DE2907228A1

DE2907228A1 - Immunochemische bestimmung

Info

Publication number: DE2907228A1
Application number: DE19792907228
Authority: DE
Inventors: Magdalena Usategui Gomez; Richard Walter Wicks
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1978-02-27
Filing date: 1979-02-23
Publication date: 1979-09-06
Also published as: IT7920097A0; JPS54124797A; GB2015157B; CA1117414A; FR2418464B1; NL185240C; NL185240B; GB2015157A; FR2418464A1; NL7901537A; US4224406A; CH643069A5; JPS6243501B2; DE2907228C2; IT1166626B

Description

Die US-PS 4 046 634 offenbart eine Bestimmung für Isoenzyme, LDH-Isoenzyme eingeschlossen, die lonenaustauschsäulenchromatographie zum Isolieren eines Gemischs von LDH₁- und LDH--Isoenzymen anwendet, die dann nach herkömmlichen Techniken, wie der Wacker-LDH-Methode, nachgewiesen werden.

Die DE-AS 21 28 670 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Isoenzymen, LDH-Isoenzyme eingeschlossen, durch Behandeln der Testprobe mit einem großen Überschuß eines spezifischen Antikörpers entweder zum Isoenzym LDH₁ oder LDH₅ zur quantitativen Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes. Nach dem Inkubieren und Zentrifugieren des ausgefällten Komplexes wur-

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de die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit nach der in Z.Klin.Chemie und Klin.Biochemie £, 658 (1970) berichteten Methode bestimmt.

Sussman et al. haben im Journal of Biological Chemistry 243, 160 (1968) eine Bestimmung für einzelne organspezifische Isoenzyme alkalischer Humanphosphatase unter Anwendung einer zweistufigen Arbeitsweise beschrieben. In der ersten Stufe wurde der spezifische Antikörper zu dem gewünschten Isoenzym mit der Testprobe umgesetzt, und dann wurde in einer folgenden Stufe der Antikörper-Antigen-Komplex mit einem zweiten Antikörper (Anti-Y-globulin) gefällt. Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit auf restliche Isoenzymaktivität getestet.

Die Verwendung eines zweiten, auf einem festen Trägermaterial unlöslich gemachten Antikörpers bei Radioimmuntestverfahren ist in der ÜS-PS 4 048 298 beschrieben. Dazu gehört auch die Verwendung zweiter Antikörper, die an der Oberfläche polymerer, fester Trägermaterialien adsorbiert sind.

Die US-PS 3 843 443 betrifft ein Verfahren zum Unbeweglichmachen von Proteinen an einem Fluorkohlenstoffpolymerisat- . Träger. Zu den offenbarten Proteinen gehören Antikörper, und das bevorzugte polymere Trägermaterial ist Polyvinylidenfluorid (Kynar).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Testprobe, z.B. eine Serumprobe, mit einem löslichen Antikörper behandelt, der gegen die M-Untereinheit der LDH-Isoenzyme, d.h. LDH₂, LDH₃, LDH₄ und LDH₅, spezifisch ist. Nach kurzzeitigem Mischen und Inkubieren wird ein zweiter Antikörper, der an einem Festphasen-Trägermaterial unlöslich gemacht worden ist, zugegeben, und es wird gemischt und dann nochmal kurzzeitig inkubiert. Der unlösliche Antigen-Antikörper(1)-Antikörper(2)-

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Festträger-Komplex wird abzentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird auf ihre LDH-Isoenzym-Aktivität getestet. Die beobachtete Aktivität ist im wesentlichen die der LDH,-Isoenzym-Komponente der Ausgangsprobe.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat erhebliche Vorteile gegenüber bisher bei der Isoenzymbestimmung angewandten Arbeitsweisen. Es ist sehr schnell, äußerst genau und reproduzierbar. Die Herstellung der LDH- enthaltenden überstehenden Flüssigkeit kann in Minuten anstelle von mehreren Stunden,, wie bisher für immunologische Techniken erforderlich, geschehen. Zudem führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer sauberen Trennung des LDH₁ von den anderen LDH-Isoenzymen, die nach Ionenaustauschsäulen-Arbeitsweisen nicht möglich ist.

Der gegenüber der M-Untereinheit des LDH spezifische, erfindungsgemäß verwendete Antikörper ist auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. die genannte DE-AS 21 28 670. Weitere, sich auf solchen Antikörper beziehende Beschreibungen finden sich in J. S. Burd et al., Clinica Chimica Acta 4jj, 205-216 (1973) und J. S. Burd et al., Biochimica, Biophysica Acta, 310, 238-247 (1973).

Der zweite Antikörper wird durch Immunisieren eines anderen als des Tieres hergestellt, in dem der erste spezifische Anti- ζ \ körper hergestellt wird, mit einem γ-Globulin aus dem Blut der für die Herstellung des ersten Antikörpers verwendeten Wirtsart. So ist der zweite Antikörper immunoreaktiv für den ersten Antikörper und bildet mit ihm einen Komplex.

Der zweite Antikörper wird unlöslich gemacht, indem er an ein unlösliches Trägermaterial gebunden wird. Geeignete Träge rma t er ia lien sind z.B. wasserunlösliche organische polymere Substanzen, wie Cellulose oder andere Polysaccharide, ein Vinyl-Additionspolymerisat oder ein Kondensationspolymerisat oder eine wasserunlösliche anorganische Substanz polymerer

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-G-

Natur, wie Glas oder Silikonharze, oder der zweite Antikörper kann an der Oberfläche eines festen Trägers, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyfluoräthylen oder Polyvinylidenfluorid, adsorbiert werden. Die Art der Verbindung des zweiten Antikörpers mit dem festen Träger ist nicht sehr kritisch und Γ kann folgende Möglichkeiten umfassen: 1. Kovalentes Kuppeln des löslichen zweiten Antikörpers an irgendeine unlösliche Polymersubstanz, 2. überführen des löslichen zweiten Antikörpers in eine unlösliche polymere Form, wie durch Umsetzen mit einem unlöslich machenden Mittel, 3. physikalisches Einschließen von Teilchen des zweiten Antikörpers in den Poren eines Gelpolymers, wie eines vernetzten Polyacrylamid^,oder 4. physikalische Adsorption an einer unlöslichen Polymersubstanz .

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der zweite Antikörper an aktiviertes Polyvinylidenfluorid (Kynar) unter Anwendung der allgemeinen, in der US-PS 3 843 443 offenbarten Arbeitsweisen adsorbiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel weiter veranschaulicht.

Beispiel

1. Reagentien

a) Antiserum zu LDH₅: Ziegen-Anti-LDHc-Serum wird auf eine Konzentration verdünnt, die 300 bis 4001.E^l an gereinigtem LDHc-Isoenzym unter Anwendung der Fisher-Diagnostik oder äquivalenter Reagentien zur Bestimmung der LDH-Enzymaktivität bindet. Die Verdünnung des Antiserums erfolgt

in 0,02m Tris vom pH 7,5 mit 0,1 % NaN₃.

b) Unlösliches Antiserum zu Ziegen-γ-Globulin

Bei der Herstellung eines unlöslichen Antiserums zu Ziegen-

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γ-Globulin (zweiter Antikörper) werden die folgenden speziellen Schritte befolgt: Das Ausgangsmaterial· ist ungesintertes Polyvinylidenfluoridharzpulver (Kynar) _!f Qualität 301 F (der Pennwalt Corp.). Das Pulver wird in Isopropanol (2-Propanolfr in Anteilen von 50 g in 1000 ml Isopropanol dispergiert. Die Suspension wird dann 5 min '

mit einem Brinkmann Polytron mit einer Frequenz von 4000 Hz homogenisiert» Das Polyvinylidenfluorid/Isopropanol-Gemisch wird dann in einen Zylinder überführt, der 10 1 * Salzlösung enthält, und gerührt, bis es dispergiert ist. Dann kann sich das Polyvinylidenfluorid absetzen, und der , -v größte Teil der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert» Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird das Polyvinylidenfluorid erneut in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,0) mit (0,01 %) Merthiolat zu einer 2%igen Polyvinylidenfluoridkonzentration suspendiert. Das Polyvinylidenfluorid ist nun im aktivierten Zustand und in der Lage, Protein aufzunehmen. Während das Isopropanöl-aktivierte Polyvinylidenfluorid gerührt wird, werden 0,5 ml Esel-Antiziegen-Y-Globulin-Serum pro g Polyvinylidenfluorid zugesetzt. Das Gemisch wird dann wieder mit dem Polytron 5 min bei gleicher Frequenz wie zuvor homogenisiert. Die Suspension wird dann bei Raumtemperatur mindestens 6 h weitergerührt, dann mindestens 12 h bei 4⁰C. Nun ist die Suspension bereit, gewaschen zu werden. Dies geschieht durch J 10-minütiges Zentrifugieren mit 1500 g und anschließendes erneutes Suspendieren in 0,02. mTris-hydroxymethylaminomethan (Tham) bei pH 7,5 mit 0,1 % NaN₃. Dieser Vorgang wird nochmal wiederholt, und das fertige Material wird erneut in 0,02 mTris vom pH 7,5 mit 0,1 % NaN₃ zu 100 g Polyvinylidenfluorid/1000 ml Puffer suspendiert. Das Gemisch wird wieder gerührt,und 5 g Rinder-Serumalbumin (RSA)/100 g Polyvinylidenfluorid werden zugesetzt. Homogenisieren mit dem Polytron bei 4000 Hz für 5 min ist die letzte Stufe bei dieser Arbeitsweise.

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2. Arbeitsweise .

a) Zu 200 μΐ Patientenserum werden 10 μΐ lösliches Ziegen-Anti-LDHc-Serum gegeben und durchwirbelt. Dann wird

5 min gewartet.

b) 200 μΐ des unlöslichen zweiten Antikörpers* werden zugesetzt und durchwirbelt. Es wird 5 min gewartet.

c) Rotation für 5 min bei etwa 1000 g.

d) Von der überstehenden Flüssigkeit wird soviel abgenommen, wie für eine herkömmliche LDH-Aktivitätsbestimmung nötig. Anzuwenden ist die gleiche Arbeitsweise.

* Es ist dafür zu sorgen, daß die Suspension des unlöslichen Antikörpers vor Verwendung gut. gemischt wird. Ein kleiner Rührstab wird in die Reagensflasche gebracht und während der Entnahme des Antikörpers gemischt.

3. Berechnungen

LDH₁-Aktivität = Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit χ 2,05.

4. Interpretation

Zur Entscheidung über einen Endpunkt für LDH- wird ein willkürlicher Wert festgelegt. Dieser Wert wird für jedes einzelne Labor in Abhängigkeit von dem normalen Gesamt-LDH-Bereich des angewandten Enzymtests differieren. Zur Festlegung einer Obergrenze des Normalen für LDH₁ (H₄.) nehme man 30 % des oberen Werts des Normalen für den Test der Gesamt-LDH-Enzymaktivität. Der Fisher-Diagnostik-LDH-Test z.B. lieferte eine Obergrenze des Normalen von 149 I.E./l (der Normalbereich ist 52 - 149 I.E./l). Daher erweist sich der angenommene Endpunkt als 30 % von 149 oder 45 I.E./l. Jedes Serum, das eine LDH₁-Aktivität über 45 I.E./l zeigt, ist dann als Herzinfarkt-positiv anzusehen.

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Klinische Ergebnisse

Seren von 106 Patienten einer Herzpflegestation wurden auf LDH₁-Erhöhung geprüft. Bei allen 72 Patienten, bei denen ein Herzinfarkt diagnostiziert wurde, wurde eine LDH..-Erhöhung beobachtet. Für alle 34 Nichtherzinfarktpatienten jedoch blieb LDH₁ nicht-erhöht. Ein Endpunkt von 45 I.E./l wurde für biochemische Infarktdiagnose festgelegt. Der Bereich der LDH₁-Aktivität in Herzinfarktpatienten betrug 46 - 470 I.E./l. Der Bereich für die Nichtherzinfarktpatienten betrug 9 bis 44 I.E./l. Derzeit bestimmen die meisten Laboratorien das

"Hochschnellen" von LDH₁ZLDH₂ durch Elektrophorese. Diese / Λ

Technik ist umständlich und zeitraubend. Die erfindungsgemäße immunochemische Arbeitsweise dagegen ist einfach und schnell. Zudem ist die Bestimmung der LDH₁-Erhöhung empfindlicher-als die übliche Methode. In 59 der 72 Herzinfarktpatienten trat das Hochschnellen des LDH am gleichen Tage ein wie der Anstieg des LDH₁. In acht Fällen jedoch tiat es einen Tag nach dem LDH₁-Anstieg ein, und in 5 Herzinfarktpatienten wurde es überhaupt nicht erhalten (vgl. Tabellen I, II und III).

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Tabelle I

Zahl der Herzinfarktpatienten

CD OD CO

72

LDH₁ erhöht

72 LDH - 7Sprung"

am gleichen Tag am Tag nach dem
wie der LDH.- LDH₁-Anstieg
Anstieg

I.

59

Tabelle II

nicht vorhanden

ι ν

Zahl der Patienten ohne Herzinfarkt	LDH₁ erhöht LDH-"Sprung"	I O
34	O

Tabelle III (Teil A)

Zahl der Herz	CPK-MB	LDH₁	erhöht	überhaupt nicht	LDH-"SpruncT"	'einen Tag nach CPK	überhaupt nicht
infarktpatien ten	vorhan den	am gleichen ' Tag wie CPK	einen Tag nach CPK	0	am 'gleichen Tag wie CPK	19	5
58	55	43	12	31

Tabelle III (Teil B)

Zahl der Herz infarktpatien ten	DPK-MB fehlend	LDH. erhöht	LDH-"Sprunq"	1	O
58	3	3	am'gleichen einen Tag nach überhaupt nicht Tag wie die der LDH₁- LDH₁-Erhöhung Erhöhung
2

Claims

Patentansprüche '

Λ Verfahren zum Bestimmen der LDH--Aktivität in einer Serum- ' probe, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Schritte:

a) Behandeln der Serumprobe mit einem für die M-Untereinheit von LDH-Isoenzymen immunologisch selektiven ersten Antikörper, der mit in der Probe vorhandenem LDH₂/ LDH₃, LDH₄ und LDH₅ einen Kombplex bildet,

b) Behandeln des Irnmunoreaktionsprodukts der Stufe a) mit einem in einer anderen als der zur Bildung des ersten Antikörpers verwendeten Tierart immunologisch erzeugten zweiten Antikörper, der auf einem Festphasen-Trägermaterial unlöslich gemacht worden ist, zu einem Immunoreaktionsprodukt zwischen dem Produkt der Stufe a) und dem unlöslich gemachten zweiten Antikörper,

c) Abtrennen des Reaktionsprodukts der Stufe b) von der überstehenden Lösung und

d) Bestimmen der LDH₁-Aktivität der überstehenden Lösung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper an aktiviertem Polyvinylidenfluorid unlöslich gemacht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als erster Antikörper Ziegen-Anti-LDHj--Antikörper verwendet wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als zweiter Antikörper Esel-Anti-Ziegen-γ-globulin verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch der Stufe a) vor Durchführung der Stufe b) etwa 5 min gemischt und inkubiert wird.

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