DE3235516A1

DE3235516A1 - Verfahren der festphase-enzymimmunanalyse

Info

Publication number: DE3235516A1
Application number: DE19823235516
Authority: DE
Inventors: Kosaka Seto Aichi Akira; Kato Nagoya Aichi Kanefusa; Yamamoto Aichi Ryohei
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1981-09-30
Filing date: 1982-09-22
Publication date: 1983-04-21
Also published as: FR2519764B1; FR2519764A1; JPS5856696A; GB2109931B; CA1215322A; GB2109931A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der immunologischen untersuchung zur Bestimmung der Mengen geringster in der Körperflüssigkeit (oder in biologischen Flüssigkeiten) vorhandener Substanzen wie im Serum und in der zerebro-· spinalen Flüssigkeit bei Säugetieren.

Der Ausdruck "Immunprobe" oder "-analyse" wird hiernach als ein Verfahren verstanden, in dem die Reaktion einer immunologischen (serologischen) Antigensubstanz (d. h. ein sogenanntes Antigen) mit einem ihr immunologisch entsprechenden sogenannten Antikörper zur Bestimmung der Menge oder Konzentration des in der Flüssigkeit vorhandenen Antigens oder Antikörpers angewendet wird.

Es werden bereits verschiedene Verfahren biologischer Tests und Wertbestimmungen oder zur Messung der Enzymtätigkeit · angewendet, um kleinste in biologischen Flüssigkeiten auftretende Stoffmengen zu bestimmen. Diese Verfahren haben sich jedoch als unzureichend erwiesen, weil sie zu aufwendige Arbeitsgänge erforderlich machten und hinsichtlich Empfindlichkeit und Genauigkeit zu wünschen übrig ließen. Demgegenüber läßt sich mit dem neu entwickelten Immunanalyseverfahren eine bedeutend höhere Empfindlichkeit und Genauigkeit erzielen, ohne daß dabei schwierige Arbeitsgänge durchzuführen sind. Demgemäß wird dieses-Verfahren nunmehr auf dem Gebiet der Biochemie.und in der klinischen Medizin angewendet.

Es wurden verschiedene Arten von Immunanalyseverfahren vorgeschlagen, bei denen die Verfahren genutzt wurden, welche ein Antigen oder Antikörper kombiniert (oder markiert) mit einem Radioisotop, fluoreszierenden Stoffen oder einem Enzym verwendeten. Insbesondere kamen hierbei die sogenannten Festphaseverfahren, bei diesen Immunanalyseverfahren unter Verwendung der Markierungsstoffe als am vorteilhaftesten geeignet in Betracht.

In dem Festphase-Immunanalyseverfahren wird das sogenannte trägeradsorbierte Substrat als Reaktionsmaterial verwendet, das aufbereitet wurde, indem unter bestimmten Reaktionsbedingungen ein Antikörper, ein sogenannter Antiantikörper (d. h. ein Antikörper, der durch Verwenden eines Antikörpers als Antigen erzeugt wurde) oder ein sogenanntes Protein A (d. h. ein von bestimmten Mikroorganismen erzeugtes Spezialprotein, das mit verschiedenen Antikörpern reagieren kann) auf einem wasserunlöslichen Träger wie Polystyrol- oder Silikonstücke, wasserunlösliche Polysacharide usw. adsorbiert wird, so daß letztere hierdurch unlöslich gemacht werden, wobei diese trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer dem Fall entsprechend dann als Antikörper-auf-Träger, Anti-Antikörper-auf-Träger bzw. Protein A-auf-Träger bezeichnet werden.

Hiernach wird das allgemeine Prinzip des Festphase-Immunanalyseverfahrens unter Verwendung eines Enzyms als Markierungsmaterials näher beschrieben, bevor noch auf die, Beschreibung der Erfindung eingegangen wird.

Es wird zumindest ein Mitglied aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper, einem markierten Antigen und einem markierten Antikörper (die hiernach allgemein als immunologisch reaktive Komponenten bezeichnet werden) oder ein immunologischer Komplex aus diesen mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer aus der Gruppe bestehend aus einem antikörperhaltigen {Antikörperauf-) Träger, einem antiantikörperhaltigen Träger und einem Protein A-haltigen Träger ein-oder zweifach zur Reaktion gebraucht, so daß sich daraus durch Bindung des markierten Antigens (oder markierten Antikörpers) oder deren immunologischer Komplex mit dem trageradsorbierten Reaktionsteilnehmer zusammen mit einem ungebundenen lösliehen Teil des markierten Antigens (oder markierten Antikörpers) ein unlöslich gemachtes Produkt bildet. Nach-

dem das ungebundene markierte Antigen (oder der markierte Antikörper) vom unlöslich gemachten Produkt abgetrennt wurde, wird die Aktivität des Enzyms (insbesondere die Adsorption des Reaktionsgemisches des Enzyms mit dessen Substrat) gemessen, das im unlöslich gemachten Produkt enthalten ist. In der Regel werden dieselben Verfahrensschritte wie oben mit veränderlichen Mengen Antigen (oder Antikörper) wiederholt, und durch Verwenden der hierdurch gemessenen Werte wird eine Eichkurve erstellt, die das Verhältnis zwischen den eingangs verwendeten Mengen der Antigene (oder Antikörper) und der damit verbundenen Enzymtätigkeit darstellt. Hiernach werden dieselben Verfahrensschritte mit einer biologischen Flüssig- ■ keit durchgeführt, die eine unbekannte Menge Antigene (oder Antikörper) enthält, um die Aktivität des Enzyms zu messen, das im sich ergebenden unlösbar gemachten Produkt enthalten ist. Dann wird die Menge oder Konzentration der in der Flüssigkeit vorhandenen Antigene (oder Antikörper) aus dem gemessenen Wert in Beziehung zur Eichkurve errechnet.

Während das oben beschriebene Verfahren der Festphase-Enzymimmunanalyse eine vorteilhaft hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit besitzt, so weist es dennoch den Nachteil auf, daß es beschwerliche Arbeitsschritte erforderlich macht.

Die herkömmliche Verfahrensweise der Festphase-Enzymimmunanalyse wurde eingehend von uns untersucht. Hierbei erfanden wir ein sehr wirksames Verfahren, indem sämtliche Schritte ausgehend von der immunologischen Reaktion der reaktiven Komponente(n) oder eines hieraus bestehenden immunologischen Komplexes mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmers bis einschließlich der Messung der Aktivität des sich im ergebenden unlösbar gemachten Produkt

enthaltenen Enzyme durchgeführt wurden und bei dem die . Chromatografie mit einer einzelnen Säule angewendet wurde.

Nach dem Verfahren der Erfindung läßt sich eine Vielzahl Antigene oder Antikörper untersuchen oder analysieren, indem man ein identisches Enzym oder einen unlöslichen Träger verwendet, wobei auch eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit ohne Beeinträchtigung durch unerwünschte störende Komponente erreicht werden kann, die in der biologischen Flüssigkeit vorhanden sind und wogegen für dieses Verfahren keine beschwerlichen Arbeitsgänge erforderlich sind. Insbesondere wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine hochempflindliche Bestimmung der im Serum vorhandenen Antikörper erreicht, was unter Verwendung des Bekannten als schwer durchführbar erachtet wurde.

Darüber hinaus ist neben dem Festphase-Enzymimmunanalyseverfahren ein weiteres Vorgehen bekannt, nach dem ein immunologisches Reaktionsgemisch der immunologischen reaktiven Komponenten einem physikalisch-chemischen Verfahren, wie der Gel-Permeations-Chromatografie, Affinitätschromatografie oder dergleichen, ausgesetzt wird, um die freien markierten Antigene (oder Antikörper) abzutrennen und dann die Aktivität des im Rest verbleibenden Enzyms zur Bestimmung der Konzentration der eingangs vorhandenen Antigene oder Antikörper zu messen. Jedoch unterscheidet sich dieses bekannte Enzym-Immunanalyseverfahren von dem erfindungsgemäßen Verfahren, weil im ersteren sich die Chromatografie nicht auf immunologische Reaktionen, sondern auf physikalisch-chemische Reaktionen richtet.

Hinzu kommt, daß das Verfahren, in dem die physikalischchemische Chromatografie verwendet wird, gegenüber dem

erfindungsgemäßen Verfahren den Nachteil aufweist, daß . die Arten der hier verwendeten Markierungsenzyme und Adsorptionsstoffe für den jeweiligen Fall besonders sorgfältig gewählt werden müssen.

Die Erfindung wird anhand der nächstfolgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen

. Fig. 1 ein Fließdiagramm, aus dem die verschiedenen Verfahrensweisen des immunologischen Reaktions

schrittes ( d. h. des Schrittes, der der Messung der Enzymaktivität vorangeht), den das erfindungsgemäße Verfahren bedingt, hervorgehen,

Fig. 2 ein Diagramm, in dem die aus dem nachstehend zu beschreibenden Beispiel 1 erhältliche Eichkurve eingezeichnet ist, und

Fig. 3 ein Diagramm, in dem die aus dem nachstehend zu beschreibenden Beispiel 5 erhältliche Eichkurve

dargestellt ist.

Der Verfahrensschritt der immunologischen Reaktion, d. h. der dem Meßschritt der Enzymaktivität vorausgehende Schritt nach der Erfindung, kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Diesbezügliche Verfahrensweisen werden nachstehend in bezug auf das Fließdiagramm der Fig. 1 näher erläutert. Hierbei ist jedoch zu beachten, daß in der nachfolgenden Beschreibung auf die immunologisehen Reaktionsprodukte, die kein Markierungsenzym enthalten, nicht näher eingegangen wird, weil ihr Vorhandensein auf die erfindungsgemäße Immunanalyse keinerlei Einfluß hat. Wird eine kleinere oder größere Menge einer immunologischen reaktiven Komponente erwähnt, so bedeutet dies eine gegenüber dem Reaktionsäquivalent zur gegebenen Menge der hiermit zu reagierenden immunologischen reaktiven Komponente 'kleinere bzw. größere Menge.

Verfahrensweise (a):

Es wird eine vorbestimmte Menge eines markierten Antikörpers 2-4 mit einer kleineren Menge des Antigens 1 zur Reaktion gebracht, um einen immunologischen Komplex 1-2-4 bestehend aus dem markierten Antikörper 2-4 und dem Antigen 1 zusammen mit einem ungebundenen freien Anteil 2-4 des markierten Antikörpers zu ergeben. Das Reaktionsgemisch wird durch eine mit dem Träger 5 gefüllte Säule hindurch geleitet, auf dem eine größere Menge des Antikörpers 2 adsorbiert ist, so daß ein unlöslich gemachtes Produkt gebildet wird, indem der markierte Antikörper-Antigen-Komplex 1-2-4 mit dem antikörperhaltigen Träger 5-2 gebunden wird, während der ungebundene markierte Antikörper 2-4 aus der Säule ausgeschieden wird.

Verfahrensweise (b) :

Im Gegensatz zur Verfahrensweise (a) wird hier eine vorbestimmte Menge eines markierten Antigens 1-4 mit einer kleineren Menge eines Antikörpers 2 zur Reaktion gebracht, um einen markierten Antigen-Antikörper-Komplex 2-1-4 und einen ungebundenen Anteil 1-4 des markierten Antigenszu ergeben. Das Reaktionsgemisch wird durch,eine mit dem Träger 5 als Füllkörper gefüllte Säule hindurch geleitet, auf dem eine größere Menge eines Anti-Antikörpers oder Proteins A 3 adsorbiert ist, so daß ein unlöslich gemachtes Produkt gebildet wird, indem der markierte Antigen-Antikörper -Komplex 2-1-4 mit dem antiant!körperhaltigen Träger oder dem das Protein enthaltenden Träger 5-3 gebunden wird, während das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus der Säule ausgeschieden wird.

Verfahrensweise (c):

Hier wird vorgegangen wie bei (b), ausgenommen daß dem· Reaktionssystem ein Antigen 1 in einer Menge zugeführt wird, die der des markierten Antigens 1-4 äquivalent ist bzw.

- y-

von ihr abweicht (was hiernach kurz als abweichende Menge bezeichnet wird), wodurch die immunologische Reaktion zu einem markierten Antigen-Antikörper-Komplex 2-1-4 und einem ungebundenen freien Anteil 1-4 des markierten Antigens führt. Das Reaktionsgeraisch wird durch eine mit dem Träger 5 gefüllte Säule geleitet, auf dem eine größere Menge eines Antiantikörpers oder Proteins A 3 adsorbiert ist. Somit entsteht durch Binden des Antigen-Antikörperkomplexes 2-1-4 mit dem Antiantikörper-auf-Träger oder Protein A-auf-Träger 5-3 ein unlöslich gemachtes Produkt, wogegen das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus der Säule ausgeschieden wird.

Verfahrensweise (d):

Es wird eine vorbestimmte Menge eines markierten Antigens 1-4 mit einer abweichenden Menge eines nicht markierten Antigens 1 gemischt und dieses Gemisch durch eine mit einem Träger 5 gefüllte Säule hindurch geleitet, wobei auf dem Träger eine kleinere Menge eines Antikörpers 2 adsorbiert ist. Somit entsteht durch Binden des markierten Antigens 1-4 mit dem Antikörper-auf-Träger 5-2 ein unlösbar gemachtes Produkt, wogegen das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus der Säule ausgeschieden wird.

Verfahrensweise (e):

Es wird eine vorbestimmte Menge eines Antigens 1 durch eine Säule geführt, die mit einem Träger gefüllt ist, auf dem eine größere Menge eines Antikörpers 2 adsorbiert ist, wodurch der Antigen-Antikörper-auf-Träger 5-2-1 gebildet wird. Hiernach wird eine größere Menge eines markierten Antikörpers 2-4 durch die Säule geführt, so daß durch Binden des markierten Antikörpers 2-4 mit dem Antigenantikörper-auf-Träger 5-2-1 ein unlösbar gemachtes Produkt entsteht, während der ungebundene markierte Antikörper-2-4 aus der Säule ausgeschieden wird.

-/-4t-

Verfahrensweise (f):

Es wird eine vorbestimmte Menge eines Antikörpers 2 durch eine mit dem Träger 5 gefüllte Säule hindurchgeführt, auf dem eine größere Menge eines Antiantikörpers oder Proteins A 3 adsorbiert ist, so daß der Antikörper-Ant!antikörper oder Protein A-auf-Träger 5-2-3 gebildet wird. Hiernach wird eine größere Menge eines markierten Antigens 1-4 durch die Säule geführt, so daß ein unlöslich gemachtes Produkt gebildet wird, indem das markierte Antigen 1-4 mit dem Antikörper-Antiantikörperauf-Träger oder Antikörper-Protein A-auf-Träger 5-2-3 gebunden wird, während das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus der Säule ausgeschieden wird.

Darüber hinaus wird erfindungsgemäß nach Durchführung des immunologischen Reaktionsschrittes obiger Beschreibung der Vorgang des Messens der Enzymaktivität vorgenommen.
Nach Beendigung der immunologischen Reaktion gemäß einer der obigen Verfahrensweisen (a) bis (f) wird die Säule mit einer Pufferlösung gewaschen und die Aktivität des in der Säule verbleibenden, im unlösbar gemachten Produkt enthaltenen markierten Enzyms 4 dadurch gemessen, daß eine ein Substrat für das Enzym enthaltende Lösung durch die Säule hindurchgeleitet wird.

Für den Normalfall gilt, daß die vorstehend dargelegten Verfahrensweisen vorher mit unterschiedlichen Mengen des Antigens 1 oder Antikörpers 2 wiederholt und die gemessenen Werte somit gegen die Mengen des eingangs verwendeten Antigens 1 oder Antikörpers 2 zur Erstellung der Eichknrve eingetragen werden. Hiernach werden dieselben Verfahren wie oben durchgeführt, indem eine biologische. Flüssigkeit verwendet wird, die eine unbekannte Menge des Antigens 1 oder Antikörpers 2 enthält. Dann wird die Kon-

zentration des Antigens 1 oder Antikörpers 2 in der Flüssigkeit aus dem gemessenen Wert in bezug auf die Eichkurve berechnet.

Bei der Durchführung der Erfindung werden die immunologische Reaktion, die Reaktion eines Antigens oder Antikörpers mit einem Markierungsmaterial und die Adsorption eines Antikörpers, eines Antiantikörpers oder Protein A auf einem unlöslichen Träger vorgenommen bei einer Temperatur im Bereich von 4° C bis etwa 40° C, was bei biochemischen Reaktionen üblich ist. In den meisten Fällen beträgt die zur abschließenden Durchführung dieser Reak- · tionen benötigte Zeit 10 Minuten oder mehr.

Das Antigen 1, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchen ist, kann ein in verschiedenartigen biologischen Flüssigkeiten enthaltenes Hormon oder Protein sein, wobei auf die Wirkweisen einiger Proteine nicht eingegangen wird. Als besondere Beispiele des Antigens sind aufzuführen: Insulin, Trijodthyronin, Thyroxin, Kalzitonin, Alpha-Fetoprotein, S-100 Protein, Enolase, Kalmodulin, sekretorisches Immunglobulin A und dergleichen. Hinzu kommt, daß die Blutpegel von von außen zugeführten Arzneimitteln wie Antibiotika ebenfalls bestimmt werden können. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Antikörper 2 ist ein dem Antigen 1 entsprechender Antikörper. Die meisten dieser Antigene 1_f Antikörper 2, Antiantikörper 3 oder biologischen Flüssigkeiten, die diese enthalten, sind in gereinigter Form im Handel erhältlich; auch in den nachstehend angeführten Beispielen der Erfindung wurden derartige handelsübliche Präparate verwendet.

Besondere Beispiele des markierten Enzyms zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen ß-D-Galaktosidase,

alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxidase, Malat-Dehydrogenase und dergleichen. Ein Enzym 4 dieser Art kann mittels herkömmlicher Verfahren mit einem Antigen 1 oder einem Antikörper 2 verknüpft werden. Dies läßt sich beispielshalber erreichen, indem ein difunktioneller Reaktionsteilnehmer als Verknüpfungsmittel wie Glutaraldehyd, Karbodiimid, N, N-o-Phenylendimalimid, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysukzinimidester oder dergleichen verwendet wird.

Charakteristische Beispiele eines in der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verwendenden unlöslichen Trägers 5 umfassen Polysacharide wie Agarose, Dextran, Zellulose usw., synthetische Harze wie PoIystyrol, Polyakrylamid usw. und Glasteilchen. Es ist bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens von Vorteil, wenn das trägeradsorbierte Reaktionsmittel, bestehend aus einem auf dem unlöslichen Träger 5 adsorbierten Antikörper 2, Antiantikörper 3 oder Protein A 3_r feinkugelförmig oder feinfaserförmig ausgebildet ist, solange der.Durchsatz des immunologischen Reaktionsgemisches durch die Säule nicht übermäßig abfällt.

Die Adsorptionsreaktion eines Antikörpers 2, Antiantikörpers 3 oder Proteins A 3 auf einem unlöslichen Träger kann nach einer beliebigen herkömmlichen Verfahrensweise vorgenommen werden. Beispielshalber läßt sie sich durchführen, indem ein unlösliches PoIysacharid mit einem Aktivator wie Zyanogenbromid, Natriumperjodat, Epichlorhydrin, 1, 1'-Karbonyldiimidazol, p-Toluensulfonylchlorid oder dergleichen verwendet und hierauf ein Antikörper oder dergleichen dem aktivierten Polysacharid. beigegeben wird. Die Menge an Antikörper 2, Antiantikörper 3 oder Protein A für diesen Zweck liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0,1 bis 20 mg pro Milliliter unlöslichem Träger.

Im Verfahren nach der Erfindung kann der Antikörper 2, . der Antiantikörper 3 oder das Protein A 3 ein aus diesen isoliertes sogenanntes aktives Fragment sein. Beim Antikörper 2 oder Antiantikörper 3 können beispielshalber die aktiven Fragmente durch Behandlung mit einer Protease wie Papain, Pepsin oder dergleichen isoliert werden.

Angesichts der geringen Volumina der Proben, die gewohnlich zur Immunanalyse verfügbar sind, ist es im Hinblick auf eine Vereinfachung des Verfahrensablaufs und zur Erreichung angemessen kurzer Betriebszeiten vorteilhaft, daß das Fassungsvermögen der Säule bei der Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung nicht höher liegt als 1 ml.

Darüber hinaus kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens jegliche Störung in der immunologischen Reaktion durch von der Anmelderin bereits vorher vorgeschlagene Verfahrensweisen, d. h. durch Zuführung eines wasserabstoßenden Proteins (z. B. Gelatin) zusammen mit einem Salz (ζ. B. Natriumchlorid) zum immunologi-. sehen Reaktionssystem verhindert werden.

Nachstehend wird das Verfahren nach der Erfindung anhand von Beispielen gesondert dargelegt, wobei diese Beispiele jedoch den Erfindungsgedanken nicht einschränken.

Beispiel 1 Untersuchung auf Insulin (nach den Verfahren der Ansprüche 2 und 6)

(1) Ansetzen eines Antikörpers und markierten Antikörpers

Ein handelsübliches Präparat Schweineinsulin aus den Bauchspeicheldrüsen von Schweinen wurde als Antigen verwendet. Ein handelsübliches Serumpräparat, das Antikörper

- ι/- /O

enthält, die durch Injizieren des Antigens in Meerschweinchen erzeugt wurden, wurde mit herkömmlichen Verfahren wie Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und DEAE-Zellulose-Chromatografie behandelt, um aus ihm Antikörper zu isolieren. Diese Antikörper wurden durch die Beimengung von Pepsin aufgespalten und dann der Säulenchromatografie unter Verwendung der Sephadex G-150 ausgesetzt, wobei die aktiven Fragmente der Antikörper isoliert wurden. Diese aktiven Fragmente wurden durch 2-Merkaptoäthylamxn auf herkömmliche Art reduziert und dann mit N, N¹-o-Phenylendimalimid zur Reaktion gebracht, um es mit den reduzierten aktiven Fragmenten zu verknüpfen. Hiernach wurde das Reaktionsprodukt weiter mit einem harn delsüblichen Präparat der ß-D-Galaktosidase reagiert, um die mit ß-D-Galaktosidase markierten aktiven Fragmente (hiernach einfach als markierte Antikörper bezeichnet) darzustellen.

Das erwähnte Antigen (d. h. Schweineinsulin) und dessen entsprechender Antikörper haben allgemein die Fähigkeit, mit anderen.Seruminsulinen (als Antigene), die aus einer großen Vielzahl von Tierarten (einschließlich des Menschen) stammen können, und deren entsprechenden Antikörpern zu reagieren, so daß sie in der Analyse der Insuline (als Antigene) oder deren in biologischen Flüssigkeiten enthaltenen entsprechenden Antikörpern .vieler Tierarten (z. B. dem Menschen) genutzt werden können.

(2) Ansetzen eines Antikörper-auf-Trägers 30

Ein derartiger Träger wurde durch Adsorption des unter (1) gewonnenen Antikörpers auf einem nichtwasserlöslichen Träger (CNBr-aktivierte Sepharose) auf herkömmliche Art dargestellt.

(3) Erstellung einer Eichkurve

1 ml Anteilen einer Pufferlösung mit 100 jaU/ml mar*- kierter Antikörper unter (1) wurden jeweils 0,1 ml wässriger Lösungen zugeführt, die kleinere Mengen

(d. h. 0 bis 320 juU/ml) des Antigens enthielten, und die Gemische wurden bei 37° C zwei Stunden lang inkubiert, um einen markierten Antikörper-Antigen-Komplex zusammen mit einem ungebundenen Anteil des markierten Antikörpers zu ergeben. In diesem und in anderen Beispielen bezeich*- net "U" die Einheitsraenge eines bei standardisierten biologischen Wertbestimmungen aufgenommenes Hormons. Hiernach wurde jedes Reaktionsgemisch durch die Säule geführt, die mit einer größeren Menge- des unter (2) angesetzten Antikörper-auf-Trägers gefüllt ist, so daß das unlöslich gemachte Produkt, durch Bindung des markierten Antikörper-An tigen-Komplexe s mit. dem antikörper ha It igen Träger gebildet wird, während der ungebundene markierte Antikörper aus der Säule ausgeschieden wird. Nach dem Waschen der Säule mit einer Pufferlösung wurde 0,1 ml einer wässrigen Lösung mit 10 mg/ml o-Nitrophenyl-ß-D-Galaktosid (hiernach als o-NPG bezeichnet) in die Säule gegossen und dann bei 37° C zwei Stunden inkubiert, um o-Nitrophenol zu erzeugen. Die Säule wurde mit 2 ml einer 0,1 M Na-COj-Lösung gewaschen und das Absorptions-» vermögen bei 420 nm des Filtrats gemessen, um die Aktivität des darin,enthaltenen Enzyms zu bestimmen. Die gemessenen Werte wurden gegen die Mengen des eingangs verwendeten Antigens eingetragen, um eine Eichkurve wie in Fig. 2 (Verfahren von Anspruch 2) zu erstellen.

Andererseits wurde das obige Verfahren abgeändert, indem eine Reihe von Lösungen angesetzt wurden, die das Anti- ". gen in gleichen Mengen wie vorher enthielten, und indem jede Lösung durch eine mit dem antikörperenthaltenden Träger gefüllten Säule geleitet wurde. Nach dem Waschen

- ff

der Säule wurde die gleiche Menge des markierten Antikörpers durch sie hindurchgeleitet, wonach das Absorptionsvermögen des Filtrats gemessen wurde. Auf diese Weise wurde eine der Fig. 2 sehr ähnliche Eichkurve (Verfahren von Anspruch 6) gewonnen.

(4) Insulinbestimmung im menschlichen Serum

Es wurde eine Probe eines' menschlichen Serums unbekannter (und hiernach stets derselben) Insulinkonzentration (jedoch im Bereich von 0-320 μϋ/ml nach der Definition unter (3) ) als Antigen verwendet und dasselbe Verfahren wie unter (3) durchgeführt, 0,1 ml der Probe wurde mit dem markierten Antikörper reagiert und das Reaktions-5 gemisch durch eine mit dem antikörperhaltigen Träger gefüllte Säule hindurchgeführt. Nach dem Zugießen von o-NPG in die Säule und Inkubierung wurde die Absorptionsfähigkeit des Säulenfiltrats gemessen. Bei der Berechnung aus dem gemessenen Wert in bezug auf die in Fig. 2 dargestellte Eichkurve ergab sich eine Insulinkonzentration in der Probe von 92 μϋ/ml. Zum Vergleich wurde dieselbe Probe in gleicher Weise einer herkömmlichen Festphase-^ Radioimmunanalyse (hiernach als RIA bezeichnet) unterzogen, bei der ein Radioisotop als Markierungsmaterial verwendet wurde, so daß man bei der Schätzung der Insulfnkonzentration in der Probe auf 1O2 uü/ml kam.

Die gleiche Probe wurde dagegen nach derselben Verfahrensweise wie im späteren Teil von (3) behandelt. Hierbei ergab sich eine Insulinkonzentration in der Probe von 95 μϋ/ml. Zum Vergleich wurde dieselbe Probe in gleicher Weise nach RIA untersucht, wobei die Insulinkonzentration in der Probe auf 1O5 uü/ml geschätzt wurde.

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Beispiel 2 Untersuchung auf Antithyroxin-Antikörper

(nach den Verfahren der Ansprüche 2 und 7}

(1) Ansetzen eines markierten Antigens und eines Antikörper s

Als Antigen wurde ein handelsübliches Thyroxinpräparat verwendet, das aus einem Extrakt von Schweineschilddrüsen isoliert wurde. Die Aminogruppe dieses Antigens.wurde mit der SH-Gruppe der ß-D-Glaktosidase auf herkömmliche Weise verknüpft, um ein markiertes Antigen zu bilden. Als Antikörper wurde ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antikörper verwendet, der durch Injizieren des Antigens in ein Kaninchen erzeugt wurde.

(2) Ansetzen eines antiantikörperhaltigen Trägers

Allgemein besitzt das Immunglobulin G (hiernach als IgG bezeichnet), das als Protein in den Seren von Tieren auftritt, die Fähigkeit, mit Antigensubstanzen zu reagieren, die aus einer Vielzahl von Tierarten stammen können, und somit auch die Eigenschaften eines ihnen entsprechenden Antikörpers. Demgemäß wurde IgG für die Darstellung eines Ant!antikörpers weitgehend verwendet.

In diesem Beispiel wurde ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antiantikörper, das durch Injizieren des Kaninchen-IgG in eine Ziege gewonnen wurde, in der gleichen Art und Weise wie unter (1) von Beispiel 1 zum Isolieren des Antiantikörpers verwendet. Es wurde bei diesem isolierten Antiantikörper das gleiche Verfahren wie unter (2) von Beispiel 1 zum Herstellen eines antiantikörperhaltigen Trägers durchgeführt.

(3) Erstellung einer Eichkurve

0,5 ml Anteilen einer Verdünnung des nach (1) angesetzten markierten Antigens wurden 3 μΐ Lösungen beigemengt, die kleinere Mengen des Antikörpers enthielten. Nach Abschluß der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet, die mit einer größeren Menge des nach (2) angesetzten antiantikörperhaltigen Trägers gefüllt worden war. Hiernach wurde das· Verfahren nach (3) von Beispiel 1 zur Erstellung einer Eichkurve (Verfahren von Anspruch 3) durchgeführt.

Das obige Verfahren wurde abgeändert, indem eine Reihe von Serumlösungen (je 0,5 ml) angesetzt wurden, die den 5 Antikörper in denselben Mengen wie vorher enthielten. Jede Lösung wurde dabei durch eine Säule geführt, die mit dem antiantikörperhaltigen Träger gefüllt worden war. Nach dem Waschen der Säule wurde dieselbe Menge des markierten Antigens durch sie hindurchgeführt, worauf dann die Messung der Absorptionsfähigkeit der Säulenfiltrate folgte. Auf.diese Weise wurde eine der vorstehend beschriebenen sehr ähnlichen Eichkurve (Verfahren von Anspruch 7) erstellt.

(4) Bestimmung des im Kaninchenserum enthaltenen Antithyroxinantikörper s

Auf dieselbe Art und Weise wie unter (3) wurde eine Kaninchenserumprobe unbekannter Antithyroxinantikörperkonzentration zum Messen der Absorptionsfähigkeit des Filtrats behandelt. Nach der Berechnung aus dem Meßwert in bezug zur nach (3) erstellten Eichkurve ergab sich eine Konzentration des Antithyroxinantikörpers in der Probe in der Höhe von 1,05 U/ml. In ähnlicher Weise wurde die gleiche Probe wie im letzten Teil unter (3) beschrieben behandelt, und es ergab sich eine Antithyroxinantikörperkonzentration von 110 U/ml.

Beispiel 3 Unter suchung auf Antiinsulin-Antikörper , (nach dem Verfahren von Anspruch 3)

(1) Ansetzen eines markierten Antigens 5

Es wurde ein handelsübliches Schweineinsulinpräparat als Antigen verwendet. Hierbei befolgte man dasselbe Verfahren wie unter (1) von Beispiel 1 bei der Markierung der ß-D-Glaktosidase am Antigen. Als Antikörper·wurde sodann ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antikörper verwendet, der durch Injizieren des Antigens in ein Meerschweinchen erzeugt wurde.

(2) Ansetzen eines ant!antikörperhaItigen Trägers 15

Ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antiantikörper (d. h. Antikörper auf Meerschweinchen-IgG), der durch Injizieren von IgG des Meerschweinchens in ein Kaninchen erzeugt wurde, wurde auf übliche Art und Weise behandelt, um daraus den Antiantikörper zu isolieren. Dabei folgte man der Verfahrensweise nach (2) von Beispiel 2, um einen antiantikörperhaltigen Träger herzustellen.

(3) Erstellung einer Eichkurve

Den 1 ml Anteilen einer Pufferlösung mit markiertem Antigen nach der Darstellungsart gemäß (1) wurden eine Reihe von Serumlösungen beigegeben, die kleinere Mengen Antikörper enthielten. Nach Beendigung der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet, die mit einer größeren Menge des nach (2.) hergestellten antiantikörperhaltigen Trägers gefüllt worden war.

_ 23.

Hiernach wurde die Säule gemäß der vorstehend unter (3) beschriebenen Verfahrensweise von Beispiel 2 behandelt, um das Absorptionsvermögen des Säulenfiltrats zu messen. Die Meßwerte wurden gegen die eingangs zur Erstellung einer Eichkurve verwendeten Antikörpermengen eingetragen.

(4) Bestimmung des im Meerschwexnchenserum enthaltenen Antiinsulin-Antikörpers

Nach demselben Verfahren wie unter (3) oben wurde eine Probe Meerschweinchenserum unbekannter Antiinsulinantikörperkonzentration zum Messen des Absorptionsvermögens des Filtrats behandelt. Nach der Berechnung aus dem Meßwert in bezug auf die Eichkurve nach (3) oben lag die Konzentration des AntiinsulinantikÖrpers in der Probe bei 0,76 uU/ml.

Beispiel 4 Untersuchung auf Alpha-Fetoprotein (nach dem Verfahren von Anspruch 2) 20

(1) Ansetzen eines markierten Antikörpers

Als Antigen wurde ein handelsübliches <*-Fetoproteinpräparat verwendet, das aus einem menschlichen Serum isoliert wurde. Auf die übliche Art wurde zur Isolierung des Antikörpers ein einen Antikörper enthaltendes handelsübliches Serumpräparat behandelt, der durch Injizieren des Antigens in eine Ziege gewonnen wurde. Bei der Verwendung des Antikörpers wurde zum Herstellen eines markierten Antikörpers das Verfahren nach (1) von Beispiel 1 befolgt.

(2) Herstellung eines antikörperhaltigen Trägers

Durch Verwenden von Toyopearl HW-55 (Handelsmarke) als nichtlöslichen Träger wurde ein antikörperhaltiger Träger auf die übliche Art und Weise geschaffen.

{3} Erstellung einer Eichkurve

Den 1 ml Anteilen einer den markierten Antikörper nach dem Darstellungsverfahren von {1} enthaltenden Lösung wurden kleinere Mengen des Antigens hinzugegeben und nach Beendigung der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet, die mit einer größeren Menge des nach (2) hergestellten antikörperhaltigen Trägers angefüllt worden war, wonach die Absorptionsfähigkeit des Säulenfiltrats gemessen wurde. Die Meßwerte wurden gegen die eingangs zur Erstellung der Eichkurve verwendeten Antigenmengen eingetragen.

(4) Bestimmung des im menschlichen Serum enthaltenen oi -Pe toprote in s

Auf dieselbe Art wie (3) oben wurde eine Probe menschlichen Serums unbekannter Konzentration an ot -Fe to protein zur Messung des Absorptionsvermögens des Säulenfiltrats behandelt. Nach der Berechnung aus dem Meßwert in bezug auf die Eichkurve nach (3) oben lag die Konzentration an <* -Fe to pro te in in der Probe bei 151 ng/ml. Zum Vergleich wurde dieselbe Probe in gleicher Weise dem RIA-Verfahren ausgesetzt, so daß die Schätzung der °*-Fetoproteinkonzentration in der Probe einen Betrag von 192 ng/ml ergab".

Beispiel 5 Untersuchung auf Kalzitonin

(nach dem Verfahren von Anspruch 4)

(1) Ansetzen eines Antikörpers

Ein aus einem Extrakt von Schweineschilddrüsen isoliertes handelsübliches Kalzitoninpräparat wurde als Antigen ver-. wendet. Auf dieselbe Art wie unter (1} von Beispiel 1 wurde ein handelsübliches Serumpräparat behandelt, das den

durch Injizieren des Antigens in ein Kaninchen geschaf-. fenen Antikröper enthielt, um den Antikörper daraus zu isolieren.

(2) Ansetzen eines markierten Antigens und Herstellung eines antiantikörperhaltigen Trägers

Die Verfahrensweise nach (1) von Beispiel 2 wurde zur Darstellung eines markierten Antigens befolgt. Dabei wurde ein antiantikörperhaltiger Träger durch Befolgen desselben Verfahrens von (2) von Beispiel 2 geschaffen.

(3) Darstellung von Antigenlösungen mit unterschiedlichen · Konzentrationen.

Eine wässrige Lösung des Antigens wurde verdünnt, um eine Reihe von O bis 150 MRC mU/ml des Antigens enthaltenden Antigenlösungen herzustellen (wobei ¹¹MRC U" die Einheitsmenge an Kaizitonin in der standardisierten biologischen Wertbestimmung bezeichnet).

(4) Erstellung einer Eichkurve

0,5 ml jeder kleinere Mengen des Antikörpers von (1) enthaltenden Lösung sowie 0,1 ml jeder nach (3) hergestellten Antigenlösung wurden den 0,1 ml-Anteilen einer Lösung zugeführt, die das nach (2) dargestellte markierte Antigen enthielt. Nach Abschluß der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet. Hiernach wurde die Säule nach demselben Verfahren wie unter (3) von Beispiel 2 zur Messung des Absorptionsvermögens des Piltrags behandelt. Die Meßwerte wurden gegen die·Mengen des Antigens eingetragen, das eingangs zur Erstellung der in Fig. 3 gezeigten Eichkurve verwendet wurde.

(5) Bestimmung des im Schweineschilddrüsenextrakt enthaltenen Kalzitonins

Eine Probe eines Schweineschilddrüsenextraktes unbekannter Kalzitoninkonzentration wurde nach (3) oben zum

Messen des Absorptionsvermögens des Filtrats behandelt. Die Berechnung des Meßwertes in bezug auf die Eichkurve der Fig. 3 ergab eine Kalzitoninkonzentration in der Probe von 75 MRC mü/ml.
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Beispiel 6 Untersuchung auf Thyroxin

(nach dem Verfahren von Anspruch 5)

(1) Ansetzen eines markierten Antigens und eines Antikörpers

Als Antigen wurde ein handelsübliches Thyroxinpräparat verwendet, das aus einem Extrakt von Schweineschilddrüsen isoliert worden war. Nach dem Verfahren (1) von Beispiel 2 wurde ein markiertes Antigen erstellt. Dabei wurde ein handelsübliches Serumpräparat, das einen dem Antigen entsprechenden Antikörper enthielt, nach (1) von Beispiel 1 behandelt, um daraus den Antikörper zu isolieren.

(2) Ansetzen eines antikörperhaltigen Trägers

Hierbei wurde das Verfahren (2) von Beispiel 1 befolgt, um den antikörperhaltigen Träger herzustellen.

(3) Darstellung der Antigenlösungen mit unterschiedlicher Konzentration

Es wurde eine wässrige Lösung des Antigens zur Herstellung einer Reihe von Antigenlösungen unterschiedlicher Konzentration verdünnt.

(4) Erstellung einer Eichkurve

Es wurden den 1 ml-Anteilen einer Lösung, die das nach (1) angesetzte markierte Antigen enthielt, Antigenlösungen nach (3) zugeführt. Jedes sich ergebende Gemisch wurde durch eine Säule geführt, die von einer kleineren Menge des antikörperhaltigen Trägers gefüllt war, wobei die Säule nach dem Verfahren von Beispiel 1 zum Messen der Absorptionsfähigkeit des Säulenfiltrats behandelt wurde. Die gemessenen Werte wurden gegen die Mengen des Antigens eingetragen, das eingangs zur Erstellung der Eichkurve benutzt wurde.

(5) Bestimmung des im Schweineschilddrüsenextrakt enthaltenen Thyroxins

Eine Schweinethyroidextraktprobe mit unbekannter Thyroxinkonzentration wurde nach (3) oben behandelt, um das Absorptionsvermögen des Säulenfiltrats zu messen. Aus dem Meßwert in bezug auf die nach (4) oben erstellte Eichkurve wurde eine Thyroxinkonzentration in der Probe von 10,5 μg/dl errechnet. Nach der zum Vergleich angezogenen und in gleicher Weise durchgeführten RIA-Methode ergab sich für die Thyroxinkonzentration ein Schätzwert von 11,0 Mg/dl.

Leerseite

Claims

PAT E NTANWALTS BU R O

PATENTANWÄLTE DIPL-INQ. W. MEISSNER (1980) DIPL-INQ. P. E. MEISSNER DIPL-ING. H.-J. PRESTINQ

ZuQelasiene Vertreter vor dem Europäischen Patentamt -Professional Representative« before the European Patent Office

Kh ZeK)Wn Ihr Schreiben vom Unsere Zeichen HERBERTSTR. 22, 1000 BERLIN 33

M-mh 23.9.1982 AMA-276

Amano Pharmaceutical Company, Limited 2-7, Nishiki 1-chome,
Naka-ku, Nagoya-shi,
Aichi 460, Japan

Verfahren der Festphase-Enzymimmunanalyse

Patentansprüche

Verfahren der Festphase-Enzymimmunanalyse , bestehend aus den Schritten (a) immunologischen Reaktion von zumindest einer immunologischen Reaktivkomponente(n) gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper, einem markierten Antigen und einem markierten Antikörper oder eines immunologischen Komplextes daraus mit einem von einem Träger adsorbierten Reaktionsteilnehmers aus der Gruppe bestehend aus einem antikörperhaltigen Träger, einem antiantikörperhaltigen Träger und einem Protein A enthaltenden Träger einfach oder zweifach zur Gewinnung eines unlöslich gemachten Produktes gebildet durch Bindung des markierten Antigens

TELEX TELEGfIAMM TELEFONi BANKKONTO POSTSCHECiO(ONTO: 1-8564« INVENTION BERUN BtRUNERBAHKAQ. P. MBSSNEH. BLN-W invent! BERLIN 030/9816037 BERLM 31 404737-103

(oder markierten Antikörpers) oder dessen immunologi- . sehen Komplexes mit dem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer zusammen mit einem ungebundenen löslichen, Anteil des markierten Antigens (oder markierten Antikörpers); (bj Abtrennung daraus des ungebundenen markierten Antigens (oder markierten Antikörpers); (c) Messung der Aktivität des im unlöslich gemachten Produkt enthaltenen Enzyms; (d) Erstellung einer die Beziehung zwischen eingangs vorhandener Antigenmenge und der damit verbundenen Enzymaktivität darstellenden Eichkurve durch Wiederholen der Schritte (a) bis (c); (e) Durchführung dersehlben Verfahrensweisen wie oben mit einer unbekannten Menge Antigen (oder Antikörper) enthaltenden biologischen Flüssigkeit zur Messung der im sich ergebenden unlöslich gemachten Produkt auftretenden Enzymaktivität;' und (f) Berechnung der Menge (Konzentration) des in der biologischen Flüssigkeit vorhandenen Antigens (oder Antikörpers) in bezug zur Eichkurve, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Schritte ausgehend von dem der immunologischen Reaktion der immunologischen Reaktivkomponente(n) oder eines daraus gebildeten immunologischen Komplexes mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer Ca) bis einschließlich dem Schritt der Messung der im sich ergebenden unlöslich gemachten Produkt auftretenden Enzymaktivität bei Anwendung der biologischen Flüssigkeit nach (e) durchgeführt werden, indem die Chromatografie mit einer einzelnen Säule angewendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Komplex (1-2-4) durch Reagieren einer vorher festgelegten Menge eines markierten Antikörpers (2-4) mit einer kleineren Menge eines Antigens (1) dargestellt wird, wobei der trägeradsorbier te

Reaktionsteilnehmer aus einer größeren Menge eines Antikörpers (2) besteht, der auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Komplex (2-1-4) dargestellt wird durch Reagieren einer vorher festgelegten Menge eines markierten Antigens (1-4) mit einer kleineren Menge eines Antikörpers (2), wobei der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer aus einer größeren Menge eines Antiantikörpers oder Protein A (3) besteht, der bzw. das auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet,

daß der immunologische Komplex (2-1-4) dargestellt wird durch Reagieren einer vorher festgelegten Menge eines markierten Antigens (1-4) mit einer kleineren Menge eines Antikörpers (2) sowie einer abweichenden Menge eines Antigens (1), wobei der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer aus einer größeren Menge eines Antiantikörpers oder Protein A (3) besteht, der bzw. das auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet,

daß als immunologische Reaktivkomponenten eine vorher bestimmte Menge eines markierten Antigens (1-4) und eine unterschiedliche Menge eines Antigens (1) verwendet werden, wobei der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer aus einem Antikörper (2) besteht, der auf einem Träger

(5) adsorbiert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologische Reaktivkomponenten eine vorher bestimmte Menge eines Antigens (1) und eine größere Menge

eines markierten Antikörpers (2-4) verwendet werden und daß diese immunologischen Reaktivkomponenten nacheinander durch eine Säule geführt werden, die mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer gefüllt ist, der aus einer größeren Menge eines auf einem Träger adsorbierten Antikörpers (2) besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologischen Reaktivkomponenten eine vorher bestimmte Menge eines Antikörpers (2) und eine größere Menge eines markierten Antigens (1-4) verwendet werden und daß diese immunologischen Reaktivkomponenten nacheinander durch eine Säule geführt werden, die mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer gefüllt ist, der aus einer größeren Menge eines Antiantikörpers oder Protein A (3) besteht, der bzw« das auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen (1 ), das eine der immunologischen Reaktivkomponenten darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der Insulin, Trijodthyronin, Thyroxin, Kalzitonin

öl-Fetoprotein, S-100 Protein, Enolase, Kalmodulin und sekretorisches Immunglobulin A zu rechnen ist. 25
9. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, dadurch gekennzeichnet, daß der den trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer darstellenden unlöslichen Träger (5) gewählt wird aus einer Gruppe, zu der Agarose, Dextran, Zellulose, PoIystyrol, Polyacrylamid und Glasteilchen zu rechnen ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der den trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer darstellenden unlöslichen Träger (5) gewählt wird aus einer Gruppe, zu der Agarose, Dextran, Zellulose, Polystyrol, Polyakrylamid und Glasteilchen zu rechnen ist.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, dadurch gekennzeich-· net, daß das markierende Enzym (4), das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der ß-D-Glaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenase zu rechnen ist.
12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das markierende Enzym (4), das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der ß-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenase zu rechnen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das markierende Enzym (4)", das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der ß-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenäse zu rechnen ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1O, dadurch gekennzeichnet, daß das markierende Enzym (4), das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird ^ aus der Gruppe, zu der ß-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenase zu rechnen ist.
15. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer feinkugelig oder feinfaserig ausgebildet ist, solange der Durchsatz des immunologischen Reaktionsgemisches durch die Säule nicht übermäßig abfällt.
16. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Fassungsvermögen der in der Chromatografie des erstehenden Verfahrens verwendeten Säule nicht größer ist als 1 ml.