DE1961541A1

DE1961541A1 - Immunologisches Indikatorreagens

Info

Publication number: DE1961541A1
Application number: DE19691961541
Authority: DE
Inventors: Fetter Marion Cook; Shradha Nand; Virendra Patel
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1968-12-09
Filing date: 1969-12-08
Publication date: 1970-06-18
Also published as: FR2025687A1; US3882225A; GB1248003A

Description

Beschreibung zu der Patentanmeldung

MILES LABORATORIES, INC., Elkhart, Indiana 46514, U.S.A;

betreffend:

"Immunologisches Indikatorreagens"

Immunologische Eeagentien, die zur direkten Agglutination mit Antigenen geeignet sind, werden hergestellt, indem man den Antikörper zur Bildung eines Aggregats vorp'olymerisiert und dann dieses Aggregat mit einem chemischen Kopplungsmittel an ein mikrobiologisches Zellträgerteilcheii koppelt. Die Vorpolymerisation des Antikörpers kann unter Verwendung des gleichen oder eines anderen Kopplungsmitteis erreicht werden. Die Verwendung des mikrobiologischen Zellträger- * teilchens erlaubt es, die gebildeten Eeagentien als immunologische Indikatorteilchen für Untersuchungen auf einem Objektträpjer zu verwenden, die ein schnelles Erkennen der Untersuchungsergebnisse erlauben. Das gebildete Reagens kann in trockener Form hergestellt und verschickt und dann " wieder mit Flüssigkeit zur Verwendung aufbereitet werden.

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ORIGINAL INSPECTED

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Die Erfindung bezieht sich auf immunologische Reagentien in Form von Indikatorteilchen, die direkt mit Antigenen agglutinieren können. Sie betrifft genauer immunologische Indikatoren, in denen ein vorpolymerisiertes Aggregat aus dem Antikörper zu dem nachzuweisenden Antigen durch ein Kopplungsmittel an ein mikrobiologisches Zellträgerteilchen gebunden ist.

Nach dem Stand der Technik treten bei der Herstellung von immunologischen Reagentien in Form von Indikatorteilchen, die zur direkten Agglutination mit Antigenen fähig sind, viele Schwierigkeiten auf. Eine Schwierigkeit bestand darin, daß die Antikörper, die notwendig sind, um die Trägerteilchen empfindlich zu machen, inaktiviert wurden, wenn sie chemisch an diese·Trägerteilchen gebunden wurden. Dieser Effekt kam offensichtlich von. der hohen Reaktivität, die die meisten reaktiven Trägerteilchen zeigen, bevor sie chemisch mit dem Antikörper verbunden sind und von der s"feerischen Hinderung, wenn der Antikörper gebunden ist. Bei solchen Reagentien, die durch physikalische Adsorption des Antikörpers auf dem Trägerteilchen hergestellt worden sind, besteht ein Problem darin, daß der Antikörper während der Untersuchung von der Oberfläche des Trägerteilchens abgelöst wird und sich mit dem nachzuweisenden Antigen verbindet und dadurch, daß er vorzugsweise mit einem derartigen Antigen reagiert, die beobachtete Konzentration des Antigens erniedrigt. Beide der oben genannten Schwierigkeiten führten zu ungenauen Testergebnissen.

Ein weiteres Problem ergibt sich nach dem Stand der Technik' aus der noch andauernden Verwendung von Erythrocyten von roten Blutkörperchen als Trägerteilchen. Das Problem, das

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mit den roten Blutkörperchen auftritt, besteht darin, daß große Unterschiede in der Art von roten Blutkörperchen, die aus verschiedenen Proben kommen, bestehen, selbst dann, wenn sie von dem gleichen "Versuchstier stammen. Es hat sich gezeigt, daß die Oberflächeneigenßchaften_?Größe und die Fähigkeit der roten Blutkörperchen,als Trägerteilchen verwendet zu werden, sich alle mit der Kondition, dem Alter, der medizinischen Behandlung und der Vorgeschichte der Versuchstiere, von denen die roten Blutkörperchen stammen, ändern. Das führt zu Schwierigkeiten bei der Herstellung von Indikatorteilchen aus einem standardisierten immunologischen Reagensi Eine mit der Verwendung von roten Blutkörperchen verbundene Schwierigkeit besteht darin, daß ihre große Form und ihre Oberflächencharakteristika die Art der Untersuchung, für die sie verwendet werden können, im allgemeinen auf solche Verfahren beschränken, bei denen die !Reaktion in einem Reagensglas durchgeführt wird, wobei das Ergebnis der Untersuchung nur nach einer langen Seit richtig abgelesen werden kann. Da rote Blutkörperchen nicht für Untersuchungen auf Objektträgern verwendet werden können, kann darüber hinaus die Reaktionszeit nicht durch Anwendung einer solchen Untersuchung abgekürzt werden. Es hat sich gezeigt, daß die Größe xirxä die Oberflächeneigerischaften auch die Empfindlichkeit der Untersuchung "begrenzen. Olovnikov, A.M. "Suspension von pol^kondensicrten> Antikörper-iHimunosorbens und ihre Verwendung zur Agglutinationsreaktion zur Bestimmung des Antikörpergehaltc" (russisch), Dokl. Adad. ITauk SSSE 1964, "!5ö (5) "!202 - 5,erwähnt das Problem dieses Nachteils bei der Verwendung von Erythrocyten a3.s Trägerteilchen.

Zusammenfassend kann man sagen» daß rote Blutkörperchen, wie

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sie "bisher verwendet wurden, wegen ihrer Zerbrechlichkeit, Größe, Gewicht und Oberflächeneigenschaften sowie der Schwierigkeit, solche Zellen zu erhalten, nicht geeignet sind für empfindliche Agglutinationsreaktionen auf dem Objektträger.

Es hat sich nun gezeigt, daß immunologische Reagentien, die zur direkten Agglutination mit Antigenen geeignet sind* in reproduzierbarer und sehr aktiver Form hergestellt we.rden können, indem man einen Antikörper vorpolymeresiert und dieses polymerisiert^ Aggregat dann an ein mikrobiologisches Zellträgerteilchen koppelt. Bei dem Vorpolymeresations— schritt entsteht ein Aggregat, bei dem mindestens einige der aktiven Stellen des Antikörpers sich an der äußeren Oberfläche befinden. Die Verwendung der mikrobiologischen Zelle als Trägerteilchen ergibt ein einheitlich geformtes Teilchen mit Form-und Gewichtseigenschaften, die geeignet sind, ein immunologisches Reagens zu bilden, das es erlaubt, Untersuchungsergebnisse bei Untersuchungen auf einem Objektträger in kurzer Zeit zu erhalten.,

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein immunologisches Indikatorreagens, das zur direkten Agglutination mit einem Antikörper geeignet ist, wobei ein vorpolymeresiertes Aggregat chemisch an ein mikrobiologisches Zellträgerteilchen. gebunden ist.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung, eines immunologischen Indikatorreagenses, das zur direkten Agglutination mit einem Antigen fähig ist.

Das immunologische Indikatorreagens der vorliegenden Erfin-

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ORiGSMAL IKSPEGTS

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dung wird dadurch, hergestellt, daß man einen Antikörper mit einem ,Kopplungsmittel polymerisiert, wo"bei ein Aggregat dieses Antikörpers entsteht und dieses Aggregat dann mit einem reaktiven mikrobiologischen Zellträgerteilchen zur Reaktion bringt. Der Antikörper wird in Form der γ-Globulinfraktion des Immunserums von Tieren erhalten, denen verschiedene Antigene injiziert worden sind. Die mikrobiologische Zellewird durch Reaktion mit einem polyfunktionellen Kopplungsmittel - reaktionsfähig gemacht. Eine der * funktionellen Gruppen des Kopplungsmittels reagiert mit der Oberfläche des Trägerteilchens, wobei eine nicht-gebundene reaktive Gruppe an der äußeren Oberfläche dieses Trägerteilchens zurückbleibt. Das vorpolymerisierte Aggregat des Antikörpers wird dann mit dem reaktiven Trägerteilchen zur Reaktion gebracht, wobei eine kovalente chemische Bindung entsteht. Diese Reaktionen werden im allgemeinen in flüssigem Medium, wie z.B. einer gepufferten Flüssigkeit, die auf den günstigsten Bedingungen gehalten werden kann, durchgeführt. .

Nachdem der immunologische Indikator gebildet worden ist, kann er gegebenenfalls durch Abtrennen des flüssigen Mediums in die trockene Form übergeführt werden. Dieser trockene Indikator kann später wieder mit einer Flüssigkeit oder der Testprobe in die zur Verwendung bei der Untersuchung geeignete Form übergeführt werden.

Die nach dem obigen Verfahren hergestellten immunologischen Indikatorteilchen enthalten dann ein mikrobiologisches Zellträgerteilchen, an das zumindest auf einem Teil seiner ·* äußeren Oberfläche ein vorpolymerisiertes Aggregat des Antikörpers gebunden ist. Die Aggregate sind durch kovalente

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, , ORIGINAL IMSPECTED

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Bindungen an die Oberfläche gebunden. Diese kovalenten Bindungen sind durch e Reaktion ^den Resten der Kopplungsmittelmoleküle, die zuerst mit den Trägerteilchen reagiert haben, gebildet worden. Wahlweise kann das Kopplungsmittel auch zu einem Gemisch der Trägerteilchen und des vorpolymerisierten Aggregats zugegeben werden, so daß es mit beiden gleichzeitig in Berührung kommt. Diese Indikatorteilchen haben Größen von ungefähr 0,2 bis 1,5/U in der kleinsten . Dimension und ungefähr 5/U in der größten Dimension. Die mikrobiologischen Zellträgerteilchen können, bevor, sie mit dem Kopplungsmittel zusammengebracht werden, durch Reaktion-mit einem Konservierungsmittel, wie Formaldehyd, stabilisiert werden. Auf ähnliche Weise können die Indikatorteilchen vor irgendeinem Hintergrund besser sichtbar gemacht werden, indem man die mikrobiologischen Zeilen mit einem geeigneten Farbstoff färbt.

Die als Trägerteilchen geeigneten mikrobiologischen Zellen können Bakterien-^ Pilz-, Protozoen-oder Virenzellen sein. Diese Zellen können irgendein sich selbst reproduzierender Mikroorganismus sein^ der sich abhängig ader unabhängig ' von anderen Organismen fortpflanzt. Sowohl gramjafpositive . als -auch grampihegative Bakterienzellen können verwendet werden. Pilz- oder Protozoenzellen können ähnlich.wie Virenteilchen verwendet werden. Das sind im allgemeinen einzellige Organismen, die manchmal in Klumpen oder Aggregaten zusammengeballt sind. Die Zellen können in dieser Form verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Größe ihres Aggregats keine

er&i.btr

TrägerteJlchen » die so groß sind, daß das damit gebildete Test system in Gegenwart einer Substanz, die der

kör Ό er, an die aggregierten Zellen gebundenen Anti^gÄfeubstanz homolog ist, nicht gut agglutiniert.. Aggregatgrößen von mehr als ·

. - 7 - · " 009825/UQ1

, ' 1Α-37 25t

ΊΟΟ ,u führen zu dieser Schwierigkeit.

!Die bevorzugten mikrobiologischen Zellen sind Bakterienzellen oder Aggregate davon, die eine einheitliche Form und Größe .!besitzen und maximale äußere Dimensionen in einer Richtung von bis zu 5 /u· haben. Obwohl es nicht besonders günstig ist, kann ein Gemisch von verschiedenen, aber gleichartigen Zellen verwendet werden. Für diese Bakterien umfassen die geeigneten mikrobiologischen Zellen diejenigen der Abteilung I des"Pflanzenreiches einschließlich der Klassen I₁ II und .III, 1. Ordnung. Die mikrobiologischen Zellen der Klasse III, Ordnung 1, umfassen die intracellularen Virenteilchen, die maximale Dimensionen von ungefähr 0,2 Ai haben. Für eine vollständige Aufzahlung der geeigneten Bakterienzellen wird auf"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology von E.S. Breed, E.G.D. Murray,N.R. Smith,7.Ausgabe, 194-7, the Williams and Wilkins Company, hingewiesen. Besonders geeignet sind die Bakterien der Klasse II,· Unterordnung II, Familie IV (Pseudomonadaceous) und Klasse, II, Ordnung IV,

(Tribes} Familie IV (Enterobacteriaceae). Alle Klassen/I "bis V werden als bevorzugte mikrobiologische Zellen für diese Erfindung angesehen. Ebenfalls Klasse II, Ordnung IV, Familien V (Brucellaceae), X (Lactobacillaceae) und XIII (Bacillaceae) werden als bevorzugt angesehen. Ordnung I'und II der Klasse-III-Organismen können verwendet werden, wenn kleinere Teilchen-Größen von ungefähr 0,2/U oder darunter gewünscht werden.. Besonders die Ordnung-II-Viren sind von einer kleinen Dimension, die ihre Nützlichkeit beschränkt·

Escherichia coli ist eiae besonders bevorzugte bakterielle Zelle für diese Erfindung. Eine andere speziell bevorzugte '" mikrobiologische Zelle ist die üblicherweise erhältliche Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die Hefewachstumsphasen der

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- Pilzzellen sind ebenfalls zur Verwendung als Trägerteilchen bevorzugt.

Andere bevorzugte mikrobiologische Zellen sind Bacillus subtilis, Lactobacillus ieichmannii, Bacillus pumilus und Pseudomonas fragii.

Diese mikrobiologischen Zellen können erhalten werden, indem man von jeder einzelnen davon eine Ausgangskultur _ in einem Nährmedium sorgfältig züchtet. Die Zellen können ■ dann an Punkt ihres maximalen Wachstums gewonnen werden.

Die Antikörper, die entsprechend der vorliegenden Erfindung vorpolymerisiert und zur Herstellung des neuen immunologischen . Reagens verwendet werden können, können irgendwelche Antikörper sein, die von irgendeinem Tier produziert worden sind. Es wird angenommen, daß Antikörper chemisch ähnlich sind, da • sie γ-Globulinmoleküle sind,'' die so modifiziert sind, daß sie an. zwei Stellen Antigenrezeptorstellen besitzen, für die Antigene, zu denen sich immunologische Gegenstücke darstellen. Daher besteht der größte Teil der Oberfläche der Antikörper aus ungefähr den gleichen Proteingruppen, die in reinen γ-Globulinmolekülen enthalten sind. Die Antikörper können solche sein, wie sie von Tieren produziert, worden sind, denen irgendeiner der folgenden beispielhaften Stoffe, die von verschiedenen Tieren erhalten worden sind, i?i;!iziert worden ist: Serumalbumine, Myoglobine, Hämoglobine, üvalbumine, Serum-α-, -ß- und -γ-Globuline, ß-Lipoproteide, Blutgruppensubstanzen A und B und Humantransferrin sowie alle Hormone, einschließlich Insulin und Humanchoriongonadotropin (HCG). Enzyme stellen eine andere Klasse von Antigenmaterialien dar, die verwendet werden können, da viele. Ti ere, wenn ihnen derartige Stoffe injiziert worden sind, Antikörper bilden. Derartige

oostas/isoi

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Enzyme sind z.B., aber nicht ausschließlich, die folgenden: Diastase, Maltase, Zymase, Amylase und Invertase.

Es können Antigenmaterialien sowohl von pathologischen wie auch natürlichen Organismen verwendet werden, wie z.B. Trichinenantigen, gereinigte Tuberkulinproteinderivate, Toxine, wie Diphtherintoxoid und Tetanustoxoid.

Die Kopplungsmittel, die zur Bildung der vorpolymerisierten Aggregate des Antikörpers und zur Bindung der Aggregate an das mikrobiologische Zellträgerteilchen verwendet werden können, sind im allgemeinen solche polyfunktionelles Verbindungen, die, zwei oder mehr der folgenden reaktiven Gruppen enthalten: Azo-, SuIfonsäure-, mit Nitroverbindungen aktivierte Pluorgruppen, Azid*-, Imin- und reaktive Chlorgruppen, wie Chlorgruppen, die an einen Ring gebunden sind, der entsprechende Resonanzstrukturen besitzt. Diese Gruppen können mit den primären Amino-, - (Mercapto-), Carbonsäure- und Hydroxylgruppen reagieren, die in den Materialien enthalten sind, die die Oberfläche der Trägerteilchen und der Proteinmaterialien, aus denen die Antikörperaggregate bestehen, darstellen.

Eine repräsentative Aufstellung derartiger Kopplungsmittel ist: Bis-diazobenzidin,· Bis-diazobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, Difluordinitrodiphenyl-sulfon, ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat„ Cyanur-Chlorid, Dichlor-s .-triazin, N-tert.~Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat, ein Dialdehyd, ein a,ß-ungesättigtes Aldehyd sowie deren Gemische. Einige dieser Kopplungsmittel, besonders die cyanurierenden Mittel, die Aldehyde und die oc,ß-ungesättigten Aldehyde können die mikrobiologiechen

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Zellen konservieren, gleichzeitig wenn sie an Gruppen an den Zelloberflächen gebunden werden» so daß die Zellen dann gegen Auflösung stabilisiert sind. So ist, wenn derartige Kopplungsmittel verwendet werden, keine getrennte Stabilisierung oder Eonservierung notwendig. Wenn N-tert.-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat verwendet wird, muß die Oberfläche, an die es· gebunden werden soll, zunächst mit einem Reagens behandelt werden, das die Bernsteinsäuregruppe einführt, wie z.B. Bernsteinsäureanhydrid.

Die Carbodiimide, die verwendet werden können, sind u.a. die-folgenden: N^li'-Dicyclohexyl-carbodiiinid, 1-lthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl)-(4)-äthylcarbodiimid)-metho-p-toluol sulfonat. Ein spezifisches Difluordinitrobenzol, das verwendet werden kann, ist 1,3-DifluDr-4-,6-dinitrobenzol und ein spezifisches Difluordinitrodiphenylsulfon ist ρ,ρ¹-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfon.

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Die Dialdehydkopplungsmittel sind aliphatische Dialdehyde mit mindestens einer Methylengruppe, die die Oarbonylgruppen trennt. Beispiele für diese Dialdehyde sind Glutaraldehyd, Propandial (Malonaldehyd) und Butandial (Succinaldehyd).

Die α,β-ungesättigten Aldehyde können irgendeine Verbindung sein, die eine Formel des folgenden Typs besitzt:

R,, R₀ 0

■ ■ ι¹ ι² ι

H-:—ο ο σ -η ■»

in der jede der Gruppen R^ oder R^ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe sein kann. Repräsentativ für diese Aldehyde

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sind: Acrolein, Methacrolein und 2-Butenal (Crotonaldehyd). Hiervon ist Acrolein das "bevorzugte.

Es ist auch, möglich, die Aldehydreaktivität, die auf den Oberflächen der Zellen zurückbleibt, nachdem sie mit Dialdehyden oder den ungesättigten Aldehyden behandelt worden sind, in Aminogruppen umzuwandeln, indem man die Zellen ferner mit Verbindungen behandelt, die eine der folgenden-Formeln besitzen:

H₂N Ar NH₂, H₂N Ar OH,

NH Ar NH₂, oder

H₂N NH Ar

₂
^0H

in denen Ar eine Phenyl-, Biphenylgruppe, ein stabilisierter heterocyclischer Hing, eine mehrkernige Kohlenwasserstoff struktur, ein mehrkerniger heterocyclischer Ring, Triphenylmethan und/oder eine substituierte Gruppe ist. Im allgemeinen besitzen alle der so definierten polyfunktionellen Verbindungen mindestens eine diazotierbare Aminogruppe und mindestens eine Amino-, Hydroxyl- oder Hydrazingruppe. Die diazotierbare Gruppe kann mit salpetriger Säure zur endgültigen Verwendung aktiviert werden. Wenn gewünscht, können viele dieser polyfunktionellen Umwandlungsverbindungen in ihren wäßrigen Formen verwendet werden, indem man deren Säuresalze verwendet. In dieser Beziehung

Balze

sind Sulfonsäuresalze und Chlorwasserstoffsäure/von Nützlichkeit. Die Sulfonsäuregruppen können durch Phosphorpentachlorid aktiviert werden.

Beispiele für die polyfunktionellen Verbindungen sind die

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. ea ■ ep folgendem- 2,7-Diaminof luor^ 2,5-Diamlnofluor/, Benzidin · HCl, 3_s3⁸-Diamino-benzidin, o-Tolidin, Hydrazin · HCl, 3,3'-Dimetiioxybenzidin-dihydroclxlorid, o-Dianisidin_? p-Rosanilin-, Chlorid und -aeetat, Ihionin, basisches Fuchsin, Safranin-0, mit Aminogruppen substituierte Triphenylmethanfarbstoffe, p-Hydrazinbenzolsulfonsäure· Einige dieser Verbindungen besitzen nur zwei funktionelle Gruppen, während andere eine größere Anzahl besitzen. In diesem Falle stehen zwei ' oder mehr reaktionsfähige funktionelle Gruppen auf der · Oberfläche der leuchen zur Eeaktion SdLt₁ den anschließend zugesetzten biologischen Materialien zur Verfugung. In den oben angegebenen Formeln sind die reaktionsfähigen Gruppen₃ die außer den zwei erforderlichen Gruppen vorhanden sind, in den substituierten Är-Gruppen enthalten.

Der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet' wird, bezeichnet immunologische Materialien, die als Ergebnis einer. Antigens-timulation von Tieren produziert werden. Der Ausdruck "immunologisches Gegenstück", wie er hier verwendet wird, bezeichnet entweder ein Antigen oder einen Antikörper, der spezifisch mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen reagiert»

Wie oben erwähnt, können die mikrobiologischen Zellen mit einem Farbstoff gefärbt werden, um die Unterscheidung der letzten Endes entstehenden immunologischen Eeagentien von dem umgebenden Hintergrund zu verbessern. Farbstoffe wie Hämatoxylin, Fuchsin und Kristallviolett können für diesen Zweck verwendet werden. Eine andere sehr gute Behandlung für die mikrobiologischen Zellen besteht darin, daß man: sie, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Alkohol, Äther xtfäscht, um etwa vorhandene Polysaccharid-oder Wachs-

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schichten zu entfernen, die die Heaktion zwischen den mikrobiologischen Zellen und den Kopplungsia.ittein stören könnten.

Die immunologischen Eeagensindikatorteilchen, die nach der vorliegenden. Erfindung hergestellt worden sind, sind geeignet zur direkten Agglutination mit dem Antigen, das das immunologische Gegenstück au dem bei der Herstellung der Indikatorteilchen verwendeten Antikörper ist. Die Indikatorteilchen werden mit einer flüssigen Probe vermischt» die ein solches Antigen enthält und die Teilchen werden dann beobachtet, um zu bestimmen, ob ein Agglutinations- oder Wichtagglutinationsmuster auftritt oder nicht. Das Auftreten eines Agglutinationsmusters zeigt die Anwesenheit des nachzuweisenden Antigens an, während das liichtauftreten eines Agglutinationsmusters die Abwesenheit dieses Antigens anzeigt. -

Wahrend die Fähigkeit des erfindungsgemäßen immunologischen Reagenses in erster Linie darin besteht, einen direkten Nachweis für Antigene zu ermöglichen ,kann das glei'Che Reagens verwendet werden zum Nachweis des Antikörpers selbst in einer flüssigen Probe. Wenn z.B. die Anwesenheit eines Antikörpers nachgewiesen werden soll, kann eine Menge des Antigens zu diesem Antikörper au dem Testmedium zugesetzt v/erden und zwar vor oder gleichzeitig mit den Indikatorteilchen der vorliegenden Erfindung, die aus den mikrobiologischen Zellen bestehen, die an das vörpolymerisierte Antikörperaggregat gebunden.sind. Wenn die Probe den Antikörper enthält, wird das zu dem Testmedium zugesetzte Antigen vorzugsweise mit diesem Antikörper reagieren und es wird dadurch nicht in der Lage sein, mit dem immunologischen Reagens zu agglutinieren. So wird die Agglutination, die

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sonst auftreten würde, verhindert und das auftretende Huster ist ein Mchtagglutinationsmuster. ·

Die Agglutination und die Verhinderung der Agglutination, wie sie oben beschrieben worden sind, werden günstigerweise in Form einer Agglutination auf dem Objektträger untersucht
, bei der die Testreagentien mit einer flüssxgen Probe auf der Oberfläche eines flachen Glases vermischt werden und das entstehende Muster nach, einer kurzen Zeit. betrachtet wird« Eine homogene miLchartige Konsistenz ist ein Anzeichen für ein Hichtagglutinationsmuster, während ein Agglutinationsmuster durch eine Anzähl von Klumpen oder Flocken gekennzeichnet ist. Wenn gewünscht, können mikrobiologische Zellen, die groß und schwer genug sind, verwendet werden, so daß die Agglutinationsreaktion xtach einer Mikrotitrator-Methöde durchgeführt werden kann, xfobei das immunologische Reagens in jede von mehreren-Vertiefun- ^;' gen gegeben wird, die sich in einer Reihe auf der Oberfläche einer .Plastik-oder anderen geeigneten Platte befinden. Die lineare Anordnung der Vertiefungen .erlaubt eine serienmäßige Verdünnung der für die Untersuchung verwendeten flüssigen Probe. ._■'■■'.

Die serienmäßige Verdünnung wird durchgeführt, indem man zunächst 1 Tropfen eines Verdünnungsmittels in jede der Vertiefungen in der Reihe gibt und dann eine Flüssigkeitsprobe von Ί Tropfen, die eine Anfangsverdünnung von beispielsweise 1:5 hat, in die erste Vertiefung gibt,xfobei man eine-geeignete Schleife oder Spirale verwendet, die 1 Tropfen der'Flüssigkeit hält. Die Schleife wird in die erste Vertiefung eingetaucht und die Lösung wird durchgerührt. Dann wird 1 Tropfen der Flüssigkeit weggenommen und mit dem Verdünnungsmittel in der zweiten Vertiefung ver-

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mischt. Die Verdünnung in der ersten Vertiefung beträgt dann 1:10 und in der zweiten Vertiefung 1:20= Das Verfahren der serienmäßigen Verdünnung wird wiederholt, bis alle Vertiefungen in der Reihe so behandelt worden sind«

(üüraungeü Hierbei entsteht eine Beihe von Antigenverofeäiiisäsgfe&g die sich jeweils durch den Faktor 1/2 von den nächsten vorher behandelten unterscheiden.

Um einen Agglutinateonshinderungstest durchzuführen, werden serienmäßige Verdünnungen in den Vertiefungen in einer Eeihe durchgeführt und bestimmte Mengen des Antikörpers in ,jede der Vertiefungen zugesetzt. Anschließend wird jeweils 1 Tropfen einer Suspension von dem erfindungsgemäßen Eeagens zugesetzt. Bei der Untersuchung einer derartigen Agglutinationshemmung werden die Verdünnungen der Testprobe so gewählt, daß die Konzentration des Antigens in dem mittleren Anteil der serienmäßigen Verdünnungen liegt» Dieses Verfahren erlaubt eine Identifikation der Konzentration des Antigens in der Flüssigkeitsprobe und damit eine halbquantitative Bestimmung. Die gleiche halb-quantitative Bestimmung kann durchgeführt werden, wenn man ein direktes Agglutinationsverfahren für die Mikrotitrator-Methode verwendet .

Das Verfahren zur Herstellung des immunologischen Indikators der vorliegenden Erfindung umfaßt drei hauptsächliche Schritte, von denen jeder in einer Anzahl von gepufferten flüssigen Medien durchgeführt werden kann. Der erste und letzte Schritt werden vorzugsweise bei Zimmertemperatur und der zweite günstigerweise bei 4-⁰G durchgeführt« Der erste Schritt ist die Bildung eines polymerisieren Aggregats des Antikörpers zu dem Antigen, das nachgeid-esen werden soll, und er wird erreicht, indem man ein Kopplungsmittel mit dem

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Antikörper zur.Reaktion "bringt. Als nächstes wird die mikrobiologische Zelle dem polymerisierten Aggregat des Antikörpers gegenüber reaktionsfähig gemacht, indem man die Zelle mit einem Kupplungsmittel zur Reaktion bringt, das das gleiche Kopplungsmittel, das in dem ersten Schritt verwendet wurde, sein kann aber nicht notwendigerweise sein muß.·

Im zweiten Sehritt werden die mikrobiologischen Zellen' in einem flüssigen Medium suspendiert, so daß eine 1- bis 10%ige Suspension entsteht. Kurze Zeit von weniger als 1h ist ausreichend, wenn dieser Schritt bei Zimmertemperatur (20 bis 25⁰G) durchgeführt wird..

} Wenn ein Konservierungsmittel verwendet wird, werden ' die mikrobiologischen Zellen, bevor man den zweiten Schritt durchführt, damit'behandelt. Wie oben erwähnt, ist das verwendete Konservierungsmittel günstigerweise Formaldehyd. Auf ähnliche Weise werden die mikrobiologischen Zellen, wenn ein Farbstoff verwendet wird, mit diesem vorbehandelt, bevor sie in dem zweiten Schritt mit dem Kopplungsmittel zur Reaktion gebracht werden.

In dem dritten Schritt wird das polymerisierte Aggregat des Antikörpers eine Zeit^ die ausreichend ist, für die Kopplungsreaktion mit den reaktionsfähigen Trägerteilchen in Berührung gebracht. Nach der Durchführung des dritten Schrittes kann der gebildete immunologische Indikator von der suspendierenden Flüssigkeit abgetrennt und ge-" trocknet werden. Diese Trennung und Trocknung kann günstigerweise durch ein Lyophilisierungsverfahreii durchgeführt· werden, bei dem Volumina von einigen Tropfen einer Suspension

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des immunologischen Indikators in Behälter gegeben und unter Vakuum auf -40⁰C abgekühlt werden. Dieses Verfahren kann in kurzer Zeit in handelsüblichen Standard-Lyophilisatoren durchgeführt werden. Bas getrocknete Reagens kann dann bei geringer Feuchtigkeit verpackt und spater bei der Anwendung wieder in die geeignete Form gebracht werden.

Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Einderserum- . albumin (BSA) wird einem zur Bildung von Anti-BSA-' Globulin injiziert. Dieses antikörperhaltige Globulin wird von den anderen Serumproteinen durch DEAE-Cellulose-(Diäthylaminoäthyleeirulöse)-Chromatographie abgetrennt.

Zu den abgetrennten Globulinen wird 1 ml einer 1:80-Verdünnung von 0,024 m Bis-diazobenaidin (BDB) in 0,15 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7j5 zugegeben,- wobei das vorpolymerisierte Antikörperaggregat entsteht. Die Reaktion kann bei Zimmertemperatur (22⁰C) unter gelegentlichem Schütteln bis zum Auftreten einer schwachen Trübung durchgeführt werden.

E. Coli-Zellen werden vorher gezüchtet, von dem Wachstumsmedium getrennt und mit Formalin behandelt, um sie zu konservieren. Dann wird BDB bei 4⁰C an die mit Formalin behandelten E. Ooli-Zellen gebunden und diese Zellen werden dann mit Salzlösung gewaschen, um alles nicht-umgesetzte BDB zu entfernen. Das vorpolymerisierte Antikörperaggregat wird dann zu den gewaschenen BDB-Zellen zugegeben und das Gemisch bei 22°C 30 min stehengelassen und anschließend mit Salzlösung gewaschen. Die empfindlich gemachten Zellen werden dann wieder in 1%igem Hormalkaninchenserum (NRS)

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suspendiert, um die Zellen während der folgenden Lyophilisierung zu schützen. Die so zusammengesetzten Zellen sind geeignet für Untersuchungen nach dem beschriebenen Verfahren. Günstigerweise wird die Konzentration des immunologischen Indikators je nach der einzelnen Testsituation eingestellt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. '

Beispiel 1

Ein immunologisches.Indikatoreagens wurde hergestellt, indem 'man die Globulinfraktion eines Kaninchens, dem BSA injiziert worden war, vorpolymeresierte. Dieses Antikörperaggregat wurde dann an reaktionsfähige mikrobiologische Zellträgerteilchen gebunden, um ein immunologisches Reagens zum Fachweis von BSA herzustellen.

Die antikörperhaltige Globulinfraktion wurde von den anderen Serumproteinen des Kaninchenanti-BSA-Serums abgetrennt, indem man DEAE-Cellulosechromatographie nach dem Standardverfahren anwandte. 2,5 mg des gereinigten Globulins wurden dann in 1 ml 0,15 m Watrimphosphat-Kaliumphosphat-Puffer vom pH-Wert 7>3 gelöst, der dadurch hergestellt worden war, daß man 808 ml 0,15 m Na₂HPO^H₂O zu 192 ml 0,15 m KH₂PO. zugab. Zu diesem Gemisch wurde 1 ml einer 1:80-Verdünnung von 0,024 m BDB in 0,15 m Phosphatpuffer bei pH 7,J zugegeben*(was zu einer BDB-Konzentration von 0,0003 m führte) Das entstehende Gemisch wurde JO min unter gelegentlichem Umschütteln bei 22⁰C stehengelassen, wobei eine schwache Trübung auftrat, die die Anwesenheit von vorpolymerisiertem

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Antikörperaggregat anzeigt.

Dieses Antikörperaggregät wurde an Tragerteilchen gebunden, die auf die folgende Weise hergestellt worden waren* 5 ml einer 2,5%igen Suspension von mit Formalin behandelten

E. GoIi, die vorher gezüchtet und konserviert worden waren, wurde 3mal mit 10 ml physiologischer Salzlösung gewaschen -und dann wieder bei 4° C in 3 ml der 0,15 m PhosphatpufferlÖsung bei pH 7*3 suspendiert. Zu diesem Gemisch wurden 10 ml 0,0012 m BDB in dem 0,15 m Phosphatpuffer zugegeben. Das entstehende Gemisch wurde 30 min bei .4⁰O gerührt und anschließend 2mal bei 4°C mit kalter Salzlösung gewaschen. Nach dem letzten Vaschen wurden die reaktionsfähigen Trägerteilchen in 3 ml 0,15 m Phosphatpuffer bei Zimmertemperatur wieder suspendiert und die oben beschriebene vorpolymeresierte Aggregatdispersion' hierzu zugegeben. Han ließ die Kopplungsreaktion 30 min bei Zimmertemperatur und gelegentlichem Mischen ablaufen. Anschließend wurde das Präparat zentrifugiert und der immunologische Indikator gewonnen und 3mal mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Anschließend wurde eine Suspension von 4 % des Indikators in Salzlösung hergestellt. - -

Der so hergestellte immunologische Indikator wurde durch ein direktes Agglutinationsverfahren auf einem Objektträger untersucht, wobei die folgenden Konzentrationen von BSA verwendet wurden: 0,1, 1, 10 und lOOyuj/ml« J¹Ur die letzten drei BSA-Konzentrationen wurden Agglutinationsmuster beobachtet. Eine Negativkontrolle,bei der Salzlösung allein verwendet wurde, gab kein Agglutinationsmuster. Bei einem Agglutinateonshinderungsversuch, der mit einer 10 /u^ml-Lösung von BSA in einer Salzlösung, die vorher mit.einer 1:50-Ver-

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dünnung von Anti-BSA in Salzlosung behandelt worden war, wurde eine Hemmung der Agglutination "beobachtet.

Bei einem entsprechenden Versuch xirurde das gleiche Verfahren, wie oben beschrieben, angewandt, mit der Ausnahme daß der Antikörper nicht vorpolymerisiert war. Wenn der auf diese Weise hergestellte immunologische Indikator mit BSA zur Reaktion gebracht wurde, wurde bei keiner der oben verwendeten Konzentrationen Agglutination beobachtet. Der so hergestellte Indikator reagierte jedoch mit einer 1:20-Verdünnung von Antikäninchenglobulin in Salzlösung, wobei ein starkes Agglutinationsmuster entstand. Das zeigte, daß, obwohl die Antikörpermoleküle tatsächlich an die mikrobiologischen Zellen gebunden waren, ihre Antikörpereigenschaften denaturiert oder in gewisser Weise verschlechtert worden waren, aber ihre Antigeneigenschaften, die von der Proteinnatur des Globulins

3 A- h

herrührten, waren noch aktiv. Das würde zeigen, daß die Antikörperstellen des γ-Globulinmoleküls inaktiv sind," wenn die γ-Globulinmoleküle direkt mit Trägerteilchen reagieren, ohne den Vorpplymerisationsschritt.

Beispiel 2

W Ein immunologischer Indikator, der geeignet ist zum Nachweis von Diphtherintoxoid wurde auf die folgende Weise hergestellt. 1 ml Diphtherinantitoxin, das 100 AU (Antitoxineinheiten Internationaler Standard) enthielt, in dem obigen 15 m Phosphatpuffer von pH 7,3 wurde »1ml 0,0006 m BDB in 0,15 in'Phosphatpuff er polymerisiert. Die folgende Reaktion zur Herstellung des vorpolymerisierten Antikörperaggregats und die Kopplung dieses Aggregats an reaktive E-. Goli-Zellen wurde dann auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt. '■' ■ . ■ ■-.--' ■-"-/:"■';_■-.-

00 9 8.2 W ISO 1

1A-37 251 '

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Dieser immunologische Indikator wurde mit den folgenden Konzentrationen von Diphtherintoxoid untersucht: 0,01, 0,1, 1 und 10 LF-Einheiten/ml (bezogen auf den Internationalen AU-Standard). Hit den letzten drei Diphtherintoxoidkonzentrationen wurden Agglutinationsmuster "beobachtet, während e.ine: Eontrollsalzlösung keine Agglutination zeigte,

B e i s .p i e 1 3 .

Ein immunologischer Indikator, der zum Nachweis von Tetanustoxoid geeignet war, wurde auf die folgende Weise hergestellt. 1 ml Tetanusantitoxin, das 80 Antitoxineinheiten (Internationaler Standard AF) enthielt, in dem obigen 0,15 m Phosphatpuffer von pH 7,3 > wurde mit 1 ml 0,0006 m BDB in dem 0,15 m Phosphatpuffer polymerisiert. Dieses Aggregat wurde dann auf die in Beispiel 1 beschriebene' V/eise zur Reaktion gebracht und dann an die aktiven E. CoIi-Trägerteilchen auf die "in Beispiel 1 beschriebene Weise gekoppelt. Es wurde dann auf die gleiche Weise untersucht, wie sie für das Indikatorreagens des Beispiels 2 verwendet wurde, wobei die gleichen Konzentrationen von Tetanustoxoid anstelle des Diphtherintoxoids verwendet wurdet Bei den beiden letzten Konzentrationen des Tetanustoxoids wurden Agglutinationsmuster beobachtet und eine Salzvergleichslösung zeigte keine Agglutination.

B e*i s ρ i e 1 4

Ein immunologischer Indikator, der zum Nachweisvon C-reaktivem Protein (OEP) durch Agglutination damit geeignet war, wurde hergestellt, indem man im allgemeinen nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren arbeitete,

■ ■-..: - 22 -

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1Α-37 251

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Der Antikörper GKP wurde von einer Ziege erzeugt, der man ein entsprechendes CEP-Gemisch injiziert hatte und der man dann nach einer ausreichend langen Zeit Blut entnahm. Das antikörperhalt ige Globulin wurde dann von den anderen Serumproteinen durch DEAE-Cellulosechromatographie abgetrennt. 3 mg der abgetrennten Globuline wurden in 1 ml 0,15 π \ Phosphatpuffer bei pH 7»3 gelöst. Diese Lösung wurde dann mit 1 ml 0,0006 m BDB in dem gleichen Puffer 25 min bei Zimmertemperatur zur -Reaktion gebracht. Ungefähr nach dieser Zeit entwickelte sich eine Trübung und die Antikörper- ö aggregate wurden dann mit-mit BDB behandelten E. Coii-Zellen auf die in Beispiel 1 beschriebeneWeise zur Reaktion gebracht. .

Der so hergestellte immunologische Indikator wurde gegen die folgenden Verdünnungen von handelsüblichen CRP in Salzlösung 1:5, 1:10, 1:100 und 1:1000 untersucht. Bei den ersten beiden Verdünnungen wurden Agglutinationsmuster beobachtet, während eine Salzkontrollösung keine Agglutination zeigte. Der immunologische Indikator agglutinierte ebenfalls mit einer 1:100-Verdünnung von Antiziegenserumproteinen in Salzlösung, was zeigt, daß . die von dem γ-Globulin herrührenden Antigeneigenschaften " des Antikörpers tatsächlich aktiv sind.

Ein Agglutinationshemmungstest wurde ebenfalls durchgeführt, wobei sowohl 1:10-als auch 1:50-Verdünnungen von CRP in ' Salzlösung verwendet wurden undjnan zur Hemmung 0,1 ml

CRP-Antikörper in Salzlösung verwendete. Es wurde eine Ver- - hinderung des Agglutinationsmusters beobachtet.

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0OS82S/1 SO 1

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Beispiel

Ein immunologischer Indikator zum Nachweis von BSA durch Agglutination damit wurde hergestellt. Das vorpolymerisierte Anti-BSA-Aggregat wurde in einem Vierstufenkopplungsverfahren an mikrobiologische Zellen gekoppelt, wobei Acrolein zuerst verwendet wurde, um die mikrobiologischen Zellen mit aktiven Aldehydgruppen zu überziehen und anschließend o-Dianisidin verwendet wurde, um die.Aldehydreaktivität in eine Aminogruppenaktivität umzuwandeln. Anschließend wurden die Aminogruppen mit BDB zur Reaktion gebracht, um die endgültigen reaktiven Trägerteilchen herzustellen. Das vorpolymerisierte Antikörperaggregat wurde dann an diese reaktiven Teilchen gekoppelt. Es ist ebenfalls möglich, ein Einstufenkopplungsverfahren zu -verwenden, wobei nur das Acrolein verwendet wird, da die Aldehydgruppen direkt an das vorpolymerisierte Antikörperaggregat koppeln.

Noch spezifischer wurde E. CoIi von den Antigenen befreit, indem man die Zellen mit einer 1:20-Verdünnung von mit

bei pH 7,2

Phosphat gepufferter Salzlösung/2,5 bis 3 h in einem Wasserbad von 100° G extrahierte. Die Konzentration der Zellen wurde dann auf 2,5 % in. Salzlösung eingestellt und 2 Volumina einer 4%igen Salzlösung von frisch destilliertem Acrolein wurden hierzu zugegeben. Dieses Gemisch wurde 72 h unter gelegentlichem Schütteln bei 22⁰C .stehengelassen. Die reaktiven Zellen wurden dann $mal mit 250 ml Salzlösung gewaschen und die Zellkonzentration auf 2,5 ^c/° eingestellt, bevor man ein gleiches Volumen von 0,25 %igem o-DianisidindihydroChlorid in Wasser zugab. Anschließend wurde das Gemisch unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben stehengelassen. ■

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- Die so-vorbereiteten Zellen wurden dann 5mal mit Salzlösung gewaschen und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise an BDB gekoppelt.

Das vorpolymerisierte Anti-BSA-Aggregat wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt und auf die in dem gleichen Beispiel beschriebene Weise an die reaktiven Trägerteilchen gekoppelt»

Eine BSA-Konzentration von 1/ug/al agglutinierte dieses L immunologische Reagens und eine SalzkontrollÖsung tat es nicht.

B ei s piel 6

Das Verfahren des Beispiels 5 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 2,7-DiaminofluorendihydroChlorid anstelle des o-Dianisidindihydrochlorids verwendet wurde. Es wurden die gleichen Testergebnisse erhalten.

B e i s pi el 7

Es ist möglich, die Größe- und die Oberflächeneigenschaften der Trägerteilchen daduißh zu verändern, daß man sie mit einer oder mehreren Schichten eines Eiweißmaterials wie oben erwähnt, überzieht. In diesem Beispiel wird eine mikrobiologische Zelle zuerst mit BSA überzogen, um die Größe und das Gewicht des Grundträgerteilchens zu erhöhen. ■

BSA wurde verwendet, um E.CoIi auf die folgende Weise zu behandeln. 5 ml 2,5$iger forminalisierter E.Coli wurden 3 mal* •gewaschen und dann wieder in 3 ml des 0,15 *& Phosphatpffers von pH 7,3 suspendiert. Anschließend wurden -10 mg BSA, die in

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2,5 ml Salzlösung gelöst waren, zusammen mit TO ml 0,0024 m BDB in 0,15 m Phosphatpuffer zugegeben. Das Gemisch, wurde dann 30 Minuten "bei Zimmertemperatur in einen Drehschüttler gegeben, zentrifugiert und 2 mal mit 10 ml.einer Salzlösung gewaschen, bevor die Zellen wieder in 10 ml einer 0,6 $igen BSA/Salzlösung suspendiert werden. Nachdem man die Trägerteilchen 30-Minuten stehengelassen hatte,wurden sie wieder 3 mal mit Salzlösung gewaschen und-in einer 2 $igen Konzentration in Salzlösung gelöst.

Ein vorpolymerisiertes Anti-BSA-Aggregat wurde hergestellt und an diese mit BSA überzogenen Trägerteilchen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gekoppelt. Wenn dieser Indikator mit BSA untersucht wurde, wurde bis herurter zu einer Konzentration von 1 g pro ml Agglutination beobachtet, während eine Salzkontrolle keine Agglutination zeigte. Ein starkes Agglutinationsmuster wurde ebenfalls beobachtet, wenn d^er immunologische Indicator mit einer 1;100 Verdünnung von AntiKaninchen- ^-globulin in Salzlösung vermischt wurde, woraus man sieht, daß die Antigen-Aktivität des vorpolymerisierten Aggregats nicht herabgesetzt worden ist.

Es wurde ebenfalls eine Untersuchung durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Überzugsschicht von BSA wirksam mit; dem vorpolymerisierten Antikörperaggregat bedeckt war. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, indem man den Indikator mit einer 1:100 Verdünnung von Anti-BSA in Salzlösung untersuchte, wobei keine Agglutination gefunden wurde.

PATENTANSPRÜCHE-

62XXIV ·

008125·/! SOI

Claims

Patentansprüche

Immunologisches Indikator-Reagenζ zur direkten Agglutination mit einem Antigen, dadurch g e k e η η ζ e i cine t,

es

daß/ein mikrobiologisches Zellträgerteilchen und ein vorpolymerisiert es Aggregat des Antikörpers gegen das besagte Antienthält,das . .
gen/an mindestens einen äußeren Teil der Oberfläche dieses Trägerteilchens gebunden ist durch Bindungen, die durch Reaktion eines Kopplungsmittels mit diesem Trägerteilchen und dem Aggregat gebildet werden. - ....-■
2. Immunologisches Indikator-Reagenz nach Anspruch 1, dadurch g e k en η ζ e ic h η e t, daß das vorpolymerisierte Aggregat durch Mischen, des Antikörpers mit einem .Kopplungsmittel erhalten worden ist* . ·
3. Immunologisches Indikator-Reagenz nach Anspruch 1 - 2, dasdureh g e k e η η ζ e i c h η e t, daß das Kopplungsmittel Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidin-dis-ulfonsäure, Tetraazop-phenylendiamin,Diflüordinitrobenzol, Difluordinitrodiphenylsulfon, ein Garbodiimid, Toluol-diisocyanat, Cyantir-chlorid, Dichlor-s-triazin- K-tert.-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat, ein Dialdehyd und/oder eino^.β -ungesättigtes Aldehyd ist. ;
4· Immunologisches Indikator-Reagenζ nach Anspruch 1-3, dadurch* g" e k e η η zeichnet, 'daß die mikrobiologische

Zelle eine Bakterien-ppilz-^rotozooen- oder Virenzelle ist.

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ORIGINAL INSPECTED
5. Immunologisches Indikator-Reagenz nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiologische Zelle einen maximalen.Durchmesser von ungefähr 5lu hat.
6. Immunologisches Indikator-Reagenz nach Anspruch 1-5» dadurch g e k. e η η ζ e i c h η et, daß die mikrobiologische Zelle konserviert worden ist. '
7. Immunologisches Indikator-Reagenz nach Anspruch 1-6, dadurch g e k e η η ζ e ic h η e t, daß die mikrobiologische Zelle gefärbt ist. .
8. *" Immunologisches Indikator-Reagenz nach Anspruch 1-7, in trockener Form.
9. Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Indikator-Reagenzes nach Anspruch 1-8, dadurch g e k e η η ζ e i chn e t, daß man ein Kopplungsmittel mit dem Antikörper gegen das Antigen zur Reaktion bringt, wobei ein polymerisiertes Aggregat dieses Antikörpers entsteht, eine mikrobiologische Zelle mit einem Kopplungsmittel zur Reaktion bringt, wobei ein reaktives Trägerteilchen entsteht und dann dieses polymerisierte Aggregat mit dem reaktiven Trägerteilchen eine ausreichende Zeit zusammenbringt, daß eine Kopplungsreaktion zwischen beiden stattfinden kann.
10. Verfahren nach Anspruc h 9, dadurch gekennzei chn e t, daß die Kopplungsmittel Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidiri-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitriobenzol, Difluordinitro-diphenyl-sulfon, ein Carbodiimid, Toluol-diisocyanat, Cyanur-ehlorid- Dichlor-s-triazinr N-tert.-butyl-S-methylisoxazolium-perchlorat, ein Dialdehyd, und/oder ein oO , ß-ungesättigtes Aldehyd sind.

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- 19615Λ1

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ig
11. Verfahren, nach Anspruch 9 - 10, dadurch" g e k e η nzeichnet, daß die mikrobiologischen Zellen Bakterien-, Pilz-Protozojaen- und/oder Virenzellen sind.
12. Verfahren nach Anspruch 9 - 11, dadurch g e k e η nz e i c h η e, t, daß die mikrobiologischen Zellen vor der Reaktion mit dem Kopplungsmittel mit einem Konservierungsmittel behandelt werden. ■, .
13· Verfahren nach Anspruch 1 - 12, dadurch g e k e« nzeichnet, daß die .mikrobiologischen Zellen zusätzlich vor der Reaktion mit dem Kopplungsmittel mit einem Farbstoff behandelt werden.
14« Verfahren nach Anspruch 9 - 13» datirch- g e k e η nzeichn et, daß die einzelnen Sehritte in flüssigem Medium durchgeführt werden und das gebildete immunologische Indikator-Reagenz anschließend von dieser Flüssigkeit abgetrennt und getrocknet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 9- 14, dadurch g e k e η nz e i c h η et, daß zunächst die mikrobiologische Zelle mit einem Aldehyd wie einem Dialdehyd und/oder einem cAß-ungesättigten Aldehyd zusammengebracht wird und anschließend die Aldehydgruppenreaktivität in eine» Aminogruppenreaktivität umgewandelt wird, indem, man die Zellen,mit einer Verbindung der allgemeinen Formel - -

H₂N— oder H₂N- H₂N- H₂N- —Ar— —Ar-— —NH- —NH- -NH₂, -r-OH, -Ar-OT₂ —Ar-

OH

behandelt, in denen Ar eine Phenyl-Diphenylgruppe, ein stabilisierter heterocyclischer Ring, ein mehrkerniger Kohlenwasser-,stoff, ein mebrkerniger heterocyclischer Ring, Triphenylmethan oder substituierte Gruppe , Sulfonsäuregruppe oder Gemische

• 00 9825/1501

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IB

-■■% -

dieser Verbindungen bedeutet und dann die entstehenden Aminogruppen diazoziert.

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