DE2705897C3 - Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischem Adenosin-3', 5'-monophosphat und/oder cyclischem Guanosin-3'3'-monophosphat - Google Patents

Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischem Adenosin-3', 5'-monophosphat und/oder cyclischem Guanosin-3'3'-monophosphat

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Description

Cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat und cyclisches Guanosin-3',5'-monophosphal spielen bei der Hormonwirkung eine große Rolle. Da sich der Gehalt von cAMP und cGMP in einem lebenden Organismus ändert, wenn sich dieser Organismus in einem unphysiologischen oder pathologischen Zustand befindet, wie z. B. einer Krankheit, ist die Bestimmung dieser cyclischen Nucleotide von größter Bedeutung nicht nur für die Grundlagenforschung sondern auch in der klinischen Medizin, für die Diagnose, die Vorbeugung und die Therapie.
In »J. biol. Chem.«, Bd. 247, S. 1106—1113 (1972) ist eine radioimmunologische Bestimmungsmethode für cyclische Nucleotide beschrieben, in der bei der Herstellung des Antigens modifizierte Nucleotide verwendet werden. Die Bestimmung von cAMP und cGMP erfolgt in Natriumacetatpuffer, bei cIMP und cUMP wird 0,05 m Imidazolpuffer verwendet. Die Empfindlichkeit dieser Methode ist jedoch für die Praxis viel zu gering.
Aus »Analytical Biochemistry«, Band 56, Seiten 394 bis 407 (1973) ist bekannt, daß man die Empfindlichkeit im Radioimmunitätsversuch dadurch erhöhen kann, daß man das cAMP succinyliert und dadurch seine Affinität zu seinem Antikörper erhöht. Diese Succinylierung kann auf zwei verschiedene Weisen erfolgen: Im Verfahren A wird eine gefriergetrocknete Probe eines Organismus und 4-Morpholino-N,N'-dicyclohexylcarboxamidin in Pyridin gelöst und mit einer Lösung von Bernsteinsäure-anhydrid in Dioxan versetzt. Im Verfahren B wird gepulvertes Bernsteinsäure-anhydrid und Triäthylamin zu einer wäßrigen Lösung der Organismusprobe zugegeben.
Verfahren A ist wegen verschiedener Schwierigkeiten jedoch praktisch nicht durchführbar, z. B. wegen des gefriergetrockneten Zustands der Probe und wegen der niedrigen Succinylierungsrate, die auf die niedrige Löslichkeit des cAMP in dem Lösungsmittel zurückzuführen ist. Im Verfahren B ist es wegen der Pulverform des Bernsteinsäure-anhydrids und seiner Hydrolysierbarkeit in einem wäßrigen Lösungsmittelsystem wesentlich, für die rasche Auflösung und die Diffusion des Bernsteinsäure anhydrids in die wäßrige Lösung der Probe zu sorgen, damit die Succinylierung mit genügend hoher Geschwindigkeit stattfinden kann. Zusätzlich zur Schwierigkeit der Handhabung dieses Pulvers muß in diesem Verfahren B für eine Schüttelausrüstung gesorgt sein. Die gleichzeitige Bestimmung einer großen Anzahl von Proben ist deshalb in diesem Verfahren besonders schwierig. Außerdem wird in diesem Verfahren B zur Trennung des freien cAMP und des nach der Antigen-Antikörperreaktion an den Antikörper gebundenen cAMP die Dialyse verwendet. Auch für die Dialyse ist eine spezielle Ausrüstung notwendig, so daß dieses Verfahren im gesamten keine zufriedenstellenden Ergebnisse ergibt.
Aufgabe der Erfindung war es, die bei der Bestimmung von cAMP und cGMP mit herkömmlichen Reagentien anfallenden Probleme zu lösen und die gleichzeitige ultramikroskopische Bestimmung von cAMPundcGMPzu ermöglichen.
Die Erfindung gehl aus von einem Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) und/oder cyclischem Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) in von lebenden Organismen entnommenen Proben, wobei man das oder die cyclische(n) Phosphat(e) mittels einer i.ösung von Bernsteinsäure-anhydrid in Gegenwart eines organischen tertiären Amins succinyliert und anschließend einer Antigen-Antikörperreaktion mittels
eines für das betreffende cyclische Nucleotid spezifischen Anti-Serums in Gegenwart von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischen! Succinyl-adenosin-S'.S'-monophosphat-tyrosin-methylester und/oder cyclischen! Succinyl-guanosin-S'.S'-monophosphat-tyrosinmethylester unterwirft, den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex abtrennt, die Radioaktivität des Komplexes oder des freien Antigens mißt und daraus durch Vergleich mit den Ergebnissen einer das oder die Nucleotide enthaltenden Standardlösung den Nucleotidgehalt bestimmt, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Succinylierung von cAMP und/oder cGMP in einem System von Wasser und einem organischen Lösungsmittel und die Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Imidazol-Puffer mit einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol durchführt
Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt durch einfaches Vermischen der organischen Lösung des Bernsteinsäure-anhydrids mit dem organischen tertiären Amin unmittelbar vor dem Versuch und Zugeben des Gemisches zur cAM P- und/oder cGM P-Standardlösung oder einer Probe die Succinylierung des cAMP und/oder cGMP sofort, außerdem kann die Empfindlichkeit gegenüber dem Antiserum deutlich erhöht werden. Wegen dieser verbesserten Empfindlichkeit kann man die Probe vor der Reaktion mit dem Antiserum noch einmal verdünnen.
Durch diese Verdünnung ist es nun möglich, die die Reaktion hemmenden Faktoren zu entfernen, außerdem wird der Bestimmungsfehler stark vermindert. Dank des jo größeren Flüssigkeitsvolumens ist es möglich, mit der gleichen Probe gleichzeitig mehrere Bestimmungen von cAMP und cGMP durchzuführen. Außerdem können Körperflüssigkeiten, wie Blut, cercbrospinale Flüssigkeit, Urin und saure Extrakte von Körpergewebe als solche als Proben verwendet werden.
Außerdem kann im erfindungsgemäßen Verfahren durch Verwendung des Imidazol-Puffers mit einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol in der Antigen-Antikörper-Reaktion anstelle des bisher verwendeten Acetat-, Phosphat- oder Citratpuffers die Antigen-Aniikörper-Reaktion stabilisiert werden, und die Hemmwirkung des Succinylierungsmittels wird vollständig ausgeschaltet.
Auf diese Weise gestattet das erfindungsgemäße Verfahren zum ersten Mal die gleichzeitige ultramikroskopische Bestimmung von cAMP und cGMP in einer einzigen Probe au? sehr einfache Weise. Außerdem liegt die geringste meßbare Menge für cAMP und cGMP jeweils bei etwa 0,006 pMol/Röhrchen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise unter Verwendung der nachsiehenden vorbereiteten Reagentien durchgeführt:
a) Lösung von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-ß'^'-monophosphattyrosinmethylester und/oder cyclischem Succinylguanosin-3',5'-monophosphatlyrosinmethylester,
b) Anti-c'^MP-Serum und/oder Anti-cGMP-Serum,
c) Imida/ol-Pufferlösung in einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol, bo
d) Substanzen für die Abtreibung des Antigen-Antikörper-Komplexes von Ireiein cAMP bzw. cGMP,
e) Bernsleinsäure-anhydrid in einem organischen Probe Lösungsmittel,
f) organisches tertiäres Amin und b5
g) cAMP-und/odercGMP-Standardlösung.
Die Menge an Benisteinsäure-anhydrid im Reagens e Rattenlunge beträgt vorzugsweise 2 bis 6 mg, insbesondere 3,5 bis Rattenhirn 4,5ΐτ^/100μΙ der zu untersuchenden Probe. Es wurde festgestellt, daß bei einem Oberschuß von Bernsteinsäure-anhydrid diese Verbindung während der Succinylierungsreaktion ausfällt und möglicherweise die Antigen-Antikörper-Reaktion hemmt.
Als Lösungsmittel für das Bernstemsäure-anhydrid geeignet ist jedes organische Lösungsmittel, das das Bernsteinsäureanhydrid stabil auflöst, jedoch keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion hat, z. B. Pyridin, Dioxan, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxld, Diäthylenglykol-dimethyläther, Hexamethylphosphortriamid, Tetrahydropyran und Äthylenglykolmonomethyläther-acetat Als Lösungsmittel bevorzugt sind Dioxan und Hexamethyiphosphortriamid.
Für das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens f ist jedes organische tertiäre Amin geeignet, das sich leicht mit dem Reagens e homogen vermischen läßt, die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht nachteilig beeinflußt und die Succinylierungsreaktion beschleunigt, z. B.Triäthylamin und4-Morpholino-N,N'-dicyclohexylcarboxamidin. Die Menge an diesem tertiären Amin beträgt im Fall des Triäthylamins z.B. 15 μΐ oder weniger, vorzugsweise 10 μΙ/100 μΐ der zu untersuchenden Probe oder darunter. Wird ein Überschuß verwendet, so steigt der pH-Wert und die Succinyüerungsreaktion wird gehemmt.
Das Mischverhältnis von Reagens e und f hängt von dem organischen Lösungsmittel und dem organischen tertiären Amin ab. Wird z. B. als Lösungsmittel Dioxan und Triäthylamin für die Succinylierung von 1 pMol cAMP in Blutplasma verwendet, so sind die Verhältnisse wie in Tabelle 1 angegeben, wobei die Succinylierung mittels Elektrophorese auf Celluloseestern bestimmt wurde.
Tabelle I Triäthylamin Dioxan i (μΐ) (μΐ) Succinyl
0 100 ierung
1,25 98,75
Zusammensetzung des Succinylierungsmittels 2,5 97,5 (%)
Bernstein- 5,0 95,0 0
säureanhydric 10,0 90 45
(mg) 70
O 100
0,5 100
1,0
2,0
4,0
Im erfindungsgemäßen Verfahren sind somit eine Lösung von 4 mg Bemsteinsäure-anhydrid in 90 μΙ Dioxan (etwa 4,4prozentige Bemsteinsäure-anhydridlösung) als Reagens e und 10 μΐ Triäthylamin als Reagens f geeignet. Die Succinylierung von cAMP und cGMP mit diesem Succinylierungsmittel bei verschiedenen Organproben zeigt Tabelle 11.
Tabelle II
Succinylierung von lebenden Proben nach Säureextraktion
Konzentration Succinylierung
10 mg/100 μΐ
10 mg/100 μΐ
99,4
98,3
Fortsetzung
Probe
Konzentration Succinylierung
Rattenleber
Rattenherz
Kaninchenplasma
Cerebrospinale
Flüssigkeit von
Kaninchen
Humanplasma
10 mg/100 μΐ 97,5
10 mg/100 μΐ 97,2
100 μ] 94,0
100 μΐ 100,0
100 μΐ
100,0
Die Succinylierung von cAMP und cGMP erfolgt in guter Wirkung unabhängig von der Art der Probe durch einfaches Vermischen der Reagentien e und f mit der Probe.
Obwohl die Art der Herstellung der Probe nicht kritisch ist, werden vorzugsweise Flüssigkeiten, wie Blut, cerebrospinale Flüssigkeit und Urin als solche oder als Lösungen, denen Äthylendiamin-tetraessigsäure zugesetzt wurde, verwendet. Gewebe werden im allgemeinen extrahiert, z. B. mit Säuren, wie Salzsäure, Perchlorsäure und Trichloressigsäure, in Wasser oder in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, mit Alkali, z. B. Bariumhydroxid und Zinksulfat, in Wasser oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel oder mit hydrophilen organischen Lösungsmitteln.
Die Bedingungen der Succinylierungsreaktion sind nicht kritisch, Raumtemperatur und eine Reaktionszeit von 5 bis 60 Minuten sind im allgemeinen ausreichend.
Für das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens c ist eine 0,1 m Imidazol-Pufferlösung mit einem pH von .'5 bis 8, der durch Zugabe einer Säure, wie Salzsäure, die keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion hat, eingestellt wurde, geeignet
Die Tabellen III und IV zeigen di& günstige Wirkung des Imidazol-F'uffers im Vergleich zu bisher verwendeten Acetat-, Phosphat- und Citrat-Puffern für die Bestimmung von cAMP und cGMP.
Tabelle IiI Meßbare Mindest
menge ((MoI*)/
Röhrchen)
Pufferlösung 6,25
25
25
25
Imidazol
Acetat
Phosphat
Citrat
*) Femtomol = 10"15 Mol
Tabelle IV		 Antigen-Antikörper-
Reaktion
(%)
Pufferlösung 65,4
68,7
47,0
38,2
Imidazol
Acetat
Phosphat
Citrat
Bei Verwendung der Imidazol-Pufferlösung erhält man vernünftige Ergebnisse von 15,5 pMol cAMP/ml Plasma und 7,5 pMol cAMP/0,5 ml Plasma. Wird jedoch ein Acetat- oder Citrat-Puffer verwendet, so liegen die Ergebnisse bei 14,5 bzw. 30 pMol cAMP/ml Plasma und bei 10,5 bzw. 20 pMol cAM P/0,5 ml Plasma.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion eines Plasmas, das kein cAMP und cGMP enthält, d. h. ein Plasma, das 24 Stunden bei 37°C stehengelassen wurde, um das cAMP und cGMP vollständig zu zerstören, und die Antigen-Antikörper-Reaktion in destilliertem Wasser sind theoretisch gleich. Bei Verwenudng der Imidazol-Pufferlösung sind die Reaktionsgrade in beiden Fällen gleich. Verwendet man jedoch Acetat-Puffer, so erhält man eine Reaktion von 73,9 Prozent mit dem Plasma und von 68,7 Prozent mit destilliertem Wasser, d. h. es besteht eine Differenz von über 5 Prozent.
Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die Plasmaprobe cAMP und cGMP in so niedrigen Mengen enthält,
M z. B. etwa 10 fMol/Röhrchen, daß sie mit dem Reagens, das Acetat-Puffer enthält, nicht erfaßt werden konnten. In einem anderen Fall wurde mit einem Citrat-Puffer eine Antigen-Antikörper-Reaktion von 38,2 Prozent für die Plasmaprobe im Gegensatz zu 34,5 Prozent in destilliertem Wasser gefunden.
Daraus ist ersichtlich, daß die Imidazol-Pufferlösung (Reagens c) nicht nur die Empfindlichkeit der Bestimmung erhöht, sondern auch die Antigen-Antikörper-Reaktion stabilisiert. Außerdem werden im erfindungsge-
Jü mäßen Verfahren viel bessere Werte erhalten, sogar in Proben, aus denen die Proteine nicht entfernt wurden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Konzentration der Imidazol-Pufferlösung wesentlich. Liegt die Konzentration nämlich unter 0,1 Mol, so erhält man abnormale Werte. Der optimale pH-Wert für diese Pufferlösung liegt bei 6,5.1st der pH-Wert niedriger als 5, so ist die Pufferwirkung zu schwach, und ist er über 8, so zersetzen sich die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und Succinyl-guanosin-3'.5'-monophosphat-Tyrosinmethylester.
Es ist bekannt, daß Imidazol die enzymatische Wirkung der Phosphodiesterase begünstigt. Um Fehler bei der Bestimmung in der Probe oder im Antiserum, die auf die Wirkung von eventuell vorhandener Phosphordiesterase beruhen, zu verhindern, kann man vorsorglich einen Phosphodiesterase-fnhibitor, wie Äthylendiamin-tetraessigsäure oder Theophyllin, zusetzen.
Die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und/oder Succinyl-guanosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylester des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagens a werden im allgemeinen als Lösung in einem Puffer, wie einem Imidazol-Puffer, oder als gefriergetrocknetes Pulver in Kombination mit einem möglichen Stabilisator, hergestellt. Das Reagens a wird je nach Bedarf mit den anderen Reagentien kombiniert: Wird z. B. nur cAMP oder cGMP bestimmt, so wird nur der eine radioaktiv markierte Tyrosinmethylester verwendet. Werden jedoch beide Nucleotide bestimmt so werden die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und Succinyl-guanosin-S'^'-monophosphat-tyrosinmethylester entweder getrennt oder vermischt anderen Reagentien zugesetzt Für die gleichzeitige Bestimmung der beiden Nucleotide im Gemisch ist es günstig, verschiedene Jodisotope zu verwenden, z.B. 125]od und 131 Jod, und diese getrennt zu bestimmen.
Das Anti-cAMP-Serum und/oder Anti-cGMP-Serum des Reagens b kann in herkömmlicher Weise hergestellt
werden. So ist ζ. B. eine nach Steiner el al. in »J. Biol. Chem.« Band 247, Seiten 1106 bis 1113 (1973) hergestellte Lösung eines Kaninchen-Antiserums in einem Imidazol- oder Acetat-Puffer sehr geeignet. Das Antiserum hat eine Bindungsfähigkeit von z. B. 50 Prozent oder darüber, bezogen auf die Gesamtradioaktivität des zugesetzten mit l25Jod markierten cyclischen Adenosin- oder Guanosin-monophosphat-tyrosin-methylesters, wenn man 0,03 μΙ (1 :9900) Antiserum eines gewissen Kaninchens für diese Bestimmung verwendet. Die Verwendung dieses Antiserums entspricht dem Reagens a.
Für die Antigen-Antikörper-Reaktion können herkömmliche Bedingungen angewendet werden, z. B. eine Temperatur von 1 bis 5°C und eine Reaktionszeit von 6 bis 48 Stunden, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden.
Die in Reagens d verwendeten Substanzen sind für eine Trennung des an den Antikörper gebundenen cAMP oder cGMP, d. h. des Antigen-Antikörper-Komplexes, von dem freien cAMP oder cGMP bestimmt. Beispiele für geeignete Substanzen für diese Trennung sind mit Dextran überzogene Kohle, Ammoniumsulfat, Polyäthylenglykol und ein Anti-gamma-Globulin-Serum, die im allgemeinen bei Radioimmunitätsversuchen verwendet werden. Diese Substanzen liegen als solche oder als Dispersion oder Lösung in Wasser oder einer Pufferlösung vor.
Die Trennung hängt von der Art der zu trennenden Verbindungen ab. So kann man zum Beispiel 100 μΐ eines mit 125Jod markierten cyclischen Succinyl-adeno- jo sin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylesters mit 100 μΐ eines 0,3molaren Imidazol-Puffers, pH 6,5, und 100 μΙ eines Anti-cAMP-Serums in 0,3molarem Imidazol-Puffer, pH 6,5, in Eiswasser 16 Stunden umsetzen, zu diesem System 500 ml einer Suspension von mit Dextran überzogener Kohle in Wasser zusetzen, das Gemisch zentrifugieren und an'-xhließend die Radioaktivität des Überstands messen, der das gebundene cAMP, d. h. den Antigen-Antikörper-Komplex, enthält.
In Tabelle V ist die prozentuale Radioaktivität des Antigen-Antikörper-Komplexes, bezogen auf die Gesamtradioaktivität, unter verschiedenen Bedingungen zusammengestellt.
Tabelle V
45
Mit Dextran überzogene Radioaktivität des Antigen-Anti-Kohle körper-KompIexes in Prozent der
Gesamtaktivität
<mg/500 ;j
Versuch
1*)
52,5 50,0 51,0
51,5 49,0 50,0
52,5 50,0 50,5
50
55
*) Versuch 1: Es wird unmittelbar nach der Zugabe der mit
Dextran überzogenen Kohle abzentrifugiert.
**) Versuch 2: Es wird erst 30 Minuten nach der Zugabe der Kohle abzentrifugiert.
***) Versuch 3: Es wird unmittelbar nach der Zugabe der Kohle abzentrifugiert und 30 Minuten später abgetrennt.
Diese Ergebnisse beweisen, daß eine Menge von 2,5 mg mit Dextran überzogener Kohle genügen und daß die Trennfähigkeit noch mindestens 30 Minuten nach der Zugabe erhalten bleibt
Als cAMP- und/oder cGMP-Slandardlösung für das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens g ist eine Lösung in Wasser oder in einem Imidazol-Puffer von freiem cAMP und/oder cGMP oder dessen Salz, wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder eines Salzes, das keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion zeigt, geeignet.
In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vermischt man die Lösung des Bernsteinsäureanhydrids in einem organischen Lösungsmittel (Reagens e) mit dem organischen tertiären Amin (Reagens f), gibt dieses Gemisch zu der zu untersuchenden Probe und zu der cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung (Reagens g), verdünnt mit der Imidazol-Pufferlösung (Reagens c) und vermischt mit dem radioaktiv markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und/oder Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethylester (Reagens a) und dem Antiserum (Reagens b), versetzt das Gemisch mit den Trennsubstanzen (Reagens d), trennt den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex ab und bestimmt in herkömmlicher Weise die Radioaktivität dieses Antigen-Antikörperkomplexes.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die in einer Probe gleichzeitig vorhandenen cAMP und cGMP gleichzeitig succinyliert. So kann man eine Probe dieser succinylierten Nucleotide aufbewahren und das cAMP und cGMP im Verhältnis zueinander radioimmunologisch bestimmen. Enthält das Reagens a ζ. Β. ein Gemisch von mit 125]od markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-monophosphat-tyrosinmethylester und mit 131Jod markiertem cyclischem Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethyiester, so so kann man nicht nur die Succinylierung sondern auch den radioimmunologischen Versuch in dem gleichen Röhrchen durchführen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Für die Bestimmung von cAMP in 75 Proben werden folgende Reagentien hergestellt:
a) 8 ml einer Lösung von mit 125]od cyclischem Succinyl-adenosin-T.S'-monophosphat-tyrosinmethylester (1 \ic) in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5,
b) 8 ml Anti-cAMP-Serum aus Hauskaninchen in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5
c) 12 ml 1,5 m Imidazol-Puffer, pH 6,5, der auf das fünffache vor der Verwendung verdünnt wird,
d) 200 mg Kohle, 200 mg Rinderseruuiaibüffiin, eine Suspension von 30 mg Dextran in 20 ml Wasser, die auf das Doppelte vor der Verwendung verdünnt wird,
e) 400 mg Bernsteinsäure-anhydrid in 9 ml Dioxan,
f) 1 ml Triäthylamin und
g) 320 pMolcAMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser.
Beispiel 2
Für die Bestimmung von cGMP in 75 Proben werden die folgenden Reagentien hergestellt:
a) 8 ml mit I25]od markiertem cyclischem Succinyl-
guanosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylester (1 μΰ) in 03 m Imidazol-Puffer, pH 6,5,
b) 8 ml Anti-cGMP-Serum aus Hauskaninchen in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5,
Reagentien c)bis e) gemäß Beispiel 1 und
f) 320 pMolcGMP (Natriumsalz in 1 ml Wasser).
Beispiel 3
Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben werden die Reagentien a) und b) des Beispiels 2, die Reagentien a), b), c), e) und f) des Beispiels 1, das Reagens d) des Beispiels 1 in doppelter Menge und als Reagens g) 320 pMol cAMP (Natriumsalz) und 320 pMol cGMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser verwendet.
Beispiel 4
Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben werden als Reagens a) 8 ml mit 125Jod markiertem cyclischem Succinyl-adcnosin-monophosphat-tyrosinmethylester und mit l3l]od markiertem cyclischem Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethylester (1 μΰ) in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5, sowie die anderen Reagentien gemäß Beispiel 3 verwendet.
Beispiel 5
Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben werden als Reagens c) 24 ml 1,5 m Imidazol-Puffer, pH 6,5, der 12,5 mMol Äthylendiamin-tetraessigsäure enthält, und die anderen Reagentien wie in Beispiel 3 verwendet.
Beispiel 6
Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben verwendet man als Reagens e) 400 mg Bernsteinsäure-anhydrid in 9 ml Hexamethylphosphortriamid. Die anderen Reagentien sind gemäß Beispiel 3.
Beispiel 7
Die Reagentien des Beispiels 1 werden zur Bestimmung von cAMP in Blutplasma verwendet.
1. Die Reagentien e) und f) werden in einem Volumenverhältnis von 9 :1 zum Succinylierungsmittel vermischt.
2. Das Reagens c), das vor der Verwendung auf ein Fünftel der Konzentration verdünnt wird, destilliertes Wasser und das Succinylierungsmittel werden in einem Volumenverhältnis von 8 :1 :1 vermischt.
3. 100μ1 des Reagens g) werden in ein Heines Proberöhrchen eingefüllt und mit 100 μΐ des Succinylierungsmittels vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, dann mit 800 μΐ des Reagens c) versetzt. Auf diese Weise erhält man 1 ml Succinyl-cAMP-Standardlösung mit einem Gehalt von 3,2 pMol/100 μΙ (Probe 1).
4. In jedes von 9 Proberöhrchen (Proben II bis X) werden 500 μΐ des gemäß 2. für die Verdünnung hergestellten Puffers und 500 μΐ der Succinyl-cAMP-Standardlösung gemäß 3. eingefüllt und vermischt. Die Röhrchen III bis X werden jeweils um die Hälfte verdünnt, so daß man Succinyl-cAMP-Standardlösungen mit einer Konzentration von 3200, 1600, 800, 400, 200,100,50,25,12,5 und 6,25 fMol/l 00 ;>.l erhält.
5. 100 μΙ Plasma werden in einem Röhrchen mit 100 μΐ Succinylierungsmittel vermischt, das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und mit 800 μΐ des Reagens c) versetzt Das Reagens c) wird in einer solchen Menge verwendet, daß die Bernsteinsäure-anhydrid-Konzentration zur Zeit der Antigen-Antikörper-Reaktion die Reaktion nicht stört (etwa 0,15 Prozent oder weniger).
6. Folgende Röhrchen werden vorbereitet:
für die Gesamtzählung: 3 Röhrchen, Nr. 1 bis 3
für den Leerwert: 2 Röhrchen, Nr. 4 und 5
für den Nullwert: 2 Röhrchen, Nr. 6 und 7
für die Standardlösung: 20 Röhrchen, Nr. 8 bis 27
für die Plasmaprobe: 2 Röhrchen, Nr. 28 und 29
7. 100 μΙ des Reagens a) werden in jedes Röhrchen eingefüllt.
8. 100 μΐ Puffer werden in die Röhrchen 1 bis 3 (Gesamtzählung), 4 und 5 (Leerwert) und 6 und 7 (Nullwert) eingefüllt.
9. 100 μΐ der Succinyl-cAMP-Standardlösung I bis X werden in jedes der Röhrchen 8 bis 27 eingefüllt.
10. 100 μΐ succinyliertes Plasma werden den Röhrchen 28 und 29 zugesetzt.
11. 100 μΙ Reagens b) werden in jedes Röhrchen Nr. 6 bis 29 für den Nullwert, für die Standardlösung und für die Plasmaprobe zugesetzt. Nach dem Vermischen werden die Gemische in Eiswasser 12 bis 24 Stunden (18 Stunden in diesem Beispiel) stehengelassen.
12. 100 μΙ 0,3 m Imidazol-Puffer werden in jedes Röhrchen 1 bis 5 für die Gesamtzählung und den Leerwert eingefüllt. Nach dem Vermischen werden die
2r> Lösungen gemäß 11. stehengelassen.
13. 500 μΐ Reagens d), das vor der Verwendung auf das Zweifache verdünnt wird, werden zu jedem Röhrchen außer zu den Röhrchen, die für die Gesamtzählung bestimmt sind, zugegeben. Die Röhrchen werden dann bei 300 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert.
" 14. Die Röhrchen für die Gesamtzählung werden mit 500 μΐ Wasser vermischt.
15. 500 μΐ des Überstands aus jedem Röhrchen werden für die Radioaktivitätsbestimmung in ein anderes Röhrchen übergeführt.
16. Die Radioaktivität jedes Überstands wird gemessen.
17. Der mittlere Leerwert BL wird von dem mittleren Gesamtwert Tund dem Mittelwert ß jeder Standardlösung abgezogen. Die Bindungsfähigkeit ß/Tin Prozent wird gemäß folgender Gleichung berechnet:
BiT ("Za) = (y(
Die Ergebnisse sind in Tabelle Vl zusammengefaßt.
Tabelle VI
Mittelwerte
cpm
cpm
-HL
π Leerwert (BL) 300
Gesamtwertf7'; 9109 8809 100
Null wert 6065 5765 65, Φ
Standardlösung 6,25 (Mol 5806 5506 62,5
Standardlösung 12,5 (Mol 5543 5243 59,5
bo Standardlösung 25 fMol 5069 4769 54,1
Standardlösung 50 fMol 4600 4300 48,8
Standardlösung 100 (Mol 3614 3314 37,6
Standardlösung 200 IMuI 2837 2537 28,8
Standardlösung 400 (Mol 1992 1692 19,2
η Standardlösung 800 (MoI 1391 1091 12,4
Standardlösung 1600 (Mol 888 588 6,7
Standardlösung 3200 (Mol 620 320 3,6
Plasma 3119 2819 32,0
18. Die Bindungsfähigkeit der verschiedenen Standardlösungen wird gegen derert Konzentrationen halblogarithmisch aufgetragen (F i g. 1).
19. An Hand der Standardkurve wird die cAMP-Konzentration des untersuchten Plasmas aus dem β/Γ-Wert auf fMol/Röhrchen, entsprechend 15 000 fMol/ml Plasma berechnet.
Beispiel 8
Die Arbeitsweise von Beispiel 7 wird für die Bsstimmung von cGMP mit den Reagentien des Beispiels 2 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIl zusammengefaßt.
Tabelle VII
Mittelwerte
cpm
cpm -BL
B/T
Leerwert (BL)
Gesamtwert (T)
Nullwert
Standardlösung
Standardlösung
Standardlösung
200 9885 6540
5,25 ("Mol 6296 12,5 fMol 5821 25 fMol 5058
9685 6340 6096 5621 4858
100,0 65,5 62,9 58,0 50,2
15
20
25
Mittelwerte
cpm
cpm
-BL
B/T
Slandardlösung 50 fMoi 4033 3833 39,6
Standardlösung 100 fMol 2870 2670 27,6
Standardlösung 200 (Mol 1866 1666 17,2
Slandardlösung 400 fMol 1288 1088 11,2
Standardlösung 800 (Mol 846 646 6,7
Standardlösung 1600 fMol 563 363 3,7
Standardlösung 3200 fMol 428 228 2,4
Plasma 4113 3933 40,6
20. Diese Werte werden wie im Beispiel 7 halblogarhhmiseh aufgetragen (Fig. 2).
21. Anhand dieser Kurve wird die cGMP-Konzentration des untersuchten Plasmas auf 46 fMol/Röhrchen, entsprechend 4700 fMoI/ml Plasma berechnet.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagentien können in Form einer Gesamtpackung vorliegen, welche die Reagentien (a) bis (e) gebrauchsfertig abgepackt enthält. Hierdurch wird die Anwendung bei Routineuntersuchungen erleichtert. Gegebenenfalls ist nur noch eine Verdünnung der Komponenten erforderlich.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) und/oder cyclischem Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) in von lebenden Organismen entnommenen Proben, wobei man das oder die cycüsche(n) Phosphat(e) mittels einer Lösung von Bernsteinsäure-anhydrid in Gegenwart eines organi- ι ο sehen tertiären Amins succinyliert und anschließend einer Antigen-Antikörperreaktion mittels eines für das betreffende cyclische Nucleotid spezifischen Anti-Serums in Gegenwart von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylester und/oder cyclischem Sucrinyl-guanosin-3',5'-monophosphai tyrosinraethylester unterwirft, den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex abtrennt, die Radioaktivität des Komplexes oder des freien Antigens mißt und daraus durch Vergleich mit den Ergebnissen einer das oder die Nucleotide enthaltenden Standardlösung den Nucleotidgehalt bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Succinylierung von cAMP und/oder cGMP in einem System von Wasser und einem organischen Lösungsmittel und die Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Imidazol-Puffer mit einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Imidazol-Pufferlösung einen pH-Wert von 5 bis 8 hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Imidazol-Pufferlösung einen Phosphodiesterase-Inhibitor enthält.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es unter Verwendung der nachstehenden vorbereiteten Reagentien durchführt:
a) Lösung von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-S'.S'-monophosphat-tyrosinmethylester und/oder cyclischem Succinyl-guanosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylester,
b) Anti-cAMP-Serum und/oder Anti-cGMP-Serum,
c) Imidazol-Pufferlösung in einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol,
d) Substanzen für die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von freiem cAMP bzw. cGMP,
e) Bernsteinsäure-anhydrid in einem organischen Lösungsmittel,
f) organisches tertiäres Amin und
g) cAMP-und/odercGMP-Standardlösung.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reagens (e) eine Dioxanlösung verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reagenslösung (e) to unmittelbar vor der Zugabe zur Nucleolid-Standardlösung bzw. zur zu uniersuchenden Probe mit dem tertiären Amin (Reagens f) vermischt.
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