DE3650691T2

DE3650691T2 - Verfahren zum Messen von Freitestosteronen in biologischen Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE3650691T2
Application number: DE3650691T
Authority: DE
Inventors: A. Dr. Diagnostic Products Corp. Los Angeles Ca 90045 Said El Shami
Original assignee: Diagnostic Products Corp
Current assignee: Siemens Medical Solutions Diagnostics Inc Canada
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-01-17
Publication date: 1998-12-10
Anticipated expiration: 2006-01-18
Also published as: NO168002C; IE60715B1; DK169365B1; ES8707342A1; FI863186A; IE861495L; EP0661540A1; NO168002B; JPS6283666A; ATE169410T1; IL79283A; CA1299984C; AU602864B2; EP0218309B1; AU5752186A; NO862278L; ES555425A0; NO862278D0; FI92878B; JP2575338B2

Description

Für mehrere Jahrzehnte waren Gleichgewichtsdialysetechniken das einzige verfügbare Verfahren zum Messen von freien Hormonen im Serum, und sie waren bis vor kurzen die einzigen Verfahren, die als verlaßlich angesehen wurden. Gleichgewichtsdialyseverfahren leiden in diesem Zusammenhang an mehreren Nachteilen, einschließlich der schlechten Genauigkeit, der Arbeitsunannehmlichkeiten usw.; vor allem jedoch sind ihre Ergebnisse in starkem Maße von der Reinheit der verwendeten Tracer abhängig.
Ellis und Ekins, R. (Acta Endocr. (KbH.), Suppl. 177:106, 1973) beschrieben ein direktes Verfahren für Bestimmungen von freiem Hormon in ihrem Artikel "Direct Measurement By Radioimmunoassay of the Free Thyroid Hormone Concentration in Serium". Dies bedeutete eine größere Verbesserung gegenüber Gleichgewichtsdialyseverfahren, da es die direkte Messung von Spiegeln an freien Liganden in Serumdialysaten durch Radioimmunoassay (RIA) ermöglichte und somit das Problem der Tracer-Reinheit umging. Dieses Verfahren wird nunmehr von vielen als Referenzmethodologie zur Messung von freiem Hormon angesehen. Es ist jedoch immer noch zeitraubend und vom Ausführenden abhängig, und es ist für die meisten kleinen Laboratorien nicht verfügbar.
Indirekte Verfahren zur Abschätzung von Konzentrationen freier Hormone, welche kurz danach eingeführt wurden, schließen das Testosteron/Steroidhormon-Bindeglobulin (SHBG)- Verhältnis, das Thyroxin (T4)/Thyroid-Bindeglobulin (TBG)-Verhältnis, den Index an freiem T4 (basierend auf dem Produkt der Triiodthyronin (T3)-Aufnahme und T4) und den Index an freiem Androgen ein.
Ekins, R. (Free Thyroid Hormones; Proceedings of the International Symposium held in Venice, Dezember 1978, Amsterdam: Excerpta Medica, 1979, 72-92) führte das Konzept der "direkten dynamischen Verfahren" ein, in denen ein Anti-freier Ligand-Antikörper in direktem Kontakt mit der biologischen Flüssigkeit bzw. dem biologischen Fluid während der Dialyse verwendet wird. Dies stellt die Basis für sogenannte "Immunoextraktions"-Verfahren dar.
Ein solches Verfahren wird in dem U.S.-Patent Nr. 4 046 870 gelehrt, in dem ein Zwei- Röhrchen-Immunoassayverfahren die Rate des Transfers von T4 von Bindeproteinen zu T4- spezifischem Antikörper ermittelt. Dieses Verfahren leidet an mehreren analytischen und klinischen Mängeln, welche es im Grunde genommen nur zu einem anderen Assay des Index an freiem T4 machen.
Ein zweites Verfahren, welches von Clinical Assays (Cambridge, MA 02139) eingeführt wurde, war ein tatsächliches Immunoextraktionsverfahren. Es verwendete eine in einem Einzelröhrchen in zwei Schritten ablaufende sequentielle (Rücktitrations-)Technik. Bei diesem Verfahren wird eine Serumprobe mit immobilisiertem Antikörper inkubiert; dann werden nach einem Waschschritt nicht besetzte Stellen auf dem immobilisierten Antikörper unter Verwendung von markiertem Ligand "rücktitriert". Bei dieser Methode liegt das Serum niemals in Kontakt mit dem markierten Liganden vor. Obgleich es theoretisch ansprechend ist, leidet es an schlechter Empfindlichkeit und Genauigkeit, und beide Reaktionen erfordern ein exaktes Timing.
Einschritt-Immunoextraktionsverfahren zur Bestimmung von Konzentrationen an freiem Ligand in biologischen Proben waren der offensichtliche nächste Schritt bei der Entwicklung von Assaysystemen für freie Liganden. Diese Verfahren verlassen sich eher auf eine chemische als auf eine physikalische Trennung von markiertem Liganden von endogenen Bindern. Um dieses Ziel zu erreichen, können mehrere Wege angepaßt werden, wie unten beschrieben.
Der Stand der Technik beschreibt, daß durch chemisches Verändern der Struktur eines gegebenen Liganden die Bindung zu endogenen Bindestoffen verringert oder gesenkt wird. Dies wurde deutlich für Steroidhormone gezeigt (siehe die nachstehende Diskussion über freies Testosteron). Im Fall von Thyroidhormonen haben Ross, J.E. und Tapley, D.F. (Effect of various analogues on the binding of labeled thyroxine to thyroxine-binding globulin and prealbumin, Endocrinology 79:493, 1966) gezeigt, daß die Bindung von TBG (Thyroidbindendes Globulin) an T4 inhibiert wird, wenn eine einigermaßen sperrige Substitution an der 3'-Position des T4-Moleküls vorgenommen wird. Darüber hinaus zeigten Schall, R.F. et al. (An enzyme-labeled immunoassay for the measurement of unsaturated thyroid hormone binding capacity in serum and plasma, Clin. Chem. 25:1078 (Zusammenfassung) 1979) und Kleinhammer, G. et al. (Enzyme immunoassay for determination of thyroxine binding index, Clin. Chem. 24:1033, 1978) unabhängig, daß TBG darin scheitert, an Konjugate zu binden, die durch die Markierung von T4 mit Meerrettichperoxidase gebildet wurden. Diese Tatsache bildet die Basis für das Einschritt-Immunoextraktionsverfahren, welches in dem U.S.-Patent Nr. 4 410 633 von Corning Glass Works beschrieben wurde, zur Messung von freiem Thyroxin und freiem 3,5,3'-Triiodthyronin, worin Meerrettichperoxidase chemisch an T4 und T3 gebunden und später radioaktiv markiert wird.
Darüber hinaus beschreibt der Stand der Technik ebenfalls, daß T3 und T4 die folgende molekulare Struktur für eine maximale Bindung an endogene Bindeproteine erfordern, siehe TBG, Thyroid-bindendes Präalbumin (TBPA), Albumin, Snyder, S.M. et al. (Binding of thyroid hormones and their analogues to thyroxine-globulin in human serum, J. Biol. Chem. 251:6489, 1976); Sterling, K. et al. (Equilibrium dialysis studies of the binding of thyroxine by human serum albumin, J. Clin. Invest. 41:1021, 1962):
1. die L-Alanin-Seitenkettenkonfiguration;
2. die Gegenwart der 4'-Hydroxylgruppe (vornehmlich für TBPA- und Albuminbindung); und
3. die Anwesenheit von zwei (Halogen-)Substituenten in den inneren und äußeren Ringen (Positionen: 3, 5, 3' und 5').
Mehrere hundert T3- und T4-Analoga wurden synthetisiert und bezüglich ihres Vermögens, an Thyroidhormon-Bindeproteine zu binden, untersucht.
Das U.S.-Patent Nr. 4 366 143 und sein europäisches Gegenstück Patent Nr. 00 26 103 beschreiben breit gefaßt die Verwendung solcher Analoga als Tracer bei einer einzelnen Immunoextraktion unter Verwendung der gleichzeitigen, eher als der sequentiellen, Titration von Antikörper zur Messung von freien Hormonen (zur Bequemlichkeit werden die Patente kollektiv nachfolgend als das "Amersham"-Patent angeführt).
Eine intakte Analinseitenkette ist zur optimalen Bindung von T4 und 13 an TBG erforderlich: die Aminogruppe auf der Analinseitenkette ist der wesentliche Konstituent. In dem Amersham- Patent beschriebene Analoga sind T3- und T4-Moleküle, die an der Analinseitenkette modifiziert sind. Obgleich diese Analoge theoretisch nicht an TBG in signifikantem Ausmaß binden, binden sie unzweifelhaft Albumin und TBPA signifikant, da die 4'-Hydroxylgruppe auf den T3- und T4-Molekülen intakt gelassen wurde. Es ist allgemein anerkannt, daß die Bindung von Albumin und TBPA an die Thyronine quantitativ ist, insbesondere unter physiologischen Bedingungen, Sterling, K. (Molecular structure of thyroxine in relation to its binding by human serum albumin, J. Clin Invest. 43:1721, 1964) und Pages, et al. (Binding of thyroxine and thyroxine analogs to human serum prealbumin, Biochem 12:2773, 1973).
Daß das Amersham-Patent darin versagt, die Bedeutung der Albumin- und TBPA-Bindung an die Thyronine zu erkennen, macht die Lehren dieser Patente ungeeignet für die wahrheitsgemäße Messung von freiem 13 und freiem 14 in biologischen Fluiden. In der Tat führen die auf dem Patent basierenden, im Handel verfügbaren Reagentien zu irreführenden und ungenauen Ergebnissen an freiem Hormon. Dies gilt insbesondere bei mehreren pathologischen Zuständen, die durch signifikante Veränderungen im Spiegel an zirkulierendem Albumin gekennzeichnet sind.
Die Literatur der jüngsten Zeit hat gezeigt, daß die Albuminkonzentration direkt mit den Konzentrationen an freiem T4 korreliert, die durch das Amersham-Assaysystem erzeugt werden. Darüber hinaus ist gut dokumentiert, daß das Verfahren von Amersham konsistent fälschlich verminderte Ergebnisse an freiem T4 bei Schwangerschaften im dritten Trimester und bei Patienten, die an schwerer nicht-thyroidaler Erkrankung leiden, ergibt, während es zu fälschlich erhöhten Spiegeln an freiem T4 in Fällen von familiärer dysalbuminämischer Hyperthyroxinamie führt, einem Zustand, bei dem T4 an zirkulierendem Albumin abnormal gebunden ist.
Während der Schwangerschaft zirkuliert Albumin in niedrigeren als normalen Spiegeln, insbesondere während des dritten Trimesters. Da der markierte T4-Analog-Tracer von Amersham Albumin und TBPA in beträchtlichem Ausmaß (größer als 99 %) bindet, würde man beim Amersham-Assaysystem erwarten, daß sich niedrigere als normale Ergebnisse an freiem T4 wänrend des dritten Trimesters ergeben: mehr Analogtracer ist zur Bindung von T4-Antikörper verfügbar, was zu einer höheren Bindung und zu einer niedrigeren apparenten Dosis führt.
Nicht veresterte freie Fettsäuren sind in der Lage, markiertes Analog von Albumin zu verdrängen; außerdem zirkulieren sie bei höheren als normalen Konzentrationen wänrend der Schwangerschaft. Dies könnte die niedrigeren als erwarteten Werte an freiem T4 erklären, die wänrend der Schwangerschaft auftreten, wenn sie mit dem Amersham-Verfahren bestimmt werden; apparente Spiegel an freiem T4 würden signifikant niedriger als erwartet sein, wenn die Albuminbindung an das markierte Analog beträchtlich ist.
Diese Situation ist ebenfalls gut dokumentiert in Fällen der Heparintherapie, wo eine signifikante Erhöhung an nicht veresterten freien Fettsäuren vorliegt. Spiegel an freiem T4 und freiem T3 zeigten niedrigere als normale Spiegel, wenn sie mittels des Amersham-Verfahrens bei mit Heparin behandelten Patienten gemessen wurden.
Das gleiche Problem tritt für die nicht-thyroidale Erkrankung auf, wo durch das Amersham- Verfahren hervorgebrachte Werte für freies T3 und T4 sich als beträchtlich niedriger als für eine euthyroide Population herausstellten, wenn sie mit einem direkten Gleichgewichtsdialyseverfahren verglichen wurden.
Das Verfahren des Amersham-Patents ließ bei Betreibern im Stand der Technik zu wünschen übrig, wie es sich durch die Beobachtung von falschen und irreführenden Messungen von Spiegeln freier Liganden darlegt. Der Anmelder hat herausgefunden, daß das Problem von der Bindung des ligandenanalogen Tracers an bestimmte endogene Proteine, z.B. Albumin in biologischen Fluiden, herrührt. Ich habe herausgefunden, daß dieses Problem überwunden werden kann durch die Verwendung von spezifischen chemischen Inhibitorreagentien. Diese Feststellung stellt einen bedeutenden Fortschritt im Fachbereich dar, und es wird angenommen, daß dies ein Patent verdient.
Die EP-A-155 104 beschreibt die Verwendung eines differentiellen Blockiermittels in einem Assay des freien Anteils eines Analyten, z.B. Thyroxin, in einem biologischen Fluid, in dem der Analyt teilweise gebunden an natürlichen Proteinbindestoffen vorliegt und in dem der freie Analyt und ein Analytderivat um die Reaktion mit einem spezifischen Bindestoff kompetitieren. Das Blockiermittel verringert die Bindung des Analytderivats, jedoch nicht die des Analyten, an die natürlichen Proteinbindestoffe.

Die Erfindung

Es ist ein Ziel der Erfindung, ein neues und verbessertes Verfahren zur Messung von freien Testosteronliganden in biologischen Fluiden bereitzustellen.
Insbesondere hat die vorliegende Erfindung die korrektere Messung von freien Testosteronliganden in biologischen Fluiden zum Ziel.
Kurz gesagt, umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Messung der Konzentration von freien Testosteronliganden in einem biologischen Fluid in Gegenwart von gebundenen Liganden und endogenen Bindeproteinen, ohne Stören des Gleichgewichts zwischen freiem Liganden und proteingebundenem Liganden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
(a) Inkubieren, in Abwesenheit von Salicylat, von 2,4-Dinitrophenol und 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure, einer Probe des biologischen Fluids mit (i) einem ligandenanalogen Tracer, welcher, infolge seiner chemischen Struktur, an einige der endogenen Bindeproteine nicht bindet, aber an mindestens ein anderes endogenes Bindeprotein bindet, (ii) einer Konzentration eines spezifischen Ligandenbindestoffs mit einer Affinitätskonstante und Selektivität für den freien Liganden in einer Weise, daß das Gleichgewicht zwischen freiem Liganden und Protein-gebundenem Liganden nicht gestört wird, und (iii) einer Konzentration an Sulfobromphthalein (SBP), die die Bindung des ligandenanalogen Tracers an das mindestens eine weitere endogene Bindeprotein ausreichend verhindert, um die Reaktion zwischen dem ligandenanalogen Tracer und dem mindestens einen weiteren endogenen Bindeprotein zu blockieren, ohne den Liganden aus Protein-gebundenem Ligand zu verdrängen;
(b) Trennen des an den spezifischen Ligandenbindestoff gebundenen ligandenanalogen Tracers von ungebundenem Tracer; und
(c) Bestimmen der Konzentration an freiem Liganden in dem biologischen Fluid.
Im allgemeinen wird im Schritt (c) die Konzentration an freiem Liganden in der biologischen Flüssigkeit bestimmt, indem die gebundene Fraktion des ligandenanalogen Tracers in der Probe mit der gebundenen Fraktion in einem gegebenen Satz von Kalibratoren für den freien Liganden verglichen wird. Die Kalibratoren für den freien Liganden können hergestellt werden, indem unterschiedliche Mengen des Liganden zu ligandenfreiem menschlichen Serum hinzugesetzt werden, durch Gleichgewichtsdialyse kalibriert wird und Werte des freien Liganden zugeordnet werden.
Das Verfahren wird vorzugsweise unter physiologischen Bedingungen, d. h. bei etwa 37 ºC und etwa einem pH-Wert von 7,4, durchgeführt.
Im allgemeinen ist der spezifische Ligandenbindestoff einer, der an dem freien Liganden koppelt oder bindet, und es kann ein spezifischer Antikörper für den freien Liganden oder ein anderer Bindestoff sein. Geeignete spezifische Ligandenbindestoffe sind bekannt und müssen nicht weiter beschrieben werden. Der spezifische Ligandenbindestoff kann auf einem festen Substrat immobilisiert werden, wie Polypropylen.
Der ligandenanaloge Tracer wird in einer bestimmten Weise markiert, so daß er nachweisbar oder beobachtbar ist. Radioaktive Markierungen sind gut bekannt und anwendbar, wie auch die anderen Markierungsmethoden, die bisher im Fachbereich zur Anwendung kamen, einschließlich Enzyme, Fluorophore, Chromophore und chemolumineszente Gruppen, die mit dem ligandenanalogen Tracermolekül zusammengefügt sind. Der Ligandenanalog-Tracer ist vorzugsweise iodiertes 6-Hydroxytestosteron-19-carboxymethyletherhistamin.
Es ist allgemein nach dem Stand der Technik anerkannt, daß Steroidmoleküle an ihre natürlichen Bindestoffe über den A- und/oder B-Ring des Moleküls binden; siehe Forest, M. et al. und darin vorkommende Druckschriften (Free and bound steroids in plasma: methodology and physiopathological implications, In: Physiological Peptides and New Trends in Radioimmunology, C.A. Bizollon, Hrsg., Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biochemical Press, 1981, 249-266). Die chemische Veränderung des A- und/oder B-Ringes wird die meisten Steroide - einschließlich Testosteron, Progesteron, Estradiol, Gortisol und so weiter - an der Bindung zu endogenen Bindestoffen inhibieren. Testosteron wurde als repräsentativer Vertreter dieser Familie gewählt. Ein Testosteronanalog, 6-Hydroxytestosteron-19-carboxymethyletherhistamin, wurde synthetisiert und mit ¹²&sup5;I mittels herkömmlicher Verfahren radiomarkiert. Dieser analoge Tracer wurde nachfolgend in 0,01 M HEPES-Puffer, pH = 7,4, enthaltend 1 mg/ml Aktivkohle-absorbiertes menschliches Serumalbumin und 0,01 % Natriumazid, kompoundiert. Blockiermittel wurden hinzugesetzt, wie nachstehend in den spezifischen Beispielen beschrieben.
Antikörper gegen Testosteron wurden in Kaninchen unter Verwendung von Testosteron-19- carboxymethylether-Rinderserumalbumin als Immunogen herangezogen und auf den Innenwänden von 12x75 mm Polypropylenröhrchen, wie oben für freies T4 und freies T3 beschrieben, immobilisiert. Kalibratoren für freies Testosteron, hergestellt durch Hinzusetzen unterschiedlicher Mengen von Testosteron zu menschlichem Serum, das an etwaigem apparenten Testosteron frei war, wurden durch direkte Gleichgewichtsdialyse kalibriert, und ihnen wurden Werte an freiem Testosteron in pg/ml zugewiesen. Für den Assay auf freies Testosteron wurden 50 ul Kalibrator oder Patientenprobe in mit Anti-Testosteron-Antikörper beschichtete Röhrchen pipettiert, gefolgt von der Zugabe von 1,0 ml iodiertem 6-Hydroxytestosteron-19-carboxymethyletherhistamin-Analog. Die Röhrchen wurden 4 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert, dann dekantiert, und die Radioaktivität wurde ausgezählt. Die Ergebnisse wurden durch Interpolation aus der Eichkurve berechnet.

Freies Testosteron: Beispiele

Beispiel 1: Um die Wirkung von Blockiermitteln auf die Ergebnisse an freiem Testosteron zu untersuchen, wurden zwanzig Proben auffreies Testosteron unter Verwendung von iodiertem Analogon - kompoundiert wie oben beschrieben - untersucht, und zwar sowohl mit und ohne Sulfobromphthalein (SBP), und mit verschiedentlichen Mengen an Natriumsalicylat, 2,4-Dinitrophenol (DNP) und 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS). Durchschnittswerte für jeden Tracer sind in pg/ml unten zusammengefaßt: Tabelle 20
Die Regressionsgleichungen zwischen entsprechenden Tracern sind unten angeführt. Tabelle 21
Aus dem obigen Beispiel fanden wir heraus, daß die Abwesenheit von Sulfobromphthalein die Spiegel an apparentem freiem Testosteron um 14 % erhöht, da Sulfobromphthalein die Bindung des analogen Tracers an Albumin ohne Verdrängung von an Albumin gebundenem Testosteron inhibiert. Wir haben ebenfalls herausgefunden - und dies ist von großer Wichtigkeit - daß Salicylat, 2,4 Dinitrophenol und ANS Testosteron von Albumin und/oder SHBG verdrängen und so das durch dieses Verfahren gemessene apparente freie Testosteron erhöhen.
Beispiel 2: Um die Wirksamkeit des Traceranalogs in dem Assay für freies Testosteron zu überprüfen, wurde iodiertes 6-Hydroxytestosteron-19-carboxymethyletherhistamin (analoger Tracer) mit iodiertem Testosteron-19-carboxymethyletherhistamin (regulärer Tracer) in Assays für freies Testosteron in Patientenproben verglichen.
Die Tracer wurden wie oben beschrieben mit 10 ug/ml Sulfobromphthalein kompoundiert. Um eine äquivalente Empfindlichkeit aufrecht zu erhalten, wurden für jeden Tracer Einstellungen in der Menge des auf der Innenwand der Propylenröhrchen immobilisierten Antikörpers vorgenommen.
Zwanzig Patientenproben wurden dem bereits beschriebenen Protokoll für freies Testosteron folgend untersucht, und zwar unter Verwendung der oben erwähnten zwei Tracer. Die durchschnittlichen Werte für freies Testosteron in pg/ml, und die Regressionsgleichung sind unten aufgeführt. Tabelle 22
Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß der analoge 6-Hydroxytestosteron-19-histamin-¹²&sup5;I-Tracer nicht an endogenen Bindestoffen bindet, wohingegen der Tracer Testosteron-19-histanun-¹²&sup5;I dieses tut, wodurch sich etwa 50 % höhere Werte an freiem Testosteron ergeben im Vergleich mit dem analogen Tracer unter identischen experimentellen Bedingungen.
Beispiel 3: Um die Wirkung von Spiegeln an Sexhormon-Bindeglobulin (SHBG) auf das Assaysystem für freies Testosteron zu untersuchen, wurde ein Aktivkohle-absorbierter Humanserumpool mit 400 ug SHBG/Milliliter versetzt, ein Spiegel welcher etwa dem 10fachen des normalen entspricht. Der SHBG-versetzte Pool zeigte einen prozentualen gebundenen Wert von 99 % B/B&sub0;, wenn er mittels des Verfahrens für freies Testosteron untersucht wurde.
Da die Aktivkohleabsorption Testosteron aus dem Serumpool entfernt, sollte er Konzentrationen an freiem (und gesamtem) Testosteron von 0 haben - und das entspricht prozentualen gebundenen Werten von etwa 100 % B/B&sub0; - sowohl vor und nach dem Versetzen. Die Ergebnisse zeigen, wie gewünscht, daß der analoge Tracer, 6-Hydroxytestosteron-19-histamin- ¹²&sup5;I selbst an hohe Spiegel von SHBG nicht bindet.
Beispiel 4: Um die Wirkung von erhöhten Albuminspiegeln auf das Verfahren für freies Testosteron zu untersuchen, wurden drei lyophilisierte Proben mit waßrigen Lösungen, die 0, 1,0, 2,0 und 3,0 g/dl an Aktivkohle-absorbiertem menschlichem Serumalbumin enthielten, rekonstituiert. Alle Proben wurden parallel untersucht, unter Verwendung des gleichen Tracers wie in Beispiel 3, und zwar mit den folgenden Ergebnissen. Tabelle 23
Die Ergebnisse zeigen, daß es keinen klinisch signifikanten Effekt gibt, selbst bei bedeutenden Steigerungen im Albuminspiegel. Man beachte, daß die mit 3,0 g/dl versetzten Proben einen sehr hohen Gehalt an Albumin darstellen, in der Größenordnung von 7 g/dl.
Beispiel 5: Mehrere Patientenproben wurden mittels des Verfahrens für freies Testosteron unter Verwendung des gleichen Tracers wie in Beispiel 3 sowom vor und nach der Aktivkohleabsorption analysiert. Nachfolgend sind Konzentrationen an freiem Testosteron (in pg/ml) vor der Aktivkohleabsorption angeführt, und die prozentualen gebundenen Werte (%B/B&sub0;) nach der Aktivkohleabsorption. Tabelle 24
Die Ergebnisse zeigen, wie gewünscht, daß die Aktivkohleabsorption beträchtlich den Spiegel an apparentem freiem Testosteron bei Patientenproben, wie durch das Analogon-Verfahren bestimmt, auf Null verringert, d.h. auf prozentuale gebundene Werte von etwa 100 % B/B0. Da die Aktivkohleabsorption Testosteron zusammen mit anderen Steroiden und kleinen Molekülen aus der Serumprobe entfernt, während größere Moleküle, wie Albumin, SHBG und andere Bindeproteine zurückbleiben, hilft dieses Experiment dabei, zu bestätigen, daß das Analogon-Verfahren für freies Testosteron nicht durch den Spiegel der Transportproteine als solches beeinflußt wird.
Beispiel 6: Da nicht-veresterte freie Fettsäuren (NEFA) eine höhere Assoziationskonstante für Albumin aufweisen als Testosteron, sollte die Zugabe von NEFA freies Testosteron von Albumin freisetzen. Dieses wurde durch ein Experiment bestätigt, in dem verschiedene Mengen an Ölsäure zu jeder von drei Patientenproben hinzugesetzt wurden. Die Auswirkungen auf die Spiegel an apparentem freien Testosteron sind in der Tabelle 25 gezeigt. Tabelle 25

Claims

1. Verfahren zum Messen der Konzentration von freiem Testosteron-Liganden in einem biologischen Fluid in Gegenwart von gebundenem Liganden und von endogenen Bindeproteinen, ohne Störung des Gleichgewichts zwischen freiem Liganden und Proteingebundenem Liganden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Ihkubieren, in Abwesenheit von Salicylat, von 2,4-Dinitrophenol und 8-Anilino-1- naphthalinsulfonsäure, einer Probe des biologischen Fluids mit (i) einem ligandenanalogen Tracer, welcher, infolge seiner chemischen Struktur, an einige der endogenen Bindeproteine nicht bindet, aber an mindestens ein anderes endogenes Bindeprotein bindet, (ii) einer Konzentration eines spezifischen Ligandenbindestoffs mit einer Affinitätskonstante und Selektivität für den freien Liganden in einer Weise, daß das Gleichgewicht zwischen freiem Liganden und Protein-gebundenem Liganden nicht gestört wird, und (iii) einer Konzentration an Sulfobromphthalein (SBP), die die Bindung des ligandenanalogen Tracers an das mindestens eine weitere endogene Bindeprotein ausreichend verhindert, um die Reaktion zwischen dem ligandenanalogen Tracer und dem mindestens einen weiteren endogenen Bindeprotein zu blockieren, ohne den Liganden aus Protein-gebundenem Ligand zu verdrängen;

(b) Trennen des an den spezifischen Ligandenbindestoff gebundenen ligandenanalogen Tracers von ungebundenem Tracer; und

(c) Bestimmen der Konzentration an freiem Liganden in dem biologischen Fluid.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Konzentration an freiem Liganden in dem biologischen Fluid durch Vergleichen des gebundenen Anteils des Ligandenanalog- Tracers in der Probe mit dem gebundenen Anteil in einem vorgegebenen Satz von Kalibratoren für den freien Liganden festgestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der spezifische Ligandenbindestoff ein Antikörper zu dem freien Liganden ist.

4. Verfahren nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der spezifische Ligandenbindestoff auf einem festen Substrat immobilisiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das feste Substrat Polypropylen ist.

6. Verfahren nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der ligandenanaloge Tracer mit mindestens einem radioaktiven Atom, einem Enzym, Fluorophor, Licht-Chromophor oder einer Chemolumineszenzgruppe markiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der ligandenanaloge Tracer iodiertes 6-Hydroxytestosteron-19-carboxymethyletherhistamin ist.

8. Verfahren nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, das bei etwa 37ºC und bei einem pH-Wert von etwa 7,4 durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Kalibratoren für den freien Liganden durch Zusetzen unterschiedlicher Mengen des Liganden zu ligandenfreiem menschlichen Serum, Kalibrieren durch Gleichgewichtsdialyse und Zuweisen von Werten des freien Liganden hergestellt wurden.