti- HB₅ etwa bei 8. Die Bestimmungsbedingungen werden daher so gewählt, daß ein pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6 und 8 angewandt wird und ein Ionenaustauschermaterial als Adsorbens verwendet wird. Geeignete lonenaustauschermaterialien sind u. a. diäthylaminoäthylsubstituierte Polymere, besonders solche mit einem Polysaccharid- z. B. Cellulose- oder Dextran-Rückgrat. DEAE-Cellulose ist besonders geeignet als Adsorbens für ΗΒ,-Antigen. Es wird auch i:, Betracht gezogen, daß ein Kationenaustauscliermaterial, wie Carboxymethylcellulose, als Adsorbens angewandt werden kann, wenn der pl-Wert des markierten Anti-HB, auf einen Wert unter demjenigen von ΗΒ,-Antigen verändert würde.

Ein besonders günstiges Verfahren zum Nachweis von ΗΒ,-Antigen in einer Serum- oder Plasmaprobe mit Hilfe eines Anionenaustauschermaterials in TeilchenfüiTn in einer Säule umfaßt die folgenden Stufen:

a) Einbringen der Probe in eine Säule, enthaltend ein Anionenaustauschermaterial in Teilchenform, das in einer Flüssigkeit wie einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 5 und R. vnryiigswpisp 7wi«ch^pn 6,5 und 7,5 äquilibriert ist.

b) Durchleiten einer Flüssigkeit, wie eines Puffers mit einem pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 durch die Säule, um im wesentlichen das Ganze nicht an das Anionenaustauschermaterial adsorbierte ΗΒ,-Antigen zu entfernen;

c) Zugabe eines vorher bestimmten Volumens einer Lösung von radioaktivmarkiertem Anti-HB, mit einer vorbestimmten Radioaktivität zu dem Anionenaustauschermaterial;

d) Inkubieren der Lösung aus radioaktivmarkiertem Anti-HBs im Kontakt mit dem Anionenaustauschermaterial. und zwar 0,5 bis 18, vorzugsweise 1 bis 3 h bei einer Temperatur zwischen 4 und 50° C, vorzugsweise zwischen 40 und 50°C;

e) Durchleiten einer Flüssigkeit, wie eines Puffers mit einem pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 durch die Säule, um im wesentlichen das gesamte, nicht mit dem Anionenaustauschermaterial über Bindungen an adsorbiertes ΗΒ,-Antigen verbundene radioaktiv markierte Anti-HB, zu entfernen;

t) iviessung der Radioaktivität des Anionenaustauschermaterials oder des Eluats aus der virigen Stufe und

g) Vergleich der gemessenen Radioaktivität in der vorigen Stufe mit derjenigen, die nach dem gleichen Verfahren gemessen worden ist unter Verwendung einer flüssigen Probe, enthaltend keine nennenswerten Mengen an HB_S-Antigen anstelle der Serum- oder Plasmaprobe.

Beispiele für Puffer, wie sie in den Stufen a), b) und e) angewandt werden können, sind Phosphatpuffer, Barbitalpuffer, Citratpuffer, Tris-(hydroxymethy!)-aminomethan-{TRIS)-Puffer, 4-{2-Hydroxyäthyl)-l -piperazinäthansulfonsäure(HEPES)-Puffer und 1,4-Piperazin-bis-(äthansulfonsäureXPIPES)-Puffer.

Die speziellen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von HB_S-Antigen gegenüber bekannten Verfahren umfassen die Herstellungsvorteile, indem kein unlöslich gemachtes AnO-HB₅ erforderlich ist, das ein wesentlicher Kosten- und Stabilitätsfaktor bei den meisten bekannten Verfahren ist und die Anwendungsvorteile, daß nur eine einzige Inkubationsstufe und weniger einzelne Verfahrensschritte notwendig sind, die Ionenaustauscher besser lagerfähig sind, die Empfindlichkeit erhöht wird und das Verfahren

auch zum Nachweis von HB_S-Antigen in Form seines Immunkomplexes geeignet ist

Neben dem Nachweis von ΗΒ,-Antigen kann das erfindungsgemäße Verfahren leicht angewandt werden (geeignet gemacht werden) zum Nachweis von HBs-Antigen in Form seines Immunkomplexes mit Anti-HBs und auf den Nachweis von Anti-HB_S selbst.

Der Nachweis von HB_S-Antigen, das an Anti-HB_S gebunden ist, d. h. in Form des Immunkomplexes vorliegt, wird folgendermaßen durchgeführt:

a) Zusammengeben der zu untersuchenden Probe eines die immunochemische Bindung schwächenden Mittels (»Lockerungsmittel«) und eines festen Ionenaustauschers, der imstande ist unter entsprechenden, dafür günstigen Bedingungen, das HBs Antigen unspezifisch zu binden;

b) Abtrennung des gebundenen »Lockerungsmittels« von dem Ionenaustauscher, z. B. durch Waschen und

c) Bestimmung des HB₅-.Antigens, das an dem Ionenaustauscher gebunden ist

Unter einem die »immunochemische Bindung schwächenden bzw. Lockerungsmittel« ist eine Substanz zu versehen, die imstande ist, die Affinität von Anti-HB_S gegenüber HB₅-Antigen in Gegenwart des Adsorbens herabzusetzen, so daß mindestens eine antigene Determinante an dem H B₅-Antigen verfügbar ist nach Abtrennen des gebundenen, die Bindung schwächenden Mittels vor dem Ionenaustauscher. Ein solches die Bindung schwächendes Mittel kann eine Säure oder ein Alkali oder eine andere Substanz sein, die für diesen Zweck bekannt ist wie solche, die als »Chaotrope Mittel« bezeichnet werden, z. B. Harnstoff, Guanidin oder Thiocyanat (Immunochem. 1:289—293 (1964), Biochem. Biophys. Acta 107: 593—596 (1965) und Arch. Biochem. Biophys. 116:82—91 (1966)). Die Anwendung eines Ionenaustauschermaterials wie DEAE-Cellulose und einer Harnstofflösung, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 2 und 8 m, ist besonders wirksam für dieses Verfahren zum Nachweis des HB_S-Antigen-Immunkomplexes. Die an den Ionenaustauscher gebundene Menge an H B_s-Antigen kann nach irgendeinem bekannten Verfahren bestimmt werden. Sie wird jedoch vorzugsweise bestimmt durch Zugabe von markiertem Anti-HB, und Messung der Menge an Markierungssubstanz, die mit dem Ionenaustauscher verbunden wird, wie oben beim Nachweis von ΗΒ,-Antigen angegeben.

Anti-HBs kann entsprechend dem oben angegebenen, allgemeinen Verfahren bestimmt werden, d.h. indem man die zu untersuchende Probe mit einem Ionenaustauscher zusammenbringt, anschließend mit markiertem HBs-Antigen und die Menge an Markierungssubstanz bestimmt die entweder mit dem Ionenaustauscher verbunden wird oder in freier Form vorliegt.

Im allgemeinen umfassen die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen PrUfmittel — üblicherweise in Form eines Testsystems oder einer Analyseneinheit - ä) einen festen Ionenaustauscher der imstande ist, unspezifisch mit der zu bestimmenden Substanz Bindungen einzugehen und b) eine markierte Form eines spezifischen Bindungspartners zu der zu bestimmenden Substanz. Das Prüfmittel kann zusätzlich einen flüssigen Puffer zur Durchführung von einem oder mehreren Waschschritten enthalten, wie sie bei der Durchführung des Bestimmungsverfahrens bevorzugt sind. Die Art des Ionenaustauschers, der Charakter, d. h. pH-Wert des Puffers und die Art der Markierungssubstanz werden nach den oben im Zus&mmenhang mit den Bestimmungsverfahreri diskutierten Kriterien ausgewählt Wenn das Prüfmittel zum Nachweis von HBs-Antigen-ImmunkompIex angewandt werden soll, enthält es zusätzlich eine Lösung des entsprechenden Mittels, das die immunochemische Bindung lockert

ίο Der Ionenaustauscher befindet sich vorzugsweise in einer Säule und liegt dort vorzugsweise in Form einzelner Teilchen vor, wie oben näher erläutert Die Säule ergibt nicht nur ein bequemes System zum Zugeben der Probe und des markierten Bindungspartners zu dem Ionenaustauscher, zum Waschen und zur Messung der Radioaktivität wenn die Markierungssubstanz eine radioaktive Substanz ist, sondern auch eine Möglichkeit die zu bestimmende Substanz aus der Probe in dem Prüfmittel zu konzentrieren. Die Säule ermöglicht es, ein verhältnismäßig großes Volumen der Probe durch den Ionenaustauscher hindurch oder an ihm vorbeizuleiten, wodurch die zu bestimmende Substanz im Verhältnis zu einem später aufzubringenden, markierten Bindungspartner wirksam konzen- triert wird.

Zusätzlich kann die wirksame Konzentration an zu bestimmender Substanz erhöht werden, indem man die Probe zunächst zur Ausfällung der zu bestimmenden Substanz behandelt den Niederschlag gewinnt und erneut in einem kleineren Volumen Lösungsmittel löst Die entstehende Lösung der zu bestimmenden Substanz kann dann auf dem Ionenaustauscher aufgebracht werden und das Bestimmungsverfahren, wie oben angegeben, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann man zum Nachweis von ΗΒ,-Antigen Polyäthylenglykol zu einer Serumprobe geben, um HB,-Antigen auszufällen, dieses Gemisch zentrifugieren oder filtrieren und das HBs-Antigen in einem kleinen Volumen Puffer lösen. Die entstehende Lösung enthält eine wesentlich höhere Konzentration an H B₅-Antigen als in der ursprünglichen Serumprobe vorhanden war.

Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann angewandt werden für den qualitativen Nachweis oder die quantitative Bestimmung irgendeiner Substanz, für die ein natürlicher oder synthetischer spezifischer Bindungspartner existiert, z. B. Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Glykoproteine, Steroide, antigene Teilchen usw. Zum Beispiel können die folgenden Substanzen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Bestimmungs- Verfahrens und Prüfmittels nachgewiesen bzw. bestimmt werden: Hormone, wie Tetrajodthyronin (Thyroxin) und Trijodthyronin; Enzyme, wie Milchsäuredehydrogenase und alkalische Phosphatase; therapeutische Mittel, wie Gentamicin und Diphenylhydan- toin, Virusteilchen, wie HBs-Antigen und Bakteriophagen; ganze Bakterienzellen und Nucleinsäuren, wie Desoxyribonucleinsäure (DNS) und Ribonucleinsäure (RNS), um nur einige wenige zu nennen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zum Nachweis und zur Bestimmung von Antigenen und Haptenen und deren Antikörpern, besonders ΗΒ,-Antigen und Anti-HB,. Verschiedene flüssige Proben können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden, besonders physiologische oder biologische Flüssigkeiten, wie Sera, Plasma, Urin, Speichel und amniotische, Cerebral- und Spinalflüssigkeiten.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Radioimmunologische Adsorbtionsbestimmung (RI-AdTM) für Hepatitis-B-Oberflächenantigen

Dieses Beispiel beschreibt ein Bestimmungsverfahren zum Nachweis von HB_S-Antigen mit Hilfe eines Ionenaustauschermaterials als unspezifisches Adsorbens. Die Genauigkeit des RI-Ad-Verfahrens wurde gegenüber dem United States Bureau of Biologies (BOB) Reference Panel Nr. 3 nachgewiesen. Die Empfindlichkeit des to RI-Ad-Verfahrens wurde bestimmt gegenüber dem »Ausria¹⁸ II radioimmunoassay test kit« der Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois ILSA.

A. Herstellung der Säulen

Die Säulen bestanden aus 0,5 ml abgesetztem Ionenaustauscherharz, DEAE-Cellulose Typ DE-52 (Whatman Inc, Clifton, New Jersey U.SA.), das zwischen zwei porösen Polyäthylenscheiben in einer Polyäthylensäule von 9,5 χ 75 mm festgehalten wurde. Die Säulen waren am oberen und unteren Ende mit Kappen verschlossen, nachdem sie mit einem Volumen 0,02 m einbasischem Natriumphosphat: zweibasischem Natriumphosphat-Puffer (im folgenden als »Phosphatpuffer« bezeichnet) bei pH 6,8 äquilibriert worden waren. Das Puffervolumen reichte aus, um das Harzbett zu sättigen und ungefähr 1 ml Puffer in dem Reservoir über dem Bett zu ergeben. Die Geometrie der Säule war so gewählt, daß die Messung der von dem Harzbett abgegebenen Strahlung leicht mit üblichen Gammastrahlen-Zählvorrichtungen (wie dem Gammacord der Arnes Company Division der Miles Laboratories, Ina, Elkhart, Indiana USA.) gemessen werden konnte. Die allgemeine Form der vollständigen Testsäule war ähnlich der in F i g. 2 der Abbildungen angegebenen.

B. Bestimmungsverfahren

1. Die obere Kappe wurde entfernt und die Säule in ein Gestell zum Ablaufen gegeben;

2. 200 μΙ der zu untersuchenden Serum- oder Plasmaprobe oder einer negativen Vergleichsprobe wurden zu dem Puffer in dem Reservoir über dem DEAE-Cellulose-Harz-Bett gegeben. Die Säule wurde leicht geschüttelt, um die Probe und den Puffer zu vermischen und dann durch Entfernen der unteren Kappe die Flüssigkeit abgezogen;

3. Das Harzbett wurde nacheinander mit zweimal je 4 ml 0,02 m Phosphatpuffer (pH 6,8) gewaschen;

4. Nach vollständigem Ablaufen wurden 200 μΙ so ¹²⁵J-AMi-HB₅ (spezifische Aktivität des markierten Anti-HB,= 14—20 μθ\/μξ (Gesamtaktivität = ungefähr 50 000 Zählung pro Minute (cpm)) auf das obere Ende des Harzbettes gegeben und konnten nach erneutem Aufsetzen der Bodenkappe in das Harz eindringen. (Das angewandte Anti-HB, war gebildet worden gegen ΗΒ,-Antigen und gereinigt nach dem Verfahren von Ling und Overby, J. Immunol. 109: 834 (1972) und markiert nach dem Chloramin-T-Verfahren nach Hunter und Greenwood, Nature 194:495(1962));

5. Die Säule wurde dann entweder (i) zwei Stunden bei 45° C inkubiert (»2 h/45°C«-Bestimmung) oder (ii) über Nacht bei Raumtemperatur, d.h. 22"C, inkubiert (»Übernacht/RT«-Bestimmung);

6. Die untere Kappe wurde entfernt und das Harzbett nacheinander mit zweimal 4 ml 0,02 m Phosphatpuffer (pH 6,8) gewaschen;

7, Nachdem die Säule vollständig abgelaufen war, wurde die Bodenkappe erneut aufgesetzt und die Säule in die öffnung eines Gammazählgerätes, wie des obengenannten Gammacord, gegeben und die Radioaktivität gezählt (bei einem alternativen Verfahren wurden die Waschflüssigkeiten der obigen Stufe 6) gesammelt und ihre Gesamtradioaktivität gemessen;

8. Eine positive Probe wurde bestimmt als eine solche, die eine Radioaktivität des Harzbettes von mehr als (oder eine Radioaktivität der Waschflüssigkeiten von weniger als) dem Bezugswert ergab, der als Mittel der Zählungen der Gammastrahlung des Harzbettes (cpm, gebunden) (oder der Waschflüssigkeitec bei dem Alternativerfahren) aus mindestens 7 Versuchen einer negativen Vergleichsprobe plus (oder minus bei dem Alteraatiwerfahren) der vierfachen Standardabweichung berechnet worden war. Ein Beispiel für eine Berechnung eines Bezugswertes, bei dem die Radioaktivität des Harzbettes gemessen wurde, ist folgende:

Es wurden sieben Parallelproben eines negativen Vergleichs getrennt nach dem Bestimmungsverfahren untersucht und die Zählungen pro Minute (cpm) an radioaktiver Strahlung in dem Harzbett (cpm, gebunden) für jeden Ansatz notiert

Ansatz Nr.	cpm gebunden
1	1459
2	1488
3	1398
4	1444
5	1543
6	1487
7	1387

Gesamt 10 206 Mittel 1458

Standard-Abweichung ± 54 Bezugswert (cut-off) 1 458+(4 χ 54) = 1 678

Daher ist jede untersuchte Probe mit cpm gebunden, > 1678 als positiv für ΗΒ,-Antigen anzusehen.

C. Genauigkeit Durchführung mit dem BOB-Panel

Jede BOB-Panel-Probe wurde nach dem 2h/45°C und Über-Nacht/RT-Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. In der Tabelle stehen die BOB-Codes für die folgenden Bedeutungen.

_;5 BOB-Code Bedeutung

A Enthält verhältnismäßig viel HB_S-Antigen,

das nach allen gängigen Methoden nachweisbar ist.

Enthält weniger ΗΒ,-Antigen, nachweisbar durch Gegenelektrophorese, umgekehrte passive Latexagglutination, umgekehrte passive Hämagglutination und radioimmunologische Bestimmung. Enthält noch weniger ΗΒ,-Antigen, nachweisbar zuverlässig nur durch umgekehrte passive Hämagglutination und radioimmunologische Bestimmung.

Fortsetzung

17

BOB-CocJe Bedeutung

(C) Enthält wenig HB_S-Antigen, gelegentlich

nachweisbar durch radioimmunologische Bestimmung.

D Enthält sehr wenig HB₅-Antigen, nach

gängigen Verfahren nicht nachweisbar.

N Enthält tatsächlich kein HB₅-Antigen.

Die Berechnungen der Bezugswerte für die 2 h/45°C und Ober-Nacht/RT-Verfaliren ergaben folgende Werte: 18

Bezugswertberechnung

2 h/45" C Über-Nacht/RT

Mittel der cpm 3374 5404

gebunden für die negativen Vergleichsansätze

Standardabweichung ±117 ±123

(S.D.)

Prozentualer Variations- 3,46 2^7

koeffizient (% CV.) Bezugswert (cpm) 3842 5896

Tabelle

Proben-Nummer

BOB Code

302 303 304 306 311 312 315 317 318 319 320 323 326 327 330 331 332 333 336 337 338 343 344 349 350

(C)

Cpm (2 h/45°C)	Probe-CO·)
Probe	Neg
3 403	Neg
3 481	+ 4318
8 160	+ 18 535
22 377	Neg
3 680	+ 17 280
21 122	Neg
3 411	Neg
3 325	+ 17 738
21570	+ 14 536
18 378	+20 888
24 730	+ 1 727
5 569	+ 14 747
18 589	+ 23 934
2 776	+ 17518
21 360	Neg
3 182	+ 6 151
9 993	+ 6 049
9 891	+ 17 629
21471	+ 15 882
19 724	+ 951
4 793	+ 754
4 606	+ 546
4 388	Neg
3 625	+ 18 423
22 265

Cpm (über Nacht/RT)

Probe Prcbe-CO»)

4 960 4 478

12 100 24 197

4 202

24 095

5 853 4 970

25 880

22 731 30 057

7 721 21 773 32 403 25 155

4 838 16 709

13 684 29 233

23 139

6 672 6 236 6 939 6 446

28 162

Neg Neg + 6 + 18 Neg + 18 Neg Neg + 19 + 16 + 24 + 1 + 15 + 26 + 19 Neg + 10813 + 7 + 23 + 17 + + I + 1 + + 22

*) cpm gebunden der Probe minus Bezugswert (CO).

Das Rl-Ad-Verfahren gab bei beiden Inkubationsbedingungen korrekt jede BOB-Panel-Probe mit einem Code von A, B oder C wieder. Es traten keine falschen positiven Werte auf, da jede als N bezeichnete BOB-Panel-Probe ein negatives Ergebnis lieferte. Weiter stellte sich die BOB-Panel-Probe Nr. 343, die als (C) bezeichnet war, nach dem Rl-Ad-Verfahren bei beiden Inkubationsbedingungen als positiv heraus und selbst eine als D bezeichnete Panel-Probe, nämlich die Nr. 349, ergab bei dem Über-Nacht/RT-Verfahren einen positiven Wert.

D. Empfindlichkeit Vergleich mit Ausria Il

Drei positive BOB-Panel-Proben (Proben 312, und 336) und eine negative Probe (317) wurden ausgewählt. Es wurden jeweils Verdünnungen zwischen 1 :50 und 1 :64 000 hergestellt. Die ausgewählten Verdünnun gen wurden nach dem Rl-Ad-Verfahren unter beiden Inkubationsbedingungen, d.h. 2h/45"C und Über-Nacht/RT (ON) untersucht mit Hilfe von Ausria-II-kits (Abott Laboratories, North Chicago, Illinois U.S.A.) nach dem in dem Produktprospekt angegebenen Ver fahren (der Prospekt gibt an, daß ein »P/N-Verhältnis« von 2,1 oder darüber ein positives Ergebnis bedeutet). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Die Berechnungen der positiven Bezugswerte für das Rl-Ad-Verfahren sind am Ende der Tabelle angegeben. »N.C.«

μ bedeutet das Mittel für cpm gebunden für die negativen Vergleichsansätze·, »S.D.« Standardabweichung und »% C.V.« prozentualer Variationskoeffizient. Das Rl-Ad-Verfahren erwies sich unter beiden Inku-

bationsbedingwngen als mindestens ebenso empfindlich wie das Ausria Η-Verfahren und unter bestimmten Umständen zeigt es eine größere Empfindlichkeit, Zum Beispiel wurde die 1; 64 000 Verdünnung der Panel

Nr, 312 (Code A) mit Hilfe des 2 h RI-Ad-Verfahrens als positiv, aber nach dem Ausria JI-Verfahren als negativ bewertet

Tabelle 2

Verdünnung	BOB #312 (A)	O. N.	Ausria Il P/KI	BOB#326(C)	O. N.	Ausria Il P/N	BOB #336 (B)	O. N.	Ausria Il p/N	BOB#3I7(N)	O. N-.
	Rl-Ad, cpm		rVIN Ratio	RI-Ad, cpm	8235	Ratio	RI-Ad, cpm		i'li Ratio	RI-Ad, cpm
	2h	—		2h	5280	83	2h	—		2h	—
1/50		—	—	5954	5280	4,1	—	—	—		—
1/100		—	—	4454	4220	2,2	—	5352	—	—	Neg
1/100	—	—	—	4454	3719	Neg	—	4161	10,0	—	Neg
1/200	—	9385	—	3983	—	Neg	3880	—	4,8	Neg	—
1/400	—	—	583	3377	3351	—	3166	3607	-	Neg	Neg
1/500	6238	7836	—	—	—	Neg	—	—	2,5	—	—
1/800	—	—	43,7	3066	Neg	—	3090	3385	—	Neg	Neg
1/1000	6210	6590	—	—	—	Neg	—	—	Neg	—	—
1/1600	—	—	31,3	7940	Neg	—	2924	Neg	—	Neg	Neg
1/2000	5275	5346	—	—	—	Neg	—	—	Neg	—	—
1/3200	—	—	21,1	Neg	—	—	Neg	Neg	—	Neg	Neg
1/4000	4390	4288	—	—	—	Neg	—	—	Neg	—	—
1/6400	—	—	10,6	—	—	—	Neg	Neg	—	Neg	Neg
1/8000	3725	3774	—	—	—	—	—	—	Neg	—	—
1/12800	—	3459	5,7	—	—	—	Neg	—	—	Neg	—
1/16000	3349	Neg	3,0	—	—	—	—	—	—	—	—
1/32000	3102	3010	Neg	—	3010	—	—	3010	—	—	3010
1/64000	2979	±97		—	±97		—	±97		—	±97
N. C-Mittel	2571	3,2		2571	3,2		2571	3,2		2571	3,2
S.D.	±90	3398		±90	3398		±90	3398		±90	3398
% C. V.	3,5			3,5			3,5			3.5
Bezugswert	2931	2931	2931	2931

Auch die Verdünnungen 1 :200 und darüber der Panel-Probe 326 (Code C) wurden nach beiden RI-Ad-Verfahren als positiv bewertet, während mit Ausria II nur die Verdünnung von 1 :100 und darunter nachgewiesen werden konnte. Bei der gleichen Panel-Nr. ergab des RI-Ad-Verfahren bei 2 h positive Ergebnisse bis herab zu einer Verdünnung von 1 :1600 (16fach größere Empfindlichkeit als Ausria II) und das RI-Ad-Verfahren über Nacht positive Ergebnisse bis herunter zu einer Verdünnung von 1 :800 (8fach größere Empfindlichkeit als Ausria II). Außerdem erhielt man bei der Panel-Probe 356 (Code B) bei beiden RI-Ad-Verfahren positive Ergebnisse bis herunter zu der 1 :1600 Verdünnung, während positive Ergebnisse mit Ausria II bei 1 :800 aufhörten (2fach größere Empfindlichkeit als Ausria II). Alle untersuchten Verdünnungen der negativen Panel-Probe (317) erwiesen sich auch hier als negativ.

Beispiel 2

Radioimmunologische Adsorptionsbestimmung

(RI-Ad™) für Hepatitis-B-Oberflächenantigen in Form des Immunkomplexes mit dem Antikörper

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von HB,-A,t ,igen, das mit Anti-HB_S einen Kvmplex gebildet hat, d. h. in Form des Immunkomplexes vorliegt In diesem Beispiel wird die Möglichkeit HBs-Antigen in Serumproben, enthaltend Anti-HB_S, nachzuweisen sowie die Möglichkeit, HB₅ in Form seines Immunkomplexes in künstlich hergestellten Proben nachzuweisen, gezeigt

A. Herstellung der Säulen

so Die Säulen wurden entsprechend Beispiel 1 hergestellt.

B. Bestimmungsverfahren

1. Bei aufgesetzter, unterer und abgenommener oberer Kappe wurde der Phosphatpuffer aus der Säule ausgegossen und durch 1 ml 8 m Harnstofflösung in 0,02 m Phosphatpuffer (pH 6,8) ersetzt

2. 200 μΙ der zu untersuchenden Serium- oder Plasma · bo probe oder Jner negativen Vergleichsprobe wurden zu dem Harnstoff-Puffer in dem Reservoir gegeben. Die Säulen wurden leicht geschüttelt, um die Probe mit dem Puffer-Harnstoff zu vermischen und 10 min stehengelassen, bevor die Lösung durch Entfernen der unteren Kappe abgelassen wurde.

3. Nach dem Abgehen der Flüssigkeit wurde, wie in Teil B von Beispiel 1 gearbeitet, beginnend mit Stufe 3).

C. Nachweis von HB,-Antigen in Serum mit endogenem Anti-HB,

Ein negatives Vergleichsserum und ein im Handel erhältliches (comm.) Serum, enthaltend eine geringe Menge ΗΒ,-Antigen und Anti-HB„ wurden nach dem

wie oben modifizierten Rl-Ad-Verfahren mit einer Inkubation 2 h/45°C, nach dem Ausria Il-Verfahren, das in dem vorigen Beispiel erwähnt ist, und dem Ausab·- Verfahren (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois U.S.A. — radioimmunoassay for anti-HB,) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Probe

lieg.

comm. Serum

modifiziertes RI-AtI. tpin Probe ProbeCO'

J313 4574

Ncp +

*) cpm gebunden tier Probe minus Be/ugsweri.

Ausrin Il

IVN Verhältnis

N ep

Neg

Ansah

Ρ.ΙΛ Kinhcilcn

Neg 477

Die Daten zeigen, daß das modifizierte Rl-Ad-Verfahren geeignet ist, ΗΒ,-Antigen in Gegenwart von endogenem Anti-HB, (verifiziert durch die Ausab-Ergebnisse) nachzuweisen, während das Ausria Il-Verfahren hierzu nicht geeignet ist.

Um das Vorhandensein von ΗΒ,-Antigen in dem im Handel erhältlichen Serum zu bestätigen, wurde ein Zentrifugationsversuch durchgeführt. Eine Probe des im Handel erhältlichen Serums wurde in Glycinpuffer (pH 2,0) equilibriert und auf einen Saccharosegradienten von 5 bis 20 Gew.-% aufgebracht. Das Gemisch aus Probe und Gradienten wurde 3 h mit 36 000 UpM zentrifugiert. Fraktionen, die sich im unteren Teil des Zentrifugenglases befanden, erwiesen sich nach dem Ausria Il-Verfahren als HB,-Antigen positiv. Das bestätigt das Vorhandensein von ΗΒ,-Antigen in dem im Handel erhältlichen Serum und bestätigt deutlich, daß ΗΒ,-Antigen, wenn es durch Zentrifugieren von Anti-HB, abgetrennt ist, durch das Ausria Il-Verfahren nachgewiesen werden kann, während es in dem im Handel erhältlichen Serum, in

H.«m pe mit Anti-HR. pinpn Komplex gebildet hat. nicht

nachweisbar war.

D. Nachweis von ΗΒ,-Antigen in Form seines Immunkomplexes

Es wurde eine Reihe künstlicher Testproben hergestellt durch Zugabe von zunehmenden Volumina ΗΒ,-Antigen positiven Serum zu einem konstanten Volumen von Humanserum mit einem honen Anti-HB,-Titer. Die Endvolumina wurden mit normalem Serum, das sowohl in Beziehung auf ΗΒ,-Antigen als auch auf Anti-HB, negativ war, ausgeglichen. Nach 20 h langer Inkubation wurde ein eventuell entstandener Niederschlag abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit als Pi .be gewonnen. Jede dieser Proben wurde nach dem modifizierten RI-Ad-Verfahren mit 2 h/45°C Inkubation, dem Ausria Il-Verfahren und dem Ausab-Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Die »Ag/Ab-Verhältnisse« sind die Volumenverhältnisse von ΗΒ,-Antigen positivem Serum, das zu dem Volumen von Anti-HB, positivem Serum zugegeben worden war.

Mit Hilfe des modifizierten RI-Ad-Verfahrens konnte ΗΒ,-Antigen in Gegenwart von Anti-HB, bis auf den geringsten Gehalt an ΗΒ,-Antigen, der zugesetzt worden, war (Ag/Ab-Verhältnis=0,2), nachgewiesen werden. An dem Punkt, an dem Anti-HB, im Oberschuß vorlag (Ag/Ab-Verhältnis <0,4), war es mit dem Ausria Il-Verfahren nicht mehr möglich, die Gegenwart von ΗΒ,-Antigen nachzuweisen. Das Vorhandensein von Anti-HB, konnte andererseits in den Proben mit einem Ag/Ab-Verhältnis von weniger als oder gleich 1,0 mit dem Ausab-Verfahren nachgewiesen werden. Mit dem Ausab-Verfahren war es jedoch nicht möglich. Anti-HB, in Gegenwart von überschüssigem ΗΒ,-Antigen (Ag/Ab-Verhältnis >2.0) nachzuweisen.

Tabelle 4

Ag/Ab
Verhältnis (V/V)

modifiziertes Rl-Ad. cpm Probe Probe-CO*)

Ausria Il

P/ N Verhältnis

Ausab

RIA Einheiten

4.0	34 654	+ 30 755	107.4	Neg
3.0	34 348	+ 30 449	127.9	Neg
2.0	29 902	+ 26 003	1465	Neg
1.0	9 143	+ 5 272	11.3	16
0.4	5 337	+ 1 438	Neg	54x102
02	5 707	+ 1 808	Neg	512x102
0.0	3515	Neg	Neg	512 χ ΙΟ²

*) cpm gebunden der Probe minus Bezugswert.

Beispiel 3

Untersuchung der Adsorptionscharakteristika

verschiedener Anionenaustauschermaterialien für

ΗΒ,-Antigen

Die Fähigkeit der folgenden Anionenaustauschermp.Vsrialien ΗΒ,-Antigen zu adsorbieren, wurde über einen- pH-Bereich von 5,0 bis 8,0 untersucht.

(1) DEAE-Cellulose (Typ DE-52 - Whatman Inc., Clifton, New Jersey, U.S.A.)

(2) DEAE-Sephadex® (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, U.S.A.)

(3) QAE-Sephadex· (Pharmacia)

(4) DEAE-Biogel· A (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, U.S.A.)

200 μΙ Volumina ^li5J-HB,-Antigen (25 ng/ml) wurden zu jeder von mehreren Säulen, enthaltend die verschiedenen Anionenaustauschermaterialien bei verschiedenen bekannten pH-Werten zugegeben. Jede Säule wurde dann mit zweimal 4,0 ml Phosphatpuffer mit dem entsprechenden pH-Wert gewaschen. Die radioaktive Strahlung der Säulen wurde dann in einer Gammastrahlen-Zählvorrichtung gemessen. Die Ergebnisse sind graphisch in F i g. 3 angegeben.

Eine optimale Adsorption wurde für jedes der untersuchten Harze bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 beobachtet. DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex und QAE-Sephadex zeigten ähnliche maximale Adsorptionsaffinⁱ⁽äten gegenüber ΗΒ,-Antigen während DEAE-Biogel A eines etwas geringere Affinität für das Antigen besaß. Insgesamt zeigte es sich, daß DEAE-Cellulose das bevorzugte Harz für ein Säulenverfahren darstellte aufgrund seiner günstigen Durchflußgeschwindigkeit und minimalen Neigung ¹²⁵J-AnIi-HB, zu adsorbieren.

Beispiel 4

Radioimmunologische Adsorptionsbestimmung (RI-Ad™) von Hepatitis-B-Oberflächenantigen

(Alternativverfahren)

L/IC3C3 Ud3|Jli:i Ut3VI Il Lll/t f-lll al IC I I Id Il V C> rVt'/^U'

Verfahren zum Nachweis von ΗΒ,-Antigen, wobei der Waschschritt zwischen dem Aufbringen der Probe und der Zugabe von markiertem Anti-HB, weggelassen wird. Die Genauigkeit dieses alternativen Rl-Ad-Verfahrens wurde gegenüber dem BOB Reference Panel Nr. 3 (Beispiel 1) abgeschätzt.

Jede Panel-Probe wurde nach dem RI-Ad-Verfahren mit einer Inkubation von 2 h/45³ C, wie in Beispiel 1 beschrieben (unter Verwendung eines unterschiedlichen Ansatzes von ^I25|-Anti-HB_S), untersucht und nach dem gleichen Verfahren ohne die Waschstufe 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Die Berechnung

der Bezugswerte für zwei Verfahren, d. h. »mit Waschstufe« und»ohne Waschstufe« sind am Ende der Tabelle angegeben. Die Abkürzungen sind die gleichen wie in Beispiel I. Ein negatives Ergebnis, d.h. wenn cpm gebunden geringer war als der Bezugswert, ist durch ein Minuszeichen angegeben. Der Unterschied in den Daten für cpm gebunden nach diesem Beispiel unter Anwendung der Waschstufe (Tabelle 5) und den in Beispiel 1 (Tabelle 1) erhaltenen, beruht auf der Anwendung eines unterschiedlichen Ansatzes von '"J-AnIi-IIB₁.

	Tabelle 5	BOB	cpm. gebunden	ohne
	Proben	Code		Waschsuife
I ")	Nr.		mil	1784(-)
			Waschstufe	1 673 (-)
		D	I 865 (-)	3 360
	302	N	1 898 (-)	6 963
.'(I	303	C	8010	1 760 (-)
	304	A	17 136	6 933
	306	N	I 734(->	I 644 (-)
	311	A	21 200	I 734 ( - )
	312	(C)	2133(-)	8517
ι -,	315	N	1934(-)	6 600
	317	C	17 647	4 586
	318	B	19 705	2 508
	319	B	17 745	8 927
	320	C	4210	6718
IH	323	C	19 427	6 132
	326	B	20 541	I 821 (-)
	327	A	18 369	3 339
	330	N	1 876 (-)	4 371
	331	C	8 821	5 605
η	332	C	9 502	11 807
	333	B	16319	2841
	336	C	18811	2 802
	337	C	3 631	2 722
	338	(C)	3 650	2 1S2
4(1	343	C	2 894	5 251
	344	D	~i * de 1 \	1 939
	JT3	B	16 417	±98
	350		1 814	5.05
	N.C Mittel		±86	2 331
4")	S.D.		4,7
	% CV.		2 158
	Bezugswert

Diese Daten zeigen, daß das Weglassen der ersten Waschstufe keinen Einfluß hat auf die Fähigkeit des RI-Ad-Verfahrens. eine positive Probe dieser BOB Panel-Proben mit einem Code von A, B oder C nachzuweisen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

ίο 15 20 Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer spezifisch bindenden Substanz in einem flüssigen Medium, durch

a) Zusammenbringen der zu untersuchenden flüssigen Probe mit einem festen Adsorbens und mit einem spezifischen Bindungspartner zu der zu bestimmenden Substanz, wobei der Bindungspartner markiert ist und das Adsorbens mit der zu bestimmenden Substanz unspezifische Bindungen eingeht und

b) Bestimmung entweder der Menge an Markierungssubstanz, die durch Bindung an die adsorbierte zu bestimmende Substanz mit dem Adsorbens verbunden ist oder der Menge an Markierungssubstanz, die nicht mit dem Adsorbens verbilden ist

dadurch gekennzeichnet, daß man (!) einen solchen markierten Bindungspartner auswählt dessen pl-Wert von demjenigen der zu bestimmenden Substanz verschieden ist; (2) als Adsorbens ein Ionenaustauschermaterial verwendet und zwar einen Anionenaustausch^, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz niedriger liegt als derjenige des Bindungspartners, oder einen Kationenaustauscher, wenn der pl-Wert der zu bestimmenden Substanz höher liegt als der des markierten Bindungspar 'ners und (3) die Stufe (a) bei einem pH-Wert zwischen dem pl-Wert der zu bestimmenden Substanz und demjenigen ües Bindungspartners durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man Stufe (a) durchführt:, indem man (i) die Probe zuerst mit dem Adsorbens zusammenbringt und (ii) anschließend das Adsorbens mit dem markierten Bindungspartner in Berührung bringt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man zwischen den Stufen (i) und (ii) das Adsorbens von dem nicht adsorbierten Teil der flüssigen Probe abtrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorbens bei einem pH-Wert zwischen dem pl-Wert der zu bestimmenden Substanz und dem des markierten Bindungspartners wäscht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorbens im wesentlichen gleichzeitig mit der Probe und dem markierten Bindungspartner zusammenbringt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (b) zunächst den nicht über Bindungen mit der zu bestimmenden Subsianz mit dem Adsorbens verbundenen Teil des markierten Bindungspartners von dem Adsorbens abtrennt.

7. Verfahren nach Anspruch I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung eine radioaktive Markierung verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterschied zwischen den pl-Wer ten der zu bestimmenden Substanz und des markierten Bindungspartners mehr als 0,5, vorzugsweise mehr als 2.0, beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz

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