DE3105555A1

DE3105555A1 - Reagens zum nachweis des rheumatoidfaktors, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE3105555A1
Application number: DE19813105555
Authority: DE
Inventors: Rene Guffroy
Original assignee: LABORATORIES POLYPHARMA; POLYPHARMA LAB
Current assignee: Laboratoires Fumouze Sa Clichy Fr
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1981-02-16
Publication date: 1981-12-17
Also published as: BE887494A; DE3105555C2; US4587222A; GB2069694A; FR2476320B1; GB2069694B; FR2476320A1; CA1168580A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein neues Reagens, das den in vitro-Nachweis des "Rheumatoidfaktors" im Serum oder einer analogen biologischen Probe ermöglicht, die Verwendung dieses Reagens sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Es ist bekannt, daß das Serum von an rheumatoider PoIyarthritis Erkrankten ein der Gruppe der ß2-Makroglobuline, die als Makroglobuline IgM bezeichnet werden, verwandtes Globulin enthält.

Dieses Makroglobulin, das üblicherweise als "Rheumatoidfaktor" oder "Rheumafaktor" bezeichnet wird, ist insbesondere gekennzeichnet durch seine agglutinierenden Wirkungen gegenüber Komplexen, die gebildet sind aus roten Blutkörperchen oder Erythrozyten und Antikörpern, wie man sie ausgehend von Iso- oder Hetero-Immunseren erhält, die zuvor gegen diese roten Blutkörperchen gebildet worden sind und die in subagglutinierenden Dosierungen eingesetzt werden. Diese Komplexe zeichnen sich aus durch immunologische Bindungen oder "immunologische Fixierungen" zwischen dem Antigen und dem Antikörper. Die Fähigkeit des Rheumatoidfaktors, eine Agglutination dieses Typs von Komplexen zu verursachen, ist die Grundlage der Waaler-Rose-Reaktion oder der davon abgeleiteten Reaktionen, die als die spezifischsten Reaktionen im Hinblick auf die sich entwickelnde chronische Polyarthritis (polyarthrite chronique evolutive (PCE)) angesehen werden.

Im folgenden sei definiert, welche Bedeutungen die Begriffe "Agglutination" und "Hämagglutination" besitzen.

Der Begriff "Agglutination" wird hierin dazu verwendet,

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die mit dem bloßen Auge sichtbare Reaktion zu bezeichnen, die man insbesondere auf einem Objektträger (im Fall der Agglutination auf einem Objektträger) beobachten kann, wenn man ein Reagens, das einen Komplex der oben definierten Art enthält, mit einem Serum in Kontakt bringt, das den Rheumatoidfaktor enthält. Natürlich spricht man auch von einer "Agglutination", wenn man rote Blutkörperchen mit einer Dosis eines Immunserums in Kontakt bringt, die dazu ausreicht, diese Agglutinationsreaktion zu verursato chen.

Der Begriff "Hämagglutination" dient zur Bezeichnung eines Phänomens, das zur spontanen Bildung eines "Teppichmusters" ("mat pattern" oder "pattern agglutination" gemäß den häufig zur Bezeichnung dieses Phänomens verwendeten englischsprachigen Ausdrücken) führt, wenn man diese roten Blutkörperchen mit einer subagglutinierenden Verdünnung des entsprechenden Immunserums in Kontakt bringt.

2o■ Es ist bekannt, daß nach dem Stand der Technik zwei Methoden zum in vitro-Nachweis der eventuellen Anwesenheit des Rheumatoidfaktors in einem biologischen Medium, beispielsweise einem Blutserum, angewandt werden, bei denen die "Objektträgeragglutination" bzw. die "Agglutination im Reaganzglas oder auf Mikroplättchen" angewandt werden.

Die erste Methode (Objektträgeragglutination) ist leicht durchzuführen. Die Agglutination stellt einen schnellen qualitativen Hinweis auf die Anwesenheit oder Nichtanwesenheit des Rheumatoidfaktors in dem untersuchten Serum dar. - ...

Die zweite Methode (Agglutination im Reagenzglas oder auf Mikroplättchen) ist dazu geeignet, zusätzlich annähernd quantitative Hinweise im Hinblick auf den Gehalt de.s Rheu-

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matoidfaktors in dem untersuchten Serum zu geben, insbesondere über die mögliche Bestimmung der Verdünnungsschwelle, die die geringste Verdünnung, bei der noch eine Agglutination verursacht wird, und die höchste Verdünnung trennt, bei der man keine Agglutination, sondern lediglich eine "Hämagglutination" beobachtet.

Es ist gut bekannt, daß eine der Schwierigkeiten, die in der Vergangenheit bei dem Objektträgertest aufgetreten ist und die bis heute in der Praxis für die Tests in Reagenzgläsern oder Mikroplättchen nicht gelöst werden konnte, in der Instabilität der natürlichen Komplexe zu sehen ist, die die globulären Antigene oder roten Blutkörperchen mit den entsprechenden Antikörpern der Immunsera bilden.

Diese Schwierigkeit wurde im Fall der Reagenzien überwunden, die für die Objektträgertests geeignet sind.

Es ist bekannt, daß Milgrom und Mitarbeiter (Arthritis and Rheumatism 7 (1) (1964), Seiten 1 bis 7) vorgeschlagen haben, zur Überwindung dieser Schwierigkeiten bei der Durchführung des anfänglich von Waaler und Rose entwickelten Objektträgertests einen Komplex, der aus roten Blutkörperchen von Schafen, welche roten Blutkörperchen zuvor einer Behandlung mit Formaldehyd unterworfen worden sind, und einem Anti-rote Blutkörperchen von Schafen enthaltenden Kaninchenserum gebildet worden ist, in einer um den Faktor 4 verringerten Verdünnung einzusetzen, bezogen auf die höchste Verdünnung, die bei einer Bestimmung in dem Reagenzglas eine Teppich-Hämagglutination ergibt (mit anderen Worten eine Verdünnung, die um den Faktor 4 geringer ist als der weiter unten definierte Hämagglutinationstiter). Nach Milgrom kann das erhaltene Reagens während einiger Zeit,

beispielsweise zwei Monate, bei 4°C oder in gefrorenem

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Zustand aufbewahrt werden, ohne daß sich merkliche Verluste der serologischen Wirkung ergeben. Nach den Ausführungen dieser Autoren ermöglicht das in dieser Weise gebildete Reagens dann, wenn es auf einem Objektträger mit einem um den Faktor 2o mit einem isotonischen Natriumchlorid-Puffer verdünnten Humanserum in Kontakt gebracht wird, nach dem Stehenlassen der Mischung bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von 5 bis 1o Minuten den Nachweis der Anwesenheit des Rheumatoidfaktors durch eine Agglutination dieses Reagens dann, wenn der Rheumatoidfaktor vorliegt. Diese Reaktion ist jedoch für die Praxis zu langsam, insbesondere wenn man die Geschwindigkeit berücksichtigt, mit der das flüssige Medium der Suspension verdampft, von dem Augenblick an, da die Mischung auf den Objektträger aufgetragen worden ist.

Die PR-PS 1 484 727 und der Zusatz Nr. 92 415 dazu, beschreiben ein verbessertes Reagens, das eine quasi augenblickliche Reaktion auf dem Objektträger ermöglicht, wenn der Rheumatoidfaktor in dem untersuchten Serum vorhanden ist. Das Reagens ist dadurch gekennzeichnet, daß es in dem Komplex aus dem Antigen und dem löslichen Antikörper eine wesentlich höhere Antikörperkonzentration aufweist, die mit Hilfe von perfektionierten Verfahrensweisen erreicht wird, die in diesen Patentschriften beschrieben sind und die darin bestehen, den zuvor aus dem Immunserum und den globulären Antigenen, insbesondere roten Blutkörperchen von Schafen (die gegebenenfalls zuvor einer Behandlung mit Formaldehyd oder einem analogen Aldehyd unterworfen worden sind) gebildeten Komplex einer stabilisierenden Nachbehandlung mit Formaldehyd oder einem analogen Aldehyd zu unterwerfen. Diese Verbesserung besitzt den wesentlichen Vorteil, daß das gebildete Reagens in einfacher Weise angewandt werden kann, da die gewünschte Reaktion, wenn sie abläuft, erfolgt, bevor die auf dem Objekt-

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- 1ο -

träger ausgebreitete Mischung Zeit hat, einzutrocknen.

Wenngleich das Problem der Herstellung eines wirksamen und stabilen Reagens in zufriedenstellender Weise im Hinblick auf Objektträgertests zum diagnostischen Nachweis der Anwesenheit oder Nichtanwesenheit des Rheumatoidfaktors gelöst werden konnte, trifft dies nicht zu für jene Reagenzien, die für den Test im Reagenzglas oder auf Mikroplättchen verwendet werden. In der Tat besitzen die in der Literatur für diesen Objektträgertest beschriebenen Reagenzien die Eigenschaft, spontan die Bildung von Teppich-Hämagglutinationen zu ergeben, und zwar in Anwesenheit und in Abwesenheit des Rheumatoidfaktors. Sie können daher nicht bei Untersuchungen zum Nachweis des Faktors in Seren verwendet werden, die diesen Faktor enthalten oder davon frei sind.

Milgrom hat von Voruntersuchungen berichtet, bei denen rote Blutkörperchen eingesetzt wurden, die zuvor mit Formaldehyd vorbehandelt und durch eine subagglutinierende Verdünnung mit einem Anti-Schaf-Kaninchenserum sensibilisiert worden sind. Die beschriebene Technik ist für die Praxis nicht geeignet und sei es nur deswegen, weil der Antikörpergehalt des Milgrom-Komplexes äußerst gering ist, was eine Folge der Bedingungen ist, unter denen der Komplex gebildet worden ist.

Die Aufgabe der Erfindung liegt nun darin, die oben angegebenen Schwierigkeiten zu überwinden und insbesondere ein Reagens zu schaffen, das gleichzeitig stabilisiert ist und für den Nachweis des Rheumatoidfaktors auf der Grundlage einer Hämagglutination, die in Reagenzgläsern oder Mikroplättchen durchgeführt werden, selektiv ist. Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Reagens hoher Empfindlichkeit zu schaffen, das eine deutliche Unter-

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scheidung des gegebenenfalls vorhandenen Rheumatoidfaktors einerseits von natürlichen Hetero-Antikörpern (wie Antirote Blutkörperchen von Schafen oder Forsman-Antikörper), die in sämtlichen Humanseren in erhöhten Titern enthalten sein können, ermöglicht. Es ist bekannt, daß diese HeteroAntikörper ebenfalls Hämagglutinationen verursachen können, und dies selbst dann, wenn man die zu untersuchenden Seren zuvor einer Adsorptionsbehandlung unterwirft, um diese Parasiten-Antikörper zu entfernen. Die Aufgabe der Erfindung ist somit insbesondere die Schaffung eines Reagens für Reagenzglas- oder Mikroplättchen-Versuche, das eingesetzt werden kann, ohne daß es erforderlich ist, extreme Serumverdünnungen anzuwenden und das Serum zuvor einer Adsorptionsbehandlung zur Entfernung von Parasiten-Antikör-' pern zu unterwerfen, die den Rheumatoidfaktor maskieren können.

Diese Aufgäbe wird nun durch das erfindungsgemäße Reagens zum Nachweis des Rheumatoidfaktors bei Reagenzglas- oder Mikroplättchen-Versuchen gelöst, das einen Komplex enthält, der gebildet ist aus roten Blutkörperchen und diesen roten Blutkörperchen entsprechenden löslichen Antikörpern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zugleich stabil ist und nur dann eine Hämagglutination in bestimmten VerdünnungsIntervallen.ergibt, wenn es mit nachweisbaren Konzentrationen eines Rheumatoidfaktors in Kontakt gebracht wird, wie sie in einem ursprünglichen biologischen Medium eines Patienten enthalten sein können, der an rheumatoider Polyarthritis erkrankt ist.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Reagens ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine relative Menge von Antikörpern ' enthält, die dem Komplex eine Empfindlichkeitsschwelle, bezogen auf das internationale Standardserum für rheumatoide Polyarthritis der Weltgesundheitsorganisation, von etwa-

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o,o1 bis 1 Internationale Einheiten/ml (nachfolgend abgekürzt auch als ΙΕ/ml bezeichnet), insbesondere von o,o5 bis o,3o ΙΕ/ml aufweist.

Es kann auch dadurch definiert werden, daß es eine Nachweisschwelle des Rheumatoidfaktors in einem um den Faktor 4o verdünnten Serum von etwa o,4 bis etwa 4o IE/ml, insbesondere 2 bis 12 ΙΕ/ml aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung des definierten Komplexes (oder des diesen Komplex enthaltenden Reagens), der bzw. das gegebenenfalls zuvor verdünnt worden ist, zum Nachweis des Rheumatoidfaktors oder eines analogen Faktors in einer biologischen Probe, die gekennzeichnet ist durch das Inkontaktbringen dieses Komplexes (oder dieses Reagens) mit der biologischen Probe, insbesondere einem Serum oder einer Gelenkflüssigkeit, in Reagenzgläschen oder Mikroplättchen, und durch Auftreten oder Nichtauftreten einer dispersen Hämagglutination, wenn das Serum den Rheumatoidfaktor enthält bzw. nicht enthält.

In der Mehrzahl der Fälle kann diese Anwendung direkt an der biologischen Probe erfolgen, die gegebenenfalls zuvor verdünnt worden ist, ohne daß es notwendig ist, zuvor eine Adsorptionsbehandlung durchzuführen, um Parasiten-Antikörper zu entfernen, bevor man die Probe mit dem Reagens in Kontakt bringt, insbesondere bei einem neutralen pH-Wert.

Es hat sich gezeigt, daß die Anwesenheit des Rheumatoidfaktors sich in einer Hämagglutination manifestiert, d. h. einem Phänomen, das ähnlich jenen Reaktionen ist, die man •mit klassichen Agglutinations-Reagenzien beobachtet, wenn man diese mit biologischen Medien in Kontakt bringt, die von dem Rheumatoidfaktor frei sind.

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Im Gegensatz dazu ergibt sich bei der Abwesenheit des
Rheumatoidfaktors in dem untersuchten Medium oder bei dem Kontakt des erfindungsgemäßen Reagens mit einer "sub-hämagglutinierenden" Verdünnung des Immunserums eine einfache Sedimentation des Materials, insbesondere der roten Blutkörperchen, die sich am Boden des Reagenzglases oder Reagenzröhrchens ansammeln. Diese "Hämagglutination" oder im Gegensatz dazu diese "Sedimentation" (die die Abwesenheit einer Hämagglutination anzeigt) lassen sich leicht erkennen, wenn man das Inkontaktbringen in den Reagenzgläschen oder den Vertiefungen von Mikroplättchen durchführt, die häufig in Laboratorien verwendet werden. Es ist bekannt, daß diese Röhrchen im allgemeinen einen zylindrischen Bereich aufweisen und/oder in einem konischen Boden auslau-'

j 5 fen. Im Fall der Hämagglutination kann man nach Ablauf
einer bestimmten Zeit die Bildung eines "Teppichs" ("mat pattern"J feststellen, der im allgemeinen im wesentlichen die Gesamtheit des konischen Bodens bedeckt, während im
Gegensatz dazu die "Sedimentation" sich in einer Ansammlung der roten Blutkörperchen in Form eines kleinen "Pfropfens" an der extremen Spitze dieser Röhrchen manifestiert.

Im folgenden bezeichnet man als "Hämagglutinationstiter" die letzte Verdünnung, bei der sich in dem Reagenzglas oder Röhrchen der genannte "Teppich" oder das "mat pattern" (Mattenmuster) ergibt, d. h. die Verdünnung, die der größeren Verdünnung vorausgeht, bei der man nur noch eine "Sedimentation" beobachtet.

Wenn man als "Agglutinationstiter" die letzte Verdünnung bezeichnet, die auf dem. Objektträger mit dem bloßen Auge sichtbare Agglutinate ergibt, d. h. die Verdünnung, die " unmittelbar vor der ersten größeren Verdünnung angesiedelt ist, die nicht zu der Bildung der genannten Agglutinate

führt, so ist festzuhalten, daß der "Hämagglutinationsti-

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ter" im Verhältnis zu dem "Agglutinationstiter" um etwa 1o, insbesondere etwa 4o größer ist im Fall eines immunologischen Komplexes aus mit Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen von Schafen und dem hämolytischen Anti-Schaf-Kaninchenserum.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Reagens der oben definierten Art/ das weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß sein Hamagglutinationstiter zu seinem Agglutinationstiter in einem Verhältnis von mindestens 1o und insbesondere mindestens 2o steht im Fall eines Komplexes aus den roten Blutkörperchen von Schafen und Anti-Schaf-Antikörpern von Kaninchen.

]5 Die erfindungsgemäß bevorzugten Komplexe können auch über den relativen Antikörpergehalt definiert werden, den sie in Abwesenheit einer Hämagglutination aufweisen können, bezogen auf den relativen Maximalgehalt, der an roten Blutkörperchen fixiert werden kann, die nicht der Behandlung des nachstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens unterworfen worden sind. Insbesondere liegt der relative Antikörpergehalt des erfindungsgemäßen Komplexes zwischen etwa 2 und etwa 2o, vorzugsweise etwa 3 und etwa 1o Hämagglutinationseinheiten, wobei zu bemerken ist, daß die Hamagglutinationseinheit dem relativen Antikörpergehalt entspricht, der in Abwesenheit einer Hämagglutination von entsprechenden roten Blutkörperchen, die nicht der erfindungsgemäßen Behandlung unterworfen worden sind, zurückgehalten werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des oben angesprochenen Komplexes ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die roten Blutkörperchen und die an diese roten Blutkörperchen immunologisch zu fixierenden Antikörper, die von entsprechenden Immunsera stammen,

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- einer Folge von mindestens zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen mit zwei verschiedenen Mitteln des Typs eines Aldehyds oder eines Gerbmittels und

- einer dritten Behandlung mit mindestens einer dispergierenden Substanz, insbesondere einer Substanz des Eiweißtyps, wie Albumin,

unterwirft, wobei mindestens die erste dieser Behandlungen mit dem Aldehyd oder dem Gerbmittel· und die dritte Behandlung mit der Eiweißsubstanz, denen die roten Blutkörperchen unterworfen werden, in Gegenwart der Antikörper durchgeführt werden, die auf diesen roten Blutkörperchen fixiert werden sollen.

Die Behandlung mit Albumin oder einer äquivalenten Substanz kann gleichzeitig mit der letzteren der aufeinanderfolgenden Behandlungen der genannten Folge oder getrennt davon im Verlaufe der abschließenden Behandlung durchgeführt werden.

Es versteht sich, daß die relativen Anteile der in Gegenwart der roten Blutkörperchen im Verlaufe der genannten Behandlungen eingesetzten Antikörper jeweils in der Weise gesteuert werden müssen, daß sie einerseits mit dem erhöhten Stabilitätsgrad verträglich sind, der nach der Durchführung einer jeden dieser Behandlungen erreicht werden kann, und daß andererseits letztlich ein Reagens erhalten wird, das die gewünschten relativen Mengen von an den roten Blutkörperchen fixierten Antikörpern aufweist, insbesondere die oben angegebenen bevorzugten Anteile bzw. Mengen.

Mit Vorteil werden die Mittel des Typs eines Aldehyds oder eines Gerbmittels aus der Gruppe ausgewählt, die im Hinblick auf die Aldehyde Formaldehyd, Glutaraldehyd, Pyruvaldehyd, Glyoxal, Methylglyoxal oder analoge Aldehyde, "vor-

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zugsweise Glutaraldehyd, und im Hinblick auf die Gerbmittel Gerbsäure/ pflanzliche und synthetische Tannine, p-Benzochinon, Sulfosalicylsäure, gerbende Stoffe mineralischen Ursprungs, wie Salze, insbesondere Chromchlorid
oder Zirkoniumchlorid, Natriumsilikat, Natriumhyposulfit etc. umfassen. Ganz allgemein kann man auf sämtliche stabilisierenden Substanzen zurückgreifen, die die roten
Blutkörperchen nicht zerstören und die an ihrer Fähigkeit

erkannt werden können, mit dem Hämoglobin der roten
Blutkörperchen eine Reaktion einzugehen, die zu einer chemischen Umwandlung des Hämoglobins führt, insbesondere in Form einer bräunlichen Verbindung.

Die bevorzugten Behandlungsbedingungen umfassen eine Inkubierung bei einer Temperatur, die vorzugsweise oberhalb der Raumtemperatur liegt und sich bis zu 6o°C erstrecken kann. Vorzugsweise bewirkt man die Behandlung bei einer
Temperatur im Bereich von 37⁰C und häufig insbesondere
zwischen 5o und 56°C im Fall der Aldehyde.
2o

Die im folgenden angesprochenen Prozentsätze sind auf das Volumen bezogen, wenn nichts anderes angegeben ist.

Vorzugsweise beträgt die Konzentration der behandelten
roten Blutkörperchen, die dieser Behandlung unterworfen
werden, in dem Medium, in dem sie inkubiert werden, 1
bis 1o %, während die Mengen der Aldehyde oder der Gerbmittel innerhalb der Bereiche variieren können, die in jedem Fall zu ermitteln sind, insbesondere im Bereich von
ο,2 bis 1 % für Formaldehyd, o,o5 bis 1,5% für Glutaraldehyd, o,25 bis 2,5 % für Pyruvaldehyd, o,oo5 bis o,o5
Gew.-% für Gerbsäure und o,o25 bis o,25 Gew.-% für Chromchlorid-hydrat (CrCl₃-OH₂O).

Der pH-Wert des Mediums wird vorteilhafterweise bei 5 bis

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9,5 und vorzugsweise in der Nähe des Neutralpunkts gehalten/ wenn man die Behandlung mit Aldehyden durchführt, und wird etwas niedriger gehalten, wenn man Gerbmittel verwendet, beispielsweise bei etwa 5,5, wenn man auf Chromsalze zurückgreift.

Bezüglich der zweiten Art von Substanz, die bei der Behandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, kann man insbesondere Serumalbumin oder andere Substanzen gleicher albuminoider Art, Seren anderer Tierarten oder Humanserum, Albuminfraktionen, aus diesen Seren isolierte ot- und ß-Globuline, Milchproteine, von Collagen abgeleitete kolloidale Eiweißsubstanzen, wie gereinigte Gelatine, und kolloidale Substanzen pflanzlichen Ursprungs, wie Gummi 5 arabicum nennen- Ganz allgemein kann man irgendwelche Eiweißsubstanzen mit dispergierenden Eigenschaften oder Substanzen verwenden, die in bezug auf die sensibilisierenden Antikörper eine kompetitive Reaktion eingehen, indem sie

- sich an der Membran der roten Blutkörperchen fixieren;

- oder sich mit den Antikörpern kombinieren, insbesondere dann, wenn die Behandlung mit einer solchen Substanz gleichzeitig mit der zweiten der Behandlungen mit Hilfe eines Aldehyds oder eines Gerbmittels durchgeführt wird.

Man kann auch auf andere Substanzen, die eine Dispergiermittelwirkung entfalten, zurückgreifen, insbesondere in der Sensibilisierungszone zwischen 2 und 5 Hämagglutinatiönseinheiten des hämolytischen Serums, wie Polyvinylpyrrolidon, das beispielsweise unter der Bezeichnung SUB-TOSAN bekannt ist, und anionische, kationische oder nichtionische Emulgiermittel.

Mit Vorteil bewirkt man die Behandlung mit der Eiweißsub-

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stanz mit Dispergiermittelwirkung bei einer Temperatur oberhalb 37 C und vorzugsweise zwischen 5o und 60⁰C, bei einem pH-Wert zwischen etwa 7 und etwa 9,2, insbesondere zwischen 7 und 8,5. In gleicher Weise bewirkt man die Behandlungen mit den Aldehyden oder den Gerbmitteln, vorzugsweise die letztere dieser Behandlungen bei den gleichen Temperatur- und pH-Bedingungen. Wenn man eine abschließende Behandlung der roten Blutkörperchen mit Polyvinylpyrrolidon oder einem der oben erwähnten Emulgiermittel durchführt, ist es von Vorteil, bei stärker alkalischen pH-Werten zu arbeiten, die sich bis zu 9,2 erstrecken können. Mit Vorteil beträgt die Menge der roten Blutkörperchen in dem Inkubierungsmedium ebenfalls etwa 1 bis 1o %, während die relative Konzentration der dispergierenden Substanzen ihrerseits mit Vorteil im Bereich von o,5 bis 5 g/l liegt.

Diese verschiedenen Behandlungen erfolgen in Suspension, wobei die relativen Konzentrationen der eingesetzten Mittel vorteilhafterweise jenen entsprechen, die weiter unten in den Beispielen angegeben sind.

Erfindungsgemäß werden überraschende Effekte ausgenützt, die durch die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hervorgerufen werden und die darin bestehen, daß die spontanen Hämagglutinationsphänomene der erhaltenen Komplexe aus roten Blutkörperchen und Antikörpern in Abwesenheit des Rheumatoidfaktors unterdrückt werden und dies bis zu relativ geringen Verdünnungen, und in dem Auftreten andererseits dieser Hämagglutinationsphänomene bei wesentlich höheren Verdünnungen in Gegenwart des Rheumatoidfaktors. Erfindungsgemäß wird somit der große Unterschied der Hämagglutinationstiter ausgenützt, die in dieser Weise gemessen werden können, um biologische Proben zu unterscheiden, die entweder den Rheumatoidfaktor ent-

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halten oder diesen nicht enthalten. Das erfindungsgemäße Verfahren hat weiterhin neben der Stabilität des Reagens zur Folge, Reagenzien zu liefern, die einen hohen Antikörpergehalt aufweisen, was eine selektive Unterscheidung des eventuell vorhandenen Rheumatoidfaktors von HeteroAntikörpern, Anti-rote Blutkörperchen fremden Ursprungs oder Forsman-Antikörper, die in den Humanseren vorhanden sind, ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Mittel, das den oben definierten Komplex enthält, welches Mittel vorzugsweise o,15 bis 3 %, insbesondere o,25 bis 2,5 % des fraglichen Komplexes in Form einer Suspension in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis 8,2 enthält. Die Lösung kann Dispergiermittel des oben beschriebenen Typs oder klassische Konservierungsmittel, wie Merseptyl oder Natriumazid, enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zum Nachweis des Rheumatoidfaktors oder analoger Faktoren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das zu untersuchende Serum (oder eine andere biologische Probe, insbesondere Gelenkflüssigkeit) in Reagenzgläschen oder dergleichen mit dem Komplex in Kontakt bringt und über das Feststellen des Auftretens einer dispergierten Hämagglutination ermittelt, ob das Serum den Rheumatoidfaktor enthält oder nicht.

Das Reagens und das zu untersuchende Serum oder die analoge Probe werden gegebenenfalls zuvor verdünnt. Im allgemeinen ist es nicht erforderlich, zuvor eine Adsorption der zu untersuchenden Probe durchzuführen, um Parasiten-Antikörper zu entfernen.

Die Anwesenheit des Rheumatoidfaktors in dem Serum eines

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Patienten manifestiert sich andererseits durch die Abwesenheit einer Sedimentation und insbesondere durch die Bildung eines Teppichmusters von sensibilisierten roten Blutkörperchen nach einigen Stunden des Kontakts in einer Pufferlösung, die insbesondere einen im wesentlichen neutralen pH-Wert aufweist, mindestens bis zu einem bestimmten Grenzwert oder Schwellenwert. Dieser Grenzwert oder Schwellenwert gibt weiterhin einen quantitativen Hinweis auf den Gehalt des in Rede stehenden Rheumatoidfaktors in dem untersuchten Serum.

Weitere Ausführungsformen, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von erfindungsgemäßen Reagenzien und ihrer Herstellung. 15

1. Auswahl der Reaktionsteilnehmer

Den erfindungsgemäßen Komplex kann man ausgehend von irgendwelchen roten Blutkörperchen und irgendeinem sensibilisierenden hämolytischen Serum herstellen, wie sie in der nachstehenden Tabelle angegeben sind:

Rote Blutkörperchen. . Sensibilisierendes Serum

A oder B Iso-Immunserum Anti A oder

Anti B

O Rh+ (CD)⁺ Anti-Rh-Serum

Schaf Kaninchen-Anti-Schaf

Schaf Kaninchen-Anti-Ziege

Ziege Kaninchen-Anti-Ziege

Ziege Kaninchen-Anit-Schaf

. Rind Kaninchen-Anti-Rind

Meerschweinchen Kaninchen-Anti-Meerschweinchen

Huhn Kaninchen-Anti-Huhn

Schaf Meerschweinchen-Anti-Schaf

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Schaf Pferd-Anti-Schaf

Maus Kaninchen-Anti-Maus

Meerschweinchen Kaninchen-Anti-Meerschweinchen

Schaf Meerschweinchen-Anti-Schaf

Pferd Meerschweinchen-Anti-Pferd

Rind Meerschweinchen-Anti-Rind

Schaf Schafs-Iso-Immunserum

Schaf Ziege-Anti-Schaf

Hundskopfäffe Kaninchen-Anti-Hundskopfäffe

To Katze Kaninchen-Anti-Katze

+) O Rh+ (CD): Rhesus-System, das durch die Anwesenheit von allomorphen Genpaaren, die als CD bezeichnet werden, in den roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist. Π5

Das System aus menschlichen roten Blutkörperchen der Blutgruppe O, Rhesus negativ und dem Kaninchenserum Anti-menschliche rote Blutkörperchen hat sich bei den Untersuchungen dieses Komplexes als besonders interessant erwiesen»

2. Gewinnung der roten Blutkörperchen

Man entnimmt Schafsblut unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Anti-Koagulans, wie Athylendiamintetraessigsäure (EDTA) (die auch unter der Bezeichnung "Complexon III" bekannt ist) in Form einer Lösung mit einer Konzentration von 1 g/l in physiologischem Serum mit einem Natriumchloridgehalt von 9 g/l. Man kann auch andere Anti-Koagulantien verwenden, wie beispielsweise Natriumcitrat.

Die frisch gewonnenen Blutkörperchen (9 Vol/Vol der Äthylendiamintetraessigsäure-Lösung) werden anschließend viermal mit physiologischem Serum (9g NaCl/1) gewaschen.

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Wenn die überstehende Flüssigkeit noch Hämolyse zeigt (was mit einem Colorimeter bei 53o nm nachgewiesen werden kann) führt man noch einen oder mehrere zusätzliche ^: Waschvorgänge durch.
5

Die gewaschenen roten Blutkörperchen werden anschließend entweder in einer Konzentration von 1o % in physilogischem Serum suspendiert, um später mit dem Immun-Serum in Kontakt gebracht zu werden,oder werden vorzugsweise zuvor einer Vorbehandlung mit Formaldehyd oder einem Tannine liefernden Mittel unterworfen, insbesondere wie folgt:

3. Bereitung der mit Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen

Zu 1 Vol. einer 5 bis 15 vol.-%-igen Suspension von roten Blutkörperchen vom Schaf in physiologischem Serum (NaCl-Lösung mit einer Konzentration von 9 g/l) gibt man ein gleich großes Volumen einer verdünnten 1 bis 5 %-igen Lösung von Formaldehyd in physiologischem Serum (wobei der eingesetzte Formaldehyd ein 4o %-iger Formaldehyd ist, der zuvor mit einer 1 η Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7,2 neutralisiert worden ist).

Man inkubiert die Suspension unter ständigem schwachem Rühren bei einer Temperatur zwischen 25 und 56°C während 12 bis 22 Stunden in Abhängigkeit von dem Ansatz. Anschließend wäscht man zwei- oder dreimal mit physiologischem Serum.

4. Herstellung des hämolytischen Kaninchenserums Anti-Schaf

Man verdünnt die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen frischen roten Blutkörperchen vom Schaf mit 1 Vol. physiologischem Serum, das der Hälfte ihres Volumens entspricht.

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Man injiziert Kaninchen vier- bis fünfmal mit einem Intervall von einer Woche 3 ml der roten Blutkörperchen auf subcutanem Wege und führt dann zwei intravenöse Injektionen durch.
5

Nach Bestimmung des Serumtiters entnimmt man das Blut des Tieres eine Woche nach der letzten Injektion durch Punktieren der Halsschlagader. Nach dem Koagulieren des Bluts gewinnt man das Serum, das man zur Zerstörung der zusätzlichen Bestandteile auf 56°C erhitzt.

Man bewahrt das Serum dann in sterilen Ampullen bei +4⁰C auf.

5. Einstellen des Titers des hämolytischen Serums

Man verwendet dieses vollständige hämolytische Anti-Schaf-Kaninchenserum oder die IgG-Fraktion, die man ausgehend von diesem Serum unter Anwendung an sich bekannter biochemischer Verfahren erhalten hat.

Zur Bestimmung des Hamagglutxnationstxters des Serums bereitet man eine Verdünnungsreihe mit geometrischer Progression des zu untersuchenden hämolytischen Serums (oder der IgG-Fraktion) in einem Volumen von 5o μΐ mit einer 1/4obis 1/40000-verdünnung. Man führt in jede Verdünnung einen Mikrotropfen von 1o bis 5o μΐ, insbesondere von 16 bis 25 μΐ der mit Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen ein (oder beispielsweise die mit .''Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen, die mit Glutaraldehyd oder mit einer Gerbsäurelösung mit einer Konzentration von o,o1o bis 1o Gew.-% in einem annähernd neutralen Puffer, insbesondere einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 behandelt worden sind). Die Konzentration der roten Blutkörperchen liegt zwischen o,5 und 5 %, insbesondere zwischen o,5

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und 2,5 % (gemessenes Volumen des die roten Blutkörperchen umfassenden Zentrifugenrückstands, bezogen auf das Volumen des Puffers).

Der Titer des Serums entspricht dem Kehrwert der letzten Lösung, die keine Sedimentation der roten Blutkörperchen zeigt. Bezüglich des gemessenen Titers entspricht beispielsweise eine Verdünnung von 1 : 5ooo einer Hämagglutinationseinheit. Die nachstehend beschriebene Sensibilisierung der roten Blutkörperchen erfolgt mit einem Antikörperüberschuß von 2 bis 2o Hämagglutinationseinheiten, d. h. dem 1/25OOstel bis zum 1/25Ostel der angestrebten Empfindlichkeit.

6. Stabilisierung des gebildeten immunologischen Komplexes durch Kombination der mit Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen mit den Antikörpern der Anti-roten Blutkörperchen der entsprechenden Art

Die Behandlung der roten Blutkörperchen mit Formaldehyd, wie es in dem oben angesprochenen französischen Patent und dem genannten Zusatzpatent angegeben ist, genügt nicht dazu, die definitive Stabilität des Komplexes während einer 'längeren Zeitdauer gegen eine spontane Hämagglutination sicherzustellen, was eine Folge des großen angewandten Antikörper-Überschusses ist.

Die Behandlung mit Formaldehyd bei einer hohen Temperatur von 5o bis 56 C ermöglicht die Verbesserung der Resistenz der roten Blutkörperchen. Um jedoch eine Stabilität sehr großer Dauer sicherzustellen, ist es erfindungsgemäß unerläßlich, eine zweite Behandlung mit Formaldehyd oder einer anderen Aldehydsubstanz, wie Glutaraldehyd, oder einer Substanz mit Gerbwirkung, wie Gerbsäure, in Gegenwart von Albumin oder eines Proteins mit äquivalenten Eigenschaften

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durchzuführen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
5

Beispiel 1

Man suspendiert mit Formaldehyd behandelte rote Blutkörperchen vom Schaf, wie sie oben unter Ziff. 3. erhalten worden sind, in dem Anti-Schaf-Kaninchenserum oder der aus diesem Serum gewonnenen gereinigten IgG-Fraktion, welches man mit einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 auf eine Konzentration von 5 bis 2o Hämagglutinationseinheiten gebracht hat unter Bildung einer Suspension, die 2 bis 1o Vol.-%, insbesondere 5 bis 1o Vol.-%, rote Blutkörperchen enthält.

Zu dieser Suspension gibt man 1 Vol. Glutaraldehyd mit einer Konzentration von o,1 bis 3 % oder eine Gerbsäurelösung mit einer Konzentration von o,o1o bis o,o5 Gew.-% in einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2, der 1 bis 1o g/l Rinderalbumin enthält, und erhitzt während mindestens einer Stunde auf eine Temperatur von mindestens 37°C und vorzugsweise eine Temperatur zwischen 5o und 56°C.

Der erhaltene stabilisierte Komplex wird mehrfach mit einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2, der 3 g/l Rinderalbumin enthält, gewaschen und wird schließlich mit einer Konzentration von o,5 bis 2,5 % in einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis 8,2, die Rinderalbumin in einer Konzentration von 1 bis 1o g/l ent- " hält, aufgenommen. Als Konservierungsmittel kann man o,1 g/l Merthiolat, das unter der Bezeichnung MERSEPTYL bekannt ist, oder 1g/l Natriumazid verwenden. Man kann'auch an-

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dere Konservierungsmittel einsetzen.

Man bereitet unter den gleichen Bedingungen eine Suspension von o,5 bis 2,5 % nichtsensibilisierter roter Blutkörperchen zu Vergleichszwecken in einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis 8,2.

Beispiel 2

Man bringt die unter Ziff. 3. erhaltenen, mit Formaldehyd behandelten roten Blutkörperchen in einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 in Suspension unter Bildung einer Suspension, die etwa 2,5 bis etwa 1o Vol.-% rote Blutkörperchen enthält. Man behandelt diese Suspension mit einem Volumen mindestens einer o,1 bis 3 %-igen Lösung von Glutaraldehyd in einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 während mindestens 1/2 Stunde oder einer o,o1o bis o,o5 gew.-%-igen Gerbsäurelösung in dem gleichen Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 während mindestens 1/2 Stunde bei einer Temperatur von 37 C. Anschließend wäscht man mehrfach mit dem Phosphat-Puffer.

Die in dieser Weise behandelten roten Blutkörperchen werden in einer Menge zwischen 5 und 1o % in dem Anti-Schaf-Kaninchenserum oder der aus diesem Serum durch Reinigen gewonnenen IgG-Fraktion, die man ihrerseits mit einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2, der 1 bis 1o g Rinderalbumin, Polyvinylpyrrolidon oder Gelatine pro 1 enthält, auf eine Konzentration von 2 bis 5 Hämagglutinationseinheiten verdünnt hat, in Suspension gebracht.

Dann erhitzt man unter ständigem Rühren während mindestens 1/2 Stunde auf eine Temperatur zwischen 5o und 56⁰C, wonach man mehrfach mit einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 wäscht.

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Der in dieser Weise stabilisierte immunologische Komplex wird schließlich in einer Konzentration von o,5 bis 2,5 % in einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 bis 8,2, der Rinderalbumin in einer Konzentration von 1 bis
1o g/l enthält, oder in einer Lösung des normalen Kaninchenserums in einer Konzentration von 1 bis 1o % (VoI/
VoI) oder in einer Lösung von o,1 g/l MERSEPTYL oder 1 g/l Natriumazid suspendiert.

Beschreibung der neuen direkten Hämagglutinationstechnxk in Mikroplättchen zur Bestimmung des "Rheumatoidfaktors"

Mit dem erfindungsgemäßen stabilisierten Reagens ist es
möglich, eine neue Methode der Titration oder Bestimmung des Rheumatoidfaktors durchzuführen, beispielsweise in

Mikroplättchen des Typs, die unter der Handelsbezeichnung "Microtiter System" bekannt sind.

Die Einzelheiten und die Vorteile des neuen Titrierverfahrens ergeben sich genauer aus der folgenden Beschreibung.

Man verwendet Mikroplättchen aus Kunststoffmaterial, die auf ihrer Oberseite mit zylindrischen Vertiefungen versehen sind, deren Boden konisch (V-förmig) ausgebildet ist. Man kann auch Plättchen verwenden, deren Vertiefungen am Boden U-förmig sind, oder man kann schließlich Röhrchen
aus Glas oder einem Kunststoff, die einen U-förmigen Boden besitzen, einsetzen.

Zum Verdünnen des Serums verwendet man eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 8,2, wozu man sämtliche bekannten Puffer einsetzen kann, wie Phosphat-Puffer, Tris-Puffer, Glykokoll-rPuffer, die man gegebenenfalls mit Albumin etc. versetzen kann. Der Phosphat-Puffer mit einem

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pH-Wert von 7,2 ist besonders gut geeignet, Man kann anschließend wie folgt vorgehen;

1· Man bereitet eine Mutterverdünnung des zu untersuchenden Serums von 1/2o. Hierzu überführt man 5o μΐ des Serums in ein einmal- zu verwendendes Kahn-Röhrchen und gibt 95o μΐ der Pufferlösung zu. ,

2. Mit Hilfe einer Mikropipette verteilt man jeweils 5o μΐ der Pufferlösung in die 12 Vertiefungen einer Reihe einer Platte des "Mikrotiter-Systems", Man gibt dann 5.o μΐ der Mutterverdünnung des Serums in die erste Vertiefung, vermischt mit einem gleich großen Volumen des Puffers und überführt 5o μΐ aus der ersten Vertiefung in die zweite Vertiefung, dann nach dem Vermischen der zweiten Verdünnung in die dritte Vertiefung usw., bis zu der 11. Vertiefung. Anschließend entfernt man 5p μΐ aus der 11. Vertiefung. In dieser Weise erhält man die folgenden Verdünnungen:

. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 1/4o 1/8o 1/16Ο 1/32Ο 1/64o 1/-j28o 1/256o 1/512o

9. 1o. 11.
1/1o24o 1/2o48o 1/4o96o

Man beschickt die 12. Vertiefung mit 59 μΐ der Mutterverdünnung des Serums einer Verdünnung von 1/2o. D^nn vermischt man mit einem gleich großen Volumen des Puffers und entfernt 5o μΐ. Diese Verdünnung 1/4o versetzt man mit 1 Mikrotropfen (I/60 ml) eines Reagens von "Kontroll-roten Blutkörperchen" (d. h. roten Blutkörperchen, die den gleichen Behandlungen unterworfen worden sind, wie die in dem Kontrollreagens enthaltenen, mit Ausnahme der Sensibxlisxerung mit dem Anti-rrote Blut-

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körperchen-Immunserum). Die erhaltene Mischung stellt das Kontrollserum dar, das normalerweise nicht zu einer Hämagglutination führt. Man gibt einen Mikrotropfen
(1/6o ml) des die stabilisierten sensibilisierten roten Blutkörperchen enthaltenden Reagens in die anderen elf Vertiefungen.

Man bewegt die Platte, um eine gute Homogenisierung
sicherzustellen und immobilisiert die Platte dann bei Raumtemperatur während der gesamten restlichen Testdauer .

Man bewirkt die Bewertung etwa 2 Stunden später.

Positive Reaktion: Keine Sedimentation der roten Blutkör perchen
Negative Reaktion: Punktförxnige Abscheidung von sedimen-

tierten roten Blutkörperchen.
2o

Der Titer des Rheumatoidfaktors in dem Serum entspricht
der stärksten Verdünnung des Serums, in der man keine Se dimentation von roten Blutkörperchen beobachtet.

Die große Stabilität des immunologischen Komplexes, der
dazu in der Lage ist, den "Rheumatoidfaktor" nachzuweisen, während mindestens 2 Jahren bei +4 C ermöglicht die Voreichung dieses Reagens gemäß der oben beschriebenen
Methode zur Untersuchung von Humanseren in bezug auf das internationale Standardserum der rheumatoiden Polyarthri tis der Weltgesundheitsorganisation, das in Bull. Who.
(S.G. Anderson, M.W. Bentzon, V. Houba, P. Krag "Interna tional reference preparation of rheumatoid arthritis serum, Bull. Who 42 (197o) 311) definiert ist. Das Interna tionale Standardserum erhält man durch Auflösen von 17,1

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- 3ο -

mg des internationalen pulverförmigen Standards mit einem Gesamttiter von 1oo IE in 4 ml einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2, d. h. zur Bildung einer Lösung mit einer Konzentration von 25 ΙΕ/ml. Die Lösung wird anschließend im Gefrierschrank bei -2o°C aufbewahrt.

Dann bildet man wie im Fall der zu untersuchenden Seren Verdünnungen von 5o μΐ des Standards in Mikroplättchen in einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 von 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1o24 und 1/2o48. Man beschickt jede Vertiefung mit einem Mikrotropfen (1/6o ml) des sensibilisierte rote Blutkörperchen enthaltenden Reagens, dessen Titer bestimmt werden soll. Die Schwelle der Grenzempfindlichkeit entspricht der stärksten Verdünnung des Standards, bei der eine Hämagglutination der roten Blutkörperchen erfolgt. Wenn beispielsweise die Verdünnung 1/256 beträgt, entspricht der Titer des Präparats der sensibilisierten roten Blutkörperchen 25:25 = o,1 IE/ ml, was bei einem Serum, dessen erste untersuchte Verdünnung 1/4o beträgt, einer Empfindlichkeit von 4 ΙΕ/ml entspricht. In dieser Weise kann der Rheumatoidfaktor-Titer des Serums direkt in ΙΕ/ml ausgedrückt werden.

In dieser Weise entspricht beispielsweise eine positive Grenzreaktion bei einer Verdünnung von 1/28o 128 IE/ml, wenn man eine Verdünnungsreihe mit einer Gruppe von stabilisierten Reagenzien anwendet, deren Empfindlichkeitsschwelle o,1 beträgt, wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, in der die angegebenen Verhältnisse den Verdünnungen entsprechen und die in ΙΕ/ml angegebenen Zahlenwerte jeweils den betreffenden Konzentrationen des Rheumatoidfaktors entsprechen, die dann abzulesen sind, wenn die entsprechende Verdünnung eine "positive Grenzreaktion" repräsentiert.

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	IE/ml	- 31 -	3105555	IE/ml
	4		128
Verdünnung	8	Verdünnung	256
1/4o	16	1/128O	512
1/8o	32	1/256O	1o24
1/1 60	64	1/512O	2o48
5 1/32O		1/1o24o	4o96
1/64O	1/2o48o
	1/4o96o

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Claims

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Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska 3105555

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Reagens zum Nachweis des Rheumatoidfaktors, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

P a t. e η t a η s ρ r ü c h e

1 .J Reagens zum Nachweis des Rheumatoidfaktors bei
Reagenzglas- oder Mikroplättchenversuchen, enthaltend einen Komplex, der gebildet ist aus roten Blutkörperchen
und löslichen Antikörpern bezüglich dieser roten Blutkörperchen, die immunologisch auf diesen roten Blutkörperchen fixiert sind, dadurch gekennzeichnet , daß es zugleich stabil ist und, wenn es mit einem biologischen Medium in Kontakt gebracht wird, nur dann eine
Hämagglutination ergibt, wenn das Medium nachweisbare
Konzentrationen eines Rheumatoidfaktors enthält.

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2. Reagens nach Anspruch 1/ dadurch gekennzeichnet , daß das Verhältnis von Hämagglutinationstiter zu Komplex-Agglutinationstiter größer ist als
3. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Komplex eine relative Antikörpermenge enthält, die ihm eine Empfindlichkeitsschwelle in bezug auf das internationale Standardserum der rheumatoiden Polyarthritis der Weltgesundheitsorganisation von etwa o,oo1 bis 1 Internationale Einheiten/ml verleiht.
4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Empfindlichkeitsschwelle des Komplexes o,o5 bis o,3o Internationale Einheiten/ml beträgt.
5. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Komplex eine NachweisschwelIe für den Rheumatoidfaktor in einem 1 : 4o verdünnten Serum von etwa 0,4 bis 40 Internationale Einheiten/ml aufweist.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Nachweisschwelle des Komplexes für den Rheumatoidfaktor etwa 2 bis 12 Internationale Einheiten/ml beträgt.
7. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der relative Antikörpergehalt des Komplexes, bezogen auf die roten Blutkörperchen, im Bereich von etwa 2 bis etwa 3o Hämagglutinationseinheiten liegt.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß der relative Antikörpergehalt des Komplexes, bezogen auf die roten Blutkörperchen, zwisehen etwa 3 und etwa 1o Hämagglutinationseinheiten liegt.

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9. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Komplex aus roten Blutkörperchen vom Schaf gebildet ist, an die Anti-Schaf-Antikörper von Kaninchen gebunden sind.

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10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Hämagglutinationstiter zu dem Agglutinationstiter des Komplexes mindestens 2o beträgt.
11. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Hämagglutinationstiter und Agglutinationstiter des Komplexes mindestens 4o beträgt.
12. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß es den Komplex in einer Menge von o,25 bis 3 % in Suspension in einer Lösung mit einem pH-Wert von 7,2 bis 8,2 enthält.
13. Verwendung des Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zum Nachweis des Rheumatoidfaktors in einem biologischen Medium, durch Inkontaktbringen steigender Verdünnungen dieses biologischen Mediums mit dem Reagens in Reagenzgläsern oder auf Mikroplättchen.
14. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus roten Blutkörperchen und löslichen Antikörpern bezüglich dieser roten Blutkörperchen, die durch immunologische Bindungen an diese roten Blutkörperchen gebunden sind, zur Bildung eines stabilen Komplexes, der nur dann beim Inkontaktbringen mit einem biologischen Medium eine Hämagglutination ergibt, wenn das biologische Medium nachweisbare Konzentrationen eines Rheumatoidfaktors enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die roten Blutkör-

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perchen und die immunologisch an diese roten Blutkörperchen zu fixierenden Antikörper

- einer Folge von mindestens zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen mit zwei verschiedenen Aldehyden bzw. Gerbmitteln und

- einer dritten Behandlung mit einer dispergierenden Substanz unterzieht,

wobei mindestens die erste der beiden Behandlungen der genannten Folge und die dritte Behandlung der roten Blutkörperchen in Gegenwart der an diese roten Blutkörperchen zu bindenden Antikörper durchgeführt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß die relativen Verhältnisse von in Gegenwart der roten Blutkörperchen jeder dieser genannten Behandlungen unterworfenen Antikörper derart gesteuert werden, daß sie einerseits mit dem erhöhten Stabilitätsgrad verträglich sind, der nach der Durchführung jeder dieser Behandlungen erreicht werden kann, und daß andererseits schließlich ein Reagens erhalten wird, das ein relatives Verhältnis von gebundenen Antikörpern gegenüber den roten Blutkörperchen zwischen etwa 2 und etwa 2o Hämagglutinationseinheiten aufweist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die relativen Anteile der Antikörper derart gesteuert werden, daß man eine relative Endkonzentration von 3 bis 1o Hämagglutinationseinheiten erreicht.
17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß die genannten Behandlungen bei einem pH-Wert von 5 bis 9,5 und bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 6o°C durchgeführt werden.

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18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß einerseits die Aldehyde aus der Formaldehyd, Glutaraldehyd, Pyruvaldehyd, Glyoxal und Methylglyoxal umfassenden Gruppe und die Gerbmittel aus der Gerbsäure, pflanzliche und synthetische Tannine, p-Benzochinon, Sulfosalicylsäure und Substanzen mineralischen Ursprungs ausgewählt sind und andererseits die Dispergiermittel aus der Gruppe ausgewählt sind, die Serumalbumine, aus Humanserum isolierte α- und ß-Globuline, Milchproteine, von Collagen abgeleitete kolloidale Proteinsubstanzen, Gummi arabicum, Polyphenylpyrrolidon und anionische, kationische oder nichtionische Emulgiermittel umfaßt.

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