DE3235516A1 - Verfahren der festphase-enzymimmunanalyse - Google Patents
Verfahren der festphase-enzymimmunanalyseInfo
- Publication number
- DE3235516A1 DE3235516A1 DE19823235516 DE3235516A DE3235516A1 DE 3235516 A1 DE3235516 A1 DE 3235516A1 DE 19823235516 DE19823235516 DE 19823235516 DE 3235516 A DE3235516 A DE 3235516A DE 3235516 A1 DE3235516 A1 DE 3235516A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- antibody
- carrier
- antigen
- labeled
- adsorbed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren der immunologischen untersuchung zur Bestimmung der Mengen geringster in
der Körperflüssigkeit (oder in biologischen Flüssigkeiten) vorhandener Substanzen wie im Serum und in der zerebro-·
spinalen Flüssigkeit bei Säugetieren.
Der Ausdruck "Immunprobe" oder "-analyse" wird hiernach
als ein Verfahren verstanden, in dem die Reaktion einer immunologischen (serologischen) Antigensubstanz (d. h. ein
sogenanntes Antigen) mit einem ihr immunologisch entsprechenden sogenannten Antikörper zur Bestimmung der Menge
oder Konzentration des in der Flüssigkeit vorhandenen Antigens oder Antikörpers angewendet wird.
Es werden bereits verschiedene Verfahren biologischer Tests und Wertbestimmungen oder zur Messung der Enzymtätigkeit ·
angewendet, um kleinste in biologischen Flüssigkeiten auftretende Stoffmengen zu bestimmen. Diese Verfahren haben
sich jedoch als unzureichend erwiesen, weil sie zu aufwendige Arbeitsgänge erforderlich machten und hinsichtlich
Empfindlichkeit und Genauigkeit zu wünschen übrig ließen.
Demgegenüber läßt sich mit dem neu entwickelten Immunanalyseverfahren
eine bedeutend höhere Empfindlichkeit und Genauigkeit erzielen, ohne daß dabei schwierige
Arbeitsgänge durchzuführen sind. Demgemäß wird dieses-Verfahren
nunmehr auf dem Gebiet der Biochemie.und in der klinischen Medizin angewendet.
Es wurden verschiedene Arten von Immunanalyseverfahren
vorgeschlagen, bei denen die Verfahren genutzt wurden, welche ein Antigen oder Antikörper kombiniert (oder
markiert) mit einem Radioisotop, fluoreszierenden Stoffen
oder einem Enzym verwendeten. Insbesondere kamen hierbei die sogenannten Festphaseverfahren, bei diesen Immunanalyseverfahren
unter Verwendung der Markierungsstoffe als am
vorteilhaftesten geeignet in Betracht.
In dem Festphase-Immunanalyseverfahren wird das sogenannte
trägeradsorbierte Substrat als Reaktionsmaterial verwendet, das aufbereitet wurde, indem unter bestimmten
Reaktionsbedingungen ein Antikörper, ein sogenannter Antiantikörper (d. h. ein Antikörper, der durch Verwenden
eines Antikörpers als Antigen erzeugt wurde) oder ein sogenanntes Protein A (d. h. ein von bestimmten Mikroorganismen
erzeugtes Spezialprotein, das mit verschiedenen Antikörpern reagieren kann) auf einem wasserunlöslichen
Träger wie Polystyrol- oder Silikonstücke, wasserunlösliche
Polysacharide usw. adsorbiert wird, so daß letztere hierdurch unlöslich gemacht werden, wobei diese trägeradsorbierten
Reaktionsteilnehmer dem Fall entsprechend dann als Antikörper-auf-Träger, Anti-Antikörper-auf-Träger
bzw. Protein A-auf-Träger bezeichnet werden.
Hiernach wird das allgemeine Prinzip des Festphase-Immunanalyseverfahrens
unter Verwendung eines Enzyms als Markierungsmaterials näher beschrieben, bevor noch auf die,
Beschreibung der Erfindung eingegangen wird.
Es wird zumindest ein Mitglied aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper, einem markierten
Antigen und einem markierten Antikörper (die hiernach allgemein als immunologisch reaktive Komponenten bezeichnet
werden) oder ein immunologischer Komplex aus diesen mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer aus der
Gruppe bestehend aus einem antikörperhaltigen {Antikörperauf-) Träger, einem antiantikörperhaltigen Träger und
einem Protein A-haltigen Träger ein-oder zweifach zur
Reaktion gebraucht, so daß sich daraus durch Bindung des markierten Antigens (oder markierten Antikörpers) oder
deren immunologischer Komplex mit dem trageradsorbierten
Reaktionsteilnehmer zusammen mit einem ungebundenen lösliehen
Teil des markierten Antigens (oder markierten Antikörpers) ein unlöslich gemachtes Produkt bildet. Nach-
dem das ungebundene markierte Antigen (oder der markierte Antikörper) vom unlöslich gemachten Produkt abgetrennt
wurde, wird die Aktivität des Enzyms (insbesondere die Adsorption des Reaktionsgemisches des Enzyms mit dessen
Substrat) gemessen, das im unlöslich gemachten Produkt enthalten ist. In der Regel werden dieselben Verfahrensschritte wie oben mit veränderlichen Mengen Antigen
(oder Antikörper) wiederholt, und durch Verwenden der hierdurch gemessenen Werte wird eine Eichkurve erstellt,
die das Verhältnis zwischen den eingangs verwendeten Mengen der Antigene (oder Antikörper) und der damit verbundenen
Enzymtätigkeit darstellt. Hiernach werden dieselben
Verfahrensschritte mit einer biologischen Flüssig- ■ keit durchgeführt, die eine unbekannte Menge Antigene
(oder Antikörper) enthält, um die Aktivität des Enzyms zu messen, das im sich ergebenden unlösbar gemachten Produkt
enthalten ist. Dann wird die Menge oder Konzentration der in der Flüssigkeit vorhandenen Antigene (oder
Antikörper) aus dem gemessenen Wert in Beziehung zur Eichkurve errechnet.
Während das oben beschriebene Verfahren der Festphase-Enzymimmunanalyse
eine vorteilhaft hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit besitzt, so weist es dennoch den Nachteil
auf, daß es beschwerliche Arbeitsschritte erforderlich macht.
Die herkömmliche Verfahrensweise der Festphase-Enzymimmunanalyse
wurde eingehend von uns untersucht. Hierbei erfanden wir ein sehr wirksames Verfahren, indem sämtliche
Schritte ausgehend von der immunologischen Reaktion der reaktiven Komponente(n) oder eines hieraus bestehenden
immunologischen Komplexes mit einem trägeradsorbierten
Reaktionsteilnehmers bis einschließlich der Messung der
Aktivität des sich im ergebenden unlösbar gemachten Produkt
enthaltenen Enzyme durchgeführt wurden und bei dem die . Chromatografie mit einer einzelnen Säule angewendet
wurde.
Nach dem Verfahren der Erfindung läßt sich eine Vielzahl Antigene oder Antikörper untersuchen oder analysieren,
indem man ein identisches Enzym oder einen unlöslichen Träger verwendet, wobei auch eine hohe Empfindlichkeit
und Genauigkeit ohne Beeinträchtigung durch unerwünschte störende Komponente erreicht werden kann, die in der biologischen
Flüssigkeit vorhanden sind und wogegen für dieses Verfahren keine beschwerlichen Arbeitsgänge erforderlich
sind. Insbesondere wird durch das erfindungsgemäße
Verfahren eine hochempflindliche Bestimmung der im Serum
vorhandenen Antikörper erreicht, was unter Verwendung des Bekannten als schwer durchführbar erachtet wurde.
Darüber hinaus ist neben dem Festphase-Enzymimmunanalyseverfahren ein weiteres Vorgehen bekannt, nach dem ein
immunologisches Reaktionsgemisch der immunologischen reaktiven Komponenten einem physikalisch-chemischen Verfahren,
wie der Gel-Permeations-Chromatografie, Affinitätschromatografie
oder dergleichen, ausgesetzt wird, um die freien markierten Antigene (oder Antikörper) abzutrennen
und dann die Aktivität des im Rest verbleibenden Enzyms zur Bestimmung der Konzentration der eingangs vorhandenen
Antigene oder Antikörper zu messen. Jedoch unterscheidet sich dieses bekannte Enzym-Immunanalyseverfahren
von dem erfindungsgemäßen Verfahren, weil im ersteren
sich die Chromatografie nicht auf immunologische Reaktionen, sondern auf physikalisch-chemische Reaktionen
richtet.
Hinzu kommt, daß das Verfahren, in dem die physikalischchemische
Chromatografie verwendet wird, gegenüber dem
erfindungsgemäßen Verfahren den Nachteil aufweist, daß .
die Arten der hier verwendeten Markierungsenzyme und Adsorptionsstoffe für den jeweiligen Fall besonders
sorgfältig gewählt werden müssen.
Die Erfindung wird anhand der nächstfolgenden Beschreibung
im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen
. Fig. 1 ein Fließdiagramm, aus dem die verschiedenen
Verfahrensweisen des immunologischen Reaktions
schrittes ( d. h. des Schrittes, der der Messung der Enzymaktivität vorangeht), den das erfindungsgemäße
Verfahren bedingt, hervorgehen,
Fig. 2 ein Diagramm, in dem die aus dem nachstehend zu beschreibenden Beispiel 1 erhältliche Eichkurve
eingezeichnet ist, und
Fig. 3 ein Diagramm, in dem die aus dem nachstehend zu beschreibenden Beispiel 5 erhältliche Eichkurve
dargestellt ist.
Der Verfahrensschritt der immunologischen Reaktion, d. h. der dem Meßschritt der Enzymaktivität vorausgehende
Schritt nach der Erfindung, kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Diesbezügliche Verfahrensweisen
werden nachstehend in bezug auf das Fließdiagramm der Fig. 1 näher erläutert. Hierbei ist jedoch zu beachten,
daß in der nachfolgenden Beschreibung auf die immunologisehen Reaktionsprodukte, die kein Markierungsenzym enthalten,
nicht näher eingegangen wird, weil ihr Vorhandensein auf die erfindungsgemäße Immunanalyse keinerlei Einfluß
hat. Wird eine kleinere oder größere Menge einer immunologischen reaktiven Komponente erwähnt, so bedeutet
dies eine gegenüber dem Reaktionsäquivalent zur gegebenen Menge der hiermit zu reagierenden immunologischen reaktiven
Komponente 'kleinere bzw. größere Menge.
Verfahrensweise (a):
Es wird eine vorbestimmte Menge eines markierten Antikörpers 2-4 mit einer kleineren Menge des Antigens 1
zur Reaktion gebracht, um einen immunologischen Komplex 1-2-4 bestehend aus dem markierten Antikörper 2-4 und
dem Antigen 1 zusammen mit einem ungebundenen freien Anteil 2-4 des markierten Antikörpers zu ergeben. Das
Reaktionsgemisch wird durch eine mit dem Träger 5 gefüllte Säule hindurch geleitet, auf dem eine größere
Menge des Antikörpers 2 adsorbiert ist, so daß ein unlöslich gemachtes Produkt gebildet wird, indem der markierte
Antikörper-Antigen-Komplex 1-2-4 mit dem antikörperhaltigen Träger 5-2 gebunden wird, während der
ungebundene markierte Antikörper 2-4 aus der Säule ausgeschieden wird.
Verfahrensweise (b) :
Im Gegensatz zur Verfahrensweise (a) wird hier eine vorbestimmte Menge eines markierten Antigens 1-4 mit einer
kleineren Menge eines Antikörpers 2 zur Reaktion gebracht, um einen markierten Antigen-Antikörper-Komplex 2-1-4 und
einen ungebundenen Anteil 1-4 des markierten Antigenszu ergeben. Das Reaktionsgemisch wird durch,eine mit dem
Träger 5 als Füllkörper gefüllte Säule hindurch geleitet, auf dem eine größere Menge eines Anti-Antikörpers oder
Proteins A 3 adsorbiert ist, so daß ein unlöslich gemachtes Produkt gebildet wird, indem der markierte Antigen-Antikörper
-Komplex 2-1-4 mit dem antiant!körperhaltigen
Träger oder dem das Protein enthaltenden Träger 5-3 gebunden wird, während das ungebundene markierte Antigen 1-4
aus der Säule ausgeschieden wird.
Verfahrensweise (c):
Hier wird vorgegangen wie bei (b), ausgenommen daß dem·
Reaktionssystem ein Antigen 1 in einer Menge zugeführt wird, die der des markierten Antigens 1-4 äquivalent ist bzw.
- y-
von ihr abweicht (was hiernach kurz als abweichende
Menge bezeichnet wird), wodurch die immunologische Reaktion zu einem markierten Antigen-Antikörper-Komplex 2-1-4
und einem ungebundenen freien Anteil 1-4 des markierten Antigens führt. Das Reaktionsgeraisch wird durch eine
mit dem Träger 5 gefüllte Säule geleitet, auf dem eine größere Menge eines Antiantikörpers oder Proteins A 3
adsorbiert ist. Somit entsteht durch Binden des Antigen-Antikörperkomplexes 2-1-4 mit dem Antiantikörper-auf-Träger
oder Protein A-auf-Träger 5-3 ein unlöslich gemachtes Produkt, wogegen das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus
der Säule ausgeschieden wird.
Verfahrensweise (d):
Es wird eine vorbestimmte Menge eines markierten Antigens 1-4 mit einer abweichenden Menge eines nicht markierten
Antigens 1 gemischt und dieses Gemisch durch eine mit einem Träger 5 gefüllte Säule hindurch geleitet, wobei
auf dem Träger eine kleinere Menge eines Antikörpers 2 adsorbiert ist. Somit entsteht durch Binden des markierten
Antigens 1-4 mit dem Antikörper-auf-Träger 5-2 ein unlösbar
gemachtes Produkt, wogegen das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus der Säule ausgeschieden wird.
Verfahrensweise (e):
Es wird eine vorbestimmte Menge eines Antigens 1 durch eine Säule geführt, die mit einem Träger gefüllt ist, auf
dem eine größere Menge eines Antikörpers 2 adsorbiert ist, wodurch der Antigen-Antikörper-auf-Träger 5-2-1 gebildet
wird. Hiernach wird eine größere Menge eines markierten Antikörpers 2-4 durch die Säule geführt, so daß durch
Binden des markierten Antikörpers 2-4 mit dem Antigenantikörper-auf-Träger
5-2-1 ein unlösbar gemachtes Produkt entsteht, während der ungebundene markierte Antikörper-2-4
aus der Säule ausgeschieden wird.
-/-4t-
Verfahrensweise (f):
Es wird eine vorbestimmte Menge eines Antikörpers 2 durch eine mit dem Träger 5 gefüllte Säule hindurchgeführt,
auf dem eine größere Menge eines Antiantikörpers oder Proteins A 3 adsorbiert ist, so daß der
Antikörper-Ant!antikörper oder Protein A-auf-Träger 5-2-3
gebildet wird. Hiernach wird eine größere Menge eines markierten Antigens 1-4 durch die Säule geführt, so daß
ein unlöslich gemachtes Produkt gebildet wird, indem das markierte Antigen 1-4 mit dem Antikörper-Antiantikörperauf-Träger
oder Antikörper-Protein A-auf-Träger 5-2-3 gebunden
wird, während das ungebundene markierte Antigen 1-4 aus der Säule ausgeschieden wird.
Darüber hinaus wird erfindungsgemäß nach Durchführung
des immunologischen Reaktionsschrittes obiger Beschreibung der Vorgang des Messens der Enzymaktivität vorgenommen.
Nach Beendigung der immunologischen Reaktion gemäß einer der obigen Verfahrensweisen (a) bis (f) wird die Säule mit einer Pufferlösung gewaschen und die Aktivität des in der Säule verbleibenden, im unlösbar gemachten Produkt enthaltenen markierten Enzyms 4 dadurch gemessen, daß eine ein Substrat für das Enzym enthaltende Lösung durch die Säule hindurchgeleitet wird.
Nach Beendigung der immunologischen Reaktion gemäß einer der obigen Verfahrensweisen (a) bis (f) wird die Säule mit einer Pufferlösung gewaschen und die Aktivität des in der Säule verbleibenden, im unlösbar gemachten Produkt enthaltenen markierten Enzyms 4 dadurch gemessen, daß eine ein Substrat für das Enzym enthaltende Lösung durch die Säule hindurchgeleitet wird.
Für den Normalfall gilt, daß die vorstehend dargelegten Verfahrensweisen vorher mit unterschiedlichen Mengen des
Antigens 1 oder Antikörpers 2 wiederholt und die gemessenen Werte somit gegen die Mengen des eingangs verwendeten
Antigens 1 oder Antikörpers 2 zur Erstellung der Eichknrve eingetragen werden. Hiernach werden dieselben
Verfahren wie oben durchgeführt, indem eine biologische. Flüssigkeit verwendet wird, die eine unbekannte Menge des
Antigens 1 oder Antikörpers 2 enthält. Dann wird die Kon-
zentration des Antigens 1 oder Antikörpers 2 in der Flüssigkeit aus dem gemessenen Wert in bezug auf die
Eichkurve berechnet.
Bei der Durchführung der Erfindung werden die immunologische
Reaktion, die Reaktion eines Antigens oder Antikörpers
mit einem Markierungsmaterial und die Adsorption eines Antikörpers, eines Antiantikörpers oder Protein A
auf einem unlöslichen Träger vorgenommen bei einer Temperatur im Bereich von 4° C bis etwa 40° C, was bei biochemischen
Reaktionen üblich ist. In den meisten Fällen beträgt die zur abschließenden Durchführung dieser Reak- ·
tionen benötigte Zeit 10 Minuten oder mehr.
Das Antigen 1, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
zu untersuchen ist, kann ein in verschiedenartigen biologischen Flüssigkeiten enthaltenes Hormon oder Protein
sein, wobei auf die Wirkweisen einiger Proteine nicht eingegangen wird. Als besondere Beispiele des Antigens
sind aufzuführen: Insulin, Trijodthyronin, Thyroxin, Kalzitonin, Alpha-Fetoprotein, S-100 Protein, Enolase,
Kalmodulin, sekretorisches Immunglobulin A und dergleichen. Hinzu kommt, daß die Blutpegel von von außen zugeführten
Arzneimitteln wie Antibiotika ebenfalls bestimmt werden können. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende
Antikörper 2 ist ein dem Antigen 1 entsprechender Antikörper. Die meisten dieser Antigene 1f Antikörper 2,
Antiantikörper 3 oder biologischen Flüssigkeiten, die diese enthalten, sind in gereinigter Form im Handel erhältlich;
auch in den nachstehend angeführten Beispielen der Erfindung wurden derartige handelsübliche Präparate
verwendet.
Besondere Beispiele des markierten Enzyms zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen ß-D-Galaktosidase,
alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxidase,
Malat-Dehydrogenase und dergleichen. Ein Enzym 4 dieser Art kann mittels herkömmlicher Verfahren mit einem
Antigen 1 oder einem Antikörper 2 verknüpft werden. Dies
läßt sich beispielshalber erreichen, indem ein difunktioneller Reaktionsteilnehmer als Verknüpfungsmittel wie
Glutaraldehyd, Karbodiimid, N, N-o-Phenylendimalimid,
m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysukzinimidester oder dergleichen
verwendet wird.
Charakteristische Beispiele eines in der Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verwendenden unlöslichen Trägers 5 umfassen Polysacharide wie Agarose,
Dextran, Zellulose usw., synthetische Harze wie PoIystyrol, Polyakrylamid usw. und Glasteilchen. Es ist bei
der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens von
Vorteil, wenn das trägeradsorbierte Reaktionsmittel,
bestehend aus einem auf dem unlöslichen Träger 5 adsorbierten Antikörper 2, Antiantikörper 3 oder Protein A 3r
feinkugelförmig oder feinfaserförmig ausgebildet ist, solange der.Durchsatz des immunologischen Reaktionsgemisches durch die Säule nicht übermäßig abfällt.
Die Adsorptionsreaktion eines Antikörpers 2, Antiantikörpers
3 oder Proteins A 3 auf einem unlöslichen Träger kann nach einer beliebigen herkömmlichen Verfahrensweise
vorgenommen werden. Beispielshalber läßt sie sich durchführen, indem ein unlösliches PoIysacharid mit einem
Aktivator wie Zyanogenbromid, Natriumperjodat, Epichlorhydrin,
1, 1'-Karbonyldiimidazol, p-Toluensulfonylchlorid
oder dergleichen verwendet und hierauf ein Antikörper oder dergleichen dem aktivierten Polysacharid. beigegeben wird.
Die Menge an Antikörper 2, Antiantikörper 3 oder Protein A für diesen Zweck liegt zweckmäßigerweise im Bereich von
0,1 bis 20 mg pro Milliliter unlöslichem Träger.
Im Verfahren nach der Erfindung kann der Antikörper 2, .
der Antiantikörper 3 oder das Protein A 3 ein aus diesen isoliertes sogenanntes aktives Fragment sein. Beim Antikörper
2 oder Antiantikörper 3 können beispielshalber die aktiven Fragmente durch Behandlung mit einer Protease
wie Papain, Pepsin oder dergleichen isoliert werden.
Angesichts der geringen Volumina der Proben, die gewohnlich zur Immunanalyse verfügbar sind, ist es im
Hinblick auf eine Vereinfachung des Verfahrensablaufs
und zur Erreichung angemessen kurzer Betriebszeiten vorteilhaft, daß das Fassungsvermögen der Säule bei der
Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung nicht höher liegt als 1 ml.
Darüber hinaus kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens jegliche Störung in der immunologischen
Reaktion durch von der Anmelderin bereits vorher vorgeschlagene Verfahrensweisen, d. h. durch Zuführung
eines wasserabstoßenden Proteins (z. B. Gelatin) zusammen mit einem Salz (ζ. B. Natriumchlorid) zum immunologi-.
sehen Reaktionssystem verhindert werden.
Nachstehend wird das Verfahren nach der Erfindung anhand von Beispielen gesondert dargelegt, wobei diese Beispiele
jedoch den Erfindungsgedanken nicht einschränken.
Beispiel 1 Untersuchung auf Insulin (nach den Verfahren der Ansprüche 2 und 6)
(1) Ansetzen eines Antikörpers und markierten Antikörpers
Ein handelsübliches Präparat Schweineinsulin aus den
Bauchspeicheldrüsen von Schweinen wurde als Antigen verwendet. Ein handelsübliches Serumpräparat, das Antikörper
- ι/- /O
enthält, die durch Injizieren des Antigens in Meerschweinchen erzeugt wurden, wurde mit herkömmlichen Verfahren
wie Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und DEAE-Zellulose-Chromatografie
behandelt, um aus ihm Antikörper zu isolieren. Diese Antikörper wurden durch die
Beimengung von Pepsin aufgespalten und dann der Säulenchromatografie
unter Verwendung der Sephadex G-150 ausgesetzt, wobei die aktiven Fragmente der Antikörper
isoliert wurden. Diese aktiven Fragmente wurden durch 2-Merkaptoäthylamxn auf herkömmliche Art reduziert und
dann mit N, N1-o-Phenylendimalimid zur Reaktion gebracht,
um es mit den reduzierten aktiven Fragmenten zu verknüpfen. Hiernach wurde das Reaktionsprodukt weiter mit einem harn
delsüblichen Präparat der ß-D-Galaktosidase reagiert, um die mit ß-D-Galaktosidase markierten aktiven Fragmente
(hiernach einfach als markierte Antikörper bezeichnet) darzustellen.
Das erwähnte Antigen (d. h. Schweineinsulin) und dessen entsprechender Antikörper haben allgemein die Fähigkeit,
mit anderen.Seruminsulinen (als Antigene), die aus einer großen Vielzahl von Tierarten (einschließlich des Menschen)
stammen können, und deren entsprechenden Antikörpern zu reagieren, so daß sie in der Analyse der Insuline (als
Antigene) oder deren in biologischen Flüssigkeiten enthaltenen entsprechenden Antikörpern .vieler Tierarten
(z. B. dem Menschen) genutzt werden können.
(2) Ansetzen eines Antikörper-auf-Trägers
30
Ein derartiger Träger wurde durch Adsorption des unter (1) gewonnenen Antikörpers auf einem nichtwasserlöslichen
Träger (CNBr-aktivierte Sepharose) auf herkömmliche Art
dargestellt.
(3) Erstellung einer Eichkurve
1 ml Anteilen einer Pufferlösung mit 100 jaU/ml mar*-
kierter Antikörper unter (1) wurden jeweils 0,1 ml wässriger Lösungen zugeführt, die kleinere Mengen
(d. h. 0 bis 320 juU/ml) des Antigens enthielten, und die
Gemische wurden bei 37° C zwei Stunden lang inkubiert, um einen markierten Antikörper-Antigen-Komplex zusammen
mit einem ungebundenen Anteil des markierten Antikörpers zu ergeben. In diesem und in anderen Beispielen bezeich*-
net "U" die Einheitsraenge eines bei standardisierten biologischen
Wertbestimmungen aufgenommenes Hormons. Hiernach wurde jedes Reaktionsgemisch durch die Säule geführt,
die mit einer größeren Menge- des unter (2) angesetzten Antikörper-auf-Trägers gefüllt ist, so daß das
unlöslich gemachte Produkt, durch Bindung des markierten Antikörper-An tigen-Komplexe s mit. dem antikörper ha It igen
Träger gebildet wird, während der ungebundene markierte Antikörper aus der Säule ausgeschieden wird. Nach dem
Waschen der Säule mit einer Pufferlösung wurde 0,1 ml einer wässrigen Lösung mit 10 mg/ml o-Nitrophenyl-ß-D-Galaktosid
(hiernach als o-NPG bezeichnet) in die Säule gegossen und dann bei 37° C zwei Stunden inkubiert, um
o-Nitrophenol zu erzeugen. Die Säule wurde mit 2 ml einer 0,1 M Na-COj-Lösung gewaschen und das Absorptions-»
vermögen bei 420 nm des Filtrats gemessen, um die Aktivität des darin,enthaltenen Enzyms zu bestimmen. Die
gemessenen Werte wurden gegen die Mengen des eingangs verwendeten Antigens eingetragen, um eine Eichkurve wie
in Fig. 2 (Verfahren von Anspruch 2) zu erstellen.
Andererseits wurde das obige Verfahren abgeändert, indem eine Reihe von Lösungen angesetzt wurden, die das Anti- ".
gen in gleichen Mengen wie vorher enthielten, und indem jede Lösung durch eine mit dem antikörperenthaltenden
Träger gefüllten Säule geleitet wurde. Nach dem Waschen
- ff
der Säule wurde die gleiche Menge des markierten Antikörpers durch sie hindurchgeleitet, wonach das
Absorptionsvermögen des Filtrats gemessen wurde. Auf diese Weise wurde eine der Fig. 2 sehr ähnliche Eichkurve
(Verfahren von Anspruch 6) gewonnen.
(4) Insulinbestimmung im menschlichen Serum
Es wurde eine Probe eines' menschlichen Serums unbekannter
(und hiernach stets derselben) Insulinkonzentration (jedoch im Bereich von 0-320 μϋ/ml nach der Definition
unter (3) ) als Antigen verwendet und dasselbe Verfahren wie unter (3) durchgeführt, 0,1 ml der Probe wurde mit
dem markierten Antikörper reagiert und das Reaktions-5 gemisch durch eine mit dem antikörperhaltigen Träger
gefüllte Säule hindurchgeführt. Nach dem Zugießen von o-NPG in die Säule und Inkubierung wurde die Absorptionsfähigkeit
des Säulenfiltrats gemessen. Bei der Berechnung aus dem gemessenen Wert in bezug auf die in Fig. 2 dargestellte
Eichkurve ergab sich eine Insulinkonzentration in der Probe von 92 μϋ/ml. Zum Vergleich wurde dieselbe
Probe in gleicher Weise einer herkömmlichen Festphase-^
Radioimmunanalyse (hiernach als RIA bezeichnet) unterzogen,
bei der ein Radioisotop als Markierungsmaterial verwendet wurde, so daß man bei der Schätzung der Insulfnkonzentration
in der Probe auf 1O2 uü/ml kam.
Die gleiche Probe wurde dagegen nach derselben Verfahrensweise wie im späteren Teil von (3) behandelt. Hierbei
ergab sich eine Insulinkonzentration in der Probe von 95 μϋ/ml. Zum Vergleich wurde dieselbe Probe in gleicher
Weise nach RIA untersucht, wobei die Insulinkonzentration in der Probe auf 1O5 uü/ml geschätzt wurde.
323551S
Beispiel 2 Untersuchung auf Antithyroxin-Antikörper
(nach den Verfahren der Ansprüche 2 und 7}
(1) Ansetzen eines markierten Antigens und eines Antikörper
s
Als Antigen wurde ein handelsübliches Thyroxinpräparat
verwendet, das aus einem Extrakt von Schweineschilddrüsen isoliert wurde. Die Aminogruppe dieses Antigens.wurde
mit der SH-Gruppe der ß-D-Glaktosidase auf herkömmliche Weise verknüpft, um ein markiertes Antigen zu bilden. Als
Antikörper wurde ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antikörper verwendet, der durch Injizieren des
Antigens in ein Kaninchen erzeugt wurde.
(2) Ansetzen eines antiantikörperhaltigen Trägers
Allgemein besitzt das Immunglobulin G (hiernach als IgG bezeichnet), das als Protein in den Seren von Tieren auftritt,
die Fähigkeit, mit Antigensubstanzen zu reagieren, die aus einer Vielzahl von Tierarten stammen können, und
somit auch die Eigenschaften eines ihnen entsprechenden Antikörpers. Demgemäß wurde IgG für die Darstellung eines
Ant!antikörpers weitgehend verwendet.
In diesem Beispiel wurde ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antiantikörper, das durch Injizieren des
Kaninchen-IgG in eine Ziege gewonnen wurde, in der gleichen Art und Weise wie unter (1) von Beispiel 1 zum Isolieren
des Antiantikörpers verwendet. Es wurde bei diesem isolierten
Antiantikörper das gleiche Verfahren wie unter (2) von Beispiel 1 zum Herstellen eines antiantikörperhaltigen
Trägers durchgeführt.
(3) Erstellung einer Eichkurve
0,5 ml Anteilen einer Verdünnung des nach (1) angesetzten
markierten Antigens wurden 3 μΐ Lösungen beigemengt, die kleinere Mengen des Antikörpers enthielten. Nach
Abschluß der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet, die mit einer größeren Menge des
nach (2) angesetzten antiantikörperhaltigen Trägers
gefüllt worden war. Hiernach wurde das· Verfahren nach (3) von Beispiel 1 zur Erstellung einer Eichkurve (Verfahren
von Anspruch 3) durchgeführt.
Das obige Verfahren wurde abgeändert, indem eine Reihe von Serumlösungen (je 0,5 ml) angesetzt wurden, die den
5 Antikörper in denselben Mengen wie vorher enthielten. Jede Lösung wurde dabei durch eine Säule geführt, die
mit dem antiantikörperhaltigen Träger gefüllt worden war.
Nach dem Waschen der Säule wurde dieselbe Menge des markierten Antigens durch sie hindurchgeführt, worauf dann
die Messung der Absorptionsfähigkeit der Säulenfiltrate
folgte. Auf.diese Weise wurde eine der vorstehend beschriebenen
sehr ähnlichen Eichkurve (Verfahren von Anspruch 7) erstellt.
(4) Bestimmung des im Kaninchenserum enthaltenen Antithyroxinantikörper s
Auf dieselbe Art und Weise wie unter (3) wurde eine Kaninchenserumprobe unbekannter Antithyroxinantikörperkonzentration
zum Messen der Absorptionsfähigkeit des
Filtrats behandelt. Nach der Berechnung aus dem Meßwert
in bezug zur nach (3) erstellten Eichkurve ergab sich eine Konzentration des Antithyroxinantikörpers in der Probe in
der Höhe von 1,05 U/ml. In ähnlicher Weise wurde die gleiche Probe wie im letzten Teil unter (3) beschrieben
behandelt, und es ergab sich eine Antithyroxinantikörperkonzentration von 110 U/ml.
Beispiel 3 Unter suchung auf Antiinsulin-Antikörper , (nach dem Verfahren von Anspruch 3)
(1) Ansetzen eines markierten Antigens 5
Es wurde ein handelsübliches Schweineinsulinpräparat
als Antigen verwendet. Hierbei befolgte man dasselbe Verfahren wie unter (1) von Beispiel 1 bei der Markierung
der ß-D-Glaktosidase am Antigen. Als Antikörper·wurde
sodann ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antikörper verwendet, der durch Injizieren des Antigens in
ein Meerschweinchen erzeugt wurde.
(2) Ansetzen eines ant!antikörperhaItigen Trägers
15
Ein handelsübliches Serumpräparat mit einem Antiantikörper
(d. h. Antikörper auf Meerschweinchen-IgG), der durch Injizieren von IgG des Meerschweinchens in ein
Kaninchen erzeugt wurde, wurde auf übliche Art und Weise behandelt, um daraus den Antiantikörper zu isolieren.
Dabei folgte man der Verfahrensweise nach (2) von Beispiel 2, um einen antiantikörperhaltigen Träger herzustellen.
(3) Erstellung einer Eichkurve
Den 1 ml Anteilen einer Pufferlösung mit markiertem Antigen nach der Darstellungsart gemäß (1) wurden eine
Reihe von Serumlösungen beigegeben, die kleinere Mengen Antikörper enthielten. Nach Beendigung der Reaktion
wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet, die mit einer größeren Menge des nach (2.) hergestellten
antiantikörperhaltigen Trägers gefüllt worden war.
_ 23.
Hiernach wurde die Säule gemäß der vorstehend unter (3) beschriebenen Verfahrensweise von Beispiel 2 behandelt,
um das Absorptionsvermögen des Säulenfiltrats zu messen. Die Meßwerte wurden gegen die eingangs zur Erstellung
einer Eichkurve verwendeten Antikörpermengen eingetragen.
(4) Bestimmung des im Meerschwexnchenserum enthaltenen Antiinsulin-Antikörpers
Nach demselben Verfahren wie unter (3) oben wurde eine Probe Meerschweinchenserum unbekannter Antiinsulinantikörperkonzentration
zum Messen des Absorptionsvermögens des Filtrats behandelt. Nach der Berechnung aus dem
Meßwert in bezug auf die Eichkurve nach (3) oben lag die Konzentration des AntiinsulinantikÖrpers in der Probe
bei 0,76 uU/ml.
Beispiel 4 Untersuchung auf Alpha-Fetoprotein
(nach dem Verfahren von Anspruch 2) 20
(1) Ansetzen eines markierten Antikörpers
Als Antigen wurde ein handelsübliches <*-Fetoproteinpräparat
verwendet, das aus einem menschlichen Serum isoliert wurde. Auf die übliche Art wurde zur Isolierung
des Antikörpers ein einen Antikörper enthaltendes handelsübliches Serumpräparat behandelt, der durch Injizieren
des Antigens in eine Ziege gewonnen wurde. Bei der Verwendung des Antikörpers wurde zum Herstellen
eines markierten Antikörpers das Verfahren nach (1) von Beispiel 1 befolgt.
(2) Herstellung eines antikörperhaltigen Trägers
Durch Verwenden von Toyopearl HW-55 (Handelsmarke) als
nichtlöslichen Träger wurde ein antikörperhaltiger Träger
auf die übliche Art und Weise geschaffen.
{3} Erstellung einer Eichkurve
Den 1 ml Anteilen einer den markierten Antikörper nach dem Darstellungsverfahren von {1} enthaltenden Lösung
wurden kleinere Mengen des Antigens hinzugegeben und nach Beendigung der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch
durch eine Säule geleitet, die mit einer größeren Menge des nach (2) hergestellten antikörperhaltigen
Trägers angefüllt worden war, wonach die Absorptionsfähigkeit des Säulenfiltrats gemessen wurde. Die Meßwerte
wurden gegen die eingangs zur Erstellung der Eichkurve verwendeten Antigenmengen eingetragen.
(4) Bestimmung des im menschlichen Serum enthaltenen oi -Pe toprote in s
Auf dieselbe Art wie (3) oben wurde eine Probe menschlichen Serums unbekannter Konzentration an ot -Fe to protein
zur Messung des Absorptionsvermögens des Säulenfiltrats behandelt. Nach der Berechnung aus dem Meßwert in bezug
auf die Eichkurve nach (3) oben lag die Konzentration an <* -Fe to pro te in in der Probe bei 151 ng/ml. Zum Vergleich
wurde dieselbe Probe in gleicher Weise dem RIA-Verfahren
ausgesetzt, so daß die Schätzung der °*-Fetoproteinkonzentration
in der Probe einen Betrag von 192 ng/ml ergab".
Beispiel 5 Untersuchung auf Kalzitonin
(nach dem Verfahren von Anspruch 4)
(1) Ansetzen eines Antikörpers
Ein aus einem Extrakt von Schweineschilddrüsen isoliertes handelsübliches Kalzitoninpräparat wurde als Antigen ver-.
wendet. Auf dieselbe Art wie unter (1} von Beispiel 1 wurde ein handelsübliches Serumpräparat behandelt, das den
durch Injizieren des Antigens in ein Kaninchen geschaf-.
fenen Antikröper enthielt, um den Antikörper daraus zu isolieren.
(2) Ansetzen eines markierten Antigens und Herstellung
eines antiantikörperhaltigen Trägers
Die Verfahrensweise nach (1) von Beispiel 2 wurde zur
Darstellung eines markierten Antigens befolgt. Dabei wurde ein antiantikörperhaltiger Träger durch Befolgen
desselben Verfahrens von (2) von Beispiel 2 geschaffen.
(3) Darstellung von Antigenlösungen mit unterschiedlichen · Konzentrationen.
Eine wässrige Lösung des Antigens wurde verdünnt, um
eine Reihe von O bis 150 MRC mU/ml des Antigens enthaltenden
Antigenlösungen herzustellen (wobei 11MRC U" die
Einheitsmenge an Kaizitonin in der standardisierten biologischen
Wertbestimmung bezeichnet).
(4) Erstellung einer Eichkurve
0,5 ml jeder kleinere Mengen des Antikörpers von (1) enthaltenden Lösung sowie 0,1 ml jeder nach (3) hergestellten
Antigenlösung wurden den 0,1 ml-Anteilen einer Lösung zugeführt, die das nach (2) dargestellte markierte
Antigen enthielt. Nach Abschluß der Reaktion wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine Säule geleitet. Hiernach wurde
die Säule nach demselben Verfahren wie unter (3) von Beispiel 2 zur Messung des Absorptionsvermögens des Piltrags
behandelt. Die Meßwerte wurden gegen die·Mengen des Antigens eingetragen, das eingangs zur Erstellung der
in Fig. 3 gezeigten Eichkurve verwendet wurde.
(5) Bestimmung des im Schweineschilddrüsenextrakt
enthaltenen Kalzitonins
Eine Probe eines Schweineschilddrüsenextraktes unbekannter Kalzitoninkonzentration wurde nach (3) oben zum
Messen des Absorptionsvermögens des Filtrats behandelt. Die Berechnung des Meßwertes in bezug auf die Eichkurve
der Fig. 3 ergab eine Kalzitoninkonzentration in der Probe von 75 MRC mü/ml.
10
10
Beispiel 6 Untersuchung auf Thyroxin
(nach dem Verfahren von Anspruch 5)
(1) Ansetzen eines markierten Antigens und eines
Antikörpers
Als Antigen wurde ein handelsübliches Thyroxinpräparat
verwendet, das aus einem Extrakt von Schweineschilddrüsen isoliert worden war. Nach dem Verfahren (1) von Beispiel
2 wurde ein markiertes Antigen erstellt. Dabei wurde ein handelsübliches Serumpräparat, das einen dem Antigen entsprechenden
Antikörper enthielt, nach (1) von Beispiel 1 behandelt, um daraus den Antikörper zu isolieren.
(2) Ansetzen eines antikörperhaltigen Trägers
Hierbei wurde das Verfahren (2) von Beispiel 1 befolgt, um den antikörperhaltigen Träger herzustellen.
(3) Darstellung der Antigenlösungen mit unterschiedlicher Konzentration
Es wurde eine wässrige Lösung des Antigens zur Herstellung
einer Reihe von Antigenlösungen unterschiedlicher Konzentration
verdünnt.
(4) Erstellung einer Eichkurve
Es wurden den 1 ml-Anteilen einer Lösung, die das nach
(1) angesetzte markierte Antigen enthielt, Antigenlösungen nach (3) zugeführt. Jedes sich ergebende Gemisch wurde
durch eine Säule geführt, die von einer kleineren Menge des antikörperhaltigen Trägers gefüllt war, wobei die
Säule nach dem Verfahren von Beispiel 1 zum Messen der Absorptionsfähigkeit des Säulenfiltrats behandelt wurde.
Die gemessenen Werte wurden gegen die Mengen des Antigens eingetragen, das eingangs zur Erstellung der Eichkurve
benutzt wurde.
(5) Bestimmung des im Schweineschilddrüsenextrakt enthaltenen Thyroxins
Eine Schweinethyroidextraktprobe mit unbekannter Thyroxinkonzentration
wurde nach (3) oben behandelt, um das Absorptionsvermögen des Säulenfiltrats zu messen. Aus dem
Meßwert in bezug auf die nach (4) oben erstellte Eichkurve wurde eine Thyroxinkonzentration in der Probe von
10,5 μg/dl errechnet. Nach der zum Vergleich angezogenen
und in gleicher Weise durchgeführten RIA-Methode ergab
sich für die Thyroxinkonzentration ein Schätzwert von 11,0 Mg/dl.
Leerseite
Claims (16)
- PAT E NTANWALTS BU R OPATENTANWÄLTE DIPL-INQ. W. MEISSNER (1980) DIPL-INQ. P. E. MEISSNER DIPL-ING. H.-J. PRESTINQZuQelasiene Vertreter vor dem Europäischen Patentamt -Professional Representative« before the European Patent OfficeKh ZeK)Wn Ihr Schreiben vom Unsere Zeichen HERBERTSTR. 22, 1000 BERLIN 33M-mh 23.9.1982 AMA-276Amano Pharmaceutical Company, Limited 2-7, Nishiki 1-chome,
Naka-ku, Nagoya-shi,
Aichi 460, JapanVerfahren der Festphase-EnzymimmunanalysePatentansprücheVerfahren der Festphase-Enzymimmunanalyse , bestehend aus den Schritten (a) immunologischen Reaktion von zumindest einer immunologischen Reaktivkomponente(n) gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper, einem markierten Antigen und einem markierten Antikörper oder eines immunologischen Komplextes daraus mit einem von einem Träger adsorbierten Reaktionsteilnehmers aus der Gruppe bestehend aus einem antikörperhaltigen Träger, einem antiantikörperhaltigen Träger und einem Protein A enthaltenden Träger einfach oder zweifach zur Gewinnung eines unlöslich gemachten Produktes gebildet durch Bindung des markierten AntigensTELEX TELEGfIAMM TELEFONi BANKKONTO POSTSCHECiO(ONTO: 1-8564« INVENTION BERUN BtRUNERBAHKAQ. P. MBSSNEH. BLN-W invent! BERLIN 030/9816037 BERLM 31 404737-103 (oder markierten Antikörpers) oder dessen immunologi- . sehen Komplexes mit dem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer zusammen mit einem ungebundenen löslichen, Anteil des markierten Antigens (oder markierten Antikörpers); (bj Abtrennung daraus des ungebundenen markierten Antigens (oder markierten Antikörpers); (c) Messung der Aktivität des im unlöslich gemachten Produkt enthaltenen Enzyms; (d) Erstellung einer die Beziehung zwischen eingangs vorhandener Antigenmenge und der damit verbundenen Enzymaktivität darstellenden Eichkurve durch Wiederholen der Schritte (a) bis (c); (e) Durchführung dersehlben Verfahrensweisen wie oben mit einer unbekannten Menge Antigen (oder Antikörper) enthaltenden biologischen Flüssigkeit zur Messung der im sich ergebenden unlöslich gemachten Produkt auftretenden Enzymaktivität;' und (f) Berechnung der Menge (Konzentration) des in der biologischen Flüssigkeit vorhandenen Antigens (oder Antikörpers) in bezug zur Eichkurve, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Schritte ausgehend von dem der immunologischen Reaktion der immunologischen Reaktivkomponente(n) oder eines daraus gebildeten immunologischen Komplexes mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer Ca) bis einschließlich dem Schritt der Messung der im sich ergebenden unlöslich gemachten Produkt auftretenden Enzymaktivität bei Anwendung der biologischen Flüssigkeit nach (e) durchgeführt werden, indem die Chromatografie mit einer einzelnen Säule angewendet wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Komplex (1-2-4) durch Reagieren einer vorher festgelegten Menge eines markierten Antikörpers (2-4) mit einer kleineren Menge eines Antigens (1) dargestellt wird, wobei der trägeradsorbier teReaktionsteilnehmer aus einer größeren Menge eines Antikörpers (2) besteht, der auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologische Komplex (2-1-4) dargestellt wird durch Reagieren einer vorher festgelegten Menge eines markierten Antigens (1-4) mit einer kleineren Menge eines Antikörpers (2), wobei der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer aus einer größeren Menge eines Antiantikörpers oder Protein A (3) besteht, der bzw. das auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet,daß der immunologische Komplex (2-1-4) dargestellt wird durch Reagieren einer vorher festgelegten Menge eines markierten Antigens (1-4) mit einer kleineren Menge eines Antikörpers (2) sowie einer abweichenden Menge eines Antigens (1), wobei der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer aus einer größeren Menge eines Antiantikörpers oder Protein A (3) besteht, der bzw. das auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet,daß als immunologische Reaktivkomponenten eine vorher bestimmte Menge eines markierten Antigens (1-4) und eine unterschiedliche Menge eines Antigens (1) verwendet werden, wobei der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer aus einem Antikörper (2) besteht, der auf einem Träger(5) adsorbiert ist.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologische Reaktivkomponenten eine vorher bestimmte Menge eines Antigens (1) und eine größere Mengeeines markierten Antikörpers (2-4) verwendet werden und daß diese immunologischen Reaktivkomponenten nacheinander durch eine Säule geführt werden, die mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer gefüllt ist, der aus einer größeren Menge eines auf einem Träger adsorbierten Antikörpers (2) besteht.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologischen Reaktivkomponenten eine vorher bestimmte Menge eines Antikörpers (2) und eine größere Menge eines markierten Antigens (1-4) verwendet werden und daß diese immunologischen Reaktivkomponenten nacheinander durch eine Säule geführt werden, die mit einem trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer gefüllt ist, der aus einer größeren Menge eines Antiantikörpers oder Protein A (3) besteht, der bzw« das auf einem Träger (5) adsorbiert ist.
- 8. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen (1 ), das eine der immunologischen Reaktivkomponenten darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der Insulin, Trijodthyronin, Thyroxin, Kalzitoninöl-Fetoprotein, S-100 Protein, Enolase, Kalmodulin und sekretorisches Immunglobulin A zu rechnen ist. 25
- 9. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, dadurch gekennzeichnet, daß der den trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer darstellenden unlöslichen Träger (5) gewählt wird aus einer Gruppe, zu der Agarose, Dextran, Zellulose, PoIystyrol, Polyacrylamid und Glasteilchen zu rechnen ist.
- 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der den trägeradsorbierten Reaktionsteilnehmer darstellenden unlöslichen Träger (5) gewählt wird aus einer Gruppe, zu der Agarose, Dextran, Zellulose, Polystyrol, Polyakrylamid und Glasteilchen zu rechnen ist.
- 11. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, dadurch gekennzeich-· net, daß das markierende Enzym (4), das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der ß-D-Glaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenase zu rechnen ist.
- 12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das markierende Enzym (4), das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der ß-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenase zu rechnen ist.
- 13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das markierende Enzym (4)", das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird aus der Gruppe, zu der ß-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenäse zu rechnen ist.
- 14. Verfahren nach Anspruch 1O, dadurch gekennzeichnet, daß das markierende Enzym (4), das das markierte Antigen oder den markierten Antikörper darstellt, gewählt wird ^ aus der Gruppe, zu der ß-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glukose-Oxydase und Malat-Dehydrogenase zu rechnen ist.
- 15. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der trägeradsorbierte Reaktionsteilnehmer feinkugelig oder feinfaserig ausgebildet ist, solange der Durchsatz des immunologischen Reaktionsgemisches durch die Säule nicht übermäßig abfällt.
- 16. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Fassungsvermögen der in der Chromatografie des erstehenden Verfahrens verwendeten Säule nicht größer ist als 1 ml.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15681281A JPS5856696A (ja) | 1981-09-30 | 1981-09-30 | カラムを用いる酵素免疫測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3235516A1 true DE3235516A1 (de) | 1983-04-21 |
Family
ID=15635861
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19823235516 Ceased DE3235516A1 (de) | 1981-09-30 | 1982-09-22 | Verfahren der festphase-enzymimmunanalyse |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5856696A (de) |
CA (1) | CA1215322A (de) |
DE (1) | DE3235516A1 (de) |
FR (1) | FR2519764B1 (de) |
GB (1) | GB2109931B (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0177191A1 (de) * | 1984-09-05 | 1986-04-09 | Serono Diagnostics Partners (A Massachusetts Limited Partnership) | Testverfahren |
WO1992002818A1 (en) * | 1990-08-10 | 1992-02-20 | Purdue Research Foundation | Matrix sequential addition immunoassay |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL73577A (en) * | 1983-12-12 | 1989-10-31 | Miles Lab | Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid |
JPS60162956A (ja) * | 1984-02-04 | 1985-08-24 | Olympus Optical Co Ltd | 免疫学的自動分析方法 |
EP0455735B1 (de) * | 1989-01-30 | 1994-09-14 | Epitope, Inc. | Avidin-biotin assistiertes immunassayverfahren |
GB2270976A (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-30 | Marconi Gec Ltd | Immunoassay/separation process using an auxiliary species on a support |
GB9511586D0 (en) * | 1995-06-08 | 1995-08-02 | Tepnel Medical Ltd | Immunological determinations |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2448411A1 (de) * | 1973-10-11 | 1975-05-22 | Miles Lab | Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von substanzen mit einer gegenseitigen spezifischen bindungsaffinitaet |
DE2744836A1 (de) * | 1976-10-07 | 1978-04-13 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunchemisches messverfahren |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE387746B (sv) * | 1974-05-29 | 1976-09-13 | Pharmacia Diagnostics Ab | Forfarande for visuellt pavisande av antikroppar i ett vattenhaltigt prov |
US4098876A (en) * | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
US4318980A (en) * | 1978-04-10 | 1982-03-09 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label |
US4200625A (en) * | 1978-07-12 | 1980-04-29 | Becton, Dickinson And Company | Immobilized binder for automated assay |
DE2930706A1 (de) * | 1979-07-28 | 1981-02-05 | Medac Klinische Spezialpraep | Verfahren zum nachweis von erregerspezifischen antikoerpern |
JPS5767860A (en) * | 1980-10-15 | 1982-04-24 | Fuji Photo Film Co Ltd | Material for multilayer analysis |
-
1981
- 1981-09-30 JP JP15681281A patent/JPS5856696A/ja active Pending
-
1982
- 1982-09-22 DE DE19823235516 patent/DE3235516A1/de not_active Ceased
- 1982-09-24 GB GB08227285A patent/GB2109931B/en not_active Expired
- 1982-09-24 FR FR8216134A patent/FR2519764B1/fr not_active Expired
- 1982-09-29 CA CA000412425A patent/CA1215322A/en not_active Expired
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2448411A1 (de) * | 1973-10-11 | 1975-05-22 | Miles Lab | Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von substanzen mit einer gegenseitigen spezifischen bindungsaffinitaet |
DE2744836A1 (de) * | 1976-10-07 | 1978-04-13 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunchemisches messverfahren |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Clinica Chimica Acta, Vol. 120, 1980, S. 261-265 * |
Clinical Chemistry, Vol. 22, No. 8, 1976, S. 1243-1255 * |
FEBS Letters, Vol. 99, Nr. 1, March 1979, S. 172-174 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0177191A1 (de) * | 1984-09-05 | 1986-04-09 | Serono Diagnostics Partners (A Massachusetts Limited Partnership) | Testverfahren |
WO1992002818A1 (en) * | 1990-08-10 | 1992-02-20 | Purdue Research Foundation | Matrix sequential addition immunoassay |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2519764B1 (fr) | 1987-06-19 |
FR2519764A1 (fr) | 1983-07-18 |
JPS5856696A (ja) | 1983-04-04 |
GB2109931B (en) | 1985-03-06 |
CA1215322A (en) | 1986-12-16 |
GB2109931A (en) | 1983-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE68920693T2 (de) | Gefriergetrocknete Zusammensetzung, die ein mit Meerrettichperoxydase markiertes Fab'-Fragment eines gegen menschliches Beta-Interferon gerichteten Antikörpers und Trehalose enthält; EIA Kit, der diese Zusammensetzung enthält. | |
DE2743444C3 (de) | Immunchemisches Meßverfahren und Reagens zu seiner Durchführung | |
DE3586254T2 (de) | Testverfahren. | |
DE3205849C2 (de) | Reagens zur immunologischen Bestimmung | |
DE2902676C2 (de) | Verfahren zur Analyse eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens im Serum mittels eines Immunoassays | |
DE3854194T2 (de) | Monoklonale antikörper gegen glykosyliertes albumin, hybride zellinien, die diese antikörper produzieren, sowie deren verwendung. | |
EP0098590B1 (de) | Immunchemisches Messverfahren | |
DE2206103A1 (de) | Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen einer Komponente der Reaktion zwischen spezifisch bindenden Proteinen und den Substanzen, die von diesen Proteinen spezifisch gebunden werden | |
DE2811537A1 (de) | Empfindlicher quantitativer assay | |
DE2164768B2 (de) | Verfahren zum nachweis und zur bestimmung einer komponente der reaktion zwischen spezifischen bindeproteinen und bindefaehigen substanzen | |
CH617774A5 (de) | ||
DE19524572A1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Kalibrators für den Einsatz in Immunoassays, bestehend aus den Analyten oder Teilsequenzen davon, die an inerten Trägermoleküle konjugiert sind | |
DE2461811A1 (de) | Immunologisches bestimmungsverfahren | |
EP0780687B1 (de) | Verwendung einer synthetischen Kalibrator für Sandwich-Immunoassays | |
DE3586951T2 (de) | Festphasendiffusionstextverfahren. | |
DE3433652A1 (de) | Immunchemisches messverfahren fuer haptene und proteine | |
DE3205301C2 (de) | ||
DE69427122T2 (de) | Kompetitiver immunotest unter verwendung eines bindenden proteins in multiklonaler antikoerperstruktur | |
DE2917658A1 (de) | Reagens zur pruefung auf das hb tief s a tief g -antigen, sowie verfahren zu seiner herstellung | |
EP0087728B1 (de) | Immunologisches Latex-Agglutinationsverfahren | |
DE3050311C2 (de) | Verfahren zur herstellung fester Tr{ger f}r Prote ine zu analytischen Zwecken | |
EP0943098A1 (de) | Rezeptorbindungsassay zum nachweis von tsh-rezeptor-autoantikörpern | |
DE2900546B2 (de) | Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Referenzstandard und Verwendung der standardisierten markierten Bindungskomponente in spezifischen Bindungstest-Verfahren | |
DE3235516A1 (de) | Verfahren der festphase-enzymimmunanalyse | |
DE2754350A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von antikoerpern, antigenen oder komplexen aus antikoerpern und antigenen in fluessigkeiten |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8131 | Rejection |