DE2600465C3 - Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von Östrogenen - Google Patents

Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von Östrogenen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von östrogenen in einer biologischen Flüssigkeit gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
In »Pharmazie heute«. November 1974. S. 205-208 und «Immunologie Methods in Steroid Determination«, herausgegeben von F. G. Peron und B. V. Caldwell, New York 1970. S. 161 —166 sind radioimmunclogische Bestimmungsverfahren für Östrogene beschrieben, bei denen als markierte Komponente ein Konjugat aus dem betreffenden östrogen und einer durch radioaktives Jod markierten Substanz, insbesondere einem markierten Protein, verwendet werden. Diese Konjugate sind mühsam herzustellen. Insbesondere ist die Bindung von Steroiden an vorher jodiertes Histamin nur in sehr geringem Maßstab möglich und sehr schwierig durchzuführen. Darüber hinaus ist die Lebensdauer der jodierten Steroid-Protein-Konjugate sehr gering und beträgt z. B. nur 1 bis 2 Wochen. Außerdem sind diese Konjugate häufig immunologisch nur noch wenig reaktionsfähig.
Bei einem weiteren bekannten Verfahren wird zur Überwindung der obenerwähnten Schwierigkeiten Tritium anstelle von radioaktivem Jod zur Markierung verwendet. Östriol liegt in Körperflüssigkeiten in Form eines Gemisches der nicht-konjugierten Form mit Konjugaten vor. von denen die wichtigsten Östriol-3-hemisulfat, östriol-16-glucuronid und östriol- j-hemisulfat-16-gluciironid sind. Da es im allgemeinen erwünscht ist, das gesamte Östriol zu bestimmen und nicht nur das freie, umfaßt das bekannte radioimmunologische B°- stimmungsverfahren folgende Stufen
a) Saure Hydrolyse der biologischen Flüssigkeit zur Aufspaltung der östriolkonjugate
b) Extraktion des gesamten (freien) Östriols in ein organisches Lösungsmittel und chromatographische Reinigung.
c) Sättigungsanalyse des Östriols nach Entfernung des organischen Lösungsmittels, mit Hilfe eines mit Tritium markierten östrenderivates, das mit dem östriol um die Reaktion mit dem spezifischen Reagenz konkurrieren soll.
Dieses Verfahren besitzt zwei hauptsächliche Nachteile. Erstens ist Tritium ein ^-Strahler und wesentlich schwieriger nachzuweisen und zu messen als ein y-Strahler wie J-125. Zweitens ist die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und Chromatographie eine mühsame und zeitraubende Operation, die nicht in Betracht kommt, wenn mehr als einige wenige Proben bestimmt werden sollen. Aufgrund dieser Nachteile wird Östriol in Krankenhäusern nicht durch Sättigungsanalyse bestimmt, sondern durch den Kober-Farb-Test. bei dem es ungünstigerweise erforderlich ist, den Urin des Patienten über einen Zeitraum von 24 Stunden zu sammeln.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von östrogenen zu entwickeln, bei dem eine markierte Substanz angewandt wird, die leicht nachzuweisen, einfach herzustellen und über längere Zeit stabil ist sowie eine gute immunologische Reaktionsfähigkeit besitzt.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 dadurch gelöst, daß man als Radio-Jod-Derivat 2-Jod-, 4-Jod- und/oder 2,4-Dijod-Derivate eines östrogens verwendet.
In verschiedenen Vorveröffentlichungen wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß eine derartige Markierung des Steroidkerns nicht möglich ist bzw. ein solches Produkt nicht für immunologische Bestimmungen angewandt werden kann, da das Steroid durch Kernsubstitution mit dem im Verhältnis zum Steroidkern außerordentlich großen Jodatom seine immunologische Reaktionsfähigkeit verlieren würde (s. zum Beispiel Immunological Methods in Steroid Determination a.a.O: P. W. Nars und W. M. Hunter. Journal of Endocrinology S. 1 Zeilen 2—4; A. PaIa, M. Ermine und G. Benagiano, Journal of Steroid Biochemistry. 1974, Bd. 5, Nr. 4, S. 306-307 und S. L. Jeffcoate. Pathologie Biologie 1975, Bd. 23, Nr. 10, S. 903-905).
Überraschenderweise hat es sich iun gezeigt, daß ein derartiger Reaktivitätsverlust nicht auftritt, sondern daß im Gegenteil die radioaktiv jodierten Östrogenderivate eine hohe immunologische Reaktionsfähigkeit besitzen, eine wesentlich bessere Stabilität als die Konjugate mit markierten Proteinen (bis zu etwa 6 Monaten verglichen mit 1 bis 2 Wochen für die Steroid-Protein-Konjugate) und daß sie eine radioimmunologische Bestimmung von Östrogenen auf einfache und zuverlässige und gut reproduzierbare Weise ermöglichen.
östrogene, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden können sind
Östriol (Ej)
Östron (Ei)
östradiol (E2)
Östetrol (E4)
und deren Derivate/. B. das 16-Glucuronid-Derivat.
Bei den erfindungsgemäß anzuwendenden 2-Jod-, 4-Jod- und 2,4-Di-jod-Derivaten der Östrogene liegt ein hoher Anteil des Jods als radioaktives Jod-Isotop J-131 oder insbesondere J-125 vor.
Diese Verbindungen können durch bekannte Reaktionen hergestellt werden. Die Östrogene können direkt jodiert werden mit Hilfe von J-125 und Chloramin-T ohne daß sie vorher mit einer anderen Substanz ein Konjugat bilden müssen. So werden z. B. Na · J-125 und Chloramin-T in äthanolischer Lösung zu dem östrogen zugegeben und vermischt. Nach Zugabe von Natriummetabisulfit wird das jodierte östrogenderivat in ein organisches Lösungsmittel extrahiert und chromatographisch gereinigt.
Es ist bevorzugt, daß konjugiertes östrogen z. B. östriol, in biologischen Flüssigkeiten durch Hydrolyse mit Hufe von Enzymen hydrolysiert wird anstatt mit Säure. Die enzymatische Hydrolyse von östriolkonjugaten ist bekannt und die beiden erforderlichen Enzyme, Glucuronidase und Arylsulfatase sind beide im Handel erhältlich. Ein großer Vorteil der enzymatischen Hydrolyse gegenüber der Säurehydrolyse besteht darin, daß das Hydrolysat für die Bestimmung verwendet werden kann ohne daß eine Lösungsmittelextraktion des östrogens erforderlich ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
A) Jodierung von östriol
Chloramin-T (0,5 mg in 100 μΐ V/asser) wurde unter Rühren zu einem Gemisch vun Östr.jl (50 μg in 400 μΐ Äthanol) und Na125J (lOmCi in 100 μΙ verdünntem NaOH zugegeben und das Gemisch w itere 5 Minuten gerührt. Dj; ^ wurde Natrium-metabisulfit (1,2 mg in 500 ilI WoLSS.-.r) zugegeben und das Gemisch 5 Minuten gerührt bevor 1 ml 0,1 mHCI zugegeben wurde. Das Gemisch wurde dann mit 1 ml Chloroform heftig gerührt. Die wäßrige Schicht wurde von dem organischen Lösungsmittel abgetrennt und erneut mit einem weiteren ml Chloroform extrahiert. Die zusammengegebenen Chloroformauszüge wurden unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und der Rückstand erneut in 50 μΐ Äthanol gelöst. Die Äthanollösung des 125-J-markierlen Östriolderivats wurde durch Chromatographie gereinigt und das Produkt mit Phospha.puffer, enthaltend Pferdeserum (10%), Natriumazid (1 mg/ml) und Gelatine (1 mg/ml), verdünnt vor der Anwendung für die radioimmunologische Bestimmung.
Östron, östradiol, östetrol und östriol-16-(|9-D-glucuronid) wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren jodiert. Man erhielt folgende Ergebnisse
Oslrogen
Östron
Östradiol
Östetrol
Ö:>rriol-16-(/;-D-glucuronid)
55.3
44,6
87,8
17,9
B) Radioimmunologische Bestimmung von östriol
Proben von 50 μΐ Standardlösungen von Östriol in Pferdeserum oder die unbekannten Humanserumproben wurden ii; Plastikröhrchen gegeben. Zu jeden Röhrchen wurder 200 μΙ einer Enzymlösung (extrahiert von der Schnecke Helix pomatia) in Natriumacetatpuffer. pH 5, gegeben und der Inhalt der Röhrchen kurz vermischt. Die Röhrchen wurden dann mit Stopfen verschlossen und in eimern Wasserbad von 37° C zwei Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden zur Wiederholung 50 μ! Proben von dem hydrolysierten Serum entnommen und in Plastikröhrchen gegeben. Zu jedem Röhrchen wurden dann 200 μΙ Phosphatpuffer, enthaltend 10% Pferdeserum, Natriumazid (1 mg/ml), Gelatine (1 mg/ml) und das, wie oben beschrieben, mit 125J-markierte Östriolderivat (ungefähr 0,3 μΟ/ηιΙ) gegeben. Volumina von 200 μΙ des Phosphatpuffers, enthaltend Pferdeserum, Natriumazid und Gelatine und eine Verdünnung von Antiserum, das gebildet worden war gegen östriol, das mit Albumin konjugiert war, wurden in jedes Röhrchen gegeben und der Inhalt der Röhrchen vermischt. Die Röhrchen wurden ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und 500 μΙ einer Ammoniumsulfatlösung (5,4 g in 10 ml Wasser) in jedes Röhrchen gegeben. Nach dem Vermischen wurden die Röhrchen zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit abgesaugt und die Niederschläge in den Röhrchen mit Hilfe eines y-Zählers untersucht.
Standard- Kurven % gebunden
Vergl.		 50ngH·, lOOngl:, 200ngE, 35OngI·, SOOngtii
Antiscrum Gesamtinipulse
pro 100 s		 68.2
69.8		 57.2
55.2		 47.3
47,3		 32,6
33.0		 23,0
21,4		 17,5
17,3
A
B		 111,169
111,169
Beispiel 2 Radioimmunoiogische Bestimmung von Östron
östron wurde mii Hilfe des in Beispiel I beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei jedoch das Antiserum gebildc worden war durch Immunisierung mit (a) österon-6-carbomethoxy-oxim-thyroglobulin (Miies-Yeda) und (b) einem Östron-Derivat das in 6-Steliung gekuppelt war (The John Radcliffe Hospital, Oxford).
Standard-Kurven
26 OO
Anliseiuni Verdünnung des
Aniiserunis		 Ges:muimpMlse
|)ΓΟ KjIi > 		Aller dei
Markierung		 -.L lit.. ■ . .
Vergl.		 lug Ö^irrun
Miles-Yeda
J. Radcliffe I Iosp.		 wie geliefert
1/32 000		 iü 700
19 300		 23 Tage
30 Tage		 40,1
44,7		 r.'.-1
11J
Beispiel 3 Radioimmunologische Bestimmung von östradiol
östradiol wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei jedoch das r, angewandte Antiserum gebildet worden war durch Immunisieren mit
Standard-Kurven
(a) östradiol-6-carbomethoxyoxim-BSA (Miles-Yeda) und
(b) einem Östradiol-Derivat das in 6-Stellung gekuppelt war (The John Radcliffe Hospital, Oxford).
Aniiserum
Verdünnung des
Antiserums
Gesamtimpulse
pro 100 s
Alter der
Markierung
% gebunden
Vergl.
!npE-
2ngE2
Miles-Yeda wie gelieren 8 !00 23 Tage 26,9 4,0 -
J. Radclifre 1/3200 14 000 30 Tage 51,5 3,0 0,5
J. Radcliffe 1/640 140 000 31 Tage 79,6 32,7 13,1
Beispiel 4 Radioimmunologische Bestimmung von Östetrol
östetrol wurde mit Hilfe des in Beispiel 1 Immunisierung mit östriol-6-carbomethoxyoxim-BSA beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei ein Antise- η als spezifisches Reagenz, da ein Antiserum zu Östetrol rum verwendet wurde, das gebildet worden war durch nicht verfügbar war.
Standard-Kurven: Gesamtimpulse 132 800 pro 100 s (Alter der Markierung 7 Tage)
Antiserum Verdünnung % Bindung % Bindung in des Anti- Vergleich Gegenwart von serums 20ngE4
A
B
1/100
1/100
58,5 48,7
11,0
Beispiel 5 Analyseneinheit zur radioimmunologischen Bestimmung von Östriol (E3)
Die Ainalysenpackung umfaßt folgendes:
a) 5 Ampullen mit gefriergetrocknetem E3 in Pferdeserum, das beim Rekonstituieren Standardlösungen der folgenden ungefähren Konzentrationen ergibt: 0,30,80,200 und 400 ng/ml.
b) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung von J-E3 in Phosphatpuffer (0,3 μ Ci/ml).
c) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 6,5 ml Enzymlösung zur Hydrolyse von Östriolkonjugaten.
d) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 13 ml einer Lösung eines Anti-Östriolserums.
t) 1 Ampulle, enthaltend ungefähr 16 g Ammoniumsulfat (fest).
f) 30 Polystyrol-Röhrchen 55 χ 12 mti (Fassungsvermögen ungefähr 5 ml) zur Verwendung bei der Enzymhydrolyse,
g) 1 Reagenzglasständer aus Polystyrol,
h) Anleitung zur Durchführung des Verfahrens nach Beispiel 1.

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von östrogenen in einer biologischen Flüssigkeit, durch Konkurrenzreaktion zwischen dem Ostrogen und einem Radio-Jod-Derivat davon um ein spezifisches Binde-Reagens für das östrogen; Abtrennung des gebundenen Östrogens und Radio-Jod-Östrogens von dem nicht-gebundenen östrogen und Radio-Jod-Östrogen und Messung der gebundenen und/oder ungebundenen Fraktionen, d a durch gekennzeichnet, daß man als Radio-Jod-Derivat 2-Jod-, 4-Jod- und/oder 2,4-Di-jod-Derivate eines östrogens verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Durchführung der Konkurrenzreaktion in der Probe vorhandene konjugierte Östrogene hydrolisierL
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse enzymatisch durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Binde-Reagens einen Antikörper für das nachzuweisende östrogen verwendet
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Binde-Reagens einen gegen östrogen-6-carboxymethylo\im-BSA gerichteten Antikörper verwendet.
6. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5 zur Bestimmung von östriol.
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