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Die Erfindung betrifft Erythrozyten oder Erythrozyten-Stroma,
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die kovalent an Polymere mit aromatischen Kernen, vorzugsweise sich
von Polystyrol ableitenden Benzolkernen, gebunden sind. Die Erfindung betrifft ferner
die Verwendung dieser an ein Polymer gebundenen Erythrozyten oder Stroma zum Abtrennen
und Nachweis von Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten.
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Die Bestimmung der Blutgruppe beispielsweise Vor einer Bluttransfusion
oder zur Diagnose oder Verhinderung von Krankheiten, beispielsweise der Hämolyse
des Neugeborenen, spielt eine wichtige Rolle in der Medizin. Der Zweck der Bestimmung
ist es, die Gegenwart von Antigenen, sogenannter Blutgruppen-Antigene, an Erythrozytenoberflächen
zu bestimmen und die Gegenwart von gegen bestimmte Oberflächenantigene gerichteten
Antikörpern im Serum von Patienten festzustellen. Infolge der Gefahren bei der Transfusion
von unverträglichem Blut erfolgt die Bestimmung der Blutgruppe routinemäßig bei
sämtlichem Spenderblut. Auch bei Eltern erfolgt die Blutgruppenbestimmung routinemäßig,
um die Wahrscheinlichkeit des Absterbens des Fetus oder der Schädigung der Frucht
durch eine Unverträglichkeit des fetalen Blutes mit dem Blut der Mutter festzustellen.
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Bei der Blutgruppenbestimmung wird die Gegenwart der Blutgruppen-Antigene,
beispielsweise A, B oder Rh, durch die Reaktion zwischen einer Probe des Patientenblutes
und einem gereinigten,gegen das fragliche Antigen gerichteten Antikörper bestimmt.
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Wenn bei der Zugabe des spezifischen Antikörpers zur Blutprobe eine
Agglutination oder Haemolyse erfolgt, wird der Test als positiv in Bezug auf das
fragliche Antigen angesehen.
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Es ist ersichtlich, daß die Blutgruppenbestimmung eine erhebliche
Menge an spezifischen Antikörpern für jedes der zu bestimmenden Blutgruppenantigene
erfordert. Diese spezifischen Antikörper werden zur Zeit aus menschlichem Serum
gewonnen, das immer ein Gemisch von Antikörpern enthält. Zu diesem Zweck wird so
ein Serum mit gereinigten humanen Erythrozyten, die Antigene gegen die nicht erwünschten
Antikörper tragen, versetzt. Die unerwünschten Antikörper verbinden sich mit den
Antigenen an den Erythrozyten und können dann mit den Erythrozyten aus dem Serum
zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt werden.
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Bei der Herstellung eines Serums, das nur Anti-D-Antikörper enthält,
verfährt man bisher so, daß man das Serum, das den erwünschten Antikörper (Anti-D)
im Gemisch mit einem nicht erwünschten Antikörper (beispielsweise Anti-A) enthält,
mit Erythrozyten der Gruppe A behandelt, um den unerwünschten Antikörper abzutrennen.
Die Erythrozyten, an welche anschließend die unerwünschten Anti-A-Antikörper komplex
gebunden sind, müssen verworfen werden und sind nicht wieder verwendbar. Deshalb
wäre ein Verfahren sehr erwünscht und ein signifikanter technischer Fortschritt,
das es gestattet, die unerwünschten Antikörper aus Serum ohne Verbrauch humaner
Erythrozyten abzutrennen.
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Die Bindung biologischer Substanzen an feste Substrate unter Beibehaltung
ihrer Aktivität ist bekannt. Beispiele für derartige Verfahren sind u.a. in den
US-Patentschriften 3 555 143, 3 788 948, 3 806 417, 4 046 723 und 4 059 685 beschrieben.
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In einer Arbeit von Campbell u.Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sci.
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USA, Bd. 37 (1951), S. 575,ist die Herstellung eines Diazobenzylcellulosederivats
sowie die Kupplung von Rinderserumalbumin an diesen festen Träger beschrieben. In
dem übersichtsartikel "Water-Insoluble Derivatives of Enzymes, Antigens, and Antibodies"
von 1.11. Silman und E. Katchalski in Annual Review of Biochemistry, Bd. 35 (II),
S. 873 (1966), ist eine ausgezeichnete Zusammenfassung der Arbeiten auf diesem Gebiet
bis etwa 1965 gegeben.
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Mehrere Porsche~ haben Erythrözytenmembranen (Stroma) in verschiedenen
Experimenten verwendet. Landsteiner und Shear, J. Exptl. Med., Bd. 63 (1936), S.
325, beschreiben die Verwendung von Stroma als unlösliches Substrat zur Verankerung
von Haptenen. Arquilla und Coblence, Anat. Record, Bd. 138 (1960), S. 203, beschreiben
die Verwendung eines Gemisches von Stroma und Cellulose zur Adsorption von Insulin
und die Verwendung dieses adsorbierten Konjugats zum Isolieren von Kaninchen-Insulin-Antikörpern
Arquilla und Finn, J. Exptl.
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Med., Bd. 118 (1963), S. 55, beschreiben die Verwendung von Stroma
als festes Substrat für Insulin, um dieses in einen unlöslichen Zustand zu überführen.
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Henry C. Isliker, Ann. N.Y. Academ. of Sci., Bd. 57 (2), S. 226-232
(November 1953) beschreibt die Bindung von Antigenen (einschließlich Stroma) an
Ionenaustauscherharze und schlägt die Verwendung dieser Substanzen zum Abtrennen
von Antikörpern aus beispielsweise humanem Plasma vor. Die Verwendung eines sulfonierten
aromatischen Amins als Verbrükkungsbindung ist ebenfalls vorgeschlagen. Dieses Verfahren
hat jedoch verschiedene Nachteile und fand deshalb keinen Eingang in die Praxis.
In dieser Arbeit ist speziell beschrieben, daß in erheblichem Umfang auch eine unspezifische
Adsorption von Antikörpern erfolgt, und daß es im allgemeinen nicht möglich ist,
unter milden Bedingungen mehr als etwa 55% der adsorbierten Antikörper zu eluieren.
Überdies weist das regenerierte Austauscherharz eine verminderte Adsorptionskapazität
im Vergleich mit dem frischen Harz auf. Mit dem Austauscherharz wurde ein abgetrenntes
Rh-Antigen kombiniert und zur Adsorption von vollständigen und unvollständigen Antikörpern
verwendet. Es ist keine Auswertung der Reinheit oder der Spezifität eines Serums
beschrieben, das mit einem an dem Austauscherharz gebundenen Antigen behandelt worden
ist.
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Die Herstellung von Diazoniumsalzen des Polystyrols sowie anderer
Polymerisate mit aromatischen Kernen ist bekannt. Sie ist beispielsweise in der
US-PS 2 274 551 beschrieben.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, an ein Polymer kovalent
gebundene Erythrozyten oder Stroma zur Verfügung zu stellen, wobei die Erythrozyten
oder Stroma über eine Diazoaminobrücke an das aromatische Kerne enthaltende Polymer
gebunden sind. Die Konjugate sollen sich zur wiederholten Herstellung von hochgereinigten
Blutgruppen-Antikörpern in hoher Ausbeute eignen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung
gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
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Die Herstellung der an ein Polymer gebundenen Erythrozyten oder Stroma
erfolgt folgendermaßen: Zunächst wird ein Polymer mit aromatischen Kernen nitriert.
Dieses Verfahren wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, beispielsweise durch
Behandlung des Polymers mit rauchender Salpetersäure. Hierauf wird das nitrierte
Polymer reduziert. Es wird ein aromatisch gebundene Aminogruppen enthaltendes Polymer
erhalten. Auch dieses Verfahren wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, beispielsweise
durch Umsetzung mit Natriumhydrosulfid und Natriumhydroxid. Schließlich wird das
Aminogruppen enthaltende Polymer diazotiert, vorzugsweise mit salpetriger Säure,
die in situ durch Umsetzung von Natriumnitrit mit Salzsäure hergestellt worden ist.
Das diazotierte Polymer (Polymerdiazoniumsalz) wird mit Erythrozyten oder Stroma
unter solchen Bedingungen umgesetzt, daß sich eine Diazoaminobrücke zwischen dem
Polymer-Diazoniumsalz und Erythrozyten oder Stroma ausbildet. Die Bildung dieses
Konjugats erfolgt beim Vermischen des Polymer-Diazoniumsalzes mit einer Lösung oder
Suspension von Erythrozyten oder Stroma in physiologischer Kochsalzlösung bei einem
pH-Wert von etwa 6 bis etwa 7,5 und bei Raumtemperatur. Die Temperatur ist nicht
besonders kritisch. Bei Verwendung von Aminogruppen enthaltendem Polystyrol und
Stroma liefern 2 g Polystyroldiazoniumchlorid pro 1 g gefriergetrock-
netes
Stroma ein brauchbares Polystyrol-Stroma-Konjugat.
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Dieses Gewichtsverhältnis ist jedoch nicht kritisch. Das Mengenverhältnis
von Polystyroldiazoniumsalz zu Erythrozyten oder Stroma wird so eingestellt, daß
ein gutes Konjugat erhalten wird. Hierzu genügen einige orientierende Versuche.
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Es wird speziell Bezug genommen auf die US-PS 2 274 551, in der ein
Verfahren zur Herstellung von Diazoniumsalzen von aromatische Kerne enthaltenden
Polymerisaten erläutert ist.
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Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Polystyrol als
bevorzugtem Polymerisat erläutert, doch kann jedes Polymerisat mit aromatischen
Kernen verwendet werden, einschließlich solcher Polymerisate, bei denen die aromatischen
Kerne in anderer Weise an die Kohlenwasserstoffpolymerkette gebunden sind. Beispielsweise
können Kohlenwasserstoffpolymerisate mit Benzolringen verwendet werden, die an die
Polymerkette über Kohlensuoff-Kohlenstoff-Bindungen gebunden sind, wie Polystyrol
oder Polydihydronaphthalin. Ferner können Polymerisate mit aromatischen Kernen als
Teil der Polymerkette verwendet werden, beispielsweise Phenol-Formaldehyd-Kondensate,
oder Polymerisate, bei denen der aromatische Kern an die Polymerkette über eine
Säureamid-Bindung gebunden ist, wie beim Polyacrylanilid. Sämtliche derartigen Kunstharze
können an den aromatischen Kernen nitriert, sodann reduziert und unter Bildung eines
Polymer-Diazoniumsalzes diazotiert werden.
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Polymerisate mit einem Benzolkern können schematisch durch folgende
allgemeine Formel I
wiedergegeben werden, die sämtliche vorstehend angesprochenen Polymerisate umfassen
soll.
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Die Erfindung betrifft also an ein-Polymer gebundene Erythrozyten
oder Stroma. Diese Polymeren enthalten aromatische Kerne, insbesondere Benzolkerne,
an die die Erythrozyten
oder Stroma über Diazoaminobrücken gebunden
sind. Diese Substanzen werden nachstehend als Polymer-Erythrozyten- oder Polymer-Stroma-Konjugate
bezeichnet. Spezielle Konjugate sind somit beispielsweise Polystyrol-Erythrozyten-
oder Polystyrol-Stroma-Konjugate. Diese Konjugate eignen sich zum spezifischen Abtrennen
oder zum Nachweis von Blutgruppen-Antikörpern in Körperflüssigkeiten. Beispielsweise
kann ein Antikörper gegen ein an das Stroma gebundenes Antigen spezifisch aus z.B.
einer biologischen Flüssigkeit abgetrennt werden, ohne andere Antikörper gleichzeitig
mit abzutrennen, wenn die biologische Flüssigkeit mit einer ausreichenden Menge
des Konjugats zusammengebracht wird. Andererseits kann durch eine Bestimmung des
prozentualen Gehalts der polymergebundenen Stroma-Antigenvalenzen, die sich mit
einem Antikörper verbunden haben, die Anwesenheit und Konzentration von Antikörpern
in der biologischen Flüssigkeit bestimmt werden.
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Die Erfindung betrIfft somit ferner Verfahren zur spezifischen Bestimmung
oder Abtrennung eines Blutgruppen-Antikörpers aus einem Gemisch, z.B. einer biologischen
Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dieses Gemisch mit einem Polymer-Erythrozyten-
oder Polymer-Stroma-Konjugat zusammenbringt, das durch die allgemeine Formel III
wiedergegeben wird, wobei S Erythrozyten oder Stroma bedeutet.
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Dieses Konjugat weist die Oberflächenantigene auf, die mit dem Antikörper
in Reaktion treten. Der Antikörper wird an das Konjugat gebunden. Hierauf wird dieser
Konjugat-Antikörper Komplex aus dem Gemisch abgetrennt. Als Gemisch kann eine biologische
Flüssigkeit, wie Serum, dienen.
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Zur Bestimmung der Konzentration des freien Antikörpers in der biologischen
Flüssigkeit kann der Prozentsatz an Valenzen am Konjugat, die sich mit dem Antikörper
verbunden haben, in an sich bekannter Weise bestimmt werden, beispielsweise mit
Hilfe des Radioimmuntests oder einem Enzymimmuntest. Ferner kann der Konjugat-Antikörper-Komplex
auf die nachstehend beschriebene Weise gespalten und die Konzentration oder die
Menge an abgespaltenen Antikörpern bestimmt werden.
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Dieses Verfahren kann schematisch folgendermaßen erläutert werden:
Ein Polymer mit aromatischen Kernen wird auf die vorstehend beschriebene Weise in
sein Diazoniumsalz überführt.
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Das Polymer-Diazoniumsalz hat die nachstehend wiedergegebene allgemeine
Formel II, in der X ein Anion darstellt. Die Umsetzung dieses Polymer-Diazoniumsalzes
mit Erythrozyten oder Stroma (S) liefert das Polymer-Konjugat der allgemeinen Formel
III:
Die Erythrceyten oder Stroma werden an das Polymer-Diazoniumsalz entweder über eine
primäre oder eine sekundäre Aminogruppe unter Bildung einer Diazoaminobindung gebunden.
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Beim Zusammenbringen des Polymer-Konjugats mit einer biologischen
Flüssigkeit wird der abzutrennende Antikörper (Ab) spezifisch gebunden. Dies wird
durch die allgemeine Formel IV erläutert.
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Auf diese Weise wird der Antikörper ohne Abtrennung anderer Antikörper
aus der biologischen Flüssigkeit entfernt.
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Die Erfindung eignet sich speziell zur Gewinnung reiner Antikörper,
wie Anti-A, Anti-B und Anti-D, zur Bestimmung von Blutgruppen-Antigenen, wie A,
B oder D in der Humanmedizin.
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Die Gewinnung von reinem Anti-D ist lediglich als Beispiel angegeben.
Es ist ersichtlich, daß zur Gewinnung dieses Antikörpers die unerwünschten Antikörper
der Hauptblutgruppen, nämlich Anti-A und Anti-B, abgetrennt werden müssen. Dies
wird nach den üblichen Verfahren dadurch erreicht, daß man Anti-D positives Serum
mit Erythrozyten der Gruppe A oder B, die aber D-negativ(= Rh-negativ) sind, behandelt.
Die Anti-A oder Anti-B-Antikörper binden sich an diese A- und B-Erythrozyten, während
die Anti-D-Antikörper im Serum verbleiben. Die Abtrennung der Erythrozyten mit den
gebundenen Anti-A und Anti-B-Antikörpern ist die erste Stufe bei der Herstellung
eines reinen Anti-D-Serums, das sich zur Bestimmung von Rh-Faktoren eignet. Diese
bekannte Art der Reinigung von Antikörpern ist zwar anhand der Bestimmung von Rh-Faktoren
erläutert, doch ist ersichtlich, daß das gleiche Prinzip zur Herstellung jedes reinen
Anti-Serums anwendbar ist. Der Hauptnachteil der bekannten Reinigungsverfahren ist
darin zu erblicken,daß jeweils frische Erythrozyten, die nur einmal verwendet werden
können, für die Reinigung erforderlich sind. Diese Erythrozyten sind natürlich teuer.
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Erfindungsgemäß ist es möglich, die äußere Membran bzw. die Gerustsubstanz
der Erythrozyten, die - unter anderen Antigenen - die für die Hauptblutgruppen verantwortlichen
Antigenendeterminanten enthält, kovalent an einen Polymerträger, beispielsweise
Polystyrolperlen, Reagenzgläser, Objektträger oder Teststreifen, zu binden. Dieses
Polymer-Stroma-Konjugat kann sodann zur spezifischen Abtrennung der entsprechenden
Antikörper aus Serum verwendet werden. Beispielsweise entfernt ein Polymer-Stroma-Konjugat
aus A-positiven, D-negativen Erythrozyten die Anti-A-Antikörper, jedoch keine Anti-D-
Antikörper,
während ein Polymer-Stroma-Konjugat aus B-positiven und D-negativen Erythrozyten
die Anti-B-Antikörper, jedoch keine Anti-D-Antikörper abtrennt.
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Ein entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Polymer Stroma-Konjugate
gegenüber ungebundenen Erythrozyten ist darin zu erblicken, daß die erfindungsgemäßen
Konjugate wieder verwendbar sind, was bei den Erythrozyten nicht der Fall ist.
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Beim Einbringen eines Polymer-Stroma-Antikörperkomplexes in eine saure
Lösung wird der vorher gebundene Antikörper wieder abgespalten und das Polymer-Stroma-Konjugat
kann erneut verwendet werden. Dieses Konjugat ist in zahlreichen Fällen wirksamer
bei der Abtrennung unerwünschter Antikörper als ungebundene freie Erythrozyten.
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Die Möglichkeit der Regenerierung des Polymer-Stroma-Konjugats durch
Abspaltung des Antikörpers in einer sauren Lösung hat den weiteren Vorieil, daß
der abgespaltene Antikörper in praktisch reiner Form gewonnen werden kann. Erfindungsgemäß
ist es somit möglich, einen bestimmten Antikörper in praktisch reiner Form auf folgende
Weise zu erhalten, nämlich entweder durch spezifische Abtrennung nicht erwünschter
Antikörper aus einem Serum durch ihre Bindung an ein Polymer-Stroma-Konjugat oder
durch spezifische Adsorption des gewünschten Antikörpers an das Polymer-Stroma-Konjugat
und anschließende Abspaltung des Antikörpers und Isolierung. Praktisch können alle
gebundenen Antikörper auf diese Weise von dem Polymer-Stroma-Konjugat wieder eluiert
werden. Bei den bisher bekannten Verfahrein, ist eine derartige Regenerierung nicht
möglich.
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Aus biologischen Flüssigkeiten lassen sich erfindungsgemäß nicht nur
Anti-D-Antikörper, sondern auch Antikörper gegen andere antigene Determinanten isolieren.
Beispiele für Blutgruppen-Antikörper sind außer Anti-D-Antikörpern die ABO- und
Rh-Antikörper, wie Anti-A, Anti-B, Anti-H, Anti-C, Anti-E, Anti-c Anti-e, Anti-f,
Anti-Ce, Anti-Cw, Anti-V, Anti-G, Anti-hrs und Anti-VS Antikörper. Weitere Beispiele
für Blutgruppen-
Antikörper, die mit den Konjugaten der Erfindung
isoliert werden können, sind Anti-Gamma, Anti-non-Gamma und Anti-Lewis-Antikörper.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung..
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Beispiel 1 5,0 g Polystyrolperlen einer Korngröße von 75 bis 150
Mikron werden in 50 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur gelöst.
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Nach etwa 10 bis 15 Minuten wird die Lösung in destilliertes Wasser
gegossen. Das ausgefällte Polystyrol wird von der Flüssigkeit abgetrennt und etwa
90 Minuten bei 1000C in einem Trockenschrank getrocknet. Sodann wird das getrocknete
Polystyrol zu einem feinen Pulver pulverisiert. Auf diese Weise werden Verunreinigungen,
wie Tenside, die aus der Herstellung des Polystyrols herrühren, entfernt.
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Das gereinigte Polystyrol wird langsam in 50 ml rauchende Salpetersäure
eingetragen, die in einem Eisbad gekühlt wird.
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Die Geschwindigkeit der Zugabe wird so eingestellt, daß die Temperatur
des Reaktionsgemisches unterhalb etwa 500C bleibt.
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Danach wird das Gemisch 60 Minuten gerührt und hierauf in kaltes destilliertes
Wasser gegossen. Das erhaltende nitrierte Polystyrol wird abfiltriert, mit Wasser
gewaschen und getrocknet.
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Das nitrierte Polystyrol wird sodann in 200 ml 2n Natronlauge eingetragen
und mit 12 g Natriumhydrosulfit versetzt.
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Das Gemisch wird 3 Tage bei etwa 1000C gerührt. Danach wird das Aminopolystyrol
enthaltende Reaktionsgemisch in einem Eisbad auf OOC abgekühlt und unter Rühren
mit 10 g Natriumnitrit versetzt. Hierauf wird in das Reaktionsgemisch unter Rühren
3n Salzsäure eingetropft. Während der Zugabe wird die Temperatur des Reaktionsgemisches
auf möglichst nahe OOC eingestellt. Die Umsetzung ist beendet, sobald bei der Zugabe
der Salzsäure keine weitere salpetrige Säure mehr ent-
wickelt
wird. Dies zeigt sich durch das Aufhören der Entwicklung von Stickoxid. Der pH-Wert
der erhaltenen Suspension des Polystyrol-diazoniumchlorids wird mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung
auf 7,5 eingestellt. Das erhaltene Polystyrol-diazoniumchlorid wird abfiltriert,
mit vollentsalztem Wasser gewaschen uni kurz vor der Herstellung des nachstehend
in Beispiel 2 geschilderten Konjugats getrocknet.
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Beispiel 2 2 g des in Beispiel 1 hergestellten Polystyrol-diazoniumchlorids-werden
in 20 ml einer 0,9prozentigen Kochsalzlösung eingetragen, und der pH-Wert wird entweder
mit 1n Salzsäure oder mit 1n Natriumbicarbonatlösung auf 7,0 - 0,2 eingestellt.
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Die erhaltene Suspension des Polystyrol-diazoniumchlorids wird mit
1 g gefriergetrocknetem B-positivem Stroma langsam versetzt und 30 Minuten gemischt.
Hierauf wird das erhaltene Polystyrol-Stroma-Konjugat drei- bis fünfmal mit 0,9prozentiger
Kochsalz lösung gewaschen, bis die Waschlösung klar abläuft. Das erhaltene Konjugat
ist nun verwendungsbereit.
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Beispiel 3 3 g des gemäß Beispiel 2 hergestellten Konjugats werden
in 30 ml Antiserum eingetragen, das Anti-B- und Anti-D-Antikörper enthält. Danach
wird das Gemisch auf 50C abgekühlt und 1 Stunde gerührt. Hierauf wird das Gemisch
10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Sodann wird der überstand, d.h.
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das Antiserum,dekantiert. Vor der Adsorption beträgt der Titer für
Anti-B-Antikörper 1-: 64. Die gesamte Anti-B-Aktivität wird durch eine einzige Adsorption
entfernt. Die Anti-D-Aktivität des Antiserums ist durch die Abtrennung der Anti-B-Antikörper
unverändert.
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Zur Regenerierung des Konjugats wird der Konjugat-Antikörper-Komplex
etwa fünfmal mit 0,9prozentiger Kochsalzlösung gewaschen, um freie Proteine abzutrennen.
Sodann wird der Konjugat-Antikörper-Komplex in 0,9prozentiger Kochsalz lösung
suspendiert
und der pH-Wert der Suspension mit 1n Salzsäure auf 2,7 bis 3,3 eingestellt. Hierdurch
werden die Anti-B-Antikörper abgetrennt. Nach etwa 90minütigem Stehen bei Raumtemperatur
wird die Suspension 10 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
Danach wird das Konjugat fünfmal mit 0,9prozentiger Kochsalzlösung gewaschen, hierauf
in 0,9prozentiger Kochsalzlösung suspendiert und die Suspension mit Natriumbicarbonat
auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Das Konjugat wird bei 5"C gelagert.
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Diese Regenerierung konnte 27ital ohne Verminderung der Adsorptionsaktivität
des Konjugats durchyeführt werden.
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Die vom Konjugat abgetrennten Anti-B-Antikörper können unmittelbar
verwendet werden.
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Beispiel 4 Das gemäß Beispiel 3 hergestellte gereinigte Anti-D-Antiserum
wird nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren an eine Anzahl von Polystyrol-diazoniumchlorid-Reagenzgläser
gebunden.
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Die Polystyrol-diazoniumchlorid-Reagenzgläser werden aus Polystyrol-Reagenzgläsern
nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 hergestellt. Ein Reinigen der Reagenzgläser
vor der Nitrierung ist jedoch nicht erforderlich. In einzelne Reagenzgläser werden
D-positive und D-negative Erythrozyten gegeben. Die D-positiven Erythrozyten werden
an die an der Wandung der Reagenzgläser gebundenen Anti-D-Antikörper adsorbiert,
während die D-negativen Erythrozyten nicht adsorbiert werden. Die adsorbierten D-positiven
Erythrozyten werden lysiert, dann die Hämoglobinmenge spektrophotometrisch gemessen,
um die Anzahl der zuvor adsorbiert gemessenen D-positiven Erythrozyten zu errechnen.
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Beispiel 5 Der nachfolgende Versuch erläutert die Fähigkeit eines
Polystyrol-Stroma-Konjugats zur Abtrennung von Anti-A,B-antikör-
pern.
Das Konjugat wird gemäß Beispiel 2 hergestellt, jedoch unter Verwendung eines Gemisches
von Stroma von Gruppe A-und B-Erythrozyten. Die Adsorption wird gemäß Beispiel 3
durchgeführt, jedoch wird vor dem Zentrifugieren 1 Stunde inkubiert.
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Das Zentrifugieren wird bei 250C und 3400 U/min durchgeführt.
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Anti-A,B-Serum mit einer starken Agglutinations-Reaktion bei.
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einer Verdünnung von 1:32 und einer noch körnigen Reaktion bei einer
Verdünnung von 1:1024 wird verwendet. Die Behandlung von 10 ml Stroma-Konjugat mit
1,0 ml Serum vermindert den Titer bei der körnigen Reaktion auf 1:8. Bei einer zweiten
Adsorption mit frischem Stroma-Konjugat ist dann die gesamte Anti-A,B-Aktivität
verschwunden.
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Dieses Beispiel erläutert die Wirksamkeit des Konjugats der Erfindung
zur Abtrennung von Anti-A,B-Antikörpern aus Serum.
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Die zum Vergleich durchgeführte Adsorption mit einer äquivalenten
Menge eines nichtkonjugierten Gemisches von A-positiven und B-positiven Erythrozyten
liefert gleichwertige Ergebnisse.
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Beispiel 6 Gemäß Beispiel 5 werden Adsorptionen mit Anti-Gamma-,
Anti-non-Gamma- und Anti-Lewis-Seren durchgeführt, die Anti-A- und Anti-B-Antikörper
als Verunreinigungen enthalten. Das Konjugat entfernt eine äquivalente Menge der
unspezifischen Antikörper aus den beiden erstgenannten Seren im Vergleich zu normalen
Erythrozyten. Eine Adsorption mit Konjugat entfernt die gleiche Menge an unspezifischen
Antikörpern aus dem Anti-Lewis-Serum wie nach drei Adsorptionen mit normalen Erythrozyten.
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Beispiel 7 Beispiel 3 wird wiederholt, jedoch wird das A,B-Stroma-Konjugat
von Beispiel 5 verwendet. Adsorptionen werden mit Anti-D-Serum durchgeführt, welches
Anti-A und Anti-B-Antikörper als Verunreinigungen enthält. Gegen A- und B-Erythrozyten
reagiert dieses Serum vor der Adsorption stark bis zur Verdünnung 1:8.
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Wenn die Adsorption bei 25"C durchgeführt wird, hat das erhaltene
Serum eine noch starke Anti-A-Reaktion nur noch unverdünnt und eine starke Anti-B-Reaktion
nur bei der Gesamtverdünnung 1:2. Eine Adsorption bei 50C liefert ein Serum, das
keine feststellbaren Mengen Anti-A- oder Anti-B-Antikörper mehr enthält.
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Beispiel 8 Beispiel 3 wird wiederholt, jedoch wird ein Stroma-Konjugat
angemessener Spezifität verwendet. Es werden folgende Ergebnisse erhalten. Die Menge
an kontaminierenden Antikörpern wird an unverdünntem Serum mit zwei verschiedenen
Methoden jeweils vor und nach der Adsorption mit dem Konjugat bestimmt.
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In der ersten Methode (Kurzbezeichnung "Imm") wird die Konzentration
an der Reaktion von Antiserum und Erythrozyten unmittelbar nach dem Mischen abgelesen.
Bei der zweiten Methode (Kurzbezeichnung ;'Inc") wird das Gemisch vor dem Ablesen
bei 370C inkubiert. Die zweite Methode ist empfindlicher.
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Die Konzentration wird auf einer Skala von 0 (keine Reaktion) bis
5 (stärkste Reaktion) angegeben. Die Reaktionsaktivitäten in einigen Fällen nach
der einmaligen Adsorption zeigt auf, daß eine zweite Adsorption notwendig ist.
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Konzentration der Verunreinigungen in un-Spezifität Spezifitätder
Verwende- verdünntem Serum des Antikörper- tes vor der Adsorption nach der Adsorption
Antiserums Verunreinigungen Konjugat Inm Inc Imm Inc A. Anti-D Anti-B B 5 5 0 1
B. Anti-D Anti-A A 5 5 Anti-B B 5 (readsorbiert) Anti-A A 3 Anti-B B 4 (readsorbiert)
Anti-A A 1 Anti-B B 2 1/2 C. Anti-A, B - A 5 2s - B (readsorbiert) - A 0 2 - B D..
Anti-D Anti-B B 5 5 0 2 1/2 (readsorbiert) " " 0 1 1/2 (readsorbiert) " " 0 0 E.
Anti-D Anti-B B 5 5 0 1 1/2 " " 0 1 " " 0 1/2 F. Anti-D Anti-B B 4 4 0 0 G. Anti-D
Anti-B B 3 2 0 0 H. Andi-D Anti-A A 4 4 0 0 Anti-D Anti-A A 0 9 0 0 Anti-B B 4 4
0 2s (readsorbiert) " " 0 1 (readsorbiert) " " 0
Beispiel 9 Beispiel
5 wird wiederholt, jedoch wird ein Stroma-Konjugat entsprechenden Spezifität verwendet.
Es werden die nachstehend aufgeführten Ergebnisse erhalten. Diese Ergebnisse zeigen,
daß gleichwertige Ergebnisse (Abwesenheit von Verunreinigungen) sowohl nach der
bekannten Adsorptionsmethode mit Erythrozyten als auch nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhalten werden.
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Spezifität Spezifität der verwende- Konzentration der Verdes Antiserums
Antikörper- tes Kon- unreinigungen .(vorher 1:8) Verunreinigungen jugat nach Adsorption
grYthrozyten Konju-Adsorption .gat-Adsorpt.
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A. Humanes Antispezies A O 0 Anti-gamma B 0 0 B. Humanes Antispezies
0 0 0 Anti-non- A 0 0 gamma B 0 0 0 0 0 B e 1 s p i e 1 10 Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens im Vergleich zum bekannten Verfahren bei der Abtrennung unerwünschter
Verunreinigungen aus Anti-D-Antiserum unter Beibehaltung der Anti-D-Aktivität wird
auf die nachstehende Weise bestimmt. Drei Proben von Anti-D-Antiseren, die Anti-A-
und/ oder Anti-B-Antikörper enthalten, werden gereinigt, wobei 1) zuerst Stroma
A-Konjugat und dann Stroma B-Konjugat (zwei Proben von Anti-D-Antiseren), 2) die
bekannte Erythrozyten-Methode (eine Probe von Anti-D-Antiseren) verwendet wird.
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Nach Entfernung der gesamten Anti-A- und Anti-B-Aktivität werden die
Antiseren auf Anti-D-Aktivität untersucht. Die mittels der Konjugate gereinigten
Proben zeigen den gleichen
Anti-D-Endtiter (64-128) wie die mittels
normaler Erythrozyten gereinigte Probe, sind jedoch etwas aktiver, wenn die quantitative
Auswertung unmittelbar nach dem Mischen gemäß Beispiel 8 vorgenommen wird.
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Der Ausdruck praktisch alle" in Bezug auf die Eluierung von Antikörpern
aus dem Konjugat-Antikörper-Komplex bedeutet mehr als etwa 95 % der gebundenen Antikörper.
Der Ausdruck "spezifisch" in Bezug auf die Abtrennung eines Antikörpers bedeutet,
daß nur der Antikörper, der dem Stroma-Antigen (z.B. Anti-A) entspricht, abgetrennt
wird, während ein Antikörper (z.B. Anti-D), der im Serum-verbleiben soll, nicht
abgetrennt wird. Bei Verwendung von Stroma mit mehr als einem Antigen (z.B. A ,
B+), bedeutet der Ausdruck spezifische Abtrennung" die Abtrennung von Anti-A- und
Anti-Br jedoch nicht von Anti-D-Antikörpern aus dem Serum.