FR2519764A1 - Procede d'immunodetermination d'enzymes en phase solide par application de chromatographie a une seule colonne - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST CARACTERISEE EN CE QUE, DANS L'IMMUNODETERMINATION (OU IMMUNODOSAGE) D'ENZYMES CLASSIQUE EN PHASE SOLIDE, TOUTES LES ETAPES ALLANT DE L'ETAPE DE REACTION IMMUNOLOGIQUE DU OU DES COMPOSANTS A REACTION IMMUNOLOGIQUE, OU D'UN COMPLEXE IMMUNOLOGIQUE DE CES PRODUITS, AVEC UN PRODUIT REAGISSANT ADSORBE SUR UN SUPPORT, JUSQU'A L'ETAPE DE MESURE D'ACTIVITE DE L'ENZYME CONTENUE DANS LE PRODUIT INSOLUBILISE RESULTANT, SONT REALISEES PAR APPLICATION DE CHROMATOGRAPHIE A UNE SEULE COLONNE. LE PROCEDE DE LA PRESENTE INVENTION A DES AVANTAGES TELS QU'UN GRAND NOMBRE D'ANTIGENES OU D'ANTICORPS PEUVENT ETRE DETERMINES EN UTILISANT UNE ENZYME IDENTIQUE OU UN SUPPORT INSOLUBLE IDENTIQUE, CETTE GRANDE SENSIBILITE ET CETTE GRANDE PRECISION POUVANT ETRE OBTENUES SANS OPERATIONS DIFFICILES POUR LE PROCEDE.

Description

1. La présente invention se rapporte à un nouveau

procédé d'immunodétermination (ou immunodosage) pour la dé-

termination de quantités de substances infinitésimales

présentes dans les fluides de l'organisme (ou fluides bio-

logiques),tels que le sérum et le fluide cérébrospinal, de mammifères. Le terme "immunodétermination", tel qu'utilisé ici, se réfère à un procéd dans lequel la réaction d'une substance antigène de manière immunologique (de manière sérologique) (un produit dit antigène) avec un produit dit anticorps, qui lui correspond du point de vue immunologique, est appliquée à la détermination de la quantité ou de la concentration d'antigène ou d'anticorps présent dans le fluide.

Classiquement, divers procédés, tels que la bio-

détermination ou des procédés de mesure d'activité d'enzy-

mes, ont été disponibles pour la détermination de quantités de substances infinitésimales présentes dans les fluides

biologiques Cependant, ces procédés ne sont pas satisfai-

sants par suite de leur fonctionnement ennuyeux et de leur

sensibilité ou de leur précision inadéquates Par opposi-

tion, la technique d'immunodétermination, qui a été récem-

ment mise au point, peut fournir une sensibilité et une pré-

cision nettement élevées sans exiger d'opérations diffici-

2,

les En conséquence, cette technique est maintenant emplo-

yee dans les domaines de la biochimie et de la médecine clinique.

Divers genres de procédés d'immunodétermina-

tion (ou d'immunodosage) ont été proposés, parmi lesquels les procédés utilisant un antigène ou un anticorps combiné (ou marqué) avec un radioisotope,ure matière fluorescente ou une enzyme ont trouvé une large application De manière plus spécifique, les modes dits en phase solide dans ces procédés d'immunodétermination en utilisant les matières de

marquage ont été considéré comme étant les plus avanta-

geux. Dans le procédé d'immunodétermination en phase solide, le produit réagissant dit adsorbé sur un support est utilisé comme matière de réaction, qui a été préparée

en adsorbant, dans des conditions réactionnelles spécifi-

ques, un anticorps, un produit dit antianticorps (c'est-à-

dire un anticorps produit en utilisant un anticorps comme antigène), ou un produit dit protéine A (c'est-à-dire une protéine spéciale produite par certains microorganismes et ayant l'aptitude à réagir avec divers anticorps) sur un

support insoluble dans l'eau,tel que des morceaux de poly-

styrène ou de silicone,des polysaccharides insolubles dans

l'eau etc pour insolubiliser le premier produit, ces pro-

duits réagissants adsorbés sur un support dans des cas

particuliers étant désignés ci-après sous le nom d'anti-

corps sur un support,d'antianticorps sur un support, ou de

protéine A sur un support, respectivement.

On explique maintenant ci-dessous le principe général du procédé d'immunodétermination (ou immunodosage) en phase solide en utilisant une enzyme comme matière de

marquage, avant de procéder à la description de la présente

invention.

Au moins un membre choisi dans le groupe se com-

posant d'un antigène, d'un anticorps, d'un antigène marqué

et d'un anticorps marqué (ces produits sont désignés gêné-

ralement ci-après sous le nom de composants à réaction immu-

nologique), ou un complexe immunologique de ces produits, 3, est mis à réagir de manière immunologique avec un produit réagissant adsorbé sur un support,choisi dans le groupe se composant d'un anticorps sur un support, d'un antianticorps sur un support et d'une protéine A sur un support, en une seule fois ou en deux fois, pour fournir ainsi un produit insolubilisé formé par la liaison de l'antigène marqué (ou de l'anticorps marqué) ou de son complexe immunologique sur le produit réagissant adsorbé sur le support,avec une

partie soluble non liée de l'antigène marqué (ou de l'an-

ticorps marqué) Après que l'antigène marqué non lié (ou l'anticorps marqué) a été séparé du produit insolubilisé,

l'activité de l'enzyme contenue dans le produit insolubili-

sé (particulièrement la capacité d'adsorption du mélange

réactionnel de l'enzyme avec son substrat) est mesurée.

Typiquement, les mêmes modes opératoires que ci-dessus sont

répétés avec diverses quantités de l'antigène (ou de l'an-

ticorps) et, en utilisant les valeurs mesurées, on cons-

truit une courbe de calibrage qui représente la relation entre la quantité d'antigène (ou d'anticorps) initialement

utilisée et l'activité de l'enzyme qui y est fixée Ensui-

te, on réalise les mêmes modes opératoires avec un fluide biologique contenant une quantité inconnue de l'antigène (ou de l'anticorps) pour mesurer l'activité de l'enzyme contenue dans le produit résultant insolubilisé Ensuite, on calcule la quantité ou la concentration de l'antigène (ou

de l'anticorps) présent dans le fluide à partir de la va-

leur mesurée, en se référant à la courbe de calibrage.

Alors que le procédé d'immunodétermination d'enzymes en phase solide, comme indiqué ci-dessus, a une

sensibilité et une précision élevées, de manière avantageu-

se, il présente l'inconvénient d'exiger des opérations en-

nuyeuses. La demanderesse a réalisé des études sur le

procédé d'immunodétermination (ou d'immunodosage) d'enzy-

mes classique en phase solide et a inventé une technique très efficace, en conduisant toutes les étapes, a partir

de l'étape de la réaction immunologique du ou des compo-

sants à réaction immunologique ou d'un complexe immunolo-

gique de ces produits avec un produit réagissant adsorbé 4, sur un support jusqu'à l'étape de mesure de l'activité de l'enzyme contenue dans le produit insolubilisé résultant,

en appliquant la chromatographie avec une seule colonne.

Selon le procédé de la présente invention, on peut déterminer un grand nombre d'antigènes ou d'anticorps en utilisant une enzyme identique ou un support insoluble

identique et une sensibilité et une précision élevées peu-

vent être obtenues sans être affectées par les composants

interférants indésirables présents dans le fluide biologi-

que, alors qu'aucune opération difficile n'est exigée pour

le procédé En particulier, le procédé de la présente inven-

tion permet la détermination fortement sensible d'anticorps dans du sérum, ce qui a été considéré comme difficile

dans la technique antérieure.

En outre,en plus du procédé d'immunodétermina-

tion d'enzymes en phase solide,on connaît jusqu'à présent une autre technique d'immunodétermination d'enzymes, dans laquelle un mélange réactionnel immunologique de composants à réaction immunologique est soumis à un mode opératoire physico-chimique, tel que la chromatographie & perméatiop sur

gel, la chromatographie à affinité ou analogues, pour sépa-

rer l'antigène marqué (ou l'anticorps marqué) libre,suivi de la mesure de l'activité de l'enzyme contenue dans le restant pour déterminer la concentration de l'antigène ou de

l'anticorps initialement présent Cependant,le procédé con-

nu d'immunodétermination (ou d'immunodosage) d'enzymes com-

me ci-dessus, diffère par sa conception technique du procé-

dé de la présente invention, parce que la chromatographie du

premier procédé s'applique non pas à la réaction immunologi-

que mais à une réaction physico-chimique En outre, le pro-

cédé utilisant la chromatographie physico-chimique a,par op-

position avec le procédé de la présente invention, des in-

convénients du fait que les genres d'enzymes de marquage et de matériaux d'adsorption pour l'utilisation doivent

être soigneusement choisis dans des cas particuliers.

La présente invention sera maintenant décrite en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels: La figure 1 est un tableau de marche schématique ' illustrant divers modes de fonctionnement de l'étape de réaction immunologique (c'est-à-dire l'étape précédant l'étape de mesure d'activité d'enzyme) impliquée dans le procédé de la présente invention; La figure 2 est un graphique illustrant la courbe

de calibrage obtenue dans l'exemple 1 qui sera donné ulté-

rieurement; et La figure 3 est un graphique illustrant la courbe de calibrage obtenue dans l'exemple 5 qui sera également

donné ultérieurement.

Tout d'abord, l'étape de réaction immunologique, c'est-à-dire l'étape précédant l'étape de mesure d'activité

d'enzyme, impliquée dans le procédé de la présente inven-

tion,peut être réalisée suivant divers modes de fonctionne-

ment Ces modes de fonctionnement sont expliqués ci-dessous en se référant au tableau de marche schématique représenté sur la figure 1 On doit, cependant,comprendre que, dans

la description suivante, on ne mentionne pas les produits

de la réaction immunologique ne contenant pas d'enzyme de marquage parce que leur présence n'exerce pas d'influence

sur l'immunodétermination selon la présente invention.

Lorsque l'on mentionne une quantité plus ou moins grande d'un composant à réaction immunologique, cela signifie une

quantité respectivement plus ou moins grande que l'équi-

valent réactionnel par rapport à la quantité donnée du com-

posant à réaction immunologique à faire réagir.

Mode (a): une quantité prédéterminée d'un anti-

corps marqué 2-4 est mise à réagir avec une plus petite

quantité d'un antigène 1 pour fournir un complexe immuno-

logique 1-2-4 se composant de l'anticorps marqué 2-4 et de

l'antigène 1, avec une partie libre non liée 2-4 de l'anti-

corps marqué On fait passer le mélange réactionnel à tra-

vers une colonne garnie d'un support 5 ayant une plus gran-

de quantité de l'anticorps 2 adsorbé dessus, et, de ce fait,

un produit insolubilisé formé par liaison du complexe anti-

corps marqué-antigène 1-2-4 sur l'anticorps sur le support -2 est produit, alors que l'anticorps marqué non lié 2-4 est évacué de la colonne, 6.

Mode (b): Contrairement au mode (a), on fait réa-

gir une quantité prédéterminée d'un antigène marqué 1-4 avec une plus petite quantité d'un anticorps 2 pour fournir * un complexe antigène marqué-anticorps 2-1-4 et une partie non liée 1-4 de l'antigène marqué On fait passer le mélan- ge réactionnel à travers une colonne garnie d'un support ayant une plus grande quantité d'un antianticorps ou

d'une protéine A 3 adsorbée dessus, et de ce fait, un pro-

duit insolubilisé formé par liaison du complexe antigène marqué-anticorps 2-1-4 sur l'antianticorps sur le support ou la protéine A sur le support 5-3 est produit, alors que

l'antigène marqué non lié 1-4 est évacué de la colonne.

Mode (c): Ce mode est le même que le mode (b) ci-dessus, sauf que l'antigène 1 est ajouté au système réactionnel en quantité équivalente à ou différente de celle de l'antigène marqué 1-4 (ci-après désignée brièvement par

"quantité différente"), et, de ce fait, la réaction immuno-

logique est effectuée pour fournir un complexe antigène marqué-anticorps 2-1-4 et une partie libre non liée 1-4 de l'antigène marqué On fait passer le mélange réactionnel à travers une colonne garnie d'un support 5 ayant une plus grande quantité d'un antianticorps ou d'une protéine A-3 adsorbée dessus Ainsi, un produit insolubilisé formé par

liaison du complexe antigène marqué-anticorps 2-1-4 sur l'an-

tianticorps sur le support ou la protéine A sur le support -3 est produit, alors que l'antigène marqué non lié 1-4

est évacué de la colonne.

Mode (d): Une quantité prédéterminée d'un anti-

gène marqué 1-4 est mélangée avec une quantité différente d'un antigène non marqué 1 et on fait passer le mélange à travers une colonne garnie d'un support 5 ayant une plus petite quantité d'un anticorps 2 adsorbée dessus Ainsi, un produit insolubilisé formé par liaison de l'antigène marqué 1-4 sur l'anticorps sur le support 5-2 est produit, alors

que l'antigène marqué non lié 1-4 est évacué de la colonne.

Mode (e): Une quantité prédéterminée d'un anti-

gène 1 est envoyée à travers une colonne garnie d'un sup-e

port 5 ayant une plus grande quantité d'un anticorps 2 ad-

7, sorbée dessus pour fournir un antigène-anticôrps sur un support 5-2-1 Ultérieurement, une plus grande quantité

d'un anticorps marqué 2-4 est envoyée à travers la colon-

ne et, de ce fait, un produit insolubilisé formé par liai-

son de l'anticorps marqué 2-4 sur l'antigène-anticorps sur le support 5-21 est produit,alors que l'anticorps

marqué non lié 2-4 est évacué de la colonne.

Mode (f): On fait passer une quantité prédéter-

minée d'un anticorps 2 à travers une colonne garnie d'un

support 5 ayant une plus grande quantité d'un antianti-

corps ou d'une protéine A 3 adsorbée dessus pour fournir

un anticorps-antianticorps ou une protéine A sur un sup-

port 5-2-3 Ultérieurement, une plus grande quantité d'un antigène marqué 1-4 est envoyée à travers la colonne et, de ce fait,un produit insolubilisé formé par la liaison de l'antigène marqué 1-4 sur l'anticorps-antianticorps sur un support ou sur l'anticorps-protéine A sur un support -2-3 est produit, alors que l'antigène marqué non lié 1-

4 est évacué de la colonne.

Ensuite, selon le procédé de la présente inven-

tion, l'étape de mesure d'activité enzymatique, après

l'étape de réaction immunologique comme expliquée ci-des-

sus, est réalisée comme suit.

Après que l'étape de réaction immunologique a été

réalisée par l'un quelconque des modes opératoires (a) -

(f),la colonne est lavée avec une solution tampon, et

l'activité de l'enzyme de marquage 4, contenue dans le pro-

duit insolubilisé qui a été maintenu dans la colonne, est mesurée par passage à travers la colonne d'une solution contenant un substrat pour l'enzyme Typiquement, les modes

opératoires précédents sont préalablement répétés, avec di-

verses quantités de l'antigène 1 ou de l'anticorps 2, et

les valeurs mesurées sont portées graphiquement en fonc-

tion des quantités d'antigène 1 ou d'anticorps 2 initiale-

ment utilisées pour construire une courbe de calibrage.

Ensuite, les mêmes modes opératoires que ci-dessus sont conduits en utilisant un fluide biologique contenant une

quantité inconnue de l'antigène 1 ou de l'anticorps 2 En-

8. suite, la concentration de l'antigène 1 ou de l'anticorps

2 dans le fluide est calculée à partir de la valeur mesu-

rée par référence à la courbe de calibrage.

Dans la mise en pratique de la présente inven-

tion, la réaction immunologique, la réaction d'un antigène

ou d'un anticorps avec une matière de marquage, et l'ad-

sorption d'un anticorps, d'un antianticorps ou d'une protéi-

ne A sur un support insoluble, sont obtenues à une tempéra-

ture allant d'environ 40 C à environ 40 C, comme cela est courant avec les réactions biochimiques Dans la plupart des cas, le temps exigé pour achever ces réactions est 10

minutes ou davantage.

L'antigène 1 à déterminer (ou à doser) par le procédé de la présente invention peut être l'une quelconque

des hormones et des protéines contenues dans divers flui-

des biologiques, les fonctions de certaines de ces protéi-

nes n'ayant pas été expliquées Des exemples spécifiques de l'antigène comprennent l'insuline, la triiodothyronine,

la thyroxine, la calcitonine, l'a-fétoprotéine, la protéi-

ne dite S-100, l'énolase, la calmoduline, l'immunoglobuline A de sécrétion et analogues En outre, les niveaux dans le

sang de produits pharmaceutiques administrés extérieure-

ment, tels que les antibiotiques, peuvent être aussi déter-

minés L'anticorps 2 pour l'utilisation dans le procédé de

la présente invention est un anticorps correspondant à l'an-

tigène 1 indiqué ci-dessus La plupart de ces antigènes 1, de ces anticorps 2, de ces antianticorps 3, ou de fluides biologiques les contenant sont disponibles dans le commerce sous forme purifiée, et ces préparations commerciales ont 3 Q été utilisées dans les exemples de la présente invention

donnés ultérieurement.

Des exemples spécifiques de l'enzyme de marquage pour l'utilisation dans le procédé de la présente invention comprennent la e-D-galactosidase, une phosphatase alcaline, la peroxydase, la glucose oxydase, la malate déhydrogénase

et analogues Une telle enzyme 4 peut être couplée à un an-

tigène 1 ou à un anticorps 2 par n'importe quel mode opéra-

toire classique Ainsi, ceci peut être réalisé en utilisant 9, un réactif bifonctionnel comme agent de couplage, tel que

le glutaraldéhyde, la carbodiimide, la N,N-o-phénylène-

dimaléimide, l'ester m-maléimidobenzoylique de N-hydroxy-

succinimide, ou analogues.

Des exemples spécifiques du support insoluble 5 pour l'utilisation dans le procédé de la présente invention comprennent des polysaccharides, tels que l'agarose, le dextrane, la cellulose, etc, des résines synthétiques telles que le polystyrène, la polyecrylamide, etc, et des morceaux de verre Dans la réalisation du procédé de la

présente invention, il est souhaitable que le produit réa-

gissant adsorbé sur le support, se composant d'un anticorps 2, d'un antiant corps 3 ou d'une protéine A 3 adsorbé sur le support insoluble 5, soit sous forme finement sphérique ou finement fibreuse, tant que le taux d'écoulement du mélange réactionnel immunologique à travers la colonne

n'est pas réduit en proportion excessive.

La réaction d'adsorption d'un anticorps 2, d'un

antianticorps 3 ou de la protéine A 3 sur un support insolu-

ble 5 peut être réalisée par n'importe quel mode opératoi-

re classique Par exemple, ceci peut être réalisé en acti-

vant un polysaccharide insoluble avec un agent d'activation tel que le bromure de cyanogène, le periodate de sodium, l'épichlorhydrine, le l,l'carbonyldiimidazole, le chlorure de p-toluènesulfonyle ou analogues, suivi d'addition d'un

anticorps ou analogues au polysaccharide activé La quanti-

té d'anticorps 2, d'antianticorps 3 ou de protéine A 3 pour l'utilisation dans ce but est convenablement dans la gamme

de 0,1 à 20 mg par millilitre du support insoluble.

L'anticorps 2,1 'antianticorps 3 ou la protéine

A 3 pour l'utilisation dans le procédé de la présente inven-

tion peut être constitué de fragments dits actifs, isolés.

Dans le cas d'un anticorps 2 ou d'un antianticorps 3, par

exemple, les fragments actifs peuvent être isolés par trai-

tement avec une protéase telle que la papaine, la pepsine

ou analogues.

Par suite de petits volumes d'échantillons ordi-

nairement disponibles pour l'immunodétermination, de la 10. simplification des opérations et de l'obtention d'un

temps de fonctionnement raisonnablement court, il est sou-

haitable que la capacité de la colonne pour l'utilisation

dans le procédé de la présente invention ne soit pas supé-

rieure à 1 ml. En outre, en réalisant le procédé de la présente

invention, toute interférence avec la réaction immunologi-

que peut être empêchée par la technique préalablement pro-

posée par la demanderesse, c'est-à-dire par l'addition d'une protéine hydrophobe (par exemple la gélatine) avec un sel (par exemple le chlorure de sodium) au système de

réaction immunologique.

Le procédé selon la présente invention est plus spécifiquement illustré par les exemples suivants, sans

aucune limitation.

Exemple 1 Détermination d'insuline ( 1 > Préparation d'un anticorps et d'un anticorps marqué Une préparation commerciale d'insuline de porc,

ayant été extraite du pancréas de porc, a été utilisée com-

me antigène Une préparation commerciale de sérum contenant

un anticorps, ayant été produite par injection de l'antigè-

ne à un-cochon d'Inde, a été traitée selon les modes opératoires classiques, tels que le fractionnement avec du

sulfate d'ammonium et une chromatographie sur DEAE (dié-

thylaminoéthyl)-cellulose pour isoler l'anticorps L'anti-

corps ainsi obtenu a été partagé par addition de pepsine et puis soumis à une chromatographie sur colonne en utilisant

le produit dit Sephadex G-150, et, de ce fait, les frag-

ments actifs de l'anticorps ont été isolés Ces fragments

actifs ont été réduits par la 2-mercaptoéthylamine à la ma-

nière ordinaire et puis mis à réagir avec la N,N'-o-phény-

lènedimaléimide pour la réunir aux fragments actifs ré-

duits Ensuite, le produit réactionnel a été en outre mis

à réagir avec une préparation commerciale de e-D-galactosi-

dase pour préparer les fragments actifs marqués par la e-D-

galactosidase (ci-après désignés simplement par anticorps marqué).

L'antigène indiqué précédemment (c'est-à-dire l'in-

11.

suline de porc) et son anticorps correspondant ont générale-

ment l'aptitude à réagir de manière immunologique avec d'au-

tres insulines de sérum (en tant qu'antigènes) provenant d'un grand nombre d'espèces animales (comprenant l'espèce humaine) et leurs anticorps correspondants, si bien qu'ils peuvent être utilisés dans la détermination des insulines (en tant qu'antigènes) ou de leurs anticorps correspondants

contenus dans les fluides biologiques de nombreuses espè-

ces animales (par exemple l'espèce humaine).

( 2) Préparation d'un anticorps sur un support Un anticorps sur un support a été préparé en

adsorbant l'anticorps obtenu en ( 1) ci-dessus sur un sup-

port insoluble dans l'eau (produit dit Sepharose activé par CNBR) à la manière ordinaire, ( 3) Construction d'une courbe de calibrage

A des parties de 1 ml d'une solution tampon conte-

nant 100 p U/ml d'un anticorps marqué indiqué en ( 1) ci-

dessus, on a ajouté 0,1 ml de chacune des solutions aqueu-

ses contenant de plus petites quantités (c'est-à-dire O à 320 i U/ml) de l'antigène, et les mélanges ont été soumis à

l'incubation à 37 C pendant 2 heures pour fournir un com-

* plexe anticorps marqué-antigène avec une partie non liée de l'anticorps marqué, Dans cet exemple et dans d'autres exemples, "U" représente la quantité unitaire d'une hormone

ayant été adoptée dans le procédé de détermination stan-

dard Alors, on a fait passer chacun des mélanges réaction-

nels à travers une colonne garnie d'une plus grande quanti-

té de l'anticorps sur le support préparé en ( 2) ci-dessus, et, de ce fait, le produit insolubilisé formé par liaison du complexe anticorps marqué-antigène sur l'anticorps sur le support est produit,alors que l'anticorps marqué non lié a été évacué de la colonne Après que la colonne a été lavée

avec une solution tampon, 0,1 ml d'une solution aqueuse con-

tenant 10 mg/ml d'o-nitrophényl-5-D-galactoside (ci-après désigné par oNPG) a été déversé dans la colonne, qui a été alors soumise à l'incubation à 37 C pendant 2 heures pour produire de l'o-nitrophénol La colonne a été lavée avec

2 ml d'une solution 0,1 M de Na 2 CO 3 et la capacité d'absorp-

12. tion à 420 nm du filtrat a été mesurée pour déterminer

l'activité de l'enzyme ayant été contenue dedans Les va-

leurs mesurées ont été portées graphiquement par rapport aux quantités d'antigène initialement utilisées pour construire une courbe de calibrage, comme présenté sur la

figure 2.

D'autre part,le mode opératoire ci-dessus a été

modifié en préparant une série de solutions contenant l'an-

tigène suivant les mêmes quantités que précédemment et en

faisant passer chacune de ces solutions à travers une co-

lonne garnie d'anticorps sur le support Après que la co-

lonne a été lavée, on a fait passer la même quantité de

l'anticorps marqué,suivi de mesure de la capacité d'absorp-

tion du filtrat De cette manière, une courbe de calibrage

très semblable à celle de la figure 2 a été obtenue.

( 4 > Détermination de l'insuline dans du sérum humain

Un échantillon de sérum humain, ayant une con-

centration inconnue (mais tombant dans la gamme de 0-320

11 U/ml comme défini en ( 3) ci-après, c'est la même défini-

tion) d'insuline, a été utilisé comme antigène, et on a

réalisé le même mode opératoire que dans la première par-

tie de ( 3) Ainsi, on a fait réagir 0,1 ml de l'échantil-

lon avec l'anticorps marqué, et on a fait passer le mélange réactionnel à travers une colonne garnie d'anticorps sur le support Après que l'on a déversé de l'o-NPG dans la colonne

et qu'on l'a soumise à l'incubation, on a mesuré la capaci-

té d'absorption du filtrat de colonne Quand on l'a calcu-

lée à partir de la valeur mesurée par référence à la courbe de calibrage représentée sur la figure 2, la concentration d'insuline dans l'échantillon a été trouvée à une valeur de 92 p U/ml A titre de comparaison, le même échantillon a

été soumis au mode semblable dans la radio-immunod&termina-

tion classique en phase solide (ci-après désignée par RIA) en utilisant un radio-isotope comme matériau de marquage, si bien que la concentration d'insuline dans l'échantillon

a été estimée à 102 p U/ml.

D'autre part, le même échantillon a été traité dans le même mode opératoire que dans la dernière partie de 13,

( 3) Ansi, la concentration d' nsuline dans l'échantil-

lon a été trouvée à 95 p U/Ml, A titre de comparaison, le même échantillon a été soumis à une RIA classique, si bien que la concentration d'insuline dans l'échantillon a été estimée à 105 p U/Ml. Exemple 2 Détermination de l'anticorps anti-thyroxine ( 1) Préparation d'un antigène marqué d'un anticorps Une préparation commerciale de thyroxine ayant été isolée à partir d'un extrait de glandes de thyroïde de porc a été utilisée comme antigène Le groupe amino de

cet antigène a été couplé au groupe SH de la B-D-galacto-

sidase à la manière ordinaire pour former un antigène

marqué D'autre part, une préparation commerciale de sé-

rum contenant un anticorps, ayant été produite par injec-

tion d'antigène à un lapin, a été immédiatement utili-

sée comme anticorps.

( 2) Préparation d'un antianticorps sur un support

Généralement, l'immunoglobuline G (ci-après dési-

gnée par Ig G), qui est un genre de protéine présente de par sa nature dans le sérum d'animaux, a l'aptitude à réagir avec des substances antigènes, provenant d'un grand

nombre d'espèces animales, et, de fait, avec les proprié-

tés d'un anticorps qui leur correspond En conséquence, l'Ig G a été utilisée largement pour la préparation d'un

antianticorps. Dans cet exemple,une préparation commerciale de sérum contenant un

antianticorps, ayant été produite par injection d'Ig G de lapin à une chèvre, a été traitée de la même manière que dans ( 1) de l'exemple 1 pour isoler

l'antianticorps En utilisant l'antianticorps ainsi iso-

lé, on a réalisé le même mode opératoire que dans ( 2) de

l'exemple 1 pour préparer un antianticorps sur un support.

( 3) Construction d'une courbe de calibrage

A des parties de 0,5 ml d'une dilution de l'anti-

gène marqué préparé en ( 1) ci-dessus, on a ajouté 3 pl

de chacune des dilutions de sérum contenant de plus peti-

tes quantités de l'anticorps, et,après achèvement de la réaction, chacun des mélanges réactionnels a été envoyé à 14. trayers une colonne garnie d'une plus grande quantité de l'antianticorps sur un support préparé en ( 2), Ensuite, le

mode opératoire en ( 3) de l'exemple 1 a été suivi pour cons-

truire une courbe de calibrage.

D'autre part, le mode opératoire ci-dessus a été modifié en préparant une série de dilutions de sérum ( 0,5

ml chacune) contenant l'anticorps, suivant les mêmes quan-

tités que précédemment, et en faisant passer chacune des solutions à travers une colonne garnie d'antianticorps sur un support Apres que la colonne a été lavée, on a fait passer,& travers, la même quantité de l'antigène marqué, suivi de mesure de la capacité d'absorption des filtrats de colonne De cette manière, on a obtenu une courbe de

calibrage tout à fait semblable à celle décrite ci-dessus.

( 4) Détermination d'anticorps anti-thyroxine dans du sé-

rum de lapin Un échantillon de sérum de lapin à concentration inconnue d'anticorps anti-thyroxine a été traité dans le même mode opératoire que dans la première partie de ( 3) pour mesurer la capacité d'absorption du filtrat Quand on l'a calculée à partir de la valeur mesurée par référence à la courbe de calibrage construite en ( 3) ci-dessus,la

concentration de l'anticorps anti-thyroxine dans l'échantil-

lon a été trouvée à 1,05 U/ml De manière semblable le même échantillon a été traité de la même manière que dans la deuxième partie de ( 3), ce qui a permis de déterminer la

concentration d'anticorps anti-thyroxine à 1,10 U/ml.

Exemple 3 Détermination de l'anticorps anti-insuline ( 1) Préparation d'un antigène marqué Une préparation commerciale d'insuline de porc a été utilisée comme antigène Le même mode opératoire qu'en

( 1) de l'exemple 1 a été réalisé pour marquer la $-D-galac-

tosidase sur l'antigène D'autre part, une préparation com-

merciale de sérum contenant un anticorps, ayant été produi-

te par injection de l'antigène à un cochon d'Inde, a

été immédiatement utilisée comme anticorps.

( 2) Préparation d'un antianticorps sur un support Une préparation commerciale de sérum contenant un 15. antianticorps (c'est-à-dire anticorps vis-à-vis de l'Ig G de cochon d'Inde) ayant été produite par injection d'Ig G de cochon d'Inde à un lapin a été traitée à la manière

ordinaire pour isoler l'antianticorps En utilisant l'an-

tianticorps,le mode opératoire en ( 2) de l'exemple 2 a été

suivi pour préparer un antianticorps sur un support.

( 3) Construction d'une courbe de calibrage

A des parties de 1 ml d'une solution tampon con-

tenant l'antigène marqué préparé en ( 1), on a ajouté une

série de dilutions de sérum contenant de plus petites quan-

tités de l'anticorps, et, après achèvement de la réaction, chacun des mélanges réactionnels a été envoyé à travers une

colonne tassée d'une plus grande quantité de l'antianti-

corps sur le support préparé en ( 2) Ensuite, la colonne a

été traitée dans le même mode opératoire que dans la pre-

mière partie de ( 3) de l'exemple 2 pour mesurer la capacité d'absorption du filtrat de colonne, Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement par rapport aux quantités

d'anticorps initialement utilisées pour construire une cour-

be de calibrage.

( 4) Détermination d'anticorps anti-insuline dans du sérum de cochon d'Inde

Un échantillon de sérum de cochon d'Inde à concen-

tration inconnue en anticorps anti-insuline a été traité

dans le même mode opératoire qu'en ( 3) ci-dessus, pour mesu-

rer la capacité d'absorption du filtrat Quand on calcule à partir de la valeur mesurée par référence à la courbe de calibrage en ( 3) ci-dessus, la concentration de l'anticorps

anti-insuline dans l'échantillon a été trouvée à 0,76 p U/ml.

Exemple 4 Détermination d'a-fétoprotéine ( 1) Préparation d'un anticorps marqué Une préparation commerciale d'"-fétoprotéine ayant été isolée à partir d'un sérum humain a été utilisée comme antigène Une préparation commerciale de sérum contenant un anticorps ayant été produite par injection de l'antigène à une chèvre a été traitée à la manière ordinaire pour

isoler i'anticorps En utilisant l'anticorps, le mode opé-

ratoire en ( 1) de l'exemple 1 a été suivi pour préparer un 16.

anticorps marque.

( 2) Préparation d'un anticorps sur un support

En utilisant le produit dit Toyopearl HW-55 (mar-

que déposée) en tant que support insoluble, on a préparé un anticorps sur un support à la manière ordinaire. ( 3) Construction d'une courbe de calibrage A des parties de 1 mi d'une solution contenant

l'anticorps marqué préparé en ( 1), on a ajouté de plus pe-

tites quantités de l'antigène, et, après achèvement de la réaction, on a fait passer chacun des mélanges réactionnels à travers une colonne garnie d'une plus grande quantité de l'anticorps sur un support préparé en ( 2), Ensuite, la

capacité d'absorption du filtrat de colonne a été mesurée.

Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement par rap-

port aux quantités d'antigène initialement utilisées pour

construire une courbe de calibrage.

( 4) Détermination d'a-fétoprotéine dans du sérum humain Un échantillon de sérum humain,à concentration inconnue d'a-fétoprotéine, a été traité par le même mode opératoire qu'en ( 3) ci-dessus, pour mesurer la capacité d'absorption 'du filtrat de colonne Quand on l'a calculée à partir de la valeur mesurée par référence à la courbe de

calibrage en ( 3) ci-dessus, la concentration d'a-fétopro-

téine dans l'échantillon a été trouvée à 151-ng/mg A titre de comparaison, le même échantilloi a'Oté soumis au mode

semblable dans la RIA, si bien que la concentration d'a-féto-

protéine dans l'échantillon a été estimée à 192 ng/ml.

Exemple 5 Détermination de calcitonine ( 1) Préparation d'un anticorps Une préparation commerciale de calcitonine, ayant été isolée à partir d'un extrait de glandes thyroïdes de porc, aoûté utilisée comme antigène Une préparation commerciale

de sérum contenant un anticorps, ayant été produite par in-

jection de l'antigène dans un lapin, a été traitée de la même manière qu'en ( 1) de l'exemple 1 pour isoler ainsi l'anticorps. 17, ( 2) Préparation d'un antigène marqué et d'un antianticorps sur un support Le mode opératoire en ( 1) de l'exemple 2 a été suivi pour préparer un antigène marqué D'autre part, un antianticorps sur un support a été préparé en conduisant

le même mode opératoire qu'en ( 2) de l'exemple 2.

( 3) Préparation de solutions d'antigène ayant différentes concentrations Une solution aqueuse de l'antigène a été diluée pour préparer une série de solutions d'antigène contenant 0 à 150 MRC m U/ml de l'antigène ("MRC U" se réfère à la quantité unitaire de calcitonine dans ld procédé standard

de biodétermination).

( 4) Construction d'une courbe de calibrage A des parties de 0,1 ml d'une solution contenant l'antigène marqué préparé en ( 2) ci-dessus, on a ajouté 0,5 ml de chacune des solutions contenant de plus petites

quantités de l'anticorps en ( 1), ainsi que 0,1 ml de cha-

cune des solutions d'antigène préparées en ( 3) Apres achè-

vement de la réaction, chacun des mélanges réactionnels a été envoyé à travers une colonne Ensuite, la colonne a

été traitée dans le même mode opératoire qu'en ( 3) de l'exem-

ple 2 pour mesurer la capacité d'absorption du filtrat Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement par rapport

aux quantités d'antigène initialement utilisées pour cons-

truire une courbe de calibrage,comme présenté sur la figure 3.

( 5) Détermination de calcitonine dans un extrait de thyroi-

de de porc Un échantillon d'extrait de thyroïde de porc, ayant une concentration inconnue en calcitonine, a été traité dans le même mode opératoire qu'en ( 3) ci-dessus pour mesurer la capacité d'absorption du filtrat Quand on l'a calculée à partir de la vapeur mesurée par référence à

la courbe de calibrage présentée sur la figure 3, la concen-

tration de calcitonine dans l'échantillon a été trouvée à

MRC m U/ml.

18. Exemple 6 Détermination de la thyroxine ( 1) Préparation d'un antigène marqué et d'un anticorps Une préparation commerciale de thyroxine, ayant été isolée à partir d'un extrait de glandes thyroldes de

porc, a été utilisée comme antigène Le même mode opératoi-

re qu'en ( 1) de l'exemple 2 a été conduit pour préparer un antigène marqué D'àutre part, une préparation commerciale de sérum contenant l'anticorps correspondant à l'antigène a été traitée de la même manière qu'en ( 1) de l'exemple 1

pour isoler l'anticorps.

( 2) Préparation d'un anticorps sur un support Le même mode opératoire qu'en ( 2) de l'exemple 1

a été conduit pour préparer un anticorps sur un support.

( 3) Préparation de solutions d'antigène ayant différentes concentrations Une solution aqueuse de l'antigène a été diluée

pour préparer une série de solutions d'antigène ayant dif-

férentes concentrations.

( 4) Construction d'une courbe de calibrage A des parties de 1 ml d'une solution contenant l'antigène marqué préparé en ( 1), on a; ajouté les solutions d'antigène préparées en ( 3) Chacun des mélanges résultants a été passé à travers une colonne garnie d'une plus petite quantité de l'anticorps sur un support, et la colonne a été traitée parle même mode opératoire qu'en ( 3) de l'exemple 1 pour mesurer la capacité d'absorption du filtrat de la colonne Les valeurs mesurées ont été portées graphiquement

par rapport aux quantités d'antigène initialement utili-

sées pour construire une courbe de calibrage.

( 5) Détermination de thyroxine dans un extrait de thyroïde de porc Un échantillon d'extrait de thyroïde de porc, à concentration inconnue en thyroxine, a été traité dans le mène mode opératoire qu'en ( 3) ci-dessus pour mesurer la capacité d'absorption du filtrat de colonne, Quand on 4 l'a calculée à partir de la valeur mesurée par référence à la

courbe de calibrage construite en ( 4) ci-dessus, la concen-

tration de thyroxine dans l'échantillon a été trouvée à 19, ,5 pg/dl, A titre de comparaison, le même échantillon a été soumis au mode semblable dans la RIA, si bien que

la concentration de thyroxine a été estimée à 11,0 pg/dl.

La présente invention n'est pas limitée aux exem-

ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes

qui apparaîtront à l'homme de l'art.

20.

Claims (13)

REVENDICATIQNS

1 Procédé d'imrunodétermination (ou d'"immunodo-

sage) d'enzymes en phase solidequi consiste (a) à faire

réagir par voie immunologique au moins un composant à réac-

tion immunologique choisi dans le groupe se composant d'un

antigène, d'un anticorps, d'un antigène marqué et d'un an-

ticorps marqué, ou d'un complexe immunologique de ces pro-

duits, avec un produit réagissant adsorbé sur un support, choisi dans le groupe se composant d'un anticorps sur un

support, d'un antianticorps sur un support et de la protéi-

ne A sur un support, en une seule fois ou en deux fois, pour fournir un produit insolubilisé formé par liaison de l'anticorps marqué (ou de l'anticorps marqué) ou de son complexe immunologique sur le produit réagissant adsorbé

sur le support avec une partie soluble non liée de l'anti-

gène'marqué (ou de l'anticorps marqué); (b) à séparer l'antigène marqué (ou l'anticorps marqué) non lié; (c) à mesurer l'activité de l'enzyme contenue dans le produit

insolubilisé; (d) à construire, en répétant les étapes (a)-

(c) ci-dessus, une courbe de calibrage représentant la

relation entre la quantité d'antigène (ou d'anticorps) ini-

tialement présente et l'activité de l'enzyme qui y est fi-

xée, (e) à réaliser les mêmes modes opératoires que ci-

dessus avec un fluide biologique contenant une quantité in-

connue de l'antigène (ou de l'anticorps) pour mesurer ain-

si l'activité de l'enzyme contenue dans le produit insolu-

hilisé résultant, et (f) à calculer la quantité (concentra-

tion) d'antigène (ou d'anticorps) présente dans le fluide

biologique par référence à la courbe de calibrage, caracté-

risé en ce que toutes les étapes allant de l'étape de réac-

tion immunologique du ou des composants à réaction immunolo-

gique, ou d'un complexe immunologique de ces produits,

avec un produit réagissant adsorbé sur un support (a) jus-

qu'à l'étape de mesure de l'activité d'enzyme contenue dans

le produit insolubilisé résultant quand le fluide biologi-

que a été utilisé (e) sont réalisées par application de chro-

matographie à une seule colonne,.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé

21 2519764

en ce que le complexe immunologique ( 1-2-4) a été préparé par la réaction d'une quantité prédéterminée d'un anticorps marqué ( 2-4) avec une plus petite quantité d'un antigène ( 1), alors que le produit réagissant adsorbé sur un support se compose d'une plus grande quantité d'un anticorps ( 2)

adsorbé sur un support ( 5).

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le complexe immunologique ( 2-1-4) a été préparé par la réaction d'une quantité prédéterminée d'un antigène marqué ( 1-4) avec une plus petite quantité d'un anticorps ( 2), alors que le produit réagissant adsorbé sur un support se compose d'une plus grande quantité d'un antianticorps ou

de la protéine A ( 3) adsorbée-sur un support ( 5).

4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ccmplexe immunologique ( 2-1-4) a été préparé par la réaction d'une quantité prédéterminée d'un antigène marqué ( 1-4) avec une plus petite quantité d'un anticorps ( 2) ainsi qu'une quantité différente d'un antigène ( 1), alors que le produit réagissant adsorbé sur un support se compose d'une plus grande quantité d'un antianticorps ou

de la protéine A ( 3) adsorbée sur un support ( 5).

Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les composants à réaction immunologique sont

fournis par une quantité prédéterminée d'un antigène mar-

qué ( 1-4) et une quantité différente d'un antigène ( 1), alors que le produit réagissant adsorbé sur un support

se compose d'un anticorps ( 2)adsorbé sur un support ( 5).

6 Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce que les composants à réaction immunologique sont constitués par une quantité prédéterminée d'un antigène

( 1) et une plus grande quantité d'un anticorps marqué ( 2-

4), et ces composants à réaction immunologique sont en-

voyés successivement à travers une colonne garnie du pro-

duit réagissant adsorbé sur un support, se composant d'une plus grande quantité d'un anticorps ( 2) adsorbée sur

un support ( 5).

7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les composants à réaction immunologique sont 22. constitués par une quantité prédéterminée d'un anticorps

( 2) et une plus grande quantité d'un antigène marqué ( 1-

4), et ces composants à réaction immunologique sont envo-

yés successivement à travers une colonne garnie du produit réagissant adsorbé sur un support, se composant d'une plus grande quantité d'un antianticorps ou de la protéine A

( 3) adsorbée sur un support ( 5).

8 Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 2 à 7, caractérisé en ce que l'antigène ( 1) consti-

tuant un des composants à réaction immunologique est un membre choisi dans le groupe se composant d'insuline, de

triiodothyronine, de thyroxine, de calcitonine, d'a-fétopro-

téine, de protéine dite S-100, d'énolase, de calmoduline,

et d'immunoglobuline A de sécrétion.

9 Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 2 à 7,caractérisé en ce que le support insoluble ( 5) constituant le produit féagissant adsorbé sur le support

est un membre choisi dans le groupe se composant d'agaro-

se, de dextrane, de cellulose, de polystyrène, de poly-

acrylamide et des morceaux de verre.

Procédé selon la revendication 8, caractéri-

sé en ce que le support insoluble ( 5) constituant le pro-

duit réagissant adsorbé sur un support est un membre choi-

si dans le groupe se composant d'agarose, de dextrane, de

cellulose, de polystyrène, de polyacrylamide et de mor-

Geaux de verre.

11 Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 2 à 7, caractérisé en ce que l'enzyme de marquage ( 4) constituant l'antigène marqué ou l'anticorps marqué est un

membre choisi dans le groupe se composant de -D-galactosi-

dase, de phosphatase alcaline, de peroxydase, de glucose-

oxydase et de malatedéshydrogénase.

12 -Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'enzyme de marquage ( 4) constituant l'antigène marqué ou l'anticorps marqué est un membre choisi dans le groupe se composant de a-D-galactosidase, de phosphatase

alcaline, de peroxydase,de glucoseoxydase et de malatedé-

shydrogénase. 23,

13 Procédé selon la revendication 9, caractéri-

sé en ce que l'enzyme de marquage ( 4) constituant l'antigè-

ne marqué ou l'anticorps marqué est unmentbre choisi dans le groupe se composant de C-D-galactosidase, de phosphatase alcaline, de peroxydase, de glucoseoxydase et de malate- déshydrogénase.

14 Prodédé selon la revendication 10,caractéri-

sé en ce que l'enzyme de marquage ( 4) constituant l'antigè-

ne marqué ou l'anticorps marqué est un membre choisi dans le groupe se composant de e-D-galactosidase, de phosphatase

alcaline,de peroxydase,de glucoseoxydase et de malatedéshy-

drogénase.

Procédé selon la revendication 9, caracté-

risé en ce que le produit réagissant adsorbé sur un sup-

port est sous forme finement sphérique ou finement fibreu-

se,tant que le taux d'écoulement du mélange réactionnel immunologique à travers la colonne n'est pas réduit en

quantité excessive.

16 Procédé selon la revendication 9, caractéri-

sé en ce que la capacité de la colonne pour l'utilisation

dans la chromatographie du présent procédé n'est pas supé-

rieuré à 1 ml.