FR2604259A1 - Reactifs, trousses et procedes d'essais immunologiques - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN REACTIF D'ESSAIS IMMUNOLOGIQUES DE LIAISON ET DE DETECTION D'ANTICORPS, COMPRENANT DES CELLULES BACTERIENNES STABILISEES NON VIABLES AYANT UN RECEPTEUR ACTIF POUR L'IMMUNOGLOBULINE ET UNE ENZYME DE MARQUAGE ACTIVE, AINSI QU'UNE TROUSSE D'ESSAIS POUR UN ESSAI IMMUNOLOGIQUE ENZYMATIQUE COMPRENANT UN OU PLUSIEURS RECIPIENTS CONTENANT UNE SUSPENSION AQUEUSE DE CELLULES BACTERIENNES STABILISEES NON VIABLES AYANT UN RECEPTEUR ACTIF POUR L'IMMUNOGLOBINE ET UNE ENZYME DE MARQUAGE ACTIVE, OU UNE PREPARATION STABILISEE SECHE DESDITES CELLULES, CONVENANT A UNE RECONSTITUTION IN SITU AINSI QUE DES PROCEDES POUR LEUR UTILISATION.

Description

Réactifs, trousses et procédés d'essais immunologiques La présente

invention concerne des réactifs, des trousses

et des procédés d'essais immunologiques.

La présente invention concerne plus particulièrement un nouveau réactif pour la liaison et la détection d'anticorps,

ainsi que des trousses et des procédés incorporant ce réac-

tif. Les procédés d'essais pour la liaison d'anticorps spé-

cifiques, également appelés procédés d'essais immunologi-

ques, constituent une technique analytique de croissance rapide, utilisés plus largement pour le diagnostic et la recherche, en raison de leurs spécificité et sensibilité élevées.

Les versions les plus récentes de cette technique qui utili-

sent des marqueurs radioisotopiques ont été remplacées de

plus en plus, ces dernières années, par des techniques d'es-

sais immunologiques enzymatiques (EIE), utilisant des mar-

queurs enzymes, lesquelles techniques sont également sensi-

bles mais plus sûres, plus simples et moins coûteuses.

Parmi les techniques EIE, on utilise couramment des procédés

d'essais dits "hétérogènes" utilisant des anticorps ou anti-

gènes marqués aux enzymes et fixés à f'immobilisés sur") des surfaces sensibilisées de supports solides, tels que des tubes à essais, des perles de polystyrène ou des plaques munies de "puits" évidés. Ces techniques sont généralement désignées

par l'abréviation "ELISA" qui signifie "enzyme-linked-immu-

nosorbent assay" ( essai immunosorbant à liaison enzymati-

que). Selon une modification, cette technique est combinée à l'utilisation connue d'un "second anticorps" ainsi dési-

gné,à savoir un antisérum au "premier" anticorps spécifi-

que. Le second anticorps sert de détecteur non spécifique pour tout "premier anticorps" soit à l'état libre, soit lié

à son antigèe spécifique dans un complexe antigène-anticorps.

Conformément à une version du procédé ci-dessus, qui réagit également à la technique connue du "tube revêtu", on fixe un antigène à la surface de paroi interne d'un tube à essais dans lequel la réaction de liaison est alors mise en

oeuvre, après quoi l'anticorps spécifique libre dudit anti-

gène présent dans l'échantillon d'essais sera fixé à la sur-

face du tube via l'antigène immobilisé sur celui-ci. Ensuite, on enlève le mélange réactionnel liquide du tube à essais, on lave ce dernier et on introduit dans le tube une seconde

solution contenant un second anticorps marqué aux enzymes.

Ce second anticorps marqué sera également immobilisé en le fixant à tout anticorps qui est lié à la surface du tube via l'antigène. On vide à nouveau le tube à essais, on le rince et on le remplit d'un substrat convenable, sensible

au marqueur enzyme du second anticorps et on mesure l'ac-

tivité enzymatique. Cette activité est directement proportion-

nelle à la concentration de l'anticorps dans l'échantillon d'essai. Au cours des dernières années, on a trouvé que le "second anticorps" dans les techniques d'essais immunologiques peut

être remplacé par une certaine protéine, à savoir la "pro-

téine A" ainsi désignée qui est un composant principal de la paroi cellulaire de nombreuses souches de Staphylococcus aureus. Cette protéine A est liée par covalence à la paroi cellulaire des staphylococci mais peut être solubilisée et est capable de se lier à de nombreuses classes de molécules d'immuloblobulines avec une affinité élevée. Elle se lie ainsi également à des complexes anticorps-antigène. La protéine A solubilisée peut, en outre, être marquée, par exemple, par de l'iode radioactif ou par des enzymes, et les préparations de protéine A marquée aux enzymes deviennent maintenant un composant de plus en plus répandu dans úes

trousses d'essais immunologiques, dans lesquelles elles ser-

vent de détecteur.

Plus récemment, LARS BJORCK et AL. ont décrit dans The Journal of Immunology, vol. 133 n 2 août 1984, pages 969 à 974, leurs découvertes en ce qui concerne la purification et les propriétés de la Protéine G des Streptocoques, en tant

que nouveau récepteur de liaison aux IgG.

Comme décrit dans cet article, la protéine G, qui constitue une protéine de la paroi de cellules bactériennes ayant de l'affinité pour l'immunoglobuline G (IgG) a été isolée à partir d'une souche de streptocoques humains du groupe G

(G148) et on a constaté qu'elle se liait à toutes les sous-

classes d'IgG humaines et également aux IgG de lapin, de

souris et de chèvres.

Dans un autre article de Bo Akerstrom et al, dans The Jour-

nal of Immunology, vol. 135 n 4, octobre 1985, pages 2589 à

2592, on étudie l'avidité de la protéine G à l'égard de di-

verses Ig monoclonales et polyclonales de classe G ainsi que l'utilisation de la protéine G radiomarquée pour la liaison

et la détection d'anticorps.

La présente invention constitue un autre perfectionnement important des techniques ELISA, de protéine A et de protéine G mentionnées ci-dessus et elle est fondée sur le concept inventif d'après lequel la protéine A marquée aux enzymes et la protéine G radiomarquée peuvent être remplacées par

des cellules bactériennes stabilisées non viables et intac-

tes possédant un récepteur aqtif pour l'immunoglobuline et une enzyme de marquage active qui a subi un pré-traitement

approprié. Ainsi, par exemple, les cellules de staphyloco-

ques peuvent effectivement et rapidement se lier à l'immuno-

globuline (comme à tout "premier anticorps" spécifique) en raison de la protéine A présente dans leurs parois cellu- laires et les cellules de streptocoques G peuvent, de manière

similaire, se lier à l'immunoglobuline en raison de la pro-

téine G présente dans leurs parois cellulaires. En même temps, le marqueur enzyme est fourni par des enzymes qui

sont naturellement présentes dans les cellules (c'est-à-

dire les enzymes endogènes ou autochtones), dont l'activité

peut être facilement mesurée, ou bien dans des modes de réa-

lisation particulièrement préférés de la présente invention, comme décrits plus loin, le marqueur enzyme est le résultat d'un gène pour ladite enzyme qui a été inséré dans une de

ses cellules parentales.

Ainsi, la présente invention fournit un réactif d'essais immunologiques pour la liaison et la détection d'anticorps comprenant des cellules bactériennes stabilisées non viables possédant un récepteur actif pour l'immunoglobuline et une

enzyme de marquage active.

Dans une première forme de réalisation préférée de la pré-

sente invention, ce réactif comprend des cellules de staphy-

lococcus stabilisées non viables.

Dans une autre forme de réalisation préférée de la présente invention, ce réactif comprend des cellules de Streptococcus

stabilisées non viables.

Le réactif ci-dessus proposé conformément à la présente inven-

tion, à savoir une suspension de cellules bactériennes trai-

tées de façon convenable,possède des avantages considérables en tant que "suspension du détecteur" par rapport à tous les détecteurs connus des anticorps ou de leurs complexes, en

ce sens qu'il évite le travail, le temps et les coûts impli-

qués dans: (a) l'isolation de la protéine de liaison ou la préparation des anti-immunoglobulines, (b) la préparation de l'enzyme à utiliser comme marqueur,

(c) la liaison du marqueur enzyme à la protéine de liaison -

qui constitue notoirement une opération de gaspillage, et/ou

(d) le radiomarquage des protéines.

A la lumière des propriétés spéciales du réactif présente-

ment proposé, l'invention fournit également une trousse d'essais pour un essai immunologique enzymatique, comprenant un ou plusieurs récipients contenant une suspension aqueuse de cellules bactériennes stabilisées non viables possédant un récepteur actif pour l'immunoglobuline et une enzyme de marquage active, ou une préparation stabilisée sèche des

cellules convenant à une reconstitution in situ.

Conformément à un autre aspect de l'invention, on fournit

une trousse d'essais de mise en oeuvre d'un essai immunolo-

gique comprenant,dans une combinaison conditionnée,un ou plusieurs supports solides sur au moins une partie de la

surface desquels est fixé un anticorps de capture ou un hap-

tène ou antigène, dont l'anticorps spécifique est à essayer ainsi qu'un ou plusieurs récipients contenant une suspension aqueuse des cellules bactériennes stabilisées de l'invention ou une préparation stabilisée sèche de ces cellules convenant à une reconstitution in situ pour obtenir une suspension

aqueuse de cellules.

Sur la base du concept ci-dessus, l'invention fournit éga-

lement, selon un de ses aspects, un procédé d'essais de liai-

son spécifique hétérogène pour déterminer un anticorps non lié dans un milieu liquide, ce procédé comprenant les étapes consistant à: i) incuber un échantillon dudit milieu liquide en contact avec un support solide sur la surface duquel est fixé un antigène ou haptène spécifique dudit anticorps; ii) séparer le support solide dudit échantillon du milieu liquide et le rincer avec une solution aqueuse pour éliminer toutes les traces dudit échantillon; iii) incuber le support solide en contact avec une suspension aqueuse de cellules bactériennes stabilisées non viables possédant un récepteur actif pour l'immunoglobuline et une enzyme de marquage active; iv) séparer le support solide de ladite suspension et le laver avec une solution aqueuse; et v) incuber ce support solide en contact avec un substrat convenable et déterminer l'activité enzymatique de l'enzyme de marquage sur des cellules retenues sur la surface du

support solide.

Le procédé d'essais de liaison spécifique conforme à l'in-

vention peut être appliqué à la détermination d'un haptène

ou antigène dans un milieu liquide en ajoutant, à un échan-

tillon dudit milieu liquide, un anticorps spécifique de l'haptène ou antigène qui est à déterminer et en incubant le mélange réactionnel en contact avec un support solide sur la surface duquel est fixé le même haptène ou antigène qui

est à déterminer, procédé dans lequel, à l'étape (i) on ajou-

te à l'échantillon d'essai un anticorps spécifique audit

haptène ou antigène, et, par suite de la liaison dudit hap-

tène ou antigène dans ledit échantillon, la quantité d'anti-

corps disponible pour la liaison au haptène ou antigène

fixée sur la surface solide est proportionnellement diminuée.

Les étapes ii) à v) décrites ci-dessus sont ensuite mises en

oeuvre et l'activité enzymatique qui est déterminée à l'éta-

pe v) est inversement proportionnelle à la concentration du haptène ou antigène dans l'échantillon. Cette concentration peut être calculée par des procédés bien connus dans les

techniques d'essais immunologiques, par exemple par compa-

raison à une série d'échantillons de référence ayant des concentrations standard connues de l'haptène ou antigène.

La suspension de cellules du détecteur de la présente inven-

tion peut pareillement être utilisée dans des essais immuno-

logiques du type 'sandwich", c'est-à-dire dans des essais dans lesquels on immobilise un "anticorps de capture" sur une surface solide pour capturerun antigène présent dans l'échantillon d'essai, et on applique ensuite un anticorps

"traceur" à l'égard dudit antigène pour former un "sandwich".

La liaison de l'anticorps "traceur" est révélée d'une ma-

nière conventionnelle par un marqueur incorporé dans cette

molécule d'anticorps.

Dans le présent procédé, la suspension de détecteur peut être utilisée pour supprimer la nécessité de marquer le second anticorps. La seule exigence est que les cellules du

détecteur ne doivent pas se lier à l'anticorps de capture.

Cette exigence peut être satisfaite en utilisant des anti-

corps qui ne se lient pas à la protéine A (par exemple IgY provenant de sérum de poulet ou de jaune d'oeuf) ou un anticorps modifié dans lequel le segment Fc est manquant

(par exemple Fab ou F (ab')2).

Une liaison sélective au second anticorps peut souvent être

observée avec des préparations classiques d'anticorps mon-

trant que l'anticorps de capture est fixé dans une configu-

ration qui rend le fragment de liaison à la protéine A (seg-

ment Fc) de l'immunoglobuline non disponible pour la liaison

de la cellule du détecteur.

Une trousse d'essais convenant à la mise en oeuvre du procé-

dé d'essais conforme à l'invention pour déterminer un haptène ou antigène dans un milieu liquide peut comprendre en outre

un ou plusieurs récipients contenant des solutions standar-

disées d'un anticorps spécifique audit haptène ou antigène qui est à déterminer. Les trousses d'essais conformes à l'invention comprennent en outre facultativement des réactifs ou solutions auxiliaires conditionnées pour mettre en oeuvre le procédé d'essais, comme des solutions de tampon, des

solutions de référence standardisées de l'analyte à déter-

miner, des solutions de substrat et des réactifs de détec-

teur pour mesurer l'activité de l'enzyme endogène servant

de marqueur, etc... De telles trousses d'essais qui compren-

nent une préparation stabilisée lyophilisée de cellules de staphylococcus aureus peuvent également comprendre en outre

un milieu aqueux conditionné pour la formation de la suspen-

sion aqueuse requise desdites cellules in situ.

Dans des formes de réalisation préféréesde la présente inven-

tion, on fournit également une trousse d'essais comprenant

en outre un support réactif absorbant sur lequel est incor-

poré un réactif spécifique de ladite enzyme de marquage.

Comme indiqué ci-dessus, les cellules de staphylocoques de la présente invention sont convenablement traitées avant utilisation de manière à assurer que la suspension cellulaire est saine (c'est-à-dire non pathogène), standardisée et

stable, tout en conservant sa capacité de liaison et l'acti-

vité de l'enzyme de marquage qui est choisie pour servir de

marqueur. On a trouvé que ces exigences peuvent être satis-

faites, par exemple en fixant les cellules de staphylocoques par traitement avec une solution à 0,5 % de formaldéhyde à

la température ambiante pendant 2 heures, suivi par un chauf-

fage pendant environ 5 à 15 mn à environ 50 -70 C. Les cel-

lules traitées peuvent être conservées, par exemple sous forme

d'une suspension à 10 % avec un conservateur tel que de l'a-

zide de sodium à 4 C ou sous forme d'un granulé lyophilisé de cellules de staphylocoques stockées dans des ampoules scellées. En variante, on peut obtenir un réactif sain et

stable en lyophilisant une suspension de cellules de staphy-

locoques et en stockant le produit dans des ampoules scellées.

Les cellules lyophilisées peuvent être reconstituées in situ

pour l'utilisation en les mettant en suspension dans un mi-

lieu liquide convenable.

Il convient de noter que, bien que des cellules de staphylo- coccus stabilisées soient commercialement disponibles, le

traitement standard pour leur stabilisation inactive norma-

lement toutes enzymes endogènes trouvées sur celles-ci et ainsi des cellules de staphylococcus stabilisées non viables possédant un récepteur actif pour l'immunoblobuline et une enzyme de marquage active n'ont pas été disponibles jusqu'à présent et n'ont pas été suggérées pour être utilisées comme

réactifs d'essais immunologiques.

Dans une forme de réalisation de la présente invention, l'en-

zyme de marquage est une catalase endogène et en détermine

l'activité de catalase des cellules de staphylococcus.

Dans des formes de réalisation particulièrement préférées de la présente invention, on utilise comme réactifs des cellules

de staphylococcus stabilisées non viables possédant un récep-

teur actif pour l'immunoglobuline et une enzyme de marquage active, le gène pour ladite enzyme ayant été inséré dans une cellule parentale de celle-ci par des techniques de génie

génétique connues en soi.

Ainsi, pour l'utilisation dans la présente invention, on prépare une souche obtenue par génie génétique de Cowan Staphylococcus qui diffère de la souche originale en ce

qu'elle comporte un gène pour la formation de e-lactamase.

L'avantage général de l'utilisation de cette approche d'in-

sertion d'un nouveau gène réside dans le fait qu'on n'a pas à faire appel à des marqueurs enzymes qui arrivent à être présents dans la souche d'origine. Ainsi, on peut ajouter

au répertoire existant des enzymes endogènes un nouveau mar-

queur héréditaire qui est plus approprié à un essai immunolo-

gique. Les avantages spécifiques du gène pour la S-lactamase résident dans le fait qu'il remplit toutes les exigences suivantes:

1. L'enzyme est largement liée à la cellule.

2. L'enzyme est complètement accessible au substrat.

3. L'enzyme est très stable et son activité peut être bien

conservée dans le traitement descellules.

4. L'enzyme a un taux de rendement très élevé.

5. Le substrat est stable, non coûteux, et son utilisation n'implique aucun danger pour la santé,ni de précautions

de sécurité.

6. L'essai de la réaction de la e-lactamase est simple, rapide

et très sensible.

7. L'essai ne nécessite aucune instrumentation et on peut garder un enregistrement permanent des résultats sans

autres manipulations supplémentaires.

Comme indiqué précédemment, plusieurs types de Streptococcus pyogenes sont connus pour produire des protéines de parois cellulaires qui peuvent servir de récepteurs pour la portion Fc d'immunoglobulines. La spécificité du récepteur de telles

protéines peut varier avec le type de souche de production.

Sont particulièrement intéressants les streptococci de typesC et G qui produisent des récepteurs puissants d'une large spécificité. De telles cellules bactériennes peuvent être utilisées comme réactifs d'une manière analogue à celle décrite pour les cellules Cowan I. Cependant, on doit noter les différences suivantes:

1. La spécificité plus large des récepteurs Fc de strepto-

coques permet l'extension de la présente méthodologie à

la détection d'immunoglobulines qui ne se lient pas conve-

nablement à la protéine A.

2. Les cellules de streptocoques ne comportent pas de cata-

lase, mais possèdent une riche variété d'autres enzymes de liaison aux cellules y compris des hémolysines, qui peuvent servir d'indicateurs endogènes de liaison à la molécule d'immunoglobuline. 3. En analogie à la modification génétique de la souche

Cowan, comme décrit ci-dessus, l'insertion de gènes conve-

nables fournit des marqueurs enzymes supplémentaires qui peuvent être avantageux dans des trousses de diagnostic

d'essais immunologiques.

D'après ce qui est mentionné ci-dessus, il est évident que les cellules de streptocoques possédant des récepteurs Fc

peuvent en elles-mêmes servir de source de réactif pour dé-

tecter une variété d'immunoglobulines. Si cela est préféra-

ble, de telles cellules peuvent être utilisées en combinaison au réactif Cowan décrit ci-dessus. L'utilisation combinée des deux types de cellules peut revêtir l'une de plusieurs formes: 1. Le réactif peut consister en un mélange de cellules des deux types. Chaque type peut porter son propre marqueur enzyme distinctif ou un seul essai peut être utilisé si

une activité enzymatique similaire est choisie comme mar-

queur pour les deux types de cellules.

2. Les cellules mélangées sont liées ensemble (par exemple avec du glutaraldéhyde) pour former un réactif combiné, qui porte maintenant un seul marqueur enzyme (par exemple

de la e-lactamase) mais deux sortes de récepteurs Fc.

3. Un réactif combiné est formé par interaction avec les im-

munoglobulines présentes dans l'essai ou est délibérément

ajouté dans ce but.

Bien que l'invention soit maintenant décrite en liaison avec certaines formes de réalisationspréférée dans les exemples

suivants, de sorte que certains aspects-de l'invention peu-

vent être plus complètement compris et appréciés, on ne doit

pas limiter l'invention à ces formes de réalisation particu-

lières. Au contraire, on doit comprendre qu'elle couvre d'au-

tres variantes, modifications et équivalents qui peuvent être inclus dans le cadre de l'invention tel que défini par les

revendications annexées. Ainsi, les exemples suivants qui in-

cluent des formes de réalisation préféréesservent à illus-

trer la mise en pratique de cette invention, étant entendu que les particularités montrées le sont à titre d'exemple et seulement dans le but d'une discussion illustrée des formes

de réalisation préféréesde la présente invention et sont pré-

sentées dans le but de fournir ce qui est considéré comme

étant la description la plus utile et la plus facilement com-

préhensible des procédés de formulation ainsi que des aspects

de principe et de concepts de l'invention.

EXEMPLE 1

Préparation d'une suspension stabilisée de cellules de Sta-

phylococcus aureus On fait croître Staphylococcus aureus (souche Cowan I, ATCC) dans du TSB (Bouillon de culture Trypticase Soja, Difco),

dans des flacons Erlenmeyer de 500 mL sur un agitateur alter-

natif pendant 18 heures à 37 C. Les cellules sont ensuite centrifugées (10 mn à 10.000 TPM), lavées deux fois au moyen d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), à pH 7,;

et misesen suspension dans 10 volumes de PBS (pH 7,3) conte-

nant 0,5 % de formaldéhyde. Au bout de 2 heures à la tempéra-

ture ambiante, les cellules sont centrifugées et lavées comme ci-dessus, et ensuite mises en suspension dans 10 volumes de PBS (pH 7,3). La suspension est incubée pendant 10 mn à 60 C sous agitation modérée, centrifugée comme ci-dessus, et mise à nouveau en suspension dans 10 volumes de PBS (pH 7,3). Des échantillons de cette suspension, striés sur des plaques de AB3 (Difco) n'ont pas montré de croissance au bout de 24 h à 37 C. Au bout d'un stockage de 12 mois à 4 C, la suspension ne montre aucun signe de changement dans ses propriétés de liaison et catalytiques. Avant utilisation, la suspension est

diluée à 1:10 dans PBS.

EXEMPLE 2

Préparation d'un réactif de staphylococcus aureus stabilisé lyophilisé On cultive Staphylococcus (souche Cowan I, ATCC) et on le

recueille comme décrit dans l'exemple 1 ci-dessus. Les cel-

lules sont lavées au PBS, remises en suspension dans 10 vo-

lumes de TSB frais, incubées pendant 10 mn à 60 C et distri-

buées en portionsde 0,5 ml dans des ampoules de lyophilisa-

tion. Après lyophilisation, les ampoules scellées sont stockées à la température ambiante (22-25 C). Pour l'utilisation, le contenu d'une ampoule est mis en suspension dans 5,0 ml de

PBS contenant 0,01 % de merthiolate.

EXEMPLE 3

Détection d'anti-BSA de lapin On active des plaques de microtitration (type U, Nunc) en remplissant les puits avec 100 pl d'une solution à 0,2 % de glutaraldéhyde dans un tampon au borate, à pH 9,0 et par incubation pendant 3 h à 56 C. Les plaques sont ensuite lavées

fois avec de l'eau distillée deux fois et revêtues d'anti-

gène en remplissant les puits avec 100 p1 d'albumine de sé-

rum de bovin (BSA) (50 g/ml), en incubant pendant 2 h à 37 C et en stockant à 4 C pendant 18 h. Après 3 lavages au PBS, les surfaces inoccupées sont bloquées en remplissant les

puits au moyen de 100 il d'ovalbumine (1,0 mg/ml) et en incu-

bant pendant 2 h à 37 C, suivi par 3 lavages au PBS.

Des puits témoins sont préparés comme ci-dessus en omettant

la BSA.

On prépare un anticorps au BSA (Anti-BSA) chez des lapins.

Du sérum de lapin normal (NRS) sert de témoin non spécifi-

* que. On fait des dilutions en série dans le PBS et on ajoute

pl de chacune aux puits revêtus d'antigène. Après incu-

bation de 30 mn à 37 C, les puits sont lavés 3 fois au PBS. Pour la détection de l'anticorps retenu par l'antigène, on

ajoute une partie aliquote(100 pl) d'une suspension cellu-

laire de staphylocoques (préparée conformément aux exemples 1 et 2 cidessus) à chaque puits.Après incubation de 20 mn à 37 C, les puits sont lavés une fois avec du Tween 20 à

1 % et deux-fois au PBS. La rétention des cellules par l'an-

ticorps lié est détectée par l'activité de phosphatase acide

ou de catalse, conformément au procédé décrit dans la spéci-

fication du brevet israélien n 36496.

RESULTATS

Le système d'essais décrit ci-dessus a été utilisé pour com-

parer la sensibilité des détecteurs, à savoir les suspensions de cellules de staphylocoques préparées conformément aux exemples 1 et 2 ci-dessus, à la sensibilité d'une préparation de protéine A radio-iodée, utilisée classiquement dans des essais radio-immunologiques sensibles en phase solide. Les résultats sont résumés au tableau I.

TABLEAU I

Détecteur préparé Anti-BSA Anti-BSA Anti-BSA NRS conformément 1:1000 1:3000 1:10000 1:3000 à

Exemple 1 Pos. Pos. Pos. Nég.

*

Exemple 2 Pos. Pos. Pos. Nég.

Protéine A Pos. Pos. Nég. Nég.

radio-iodée *Basé sur une activité de catalase manifestée 5 minutes après l'addition du substrat, à savoir 50 pl d'une solution à 6%

de peroxyde d'hydrogène.

EXEMPLE 4

Un gène pour la formation de pénicillinase constitutive (pen I) est inséré dans la souche Cowan I de staphylococcus aureus. Le gène se trouve à l'origine dans un plasmide

(PI258, pen 1443) porté par la souche (RN 453) de staphylo-

coccus aureus (Novick, R.P., et Brodsky, R., 1972), Etudes sur la réplication des plasmides; Réplication des plasmides non établis dans S Aureus. J. Mol.Biol 68: 285-302), et est transduit avec le phage o11. La transduction est telle que décrite par Novick (Novick, R.P., 1967), Propriétés d'un phage de transduction cryptique à fréquence élevée dans

staphylococcus aureus; Virology 33: 155-166. Une suspen-

sion stabilisée de ces cellules comportant de la -lactamase

en tant qu'enzyme de marquage est préparée selon la procé-

dure de l'exemple I.

EXEMPLE 5

Détection d'anticorps de brucella dans des sérums de bovins

On active une boite de Pétri en polystyrène (dimension stan-

dard, miniplaque) en 8 endroits équidistants présélectionnés en plaçant 50 Ml d'une solution à 25 % de glutaraldéhyde (Merck) à chaque endroit. Au bout de 150 sec. à 24 C, on

rince la boite avec de l'eau et on ajoute 10 pl de la sus-

pension d'antigène à chaque endroit. La suspension d'antigène consiste en cellules tuées à la chaleur (90 mn à 72 C) de Brucella abortus, mises en suspension dans du PS (phénol à 0,5 % et NaCl à 0,85 % dans l'eaudistillée) à une densité optique correspondant à 200 unités Klett. Les endroits sont rincés abondamment et la boîte de Pétri est recouverte de 5 ml d'une solution de blocage consistant en de la BSA (20 mg/ml) dans du PBS. Au bout de 2 h à 37 et 16 h à 4 , on enlève la solution de blocage et on rince la botte de Pétri 2 fois avec du PBS, ensuite 2 fois avec du Tween 20 à 0,05 % dans le PBS et à nouveau avec du PBS. La boite est ensuite séchée à l'air et on ajoute 20 pl d'échantillons de sérums bovins, dilués comme indiqué au Tableau II, aux endroits marqués. Après mn à 37 , on rince et lave la boîte comme précédemment,

et chaque endroit reçoit 20 pl d'une suspension de détecteur.

La suspension de détecteur consiste en les cellules de sta- phylocoques génétiquement modifiées de l'exemple 4 mises en suspension dans du PBS à OD correspondant à 200 KU. Après rinçage et séchage à l'air, l'activité de la 8-lactamase des cellules de détecteur retenues aux endroits est testée en plaçant sur chaque endroit une bande de révélateur. La bande de révélateur est une section (12x15 mm) de papier filtre Whatman n 3 imprégné d'une solution de réactif contenant de l'iode (12 mM), de l'iodure de potassium (63mM) de l'amidon soluble (1,0 % poids/poids) et de la péniciline (50 mM) dans du PBS. L'activité de l'enzyme de marquage des cellules de détecteur, à savoir de B-lactamase est obtenue

en déterminant le temps nécessaire à l'apparition d'un cer-

cle blanc au centre de la bande de détecteur bleu foncé.

Le cercle blanc indique que l'iode a été absorbé par l'acide

pénicilloique et ainsi enlevé du complexe qui donne la colo-

ration foncée à la bande de détecteur. L'acide pénicilloique

est le produit d'hydrolyse d'un B-lactame (ici une pénicil-

line) catalysé par la e-lactamase. De ce fait le taux de

décoloration de la zone circulaire autour de l'endroit mar-

qué est inversement proportionnel à la quantité de B-lacta-

mase úetenue sur cet endroit.

TABLEAU 2

Titre de Titre du Sérum n Titre fixation du présent dagglutination complément * essai **

2 1:10 1:5 1:200

6 1:20 1:5 1:200

32 Nég Nég 1:1000

53 1:80 1:5 1:1000

77 Nég Nég Nég

26 1:40 1:50 1:2000

111 1:1250 - 1:16000

Normal Nég Nég Nég Sérum de bovin * Comme déterminé au Kimron Veterinary Institue, Beth Dagan, Israël.

* La dilution la plus élevée (dans PBS) qui montre une déco-

loration en moins de 10 mn.

Il apparaîtra à l'évidence à l'homme du métier que l'inven-

tion n'est pas limitée aux détails des exemples illustratifs précédents et que la présente invention peut être mise en oeuvre sous d'autres formes spécifiques sans s'écarter de ses attributs essentiels et il est donc désiré que les présents modes de réalisation et exemples soient considérés, à tous égards, comme illustratifs et non limitatifs, référence étant

faite aux revendications annexées, plutôt qu'à la description

précédente, et tous les changements qui tombent au sens de

l'équivalence des revendications sont donc considérés comme

étant présentement inclus.

Claims (17)

Revendications

1. - Réactif d'essais immunologiques pour la liaison et la détection d'anticorps, comprenant des cellules bactériennes stabilisées non viables ayant un récepteur actif pour l'im-

munoglobuline et une enzyme de marquage active.

2. - Réactif d'essais immunologiques pour la liaison et la détection d'anticorps selon la revendication 1, comprenant

des cellules de staphylococcus stabilisées non viables.

3. - Réactif d'essais immunologiques de liaison et de détec-

tion d'anticorps selon la revendication 1, comprenant des

cellules de streptococcus stabilisées non viables.

4. - Trousse d'essais pour essais immunologiques enzymatiques

comprenant un ou plusieurs récipients contenant une suspen-

sion aqueuse de cellules bactériennes stabilisées non viables possédant un récepteur actif pour l'immunoglobuline et une enzyme de marquage active ou une préparation stabilisée sèche de telles cellules, convenable pour une reconstitution in situ.

5. - Trousse d'essais selon la revendication 4, dans laquelle

lesdites cellules sont une souche Cowan I de cellules de sta-

phylococcus aureus contenant un gène pour la formation de B-lactamase, le gène pour ladite enzyme ayant été inséré dans

une de ses cellules parentales.

6. - Trousse d'essais selon la revendication 4, dans laquelle

lesdites cellules sont des cellules G148 de souche de strep-

tocoques de groupe G.

7. - Trousse d'essais selon la revendication 4, comprenant en outre un ou plusieurs supports solides sur au moins une

partie de la surface desquels est fixé un anticorps de cap-

ture ou un haptène ou antigène, dont l'anticorps spécifique

est à déterminer.

8. - Trousse d'essais selon h revendication 4, laquelle comprend en outre un ou plusieurs récipients contenant des solutions standardisées d'un anticorps spécifique à l'égard

de l'haptène ou antigène qui est à déterminer.

9. - Trousse d'essais selon la revendication 4, laquelle comprend en outre un support réactif absorbant incorporant

sur lui un réactif spécifique de ladite enzyme de marquage.

10. - Procédé d'essais de liaison spécifique hétérogène pour déterminer un anticorps non lié dans un milieu liquide, comprenant les étapes consistant à: i) incuber un échantillon dudit milieu liquide en contact avec un support solide sur la surface duquel est fixé un antigène ou haptène spécifique dudit anticorps; ii) séparer le support solide dudit échantillon de milieu

liquide et le rincer avec une solution aqueuse pour éli-

miner toutes les traces dudit échantillon; iii) incuber le support solide en contact avec une suspension aqueuse de cellules bactériennes stabilisées non viables ayant un récepteur actif pour l'immunoglobuline et une enzyme de marquage active; iv) séparer le support solide de ladite suspension et le laver avec une solution aqueuse; et v) incuber ledit support solide en contact avec un substrat convenable et déterminer l'activité enzymatique de l'enzyme

de marquage sur des cellules retenues sur la surface de sup-

port solide.

11. - Procédé selon la revendication 10, prévu pour détermi-

ner un haptène ou antigène dans un milieu liquide dans lequel

le même haptène ou antigène à déterminer est fixé sur la sur-

face du support solide, et dans lequel dans l'étape i) on

ajoute un échantillon d'essais à l'anticorps spécifique du-

dit haptène ou antigène et, par suite de la liaison dudit haptène ou antigène dans ledit échantillon, la quantité d'anticorps disponible pour la liaison à l'haptène ou anti-

gène fixé sur la surface solide est proportionnellement di-

minuée.

12. - Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite suspension aqueuse contient des cellules de staphylococcus stabilisées par traitement à la chaleur et du formaldéhyde pour conserver leur capacitié de liaison et l'activité de

l'enzyme de marquage.

13. - Procédé selon la revendication 12, dans lequel ladite enzyme de marquage est une catalase endogène et en détermine

l'activité de catalase des cellules de staphylococcus.

14. - Procédé selon la revendication 10, comprenant l'incuba-

tion dudit support solide avec-une solution aqueuse de cellu-

les de staphylocoques stabilisées non viables possédant un

récepteur actif pour l'immunoglobuline et une enzyme de mar-

quage active, le gène pour ladite enzyme ayant été inséré

dans une cellule parentale de celle-ci.

15. - Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite suspension aqueuse contient des cellules de streptococcus stabilisées.

16. - Procédé selon la revendication 15, dans lequel ladite

enzyme de marquage est de l'hémolysine endogène et en déter-

mine l'activité d'hémolysine des cellules de streptococcus.

17. - Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite

suspension aqueuse contient une souche Cowan I de staphylo-

coccus aureus contenant un gène pour la formation de B-

lactamase, le gène pour ladite enzyme ayant été inséré dans

une cellule parentale de celle-ci.