DE2037507A1 - - Google Patents

Description

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PATENTANWÄLTE

dr. W. Schalk · dipl.-ing. p. Wi rth · di pl.-i ng. G. Dan ν en berg DR. V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. WEI N HOLD · DR. D. GUDEL

6 FRANKFURT AM MAIN

OR. ESCHENHEIMER STRASSE 3»

SK/SK H6

Baxter Laboratories, Inc. Horton Grove, 111. 6ü 053 USA

Verfahren zur Bestimmung; von Antikörpern

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimriung der Antikörper in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere auf ein Diffusionsverfahren zur quantitativen oder halb-quantitativen Bestimmung von "Komplemen.t'kfixierenden Antikörpern ijn Blutserum. '

Antikörper sind im Blutserun anwesende komplexe Proteinsubstanzen, von denen einige bekanntlich gegen Infektionsträger (Bakterien und Viren) schützen oder Toxine neutralisieren. Diese Substanzen spielen eine wichtige Rolle bei der Immunisierung gegen tökroben und Toxine. Sie bewirken eine Agglomeration oder Zerstörung von Zellen oder die Ausfällung von Proteinen in den, was - üblicherweise - als Antigen-Antikörper-Reaktion bezeichnet wird.

Es sind bisher verschiedene Verfahren entwickelt worden zur Bestimmung der Antikörper oder zum Messen von Aritigen-AntikÖrper*-Reaktionen. Gleich anderen-Proteinen kann die Anwesenheit der Antikörper durch übliche Verfahren der fr-aktionierten Ausfällung, Elektrophorese, Ultrazentifurierung und andere derartige physiko-chemische oder analytische Verfahren gezeigt werden.

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Ein als besondere geeignetes analytischen und diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen gefundenes Verfahren ist das als ¹¹ ünmunodiffusion" bekannte Verfahren. Die Immunodiffusion bedient sich einer Reaktion, z.B. zwischen einem Antigen und einen Antikörper, in halbfesten Gel-Medien, üblicherweise einem Agargel. Beide keaktionsteilnehmer sind anfänglich im Medium löslich, jedoch das anschlieJSende Reakt ions produkt oder der Komplex aus der Antigen-Antikörper-Reaktion ist unlöslich und bewirkt die Bildung eines sichtbaren Präcipitinbogens, der visuell mit den Auge oder photographisch beobachtet werden kann. Das Agargel-Diffusionsverfahren zur Untersuchung von Ausfällungsreaktionen ist im Hinblick auf die frühen und intensiven Arbeiten auf diesem Gebiet von Orjan Ouchterlony als "Ouchterlony"-Verfahren bekannt geworden (vgl. "Handbook of Intnunodiffusion and Immunoelectrophoresis", Ann Arbor Science Publishers, Inc., Ann Arbor, Mich. (1968)).

Eine besondere Adaption der Immunodiffusion, nämlich die sog. "Immunoelektro-

phorese". bedient sich des kombinierten Verfahren der Trennung von Mischungen aus Aritigenen durchAgargel-Elektrophorese und anschließenden Antigen-Antikörper-Reaktion en, die zur Bildung von Ouchterlony- oder Präcipitin-Bögen führen.

Eine andere, als "Radialimmunodiffusion" bekannte Adaption der Immunodiffusion verwendet ein den Antikörper im Agargel enthaltendes Agargelsystem, und das Antigen im Testserum diffundiert radial von einen» ringförmigen Reservoir unter Bildung einer radialen Präzipitinzone ("precipitin zone") im Agargel.

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Die obigen allgemeinen Verfahren der Inmunidiffusion sind in J.Ara.Med.Ass'n. Band 200, Seite 161 und 323 (I966) zusammengefaßt.

Bei der Untersuchuni» bestirnter Antigen-Antikörper-Reaktionen wurde gefunden, dal' die Beendigung der Reaktion die Untersützung eines besonderen, im normalen Senn anwesenden Kittels, das als Vonplementfbekahnt ist, erfordert. Bei diesem serologischen Reaktionen wurden zwei Stufen festgestellt. Die erste iitufe ist die spezifische teeäniaing zwirnen den Antikörpern und dem Substrat; diese wird gefolgt von einer zweiten Stufe, bei der sichtbare Veränderungen, vie Flok'r.ul at ion oder Lysis, auftreten. So ist es bekannt, daß nach der Fixierung von Lysinen an Zellen die Zugabe des"Komplements" notwendig ist, um ein Auflösen zu bewirken»

Das Charakteristikun des^MKor!pleiBents*_r das mittels der durch die Reaktion von Antigenen und Antikörpern gebildeten Aggregate gebunden werden soll, ist die Grundlage für einen üblichervieise verwendeten, als Kompltrtent-Fixierungs-Reaktion bezeichneten, serologischen Test. Bei diesen Test werden das zu testende Antigen und Antikörper mit einer Komplenentquelle gemischt, und nach einer Bebrütung werden hämolytisehes Imunsenm und entsprechende rote Zellen zugefügt, 'nenn in der ersten Stufe eine immunologische Reaktion erfolg, dann ist das Komplement fixiert und von der Lösung entfernt, und eine Hänolyse wird - entsprechend der Intensität der Reaktion - vollständig oder teilweise verhindert.

Die oben beschriebenen Immunodiffusionsverfahren vmrden neuerlich bei Untersuchungen der serologischen Hämolyse und insbesondere bei Untersuchungen .des Komplement-Fixierungs-Tests angev?endet. So beschreibt Milgrom et al (Vox Sang., Bd. 8, Seite 537-**β (1963) und J.Immunol, Bd. 96, Seite ^15-23 " (1966)) Agargel-Diffusionsverfahren zur Untersuchung der Lysis von rcten Schafsblut zellen, die durch Kaninchen-Antischafhäf.o lysin und Meerschwein-

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komplement induziert ist. In einzelnen Diffusionsverfahren wurden hämolytische Zonen untersucht, die durch Komplementdiffus ion in Agar, der rote Schafsblutzellen wnd Hämolysin enthielt, gebildet werden; weiterhin wurden hämolytische Zonen untersucht, die durch Hämolysindiffusion in Agar, der rote Schafsblutzellen und Komplement enthielt, gebildet wurden. In Doppeldiffusionsverfahren wurden Komplement und Hänolysin fce-'on einander in Agar diffundieren gelassen, der nur Schafserythrocyten enthielt. Diese Diffusionsverfahren wurden insbesondere bei Untersuchungen von j*G und l^M hämoIytischen Antikörpern angewendet. ■

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines neuen und verbesserten Verfahrens zur Bestimmung der Komp&nent-fixierenden Antikörper in biologischen Flüssigkeiten, sowie die Schaffung eines einzigen Diffusionsverfahrsns zur quantitativen oder halb-quantitativen Bestimmung Komplement-fixierender Antikörper in Blutserum, kin weiteres Ziel ist die Schaffung eines schnellen

quantitativen und zweckmäßigen Verfahrens zur Bestimmung und/Auswertung Komplement-fixierender Antikörper im Serum eines Patienten als wertvolles Hilfsmittel bei der Diagnose von erkrankungen, die bekanntlich Korapleraent-fixierende Antikörper produzieren, wie z.B. verschiedene mikrobiale, virale, bakterielle, rickettsielle, protozonelle, fungale und helnkithale Infektionen.

Srfindungsgemäl3 werden nun vorherbestimmte Menge an Komplnent und einem Komplenent-fixierenden Antigen in vorherbestimmten Verhältnissen mit einer biologischen, Antikörper-enthaltenden Flüssigkeit gemischt und die Mischung mit einer bekannten Menge Hämoljrsin-sensibilisierter Erythrocyteh in einem halb-festen oder festen Gelmedium für eine vorherbestimmte Dauer umgesetzt.

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Wird in diesem Verfahren das Kompliment nicht fixiert (negativer Test), so erscheint eine klare, sichtbare, radiale Diffusionszone der Lysis, während bei Fixierung von Komplement und Antigen an den Antikörper (positiver Test) keine Lysis auftritt. Im positiven Test ist der Durchmesser der Diffusionszone ungekehrt proportional zum Komplement-fixierenden Antikörpertiter.

Bei einem bevorzugten erfindungsgemäiSen Verfahren werden die Hämolysin-sensibilisierten firythrocyten homogen auf einer Platte in einem halb-festen GeI-medium dispergiert, und die Mischung aus Komplement, Komplement-f ixierendera Antigen und Antikörper enthaltender biologischer Flüssigkeit wird durch

gebohrte

offene/Löcher oder gestanzte oder anderweitig im Gf⁴I gebildete Löcher eingeführt. Bei diesem Verfahren bildet sich die Diffus-ionssone der Lysis an der Zwischenfläche des Gels und der durch die Löcher· eingeführten Flüssigkeit sprobe.

Vorzugsweise wird eine Mischung aus Komplement-fixierendem Antigen und überschüssigem Komplement zu einer unbekannten-Probe Blutserum oder anderen biologischen Flüssigkeit zugefügt, die auf Komplement-fixierende Antikörper untersucht werden soll, und die erhaltene Mischung wird mittels einer Kapillarpipette oder ähnlichen Vorrichtung in die offenen Löcher gegeben.

Dann wird die Platte etwa 30 Hinuten bis etwa 4-8 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0°G„ bis etwa 5ü°C., vorzugsweise.etwa 2-6 Stunden bei etwa 20-kO C, bebrütet. Während dieser Bebrütung erscheint bei einem negativen Test eine klare, radiale Diffusionszone der Lysis.

Die in erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mengen und Verhältnisse von Antigen, Komplement und unbekannter Probe können stark variieren, solange . sie vorherbestimmt sind und mit Kontrollen oder bekannten Proben ver^lichon Herden können. In einem Anschauungsbeispiel wurden ausgezeichnete Ergebnisse erzielt durch bebrütung von 1 Vol» Antigen, 1 Vol. Komplement ₉ das 1:5 verdünnt worden war, und 1 Vol. unbekannte* Blutserum etwa 3^ Minuten bis etwa 18 Stunden bei etwa 0-10 C.

Bei der Herstellung des Gelmediums kann jedes übliche Gelierungsmittel verwendet werden» wie z.B. Gelatine, Pectin, Kieselsäuregel, Stärke, Polysaccharide aus Seetang, wie Agar, Algin und Carrageenan» synthetische polymere Gelierungsmittel, wie die vernetzten Polyacrylamide der US-Patentschrift 3 046 201, die modifizierten Gellulosen der US-Patentschrift 3 36O Vtf) und ähnliche Materialien. Das üelierungsraittel hat vorzugsweise die für Agar-Agar charakteristischen physikalischen Eigenschaften, indem esjleicht in Wasser dispergiertbar ist und ein praktisch klares. Hydrogel ausreichender jföstigkeit bilden kann, so daß die das Gel enthaltende Platte umgedreht werden kann ohne die Gefahr» daß das Gel herunterfällt.

Das bevorzugte Gelierungsmittel, das im erfindtingsgemäSen Gelisedium verwendet wird, :^?st Agar» Dieses Gelierung-smittel wird gewöhnlich in einer Konzentration von etwa O₃1-5 Gew_a-# Gelimedium_s vorzugsweise etwa 1,5 Gew.,-;« Geleraediura. verwendet«

Das Gelmedium wird zweckmäßig hergestellt^ indem man das GeHerungsnittel in ■ heißem Wasser löst, die vorherbestirsaten Mengen an HäEolyin-sensibili-' sierten Krythroeyten zufügt, gründlich saischt und in einer für die Plattengröße ausreichenden Menge in einen niedrig^vrandigen, flachen Behälter

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(hier auch als Platte bezeichnet) gießt. Die Hämolysin-sensibilisierten Krythrocryt'.n worden gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,05-5 GcK.-vJ dos .ielmediuns, vorzugsweise etwa 0,5 üew.-/o des üelmediums, verwendet, üei der Herstellung des üelmediums werden vorzugsweise gleichen Volumen der Lösungen aus (Jelierunrsmittel und Hämolysin-sensibilisierten Krythrocytcn verwendet. Dann wird die Kischung aus Uelierungsmittel und H:inolysin-s"nsibilisinrten Erythrocyten gelieren gelassen, und im üel werden zylindrische Löcher von etwa 1-10 mm Durchmesser gestanzt oder anderweitig gebildet·

Ij."s erfindunfsremäJie Verfahren kann zur Bestinnung von Antikörpern verwendet werden, die mit. Antiwnen in einer Konplement-fixierenden Reaktion reagieren. Ho kann os verwendet werden, um die Antikörper zu verschiedenen bakteriellen, funr.alen, viralen, parasitischen uni rickettsialen Anti^enen zu bestimmten. lOin fteeipnet.es, Komnle"ient-fixiarendes Antigen ist z.B. das Kolmer-Antifren (vgl. Ko3r.er et al, ,!.Vener. Dis. Inform., Hd. 29, Seite 166-72 (19^)). Andere, Konj.l'Jnent-fixierende Antigene sind z.B. diejenigen von Rocky Wountain Kleckfielx>r, epidemischen Typhus, Murapsvirus und Coccidioidomycosis.

Das in erfindunfisgemääen Verfahren verwendete Komplenent kann aus jeder be-' kannten KomplRnentquelle erhalten werden. So kann z.B. ein handelsübliches, lyophiliertes iieerschwänchen-gesantserun, das erneut aul' sein ursprüngliches Volumen gebracht worden ist, verwendet werden. Vorzugsweise wird das rekonstituierte Serum vor der Verwendung 1:5 verdünnt.

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Bin geeignetes Komplement kann auch leicht hergestellt werden indem man Meer-•ehweinchengesamtblut sammelt und gerinnen läßt. Die roten Blutzellen werden abaen^rifugiert und das zurückbleibende Serum wird eingefroren» getrocknet wxl dann vor der Verwendung erneut auf sein ursprüngliches Volumen gebracht.

Das getrocknete Komplement wird vorzugsweise mit Kolmer-Kochsalzlösung rekon-• etituiert} diese kann hergestellt werden durch Lösen von 8,5 g NaCl, 0,082 g

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! MgCl^.oH^O und 0,040 g CaCl₂.2H₂0 in einem 1 dest. Wasser.

Vor dem Trocknen wird dem Komplement vorzugsweise eine geringe Menge eines Konservierungsmittels» wie z.B. etwa 0,01 # Natriumazid, zugefügt.

Als Quelle für das erfindungsgemäß verwendete Komplement kann auch Menschen-,

Kaninchen- und anderes Tierblut verwendet werden« ·

' Die erfindungsgemäß verwendeten, Hämolysin-sensibilisierten JSrythrocyten j sind vorEugsweise Hämolysin-sensibilisierte rote Schafblutzellen. Diese Zellen werden in einer Konzentration von etwa 1-5 i>% vorzugsweise etwa 2 VoI.-^, in Kolmer-Kochsalzlösung suspendiert und dann mit Schafszellenhänolysin sensibilisiert.

Die'roten Schafzellen können wie folgt Hämolysin-sensibilisiert werden: Schafzellenhämolysin wird mit etwa 10-100, vorzugsweise etwa 19, Vol. Kolmer-Kochsalzlösung verdünnt. Zu 1 Vol. dieser Hämolysinverdünnung wird etwa 1 Vol«rote Schaf blut zellen, vorzugsweise in einer 2-jbigen, oben beschriebenen Suspension, zugefügt. Das Schafzellenhämolysin und die roten Schafblutzellen werden etwa 10 Minuten bei etwa 0-30 C, vorzugsweise bei

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etwa 25 C, 'gemischt, wodurch die roten Schaf zellen gegenüber Hämolysin sensibilisiert werden. Als Schafzellenhämolysin in diesem Verfahren kann auch Kaninchenserum oder Serum anderer Tierarten mit Antikörpern gegen rot* Schafblutzellen verwendet werden. .

Über die üelplatte, die die Hämolysin-sensibilisierten Erythrocyten enthält, kann man eine Schutzmembran legen, dann kann die Gelplatte auf verschiedene Weise verpackt werden und steht für die anschließende Verwendung bei der Bestimmung der Komplement-fixierenden Antikörperaktivität in Krankenhäusers, Laboratorien usw. zur Verfugung, wo die Forderung nach einer vereinfachten* jsdoch genauen Bestimmung der Komplement-fixierenden Aktivität in Blutpl**»- proben besteht. Das Verpackungsmaterial für diese Platten kann z.B. aus Kunststoffilm- oder Metallfolientüten, -säcken usw. bestehen, die vorzugsweise sterilisiert und zur Vermeidung eines Eindringens von Luft_s Feuchtigkeit, Schmutz und anderer unverunreinigender Materialien versiegelt sind. Geeignete Metallfolien können z.B. aus Aluminium und ähnlichen Metallen hergestellt werden; geeignete Kunststoffilme erhält man z»B. aus Vinylchlorid- und V inylidenchloridmisch polymerisat en, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol, Polyäthylen, Polypropylen, Polystyrol, Polycarbonaten, Polyamiden, Celluloseacetat und -propionat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetat butyrat, Athylcellulose, Fluorkohlenstoffen, Acrylkunststoffen, wie Acrylate und Methacrylate·,, und Polyestern, wie z.B. die durch Kondensa-· •ti-onsreaktionen zwischen Äthylenglykol und Terephthalsäure gebildeten Polyester» * ·

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Die die H&molysin-sensibilisierten iärythrocyten enthaltenden Gelplatten körnen auch in Verbindung mit Komplement-fixierenden Antigenen, Komplement- und

■ Kontrollproben sowie mit Kapillarrohren und anderen Komponenten zur Durchführung der vollständigen, Komplement-fixierenden Untersuchung verpackt werde.-..

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken. Falls nicht anders angegeben,, sind alle Teile und Prozentangaben Gew.-Teile und Gew,-#.

Beispiel 1 · .'.'■'■■ ■■■". ■ .

Hämolysin-sensibilisierte Erythrocyte» wurden wie folgt in einam -halb-fester. Gelniedim suspendiert; s ■" ". ■ ,

Schafsellenhamolyein wurde 1:20 mit Kolfflsr-Kochsalzlöstgig v®»iimnt und dare ait eitlen gleichen foltaien 'roter Sebafsellap g©sais©hfco Diese-Mischung wurde dann isit einem gleichen Vole-Toil feiner esränitatem, wässrigen Lösung aus 3»0 J? Difco Noble Agar- gemischt» Die ©shitst® Misshwig i-a^u® dann in eine Platte von etwa. 7$5 x 2₉5 x ^ö»^ ®» gegossen xm& gelieren gelassen.. Dann wustlsa in das del 6 Löcher mit jeweils einem Dtsrelmssser von- Z sa in gleiches Abstand voneinander gestansto

■ Dann wurde die oben hergestellte Tsstplatte wie folgt sur Bestimming lomple-■na*~fixi©rend©r Antikörper gegen folaer-lntigen v©n-J®ndets

Ziierst wurde i ¥ol«-Teil Iolmer-liatig@a mit eine» gleichen Yolmaen Komplement und dann mit einem gleicheH VoöLusaen efaer Blutseruasprobe in einem Testrohr •gemischt und 1 Stunde bei 5 C· gehaltene Das ICasnplement bestand aus einem rekonstituierten, 1:5 mit Kolmer-Kcchsalzlösung verdünnten Meerschweinchenkompleraent. Dann \iurde die Mischung in ein Loch der Platte gegeben und k-Stunden bei 3?°C. bebrütet. Nach der Bebriitungsseit erscheint bei einem

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negativen Test, in den das Komplement nicht fixiert ist, eine klare, sieht- ' bare, radiale Diffusionszone der Lysin, während im positiven Test, bei dem Komplement und Kolraer-Antigen an den Antikörper in der Blutserumprobe fixiert sind, keine Lysis oder wesentlich weniger Lysis erscheint«

Zur Erzielung einer quantitativen oder halb-quantitativen Bestimmung der Koraplement-fixierenden Antikörper wurden drei verschiedene Verdünnungen , einer unbekannten Blutserumprobe mit drei ähnlichen Verdünnungen einer Kontrolle oder bekannten Probe verglichen. Bei diesem Verfahren kann der ftingdurchraesser der ifontroUproben mit den Ringdurchmessern der unbekannten ^

Proben vergöohen und so der Komplement fixierende Antikörpertiter geschätzt werden. Die Zone der Lysis ist praktisch ungekehrt proportional zum Maß des durch die Reaktion fixierten Komplementes. Beispiel 2 .

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei anstelle des Kolmer-Antigens Rocky Mountain .Fleckfieber-Antigen verwendet wurde; so konnte man den Komplement- - ι fixierenden Antikörpertiter einer Blutserumprobe gegen das Testantigen : bestimmen. ..-■.? B eis pie! ^

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei anstelle des Kolmer-Antigens epide- w

misches Typhus-Antigen zur Bestimmung des Komplement-fixierenden Antikörpertiters einer Blutserumprobe gegen das Testantigen verwendet wurde. , Beispiel k

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei anstelle des Kolmer-Antigens Mumpsvirus* Antigen zur Bestimmung des Komplement-f ixierenden Antikörpertiters einer Blutserumprobe gegen das Testantigen verwendet wurde.

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Beispiel 5

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei anstelle des Kolmer-Antigens Coccidiondomycocis-fungal-Antigen zur Bestimmung des Komplement-l'ixierenden Antikörpertiters einer Blutsorumprobe gegen das Tostantigen verwendet wurde.

Wie für den Fachmann selbstverständlich, können in den obigen Beispielen zur Bestimmung der entsprechenden Komplerient-i'ixiercnden Antikörper andere bekannte, Komplenent-fixierende Antigene verwendet werden. Mit praktisch gleichwertigen Ergebnissen können anstelle der in den obigen Beispielen beschriebenen besonderen Verdünnungen andere Verdünnungen von Antigen, Konplement, Hämolysin-sensibilisierten i'Irythrocyten und Gelierungrsmittel verwendet werden.

SAD

Claims (1)

1. P ah ο nt an s η r ü c h e

   1,- Vorfahren zur Bestimmung von Komplement-fix ierenden Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man vorherbestimmte Mengen an Komplement und Komplement-fixierendem Antigen mit einer antikörperhaltigon biologischen Flüssigkeit in vorherbestimmten Verhältnissen mischt und die Mischung mit einer bekannten Menge HämolysLn-sensibilisierter ärythrocyten in einem halb-festen Gelmediitn für eine vorherbestimmte Dauer umsetzte

   2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelmedium die Hämolysin-sensibilisierten lOrythrocyten auf einer Platte enthält und die Mischung aus Komplement, Komplement-fixierendem Antigen und Antikörper-enthaltender biologischer Flüssigkeit mit den Hämolysin-sensibilisierten i£rythrocyten zwecks Reaktion mit denselben durch Diffusion aus den durch die Oberfläche des Gels gestanzten Löchern in Berührung kommen gelassen wird.

   3·- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gskennzeichnet, daß das Gelmedium etwa 0,1-5 Gew.-ρ Agar enthalt.

   ^.-Verfahren nach Anspruch 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß das GeI-medium etwa 0,05-5 Gew.-i Hämolysin-sensibilisierte cirythrocyten enthält.

   5.- Verfahren nach Anspruch 1 bis ^J-, dadurch gekennzeichnet, daß Komplement, Komplement-fixierendes Antigen und Antikörper-enthaltende biologische Flüssigkeit in etwa gleichen Volumenverhältnissen gemischt werden.

   6.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 51 dadurch gekennzeichnet, daß die Komplement-fix ierenden Antikörper im Blutserum bestimmt werden.

   7.- Agar-Gelplatte zur quantitativen Bestimmung von Komplement-fixierenden Antikörpern, bestehend aus einer Platte und einem Agar-Gelmedium, das eine vorher be stimmt G nenge lüimolysin-sensibilisierter ibrythrocyten enthält.

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   8,- Agar-Gelplatte nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daii das GjI-mediuin etwa 0,1-5 Uew.-,ί Agar und etna 0,05-5 üevr.-^ Hänolyain-sensiLilL-sierte Krythrocyten enthält.

   Der Patentanwalt:

   08/1404- · ÖÄD