DE2551576A1

DE2551576A1 - Traeger fuer immunochemische messungen

Info

Publication number: DE2551576A1
Application number: DE19752551576
Authority: DE
Inventors: Masakatsu Hashimoto; Nobuhisa Ogawa
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-11-16
Filing date: 1975-11-17
Publication date: 1976-05-20
Also published as: GB1487698A; FR2291496A1; DK143045B; JPS5247012B2; NL180546B; NL7513302A; BR7507475A; DK143045C; JPS5157818A; DE2551576C3; FR2291496B1; US4062936A; DE2551576B2; CA1049404A; NL180546C; DK513375A

Description

MÜLLER-BORIS · GROJBXING · DJUOFi₁L · SCHÖN · HERTEL

DR. WOI-FQANe MÖLLER-BORS HANS W. QROENINQ, DIPL-INS. DR. PAUU DEUFEL, DIPU-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN, DIPU-CHEM. WERNER HERTEI-, DIPI PHYS.

17. NOV. 1975

S/Gl - M 2475

Mochida Seiyaku Kabushiki Kaisha, Tokio / Japan Träger für immunochemische Messungen

In den vergangenen Jahren wurde die Messung biologisch aktiver Komponenten in einem lebenden Körper, wie Insulin, Wachstumshormonen, Prolactin, Gastrin, Nebennierenrindenhormonen, Schilddrüsenhormonen, Angiotensin oder dergleichen, als wichtig für die Diagnose, Therapie und Verhinderung von menschlichen Krankheiten oder zur Durchführung von verschiedenen Funktionstests angesehen. Die Folge ist, dass derartige Messungen nunmehr sehr häufig durchgeführt werden.

Da jedoch alle diese biologischen Komponenten in sehr kleinen Mengen vorliegen, können sie nicht nach einer herkömmlichen chemischen Methode gemessen werden, vielmehr werden sie nach einer immunochemischen Methode gemessen, beispielsweise durch eine Radio-

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MOSTCIIEiT 80 · SIEBERTSTR. 4 · POB 860720 · KABEL·: 5ITJEBOPAT · TEL·. (089) 471079 · TELEX 5-226 59

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immunoarialyse, die nachfolgend als RIA bezeichnet wird. Diese Analyse ermöglicht eine aussergewöhnlich empfindliche Messung.

Die RIA-Methode eignet sich jedoch nicht zum Messen von Komponenten des menschlichen Körpers im Rahmen einer Routineuntersuchung in medizinischen Labors, da sie spezielle Instrumente erfordert, die unter Einsatz von Isotopen arbeiten₇ wobei die Bedienung dieser Instrumente schwierig und nicht sehr bequem ist.

Eine bekannte einfache Methode zur Messung von biologischen Komponenten im menschlichen Körper besteht darin, einen Träger aus Blutzellen, Polystyrollatex, Kaolinit, Bentonit, Aktivkohle, kristallinem Cholesterin oder dergleichen mit einem Antigen oder Antikörper zu sensibilisieren und dann den Träger mit dem Antikörper oder Antigen in der Probe umzusetzen, wodurch eine immunochemische Agglutinierungsreaktion oder eine Agglutinierungsinhibierungsreaktion erfolgt. Eine Methode unter Einsatz von Blutzellen als Träger ist infolge ihrer hohen Empfindlichkeit besonders vorzuziehen.

Die Blutzellen, die als Träger für die vorstehend erwähnte immunochemische Messung eingesetzt werden, werden gewöhnlich aus Blutzellen hergestellt, die von verschiedenen Tieren ohne eine chemische Behandlung erhalten werden. Man kann auch auf Blutzellen zurückgreifen, die zuerst mit einem geeigneten Fixiermittel, wie Formaldehyd, Pyruvinaldehyd, Wasserstoffperoxyd oder dergleichen und dann mit einem Bindemittel, wie Gerbsäure, Bisdiazobenzidin, 1,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol oder dergleichen, behandelt worden sind.

Die Tiere, aus denen die Blutzellen erhalten werden, sind im allgemeinen Säugetiere, beispielsweise Rinder, Pferde, Schafe, Kaninchen, Menschen etc_v oder Vögel, beispielsweise Küken, Tauben, Truthähne oder dergleichen, man kann jedoch auch auf andere Tiere

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*"· j. —

zurückgreifen, beispielsweise Reptilien, wie Krokodile und Schlangen, sowie Amphibien, wie Frösche etc., ferner auf Wassertiere, wie Delphine.

Die Blutzellen, die aus diesen Tieren erhalten werden, können in unbehandeltem Zustand verwendet werden, I_n. den meisten Fällen werden jedoch fixierte Blutzellen, die mit den vorstehend geschilderten Fixiermitteln behandelt worden sind, verwendet, da nichtbehandelte Blutzellen in ihrer natürlichen Form eine schlechte Festigkeit besitzen und zu einer Hämolyse während mechanischer oder chemischer Behandlungen neigen.

Unter dem Begriff "Blutzellen" soll die Materialkomponente in dem Blut verstanden werden, die sich hauptsächlich aus roten Blutzellen zusammensetzt, wobei sowohl nicht-behandelte Blutzellen, die keinerlei Behandlung unterzogen worden sind, als auch die erwähnten fixierten Blutzellen in Frage kommen. Die Menge der Blutzellen wird durch das scheinbare Volumen an Blutzellen wiedergegeben, das beim Zentrifugieren von Blut ermittelt wird.

Diese Blutzellen müssen mit dem vorstehend erwähnten Bindemittel behandelt werden, bevor sie als Träger verwendet werden. Es ist schwer. Antigene oder Antikörper an Blutzellen zu binden, die nicht mit einem Bindemittel behandelt worden sind. Auch dann, wenn sie gebunden sind, lässt sich kein gleichmässiges Produkt erhalten, so dass es unmöglich ist, einen Träger zu gewinnen, der eine reproduzierbare Empfindlichkeit aufweist. Andererseits besitzen Blutzellen, die mit einem Bindemittel behandelt worden sind, ein verbessertes Bindevermögen auf ihren Oberflächen, wodurch die Bindung an ein Antigen oder an einen Antikörper erhöht wird, so dass ein Träger mit einer besseren immunochemischen Agglutinierungsreaktion oder Agglutinierungsinhibierungsreaktion erhalten wird. Wird beispielsweise Gerbsäure als Bindemittel bei der Durchführung von üblichen Methoden verwendet, dann wird eine Suspen-

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sion von Blutzellen in einer Pufferlösung (Blutzellenkonzentration 2 bis 8 %) mit einem gleichen Volumen einer Lösung eines Bindesmittels in der Pufferlösung vermischt, worauf beide Komponenten bei 37 bis 56⁰C während einer Zeitspanne von 30 bis Minuten reagieren gelassen werden. Die Gerbsäurelösung besitzt gewöhnlich eine Konzentration von 1/20 000 bis 1/40 000. Die Angabe 1/20 000 im Zusammenhang mit der Gerbsäurelösung bedeutet, dass 20 000 ml der Lösung durch Zugabe von 1 g des gelösten Stoffes zu dem Lösungsmittel hergestellt worden sind. Auf weitere Fälle wird nachfolgend eingegangen.

Werden Blutzellen mit Gerbsäure behandelt, dann werden ungefähr 0,3 bis 2,5 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden. Die Blutzellen besitzen eine Empfindlichkeit von ungefähr 100 ng/ml bei der Messung von menschlichem Serumalbumin (nachfolgend als HSA bezeichnet) mit den Blutzellen als Träger. Dieser Empfindlichkeitswert ist vergleichsweise hoch im Vergleich zu anderen Trägertypen als Blutzellen, beispielsweise kleinen Polystyrollatexteilchen. Dennoch ist dieser Wert nicht mehr als 1/10 bis 1/10 000 der Empfindlichkeit der RIA-Methode.

Daher ist es bei der Durchführung von immunochemischen Agglutinierungsreaktionen oder Agglutinierungsinhibierungsreaktionen unmöglich, eine. Empfindlichkeit zu erzielen, die mit derjenigen einer RIA-Methode unter Einsatz eines herkömmlichen Trägers vergleichbar ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, dass die Messung mit einer derartig hohen Empfindlichkeit einen neuen Träger erfordert.

Als stark empfindlicher und sehr spezifischer Träger für die Durchführung einer immunochemischen Messung sollte er folgende Eigenschaften besitzen: Wird der Träger mit einem Antigen oder Antikörper entsprechend der zu messenden Substanz sensibilisiert, dann kann eine geringe Menge Antigen oder Antikörper in einem

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lebenden Körper als biologische Komponente leicht eine immunochemische Reaktion mit dem Antikörper oder Antigen, mit welchem der Träger sensibilisiert worden ist, verursachen, so dass auf der Grundlage dieser Reaktion der sensibilisierte Träger eine vollständige Agglutinxerungsreaktion eingeht. Für den Fall, dass die immunochemische Reaktion nicht stattfindet, tritt keine spontane Agglutinxerungsreaktion ein.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Trägers, der bei einer vereinfachten Messung von biologischen Komponenten unter Anwendung einer immunochemischen Agglutinxerungsreaktion oder einer Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität wie im Falle einer Radioimmunoanalyse ergibt.

Die Erfindung betrifft einen Träger für immunochemische Messungen, der dadurch gekennzeichnet ist, dass Gerbsäure an Blutzellen in einer Menge von 3 0 bis 500 mg pro 1 ml der Blutzellen gebunden ist. Bisher wurden die qualitativen und quantitativen Messungen der biologischen Komponenten eines lebenden Körpers durch Anwendung von immunochemischen Reaktionen durchgeführt. Diese Methoden sind zwar sehr einfach im Vergleich zu der Radio-. immunoanalysen-Methode (RIA-Methode), sie besitzen jedoch insofern Nachteile, als eine Antigen-Antikörper-Reaktion eine geringe Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu der RIA-Methode bedingt, da man keinen geeigneten Träger zum Tragen des Antigens und Antikörpers gefunden hat, das bzw. der mit biologischen Komponenten über eine immunochemische Reaktion reagiert.

Es wurde nunmehr gefunden, dass durch Vermischen der Blutzellen mit einer grossen Menge an Gerbsäure ein Träger aus Blutzellen erhalten wird, bei welchem 30 bis 500 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind, wobei dieser Träger bei der Durchführung von immunochemischen Messungen ganz hervorragende Eigenschaften besitzt.

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— D —

Der erfindungsgemässe Träger wird gewöhnlich in der Weise hergestellt, dass eine Blutzellensuspension, die 2 bis 4 % Blutzellen in einer Pufferlösung enthält, mit einer Lösung von Gerbsäure in der Pufferlösung mit einer Konzentration von 1/50 bis 1/1000 Gerbsäure vermischt und umgesetzt wird, dass 30 bis 500 mg Gerbsäure an 1 ml der Blutzellen gebunden sind.

Die erfindungsgemäss eingesetzten Blutzellen können allen Typen entsprechen, die als Träger für herkömmliche immunochemische Messungen eingesetzt worden sind.

Die Menge an Gerbsäure, die an die Blutzellen gebunden wird, liegt vorzugsweise zwischen 30 und 500 mg pro 1 ml der Blutzellen. Ist die Menge geringer als 3 0 mg, dann kann der Träger nicht die gewünschte hohe Empfindlichkeit und Spezifität erreichen, übersteigt sie 500 mg, dann ist die Agglutinierungswarkung des Trägers zu intensiv, um nach der nachfolgend geschilderten Methode kontrolliert werden zu können, so dass daher der Träger nicht mehr zur Durchführung einer immunochemisehen Messung eingesetzt werden kann.

Gewöhnlich werden bei der Umsetzung zwischen Blutzellen und Gerbsäure gleiche Mengen der Blutzellensuspension, die 2 bis 4 % Blutzellen enthält, sowie einer Gerbsäurelösung mit einer Konzentration von 1/50 bis 1/1000 vermischt. Die Konzentration der Blutzellen in der Suspension, die Konzentration der Gerbsäure in der Gerbsäurelösung sowie das Mischungsverhältnis der Blutzellensuspension zu der Gerbsäurelösung werden derartig gewählt, dass die Menge an Gerbsäure, die an 1 ml der Blutzellen gebunden ist, zwischen 30 und 500 mg liegt. Dies bedeutet, dass entweder Blutzellen in einer Gerbsäurelösung mit einer Konzentration von 1/100 bis 1/2000 suspendiert werden oder Gerbsäure selbst einer Blutzellensuspension mit einer Konzentration von 1 bis 2 % zugesetzt werden.

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Die Pufferlösung zur Suspendierung der Blutzellen sowie zur Auflösung der Gerbsäure kann jede Pufferlösung sein, wie sie in herkömmlicher Weise zur Durchführung von immunochemisehen Reaktionen eingesetzt wird. Insbesondere kann eine physiologische Salzlösung verwendet werden, vorzugsweise eine Phosphatpuffersalzlösung.

Die Blutzellen können mit der Gerbsäure bei Zimmertemperatur umgesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn man auf eine Temperatur zwischen 37 und 56⁰C erhitzt, dies ist der übliche Temperaturbereich, der im allgemeinen bei der Durchführung von immunochemischen Verfahren eingehalten wird.

Der erfindungsgemässe Träger, der eine grössere Menge an Gerbsäure als übliche Träger festhält, besitzt eine wesentlich gesteigerte Agglutinierungswirkung und vermag gleichzeitig eine grössere Menge an Antigen oder Antikörper an sich zu binden als herkömmliche Träger.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die zur Behandlung von Blutzellen zugesetzt worden ist, und der Menge an Gerbsäure, die an die Blutzellen gebunden ist, geht aus der Tabelle I hervor.

Tabelle I

Menge an Gerb- Gerbsäure, die Bindungsgrad, %

säure, die 1 ml an 1 ml Blutzellen

Blutzeilen züge- gebunden ist, mg setzt wird, mg

1 0,94 94,0

10 8,82 88,2

100 86,2 86,2

600 498 83,0

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Die in der Tabelle I angegebenen Werte sind Gerbsäurewerte, die unter Verwendung von FoIin-Denis—Reagens in Äthanolextrakten aus Blutzellen, die mit Gerbsäure behandelt worden sind, gemessen worden sind. Ungefähr die gleichen Werte werden durch Messen des Restgerbsäuregehaltes in der überstehenden Flüssigkeit nach dem Binden der Gerbsäure an die Blutzellen und Abziehen von der Ausgangsmenge an Gerbsäure erhalten. Aus dieser Tabelle geht hervor, dass der grösste Teil der zugesetzten Gerbsäure an den Blutzellen gebunden ist, und zwar unabhängig von der Menge an Gerbsäure, die den Blutzellen zugesetzt wird.

Die Agglutinierungswirkung des Trägers selbst, die Agglutinierungswirkung, die dann ermittelt wird, wenn Rinderserumalbumin " als Stabilisiermittel für ein Reaktionssystem zugesetzt wird, und die Agglutinierungswirkung eines Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert worden ist, wurden zur Durchführung eines Vergleichs der herkömmlichen Träger mit dem erfindungsgemässen Träger ermittelt. Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst schwankt im allgemeinen mit dem pH-Wert, der Ionenstärke etc. der Pufferlösung, in welcher der Träger suspendiert ist. In dem vorliegenden Beispiel werden Träger, an die verschiedene Mengen Gerbsäure gebunden sind, in einer Phosphatpuffersalzlösung (pH 6,4 und Konzentration 0,067 Mol) mit einer Konzentration von 0,133 % suspendiert, wobei 0,5 ml einer jeden Suspension in ein kleines Reagensglas eingefüllt und 2 Stunden stehen gelassen werden, worauf die Agglutinierungswirkung des Trägers auf der Grundlage der Sedimentation am Boden des Reagensglases ermittelt wird.

Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst wird nach Zugabe eines Rinderserumalbumins. als Stabilisierungsmittel für ein Reaktionssystem in der gleichen Weise wie in dem Fall gemessen, dass kein Serumalbumin vorliegt, mit der Ausnahme, dass eine Phosphatpuffersalzlösung, die 0,2 % Rinderserumalbumin enthält, zum Suspendieren des Trägers verwendet wird. Die Agglutinierungswirkung

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eines Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist₇ wird in der gleichen Weise wie in Spalte 2 von Tabelle II angegeben ist, mit der Ausnahme, dass ein Träger verwendet wird, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Die Kriterien für die Sedimentation auf dem Boden eines Reagensglases werden wie folgt festgelegt:

sehr intensive positive Reaktion intensive positive Reaktion positive Reaktion
negative Reaktion

Die Ergebenisse sind in der Tabelle II zusammengefasst,

Gerbsäure, die an
1 ml Blutzellen
gebunden ist, mg

Spalte 1

Agglutinierungswir- kung des Trägers selbst

Tabelle II Spalte 2

Agglutinierungswirkung des Trägers selbst mit Zusatz von Rinderserunaalbumin als Stabilisierungsmittel für das Reaktionssystem

Spalte 3

Agglutinierungswirkung des Trägers, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist

500
100
10.
1

-t-H-

-H-

Die Tabelle II zeigt, dass der erfxndungsgemässe Träger, an dem eine grosse Menge Gerbsäure gebunden ist, eine spontane Agglutinierungsreaktion bedingt, während die herkömmlichen Träger, an denen nur eine kleine Menge Gerbsäure gebunden ist, diese Wirkung nicht zeigt. Dies legt nahe, dass dann, wenn eine grosse Menge an Gerbsäure an die Blutzellen gebunden ist, eine bestimmte Verände-

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rung der Oberfläche der Blutzellen erfolgt, die eine Erhöhung der Agglutinierungswirkung des Trägers selbst bedingt.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die an Blutzellen gebunden ist, und der Menge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das an den Träger gebunden ist, der wiederum mit Gerbsäure verbunden ist, wurde untersucht.

Die Menge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das an einen Träger gebunden ist, wird durch Bestimmung der Menge an Antikörper oder Antigen in der überstehenden Flüssigkeit nach der Sensibilisierung des Trägers mit Antikörper oder Antigen nach einer immunologischen Diffusionsmethode und Abziehen von der Anfangsmenge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das zum Zwecke der Sensibilisierung zugesetzt worden ist, ermittelt.

In dem vorliegenden Beispiel wird ein Kaninchen-Gamrnaglobulin bzw. HSA als Antikörper und Antigen verwendet.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor.

Tabelle ITI

Gerbsäure, die an 1 ml Gebundener Antikörper Blutzellen gebunden (Gammaglobulin), mg ist, mg (5 mg Zusatz zu 0,2 ml

Blutzellen)

Gebundenes Antigen (HSA), mg

(2 mg Zusatz zu 0,2 ml

Blutzellen)

500 100 50 10

3,0 (60 %1

2,5 (50 %)

1,9 (38 %)

Q,6 (12 %)

0,4 (8 %)

1,7 (85%)

1,5 (75 %)

1,3 (65 %)

0,7 (35 %)

0,3 (15 %)

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, steigt mit zunehmender gebun-

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dener Menge Gerbsäure an dem Träger die an dem Träger gebundene Gammaglobulinmenge. Ein Träger, an dem 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, bindet ungefähr 7,5 mal soviel Gammaglobulin wie ein Träger, an dem 1 mg Gerbsäure gebunden sind. Im Falle von gebundenem Antigen ist die Situation ähnlich. Daraus ist zu schliessen, dass der erfindungsgemässe Träger eine merklich gesteigerte Wirkung besitzt, Antikörper oder Antigen zu binden, und zwar im Vergleich zu herkömmlichen Trägern.

Ferner besitzt der erfindungsgemässe Träger den Vorteil, dass die hohe Agglutinierungswirkung und das ausgeprägte Vermögen, eine grosse Menge an Antigen oder Antikörper zu binden, je nach dem Anwendungszweck gesteuert werden kann. Eine derartige Steuerung lässt sich in sehr wirksamer Weise durch Anwendung der bekannten Methoden durchführen, beispielsweise bei der Sensibilisierung eines Trägers mit einem Antigen oder Antikörper, um die Menge an Antigen oder Antikörper zu steuern, ferner durch Zugabe von normalem Kaninchenalbumin, Rinderserumalbumin oder eines grenzflächenaktiven Mittels etc. als Stabilisierungsmittel für das immunochemische Reaktionssystem, durch eine Steuerung des pH-Wertes und der Ionenstärke des immunochemischen Reaktionssystems oder durch eine Kombination dieser bekannten Methode {vgl. die Tabelle II).

Der erfindungsgemässe Träger kann als Träger für Antigen oder Antikörper zur. Durchführung von immunochemischen Agglutinierungs- und Agglutinierungsinhibierungsreaktionen eingesetzt werden. Wird beispielsweise HSA unter Einsatz des erfindungsgemässen Trägers gemessen, dann ist eine Messung von HSA in einer Grössenordnung von 100 pg/ml möglich. Dies bedeutet, dass die Empfindlichkeit der Messung um ungefähr das 1000-fache im Vergleich zu dem Einsatz herkömmlicher Träger verstärkt wird.

Die folgenden Versuche und Beispiele erläutern die Erfindung.

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Versuch 1

2 ml Schafblutzeilen, die mit Formalin fixiert worden .sind, werden in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 60 ml einer Lösung von Gerbsäure mit verschiedenen Konzentrationen, gelöst in der Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Verschiedene Träger mit verschiedenen Mengen an gebundener Gerbsäure werden erhalten. Jeder der Träger wird in 60 ml der Pufferlösung suspendiert und dann mit einer Antikörperlösung vermischt, die in der Weise hergestellt wird, dass 60 mg eines Anti-HSA-Antikörpers (als Kaninchengammaglobulin) in der Pufferlösung aufgelöst werden. Die Mischung wird bei 56⁰C während einer. Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit dem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Danach wird jeder der auf diese Weise erhaltenen sensibilisierten Träger mit 50 ml Pufferlösung gewaschen und zu einer 1 %igen Suspension in einer- PHosphatpuffersalzlösung formuliert, die 10 % Rohrzucker, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,02 % normales Kaninchenserum enthält.

0,1 ml einer jeden dieser sensibilsierten Trägersuspensionen werden in ein Reagensglas mit einem Innendurchmesser von ungefähr 9 mm mit einem kugelförmigen Boden eingebracht und allmählich mit 0,3 ml der Phosphatpuffersalzlösung zur Gewinnung einer 0,25 %igen Suspension vermischt, worauf sich die Zugaben von 0,1 ml HSA-Lösungen mit 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0_# 10, 20, 50 bzw. 100 ng/ml HSA anschliessen. Nach einem Schütteln werden die Mischungen während einer Zeitspanne von 2 Stunden stehen gelassen. Die Sedimentationsmuster, die sich am Boden der Reagensgläser entwickeln, werden beobachtet. Die Ergebnisse werden als negativ bzw. positiv eingestuft, je nachdem, ob ein Sedimentationsring gebildet worden ist oder nicht.

Die Tabelle IV zeigt die Ergebnisse der Empfindlichkeiten von ver-

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schiedenen Trägern bei HSA-Messungen, und zwar dargestellt als die minimalen Mengen an HSA, die erforderlich sind, um positive Reaktionen zu bewirken.

Tabelle IV

Konzentration der Gerbsäurelösung, die für die Behandlung der Blutzellen verwendet wird

Gerbsäure, die an 1 ml Blutzellen gebunden ist,itig

Empfindlichkeit bei der HSA-Messung, ng/ml

1/50	500	*(298)
1/250	100	(103)
1/900	30	(29)
1/2 500	1Q	(10,4)
1/30 000	1	(0,96)

0,5

0,1 5,0 20
100

*Die Werte in Klammern sind die tatsächlich gemessenen Werte.

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, wird das beste Ergebnis mit dem Träger erhalten, bei welchem 100 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind. Dieser Träger besitzt eine ungefähr 1000 mal so grosse Empfindlichkeit wie ein herkömmlicher Träger, bei dem nur 1 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden ist.

Versuch 2

60 ml jeweils einer der Trägersuspensionen, die nach der in Versuch 1 beschriebenen Weise hergestellt worden sind, werden mit einer Lösung von 6 mg eines Kombinationsproduktes aus 2,4-Dinitrophenol und Rinderserumalbumin (nachfolgend als DNP-BSA bezeichnet)

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in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung vermischt. Die Lösung wird bei 56⁰C während einer Zeitspanne von 3 0 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit DNP-BSA sensibilisiert ist. Dann wird jeder der Träger mit 50 ml der vorstehend erwähnten Pufferlösung gewaschen und zu einer 1 %igen Suspension in der Phosphatpuffersalzlösung formuliert, die 10 % Rohrzucker, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,02 % normales Kaninchenserum enthält.

Zuerst wird mit den sensibilisierten Trägern das maximale Verdünnungsverhältnis eines Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, untersucht.

Ein Anti-DNP-BSA-Antiserum wird in der Weise hergestellt, dass Freund¹sches Complete Adjuvant mit DNP-BSA nach einer herkömmlichen Methode vermischt und dabei ein Kaninchen immunisiert wird. Die Absorption des Serums mit BSA liefert ein Antiserum, das eine Antikörperaktivität nur gegenüber DNP besitzt. Das Antiseruia wird mit 0,25 % einer Salzlösung verdünnt, die 1 % BSA enthält, und zwar in der Reihenfolge des 1-, 10-, 20-, 50-, 100-, 200-, 300-, 400- und 500-fachen. Dann werden 0,1 ml der verdünnten Sera in ein Reagensglas gegeben, das 0,1 ml jeweils einer der sensibilisierten Trägersuspensionen und 0,3 ml Phosphatpuffersalzlösung enthält, worauf geschüttelt wird. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wird das maximale Verdünnungsverhältnis des Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, bestimmt.

Dann werden einige Agglutinierungsinhibierungssysteme aus jedem der sensibilisierten Träger zusammengesetzt, worauf das Antiserum bei dem maximalen Verdünnungsverhältnis bestimmt wird, das für die Agglutinierungsreaktion erforderlich ist. Jedes der Systeme, das auf diese Weise erhalten wird, wird auf seine Empfindlichkeit zur Durchführung einer DNP-Messung untersucht.

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Für jedes der Agglutinierungsinhibierungsreaktionssysteme werden 0,1 ml des erwähnten Antiserums mit maximaler Verdünnung in einem Reagensglas mit 0,1 ml einer DNP-Lösung vermischt, die 50, 100, 200, 300, 500, 700 oder 1000 ng/ml DNP in einer Phosphatpuffersalzlösung enthält, der 0,1 ml der sensibilisierten Trägerlösung und 0,2 ml Phosphatpuffersalzlösung zugesetzt worden sind. Nach einem Schütteln und Stehenlassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wird das Sedimentationsmuster, das sich auf dem Boden des Reagensglases entwickelt hat_f beobachtet. Falls ein Sedimentationsring gebildet wird, wird das Ergebnis als positiv eingestuft, während es als negativ bewertet wird, wenn sich kein Sedimentationsring gebildet hat.

Die Empfindlichkeiten der Träger sind in der Tabelle V zusammengefasst und werden als minimale Menge an DNP wiedergegeben, die für das Auftreten positiver Reaktionen erforderlich sind.

Tabelle V

Konzentration der Gerbsäurelösung, die für die Behandlung von Blutzellen ein gesetzt wird	Gerbsäure, die an 1 ml Blutzel len gebunden ist, mg
1/50	500
1/250	100
1/900	30
1/2 500	10
1/30 000	1

Maximales Verdünnungsver hältnis des Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion erforderlichiist

300 300 100

50 *

Empfindlichkeit bei der DNP-Messung, ng/ml

100

200

1000

*Es erfolgt keine Agglutinierung, selbst wenn nicht-verdünntes Serum verwendet wird.

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Aus der Tabelle V geht hervor, dass herkömmliche Träger, an denen 1 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden ist, auch dann nicht agglutiniert werden können, wenn nicht-verdünntes Antiserum verwendet wird, während der erfindungsgemässe Träger, an dem 100 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, eine Agglutinierungsreaktion mit einem Antiserum zu bewirken vermag, das um das 3 00-fache verdünnt worden ist.

Die erfindungsgemässen Träger besitzen eine 5 bis 10 mal grössere Empfindlichkeit bei der Messung als die herkömmlichen Träger.

Aus diesen Versuchen geht hervor, dass die Verwendung des erfindungsgemässen Trägers zur Durchführung einer immunochemisehen Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine starke Vervielfachung der Verdünnung des Antiserums im Vergleich zu einer Verwendung von herkömmlichen Trägers ermöglicht, so dass Messungen mit einer höheren Empfindlichkeit möglich sind, bei denen Antiseren mit einem derart niedrigen Antikörpergehalt verwendet werden können, welcher bisher für eine Messung unmöglich war.

Beispiel 1

30 ml Schafblutzellen, die mit Formalin fixiert worden sind, werden mit 300 ml Phosphatpuffersalzlösung gewaschen und dann in einer Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 900 ml eingestellt wird. Die Suspension wird mit 900 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/300-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, versetzt, worauf die Mischung bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger jeweils zweimal mit 600 ml der Pufferlösung gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt worden ist, enthält ungefähr 90 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen in gebundener Form.

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Beispiel 2

50 ml Kükenblutzellen, die mit Pyruvinaldehyd fixiert worden sind, werden 10 mal mit der physiologischen Salzlösung gewaschen und dann in 1000 ml dieses Lösungsmittels suspendiert.

Dieser Blutzellensuspension werden 2 000 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/350-Konzentration zugemischt, worauf die Mischung bei 25°C während einer Zeitspanne von 60 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger mit 1000 ml des Lösungsmittels gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt wird, weist in gebundener Form ungefähr 100 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen auf.

Beispiel 3

50 ml Kaninchenblutzellen, die nach einer Behandlung mit Wasser— stoffperoxyd fixiert sind, werden mit 500 ml einer Boratpuffersalzlösung gewaschen und dann erneut in der Pufferlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 1500 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/500-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56°C während einer Zeitspanne von 45 Minuten umgesetzt wird. Nach der Umsetzung wird das Produkt mit 1000 ml der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 50 mg Gerbsäure pro 1 „gji .Blutzellen auf.

Beispiel 4

30 ml nicht-behandelter Rinderblutzellen werden mit 500 ml Veronalpufferlösung gewaschen, wgrauf die Blutzellen zentrifugiert werden. ■ Die Blutzellen werden in einer Gerbsäurelösung suspendiert, die durch Auflösen von 1 g Gerbsäure in 1000 ml der Pufferlösung hergestellt worden ist, worauf die Suspension bei 37⁰C während einer Zeit-

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spanne von 3 0 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen .

Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 3 0 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen auf.

Beispiel 5

20 ml Rinderblutzellen, die mit Wasserstoffperoxyd fixiert worden sind, werden mit 3 00 ml Phosphatpuffersalzlösung gewaschen und dann in der Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 600 ml eingestellt wird. ^:

Die Blutzellensuspension wird mit einer Lösung von Gerbsäure mit einer 1/50-Konzentration, gelöst in der Pufferlösung, vermischt. Die Mischung wird bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels enthält ungefähr 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen.

Wie vorstehend erwähnt worden ist, besitzt der erfindungsgemässe Träger für immunochemische Messungen eine höhere Empfindlichkeit und eine höhere Spezifität als herkömmliche Träger, so dass er ohne weiteres eine immunochemische Reaktion auslöst, und zwar auch dann, wenn die Menge der biologischen Komponenten sehr gering ist. Ferner bedingt er, aufgrund dieser Reaktion, eine vollständige Agglutinierungsreaktion. Daher erleichtert die Verwendung des erfindungsgemässen Trägers die Messung von biologischen Komponenten, so dass er von sehr hohem medizinischen Wert ist.

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Claims

Patentansprüche

1 . Träger für immunochemische Messungen, dadurch gekennzeichnet, dass er aus Blutzellen besteht, an die Gerbsäure in einer Menge von 30 bis 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden ist.
2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutzellen aus verschiedenen Tieren in nicht-behandeltem Zustand erhalten worden sind.
3. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutzellen, die aus verschiedenen Tieren erhalten worden sind, mit einem geeigneten Fixiermittel fixiert worden sind.
4. Träger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixiermittel aus Formaldehyd, Pyruvinaldehyd oder Wasserstoffperoxyd besteht.
5. Verfahren zur Herstellung eines Trägers für immunochemische Messungen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutzellensuspension, die durch Suspendieren von Blutzellen in einer Pufferlösung hergestellt worden ist, mit einer Gerbsäurelösung umgesetzt wird, wobei die Konzentrationen und das Mischungsverhältnis der Lösungen derartig sind, dass 3 0 bis 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutzellensuspension mit einer Blutzellenkonzentration von 2 bis 4 % in einer Pufferlösung mit einer Lösung vermischt und umgesetzt wird, die Gerbsäure in Lösung in der gleichen Pufferlösung in einer Konzentration von 1/50 bis 1/1OQO enthält, so dass 30 bis 500 mg Bernsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden werden.
7. Verfahren zur Herstellung eines Trägers für immunochemische Mes-

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sungen, der aus Blutzellen besteht, mit denen Gerbsäure in einer Menge von 30 bis 50 0 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass Blutzellen und Gerbsäure in einer Pufferlösung derartig umgesetzt werden, dass 30 bis 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Pufferlösung aus einer Phosphatpuffersalzlösung, einer physiologischen Salzlösung, einer Boratpuffersalzlösung oder aus einer Veronalpufferlösung besteht.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Blutzellen aus natürlichen Blutzellen, die aus verschiedenen Tieren erhalten werden, sowie aus fixierten Blutzellen bestehen, die durch Fixieren von natürlichen Blutzellen mit einem Fixiermittel erhalten werden.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reaktionstemperatur zwischen 37 und 56°C eingehalten wird.
11. Reaktionssystem für eine immunochemische Messung, gekennzeichnet durch einen Träger gemäss Anspruch 1, der mit einem Antigen oder Antikörper sensibilisiert ist.
1-2 .Reaktionssystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass er der jeweiligen Messung durch Zugabe eines Stabilisieirungsmittels angepasst ist.
13. Reaktionssystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich dem Messzweck durch. Steuerung seines pH-Wertes angepasst ist.
14. Reaktionssystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich dem jeweiligen Messzweck durch Steuerung seiner Ionenstärke angepasst ist.

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15. Verfahren zur Messung von immunochemisehen biologischen Komponenten, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionssystem gemäss Anspruch 11 einer immunochemischen Agglutinierungs- oder Agglutinierungsinhibierungsreaktion mit einer Testprobe zugeführt wird, welche die zu messenden biologischen Komponenten enthält.

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