FR2490826A1 - Procede pour la mesure de la thyroxine libre ou de la 3,5,3'-triiodothyronine libre dans un echantillon liquide - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION SE RAPPORTE A L'ANALYSE BIOLOGIQUE. ELLE CONCERNE UN PROCEDE DE DETERMINATION IMMUNOLOGIQUE POUR LA MESURE DIRECTE DE LA THYROXINE LIBRE OU DE LA 3,5,3'-TRIIODOTHYRONINE LIBRE DANS UN ECHANTILLON LIQUIDE DANS LEQUEL LA THYROXINE OU LA 3,5,3'-TRIIODOTHYRONINE, RESPECTIVEMENT, EST PRESENTE A LA FOIS A L'ETAT LIBRE ET DANS UN ETAT COMBINE, CE PROCEDE COMPRENANT LES ETAPES SELON LESQUELLES: A.ON COMBINE L'ECHANTILLON AVEC UN PRODUIT DE CONJUGAISON MARQUE THYROXINE-RAIFORT PEROXYDASE OU UN PRODUIT DE CONJUGAISON MARQUE 3,5,3'-TRIIODOTHYRONINE-RAIFORT PEROXYDASE, RESPECTIVEMENT, QUI NE REAGIT PAS NOTABLEMENT AVEC LA GLOBULINE FIXANT LA THYROXINE ET LA PREALBUMINE FIXANT LA THYROXINE INITIALEMENT PRESENTES DANS L'ECHANTILLON ET UN ANTICORPS IMMOBILISE QUI EST SPECIFIQUE POUR LA THYROXINE OU LA 3,5,3'-TRIIODOTHYRONINE, RESPECTIVEMENT; B.ON FAIT INCUBER LE MELANGE RESULTANT; C.ON SEPARE UNE PHASE SOLIDE DE LA PHASE LIQUIDE; ET D.ON MESURE LA QUANTITE DE PRODUIT DE CONJUGAISON MARQUE THYROXINE-RAIFORT PEROXYDASE OU DE PRODUIT DE CONJUGAISON MARQUE 3,5,3'-TRIIODOTHYRONINE-RAIFORT PEROXYDASE, RESPECTIVEMENT, PRESENTE DANS CHAQUE PHASE AU MOYEN DE L'ACTIVITE DU TRACTEUR. UTILISATION PAR LES LABORATOIRES D'ANALYSE MEDICALE.
Description
La présente invention concerne un procédé
pour la mesure de la thyroxine libre ou de la 3,5,3'-
triiodothyronine libre dans un échantillon liquide dans lequel la thyroxine ou la 3,5,3'-triiodothyronine est présente & la fois & l'état libre et à l'état combiné. Le procédé utilise un produit de conjugaison marqué de la thyroxine ou de la 3,5,3'-triiodothyronine avec la raifort peroxydase qui ne réagit pas notablement
avec la globuline fixant la thyroxine et avec la pré-
albumine fixant la thyroxine initialement présentes
dans l'échantillon.
Il est fréquemment nécessaire de déterminer
la concentration de la thyroxine libre dans un échantil-
lon liquide dans lequel la thyroxine est présente à la
fois à l'état libre et dans un état combiné ou lié.
Typiquement, une telle détermination fait partie d'un examen hématologique courant du sérum sanguin ou du plasma pour la prophylaxie ou le traitement de divers
troubles et de diverses maladies.
La thyroxine et la 3,5,3'-triiodothyronine (appelée ci-après triiodothyronine) sont des hormones caractéristiques, secrétées par la glande thyroïde, qui
ont des effets physiologiques importants sur le méta-
bolisme de base des mammifères. Bien que la triiodothy-
ronine présente une plus grande activité hormonale que la thyroxine, il apparaSt que la thyroxine est la principale hormone thyroïdienne en circulation. Ainsi, les observations qui suivent mentionnent surtout la thyroxine, mais sont applicables aussi d'une manière
générale à la triiodothyronine.
La thyroxine est emmagasinée dans la glande
thyroïde sous la forme de thyroglobuline, une glyco-
protéine, et est libérée par protéolyse. Dans le sang,
la thyroxine est liée dans une large mesure aux protéi-
nes du plasma, principalement à la globuline fixant
la thyroxine et à la préalbumine fixant la thyroxine.
Une quantité petite, mais finie, de thyroxine est libre ou non liée, et c'est cette thyroxine libre qui est
l'entité physiologiquement active. Ainsi, la détermina-
tion de la thyroxine libre dans le sang est une partie importante du diagnostic d'un fonctionnement défectueux de la glande thyroide.
Le principal problème associé à une détermina-
tion quelconque de thyroxine libre est le fait que la thyroxine libre est présente dans le sérum humain à de très faibles concentrations. L'intervalle normal admis est d'environ 0,8 à environ 2,5 ng de thyroxine libre par décilitre de sérum (8"25 pg/cm). Cet intervalle est typiquement très au-dessous d'environ 1 % de la thyroxine totale normalement présente dans le sérum
et exige des mesures précises en parties par trillion.
La thyroxine libre a été déterminée par dialyse à l'équilibre, méthode longue et intensive pour l'opérateur. De plus, il existe deux déterminations immunologiques connues pour la mesure de la thyroxine libre. La première (Corning Nedieal and Scientific Division, Corning Glass Works 9 edfield, Massachusetts) est une méthode à deux tubes qui mesure la vitesse de transfert de la thyroxine des protéines fixatrices à l'anticorps spécifique de la thyroxine. Cette méthode, qui est décrite plus en détail ci-après, exige un chronométrage soigneux de la fixation de l'antigène par l'anticorps dans deux tubes séparés. La deuxième méthode (Clinical'Assays Division, Travenol Laboratories, Inc., Deefield, Illinois) utilise un seul tube dans lequel l'anticorps spécifique de la thyroxine est mis à incuber avec l'échantillon pendant un laps de temps réglé avec précision; la quantité d'antigène fixée par
l'anticorps est en relation avec la thyroxine libre ini-
tialement présente. Le complexe anticorps-antigène est séparé de l'échantillon et est ensuite mis à incuber
avec de la thyroxine marquée par un traceur radio-
actif qui se complexe avec les sites de fixation non
occupés sur l'anticorps. Ainsi, la quantité de radio-
activité fixée par le complexe est inversement propor-
tionnelle & la concentration de thyroxine libre initiale-
ment présente dans l'échantillon.
-La première méthode ci-dessus est enseignée essentiellement par le brevet des E.U.A. N 4 046 870 qui décrit un procédé pour déterminer la concentration d'hormone thyroïdienne libre dans un échantillon de sérum sanguin qui comprend les étapes selon lesquelles on analyse l'échantillon par détermination immunologique
(typiquement détermination radio-ilmunologique) con-
cernant l'hormone thyroïdienne désirée en présence ou en l'absence d'un agent de blocage tel qu'un merthiolate
(thimérosal) ou l'acide 8-anilino-1-naphtalène-sulfo-
nique pour établir un différentiel de fixation de
l'hormone thyroïdienne et ensuite on établit une corré-
lation entre ce différentiel et une courbe de référence représentant la relation entre les concentrations des hormones thyroïdiennes libres respectives et les
différentiels de fixation.
Il existe encore un besoin, toutefois, con-
cernant un procédé rapide, sensible et précis pour la mesure directe de la thyroxine libre dans mun échantillon liquide dans lequel la thyroxine est présente & la fois à l'état libre et dans un état combiné. Ce besoin a été satisfait maintenant par la découverte qu'un produit de conjugaison marqué de thyroxine et de raifort peroxydase qui ne réagit pas notablement avec la globuline fixant la thyroxine et avec la préalbumine fixant la thyroxine initialement présentes dans l'échantillon peut être utilisé dans une détermination iumunologique pour permettre la mesure de la thyrosine libre dans l'échantillon. Comme la raifort peroxydase dans le produit de conjugaison conserve sensiblement son activité quand il est complexé avec un anticorps immobilisé qui est spécifique pour la thyroxine, le produit de conjugaison convient particulièrement bien pour une détermination immunologique enzymatique en
phase solide de la thyroxine.
En général, des produits de conjugaison
haptène-enz7me sont bien connus dans la technique anté-
rieure. Voir, par exemple, les brevets des E.U.A.
N 3 654 090, 3 791 932, 3 839 153, 3 850 752,
3 879 262, 4 016 043, 4 040 907 et le brevet des EUA redélivré N 26 169. Plusieurs de ces brevets sont
particulièrement intéressants.
Le brevet des E.U.A. Ne 3 839 153 décrit une détermination immunologique enzymatique qui utilise
une méthode A deux anticorps. Ainsi, un produit de con-
jugaison haptène (ou antigène)-enzyme et un anticorps soluble spécifique pour l'haptène (ou l'antigène)
sont mélangés avec l'échantillon soumis à la détermi-
nation. On ajoute ensuite un anticorps insolubilisé au mélange réactionnel, dans lequel l'anticorps insolubilisé est spécifique pour l'anticorps soluble utilisé précédeument. Le complexe résultant anticorps insolubilisé-anticorps-haptène (ou antigène)-enzyme est ensuite séparé du mélange et on détermine l'activité enzymétique de chaque phase séparée. La peroxydase est incluse dans les exemples d'enzymes utilisables, mais il n'y a aucune suggestion que le procédé soit utilisable pour la détermination de la
thyroxine dans un échantillon, et il ne l'est certaine-
sent pas pour la thyroxine libre.
Le brevet des E.U.A. N 3 850 752 concerne
aussi des déterminations immunologiques enzymatiques. Briè-
vement, le brevet enseigne un procédé pour la déter-
mination d'un haptène qui comporte l'addition à un échantillon à analyser d'un produit de conjugaison
haptène-enzyme- et d'un anticorps insolubilisé spécifi-
que pour l'haptène. Le complexe anticorps insolubilisé-
haptène-enzyme résultant est ensuite séparé du mélange et on détermine l'activité enzymatique de chaque phase
résultante. La peroxydase est incluse dans les exem-
ples d'enzymes utilisables et le thyroxine est incluse dans les exemples des haptènes qui peuvent être déterminés
par la méthode décrite. Il n'y a pas, toutefois, d'ensei-
gnement particulier concernant un produit de conJugaison thyroxineperoxydase ou concernant la détermination d'un haptène libre, par exemple de la thyroxine libre. Le brevet des E.U.A. N 3 879 262 concerne aussi des déterminations immunologiques enzymatiques. Le procédé décrit est en réalité un perfectionnement de
chacun des procédés décrits dans les brevets des E.U.A.
NI 3 839 153 et 3 850 752. Ce perfectionnement exige que la nature de la combinaison entre l'haptène et l'enzyme diffère de celle de la combinaison entre l'haptène et une matière immunogène, ce dernier produit de conjugaison étant utilisé pour produire des anticorps spécifiques pour l'haptène chez un animal. La thyroxine est incluse dans la liste des haptènes utilisables et les peroxydases sont incluses dans la liste des enzymes utilisables. Toutefois, il n'y a pas d'enseignement particulier concernant un produit de conjugaison thyroxine-peroxydase. De plus, le procédé décrit n'est
pas utilisé pour déterminer l'haptène libre.
Enfin, le brevet des E.U.A. NO 4 040 907 con-
cerne des produits de conjugaison de polyiodothyronine ou de thyroxine avec des enzymes. Les enzymes dans ces produits de conjugaison doivent subir une modification
importante d'activité pour 9tre utiles dans des déter-
minations immunologiques enzymatiques.
On connatt deux références supplémentaires qui
décrivent des produits de conjugaison thyroxine-peroxydase.
La première est la suivante: R.F. Schall, Jr. et autres, Clin. Chem.,, 24, 1801 (1978); un résumé de l'article
se trouve dans Clin. Chem. 24, 1033 (1978). Cette réfé-
rence décrit une détermination immunologique enzymati-
que manuelle pour la thyroxine. Le mode opératoire détermine la quantité totale de thyroxine dans le sérum, et est le suivant: L'échantillon de sérum est mélangé
avec la solution de produit de conjugaison thyroxine-
raifort peroxydase qui contient aussi un agent de blocage, l'acide 8anilino-1-naphtalènesulfonique,
et un anticorps immobilisé spécifique pour la thyroxine.
Le mélange résultant est mis à incuber et est centri-
fugé. On lave la phase solide et on ajoute à la phase solide une solution substrat-chronogène. On laisse la couleur se développer et ensuite on la fixe. On mesure le facteur d'absorption et on détermine la teneur totale en thyroxine de l'échantillon d'après une courbe de
référence.
La deuxième référence supplémentaire est la suivante: G. Kleinhammer et autres, "Enzyme Immuno Assay for Determination of the Thyroid Binding Index", un article présenté à l'assemblée annuelle de l'American Association for Clinical Chemistry, juillet 1978; un
résumé a été publié dans Clio chem., 24, 1033 (1978).
Selon ce document, les premières tentatives en vue de
trouver une méthode de détermination immunologique enzy-
matique capable de détecter des concentrations anormales de globuline fixant la thyroxine (TBG) n'ont pas été couronnées de succès, principalement parce que le produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase ne se liait
pas & TBG. Il est indiqué que la détermination est effec-
tuée comme suit: A un échantillon de sérum, on ajoute une quantité déterminée de thyroxine, cette quantité étant supérieure à la quantité de TBG non liée dans l'échantillon. La quantité de thyroxine en excès non
fixée par TBG est mesurée par détermination immunoelo-
gique enzymatique en utilisant le produit de conjugaison thyroxineraifort peroxydase et des tubes rev9tus d'anticorps spécifique pour la thyroxine. Ainsi, ce
procédé n'a pas été utilisé pour déterminer la thyro-
xine libre dans le sérum. Comme le produit de conju-
gaison triiodothyronine-raifort peroxydase ne se liait pas non plus à TBG, ce produit de conjugaison peut 9tre utilisé à la place du produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase, mais ce dernier était préféré en raison de la plus forte affinité de TBG pour
la thyroXine.
Il y a lieu de noter que l'on connatt des déterminations iumunologiques enzymatiques spécifiques pour la thyroxine totale. Ces déterminations sont
basées sur la maléate déshydrogénase ou sur une phospha-
tase alcaline; voir, par exemple, P.R. Finley et R.J.
Williams, Clin. Chem., 24, 165 (1978); A.P. Jaklitsch et autres, Clin. Chem., 21, 1011 (1975); F. VanLente et D.J. Fink, Clin. Chem., 24, 387 (1978); R.S. Galen et D. Forman, Clin. Chem., 23, 119 (1977); et brevet
japonais N 77/108017.
La présente invention a donc pour but de
fournir un procédé de détermination immunologique enzyma-
tique pour la thyroxine libre dans un échantillon liquide dans lequel la thyroxine est présente A la
fois & l'état libre et dans un état combiné.
C'est aussi un but de la présente invention de fournir un procédé de détermination immunologique non-enzymatique pour la mesure de la thyroxine libre dans un échantillon liquide dans lequel la thyroxine est présente A la fois à l'état libre et dans un état combiné.
Un autre but est de fournir un procédé de déter-
mination imunologique enzymatique pour la triiodothyronine
libre dans un échantillon liquide dans lequel la tri-
iodothyronine est présente A la fois A l'état libre et
dans un état combiné.
Un autre but est de fournir un procédé de détermination immunologique nonenzymatique pour la mesure de la triiodothyronine libre dans un échantillon liquide dans lequel la triiodothyronine est présente à
la fois à l'état libre et dans un état combiné.
D'autres buts et avantages de l'invention
résulteront encore de la description ci-après et des
revendications annexées.
La présente invention concerne donc un procédé
de détermination immunologique pour la mesure de la thy-
roxine libre dans un échantillon liquide dans lequel la thyroxine est présente à la fois A l'état libre et dans un état combiné, ce procédé de détermination immunologique comprenant les étapes selon lesquelles: A. on combine l'échantillon avec un produit de conjugaison marqué thyroxineraifort peroxydase qui ne réagit pas notablement avec la globuline fixant la
thyroxine et la préalbumine fixant la thyroxine initiale-
ment présentes dans l'échantillon et un anticorps immo-
bilisé qui est spécifique pour la thyroxine; B. on fait incuber le mélange résultant; C. on sépare une phase solide de la phase liquide;
D. on mesure la quantité de produit de con-
jugaison marqué thyroxine-raifort peroxydase présente
dans chaque phase au moyen de l'activité du traceur.
La présente invention concerne aussi un procédé de détermination imunologique pour la mesure de la triiodothyronine libre dans un échantillon liquide dans lequel la triiodothyronine est présente & la fois à l'état libre et dans un état combiné, ce procédé de détermination immunologique comprenant les étapes selon lesquelles s A. on combine l'échantillon avec un produit de conjugaison marqué triiodothyronineraifort peroxydase qui ne réagit pas notablement avec la globuline fixant la thyroxine et avec la préalbumine fixant la thyroxine
initialement présentes dans l'échantillon et un anti-
corps immobilisé qui est spécifique pour la triiodothyronine; B. on fait incuber le mélange résultant; C. on sépare une phase solide de la phase liquide; et D. on mesure la quantité de produit de conjugaison marqué triiodothyronine-raifort peroxydase présente dans chaque phase au moyen de l'activité du traceur. Aux dessins annexés: La figure 1 est une courbe de référence pour détermination immunologique enzymatique de la thyroxine obtenue avec un anticorps immobilisé sur un support en particules. La figure 2 montre les affinités de fixation d'un produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase et de la 125I-thyroxine pour la globuline fixant la thyroxine. La figure 3 montre l'affinité de fixation d'un produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase
pour la préalbumine fixant la thyroxine.
La figure 4 est une courbe de référence pour détermination immunologique enzymatique de la thyroxine libre obtenue avec un anticorps immobilisé dans un tube
A essai en matière plastique.
La figure 5 est une courbe de référence pour
détermination immunologique de la thyroxine libre.
Tels qu'utilisés ici, les termes "insolubilisé" et "'immobilisé' sont synonymes et exigent seulement une
insolubilité importante dans des milieux aqueux.
Pour plus de commodité dans la description ci-
après, l'expression "produit de conjugaison haptène-
raifort peroxydase", ainsi que ses variantes, doit 9tre
comprise comme englobant & la fois le produit de conju-
gaison thyroxine-raifort peroxydasé et le produit de
conjugaison triiodothyronine-raifort peroxydase.
Il sera évident pour l'homme de l'art que quelle que soit la nature du traceur dans le produit de conjugaison marqué haptène-raifort peroxydase, il est
nécessaire de combiner l'haptène à la raifort peroxydase.
De plus, quand le traceur n'est pas la raifort peroxydase elle-même, l'une quelconque des portions haptène et raifort peroxydase ou les deux peuvent ttre marquées
avant ou après la préparation du produit de conjugaison.
Ainsi, la préparation du produit de conjugaison peut 8tre considérée comme comprenant (a) la combinaison de
l'haptène avec la raifort peroxydase et (b) éventuelle-
ment l'introduction d'un traceur autre que la raifort peroxydase dans le produit de -conjugaison avant ou après (a), les deux étapes étant conduites selon des modes opératoires bien connus de l'homme de l'art. A
titre d'illustration seulement, on trouve des descrip-
tions générales de procédés de combinaison haptène-
enzyme dans les brevets des EsUoA. Ne 3 839 153,
3 850 752, 3 879 262 et 4 040 907.
Les traceurs utilisables pour le produit de conjugaison haptène-raifort peroxydase sont divisés commodément en deux catégories générales: traceurs
enzymatiques et traceurs non-enzymatiques.
Les traceurs enzymatiques comprennent évidem-
ment la raifort peroxydase puisque l'enzyme conserve
une activité enzymatique notable quand elle est com-
binée avec l'haptène. D'autres enzymes, toutefois,
peuvent aussi 9tre présents dans le produit de conjugai-
son haptène-raifort peroxydase, l'activité enzymatique intéressante étant celle de ces autres enzymes. Comme
en ce qui concerne la préparation du produit de conju-
gaison haptène-raifort peroxydase, la combinaison d'un enzyme antre que la raifort peroxydase est effectuée
par des procédés bien connus de l'homme de l'art.
En général, le traceur nonenzymatique peut
être n'importe quel traceur connu de l'homme de l'art.
Ainsi, le produit de conjugaison peut 9tre marqué par un traceur radioactif, un traceur fluorescent, un traceur chimio-luminescent, ete.o Bien que les techniques de marquage soient typiquement connues, plusieurs des procédés les plus largement utilisés sont examinés brièvement. Le procédé de choix dans la préparation d'un produit de conjugaison haptène-raifort peroxydase marqué par un traceur radio-actif dépend dans une large
mesure de l'isotope radio-actif qui doit 9tre utilisé.
Les exemples des plus utilisables de ces isotopes com-
I1 prennent, entre autres, H3, C14, S35, I125 et I131
I125 et I131 étant particulièrement préférés.
En général, l'un quelconque des traceurs fluo-
rescents connus peut gtre utilisé dans la préparation d'un produit de conjugaison marqué par traceur fluores- cent. Les exemples de traceurs fluorescents utilisables
comprennent, entre autres, l'isothiocyanate de flueres-
céine, la tétraéthylrhodamine, la fluorescamine, etc..
Evidemment, le procédé de préparation choisi dans un cas donné quelconque dépend, au moins en partie, de
la structure du traceur fluorescent. Typiquement, tou-
tefois, le traceur fluorescent peut 9tre lié par cova-
lence selon des techniques normales à l'haptène ou
A la raifort peroxydase. En variante, le traceur fluores-
cent peut Otre combiné avec l'une ou l'autre portion au moyen d'un agent de couplage intermédiaire tel
qu'un polypeptide.
Des principes similaires s'appliquent & la préparation d'un produit de conjugaison marqué par traceur chimioluminescent. Les traceurs chimioluminescents utilisables comprennent, entre autres, le luminol, la luciférine, la lucigénine, l'acridine, le pyrogallol, l'indol, la riboflavine, la lophine, le bleu de
méthylène, le xiloxène, etc..
Il sera évident pour l'homme de l'art que quel que soit le traceur nonenzymatique utilisé ou le procédé particulier utilisé pour préparer le produit de conjugaison marqué, le traceur doit conserver son r8le prévu sans nuire à la capacité de l'haptène de se lier à l'anticorps antihaptène ou à la caractéristique de
non-interaction du produit de conjugaison.
La préparation du complexe d'un produit de conjugaison haptène-raifort peroxydase marqué avec un anticorps immobilisé spécifique pour l'haptène est effectuée selon les procédés connus. Dans la pratique, il est nécessaire seulement de mettre le produit de conjugaison et l'anticorps immobilisé ensemble dans
un milieu aqueux.
En général, l'anticorps spécifique pour l'haptène
est produit selon des procédés connus. Typiquement, tou-
tefois, l'antisérum ainsi obtenu n'est pas traité ensuite pour donner l'anticorps purifié. Pour des raisons de commodité, l'anticorps immobilisé est préparé directement
à partir de l'antisérun. Ainsi, la préparation de l'anti-
corps immobilisé donne inévitablement aussi des protéines immobilisées, par exemple des globulines, de divers types, dont aucune n'est importante en ce qui concerne la présente invention. En conséquence, l'expression "anticorps immobilisé" n'implique aucun degré particulier de pureté, mais il sera évident pour l'homme de l'art que des préparations d'anticorps immobilisés dérivées
directement d'antisérum exigeront une plus grande quantité.
de cette préparation par unité d'haptène qu'une telle
préparation dérivée d'antisérum.purifié.
L'immobilisation de l'anticorps, à son tour, est effectuée selon des techniques connues. En général, ni le support ni la technique d'immobilisation ne sont critiques, du moment que l'on évite des effets nuisibles importants. Ainsi, les supports peuvent 9tre organiques ou inorganiques, poreux ou non, et d'une conformation ou d'une forme désirées quelconques. le support peut ttre en particules, cela allant d'une poudre finement divisée à une matière granulaire grossière, ou le support peut 9tre un article continu de forme déterminée tel qu'une feuille plane ou courbe ou d'une pastille, ou un article tridimensionnel tel qu'un tube rectangulaire
ou cylindrique ou un monolithe complexe. Dans la prati-
que, le support sera très souvent en particules relative-
ment fines, par exemple d'environ 0,15 à environ 0,84 am, ou sera un article tridimensionnel, par exemple un tube cylindrique fermé à une extrémité, c'est-à-dire un
tube à essai.
Des exemples de supports organiques utilisables comprennent, entre autres, des polyesters, comme du polyr-(éthylène-têréphtalate); des polyamides, comme du
nylon 6 et du nylon 6,6; des polyacrylates; des poly-
méthacrylates; des polyacrylamides; du poly(acide acry-
lique); du poly-(acide méthacrylique); du poly(acide ga-
lacturonique); du poly(acide aspartique); des copoly-
mères éthylène-anhydride maléique; des polyoléfines, comme du polyéthylène, du polypropylène, du polybutène et du polybutadiène; du poly-(alcool vinylique); du poly(chlorure de vinylidène); de la cellulose; des sels d'agarose; des sels de dextrane; des polysaccharides;
des polypeptides; du collagène; etc..
Les supports inorganiques peuvent ttre
classés en supports siliceux et oxydes de métaux non-
siliceux. Des exemples de supports siliceux sont, entre autres, le verre, la silice, la wollastonite,
la bentonite, la cordiérite, etc.. Des exemples d'oxy-
des métalliques non-siliceux sont, entre autres, l'alu-
mine, la spinelle, l'apatite, l'oxyde de nickel, l'oxyde
de titane, la zircone, etc..
Les supports préférés sont de nature inorga-
nique, des matières siliceuses étant particulièrement préférées. Les supports spécialement préférés sont la silice et le verre. De préférence,le support sera poreux,-de manière A fournir une plus grande quantité
d'anticorps par volume ou masse unitaire de support.
De plus, la surface du support peut 8tre modifiée par des méthodes bien connues dans la technique, comme par attaque ou dépolissage, traitement chimique, revêtement
chimique, etc..
Quand le support est un article tridimensionnel tel qu'un tube à essai, le support est de préférence une
matière plastique telle que du polyéthylène ou du poly-
propylène. Ainsi, un exemple particulièrement préféré de l'utilisation d'un article tridimensionnel est un tube
à essai en matière plastique ayant un anticorps appli-
que sur sa partie intérieure inférieure.
En général, l'anticorps peut ttre immobilisé par des moyens connus quelconques qui peuvent varier
d'une simple adsorption A une combinaison chimique.
L'adsorption, évidemment, comporte habituellement la mise en contact d'une solution aqueuse de l'anticorps (antisérum) & immobiliser avec le support pendant un temps suffisant pour permettre le degré désiré (ou
maximal) d'immobilisation. L'immobilisation par combinai-
son chimique comporte typiquement le traitement du support par un ou plusieurs composés chimiques, cela étant suivi de la mise en contact du support traité avec une solution aqueuse de l'anticorps. Parmi les
composés chimiques qui peuvent 8tre utilisés pour trai-
ter le support, et spécialement le support inorganique, se trouvent l'odianisidine (brevet des E.U.A. N 3 983 000), des isocyanates polymères (brevet des E.U.A. N 4 071 409), des silanes (brevets des EoUAQ. N 3 519 538, 3 652 761
et 3 669 841), etc.. Voir aussi les brevets des E.U.A.
N 3 930 951 et 3 933 589. Comme exemples de techniques utilisables pour l'immobilisation d'anticorps sur des
supports inorganiques, voir le brevet des E.U.A.
N 4 034 073; M.K. Weibel et autres, Biochem. Biop__.
* Res. Comm., 44; 347 (1971); et H.H. Weetall, Seience,
166, 615 (1969).
Il sera évident pour l'homme de l'art que
la détermination immunologique enzymatique et la dé-
termination immunologique non-enzymatique décrites ici sont en fait très similairesq différant principalement par la méthode utilisée pour déterminer ou mesurer la quantité de produit de conjugaison présente, cette méthode dépendant de la nature du traceur incorporé dans le produit de conjugaison. Ainsi, les paramètres qui concernent la méthodologie peuvent 8tre examinés d'une manière générale, étant entendu que ces paramètres s'appliquent aux déterminations immunologiques tant enzymatiques que non-enzymétiques. En conséquence, le terme "produit deconjugaison" est utilisé partout
dans la description ci-après sans référence à un
traceur particulier quelconque.
La première étape dans chacune de ces détermi-
nations iumuunologiques comprend la combinaison de l'é-
chantillon avec un produit de conjugaison qui ne réagit pas notablement avec la globuline fixant la thyroxine et la préalbumine fixant la thyroxine initialement présentes dans l'échantillon et un anticorps immobilisé
qui est spécifique pour l'haptène.
La quantité de produit de conjugaison utilisée n'est pas critique, mais pour porter à son maximum la sensibilité de la détermination immunologique, la quantité de produit de conjugaison ajoutée donnera de préférence
une quantité de produit de conjugaison libre approxima-
tivement équivalente, en moles, à la quantité d'haptène
libre initialement présente dans l'échantillon.
D'une manière similaire, la quantité d'anticorps immobilisé utilisée n'est pas critique, du moment que cette quantité n'est pas suffisante pour enlever aux protéines fixatrices une proportion importante de l'hapténe lié. C'est-à-dire que l'anticorps immobilisé doit être présent en quantité suffisante pour fixer une proportion d'haptène libre suffisante pour fournir une sensibilité adéquate durant l'étape de mesure. Dans la pratique, la
quantité appropriée d'anticorps immobilisé est détermi-
née facilement par quelqu'un ayant une expérience ordi-
naire dans cette technique et elle dépend, au moins en partie, du titre de l'antisérum et du niveau ou du degré d'immobilisation de l'anticorps. En ce qui concerne la réaction immunochimique entre l'haptène et l'anticorps immobilisé, il y a lieu de noter que l'expression -30 "haptène libre" se rapporte nécessairement à tout l'haptène qui n'est pas dans un état lié, c'est-à-dire qui n'est pas lié à la globuline fixant la thyroxine et à la préalbumine fixant la thyroxine, entre autres protéines,
initialement présentes dans l'échantillon. Ainsi, l'ex-
pression "haptène libre" englobe la totalité de l'haptène qui est capable de se lier ou de se complexer avec l'anticorps anti-haptène et, en conséquence, englobe à la fois l'haptène libre initialement présent dans l'échantillon et l'haptène ajouté ensuite à l'échantillon sous la forme du produit de conjugaison. Il en résulte donc que l'expression "haptène marqué" se rapporte simplement à l'haptène présent sous la forme du produit
de conjugaison.
La deuxième étape comprend l'incubation du mélange résultant de la première étape, de préférence pendant un temps suffisant pour que l'on arrive à la
fixation d'équilibre ou qu'on s'en rapproche beaucoup.
En général, l'incubation peut tre effectuée à une température quelconque qui n'est pas destructrice pour les constituants du mélange. Typiquement, la température d'incubation sera comprise entre la température ambiante environ et 40 0 environ. Les durées d'incubation ne sont pas critiques. Comme on l'a déjà indiqué, il est préféré que ces durées soient suffisantes pour que l'on arrive à la fixation d'équilibre ou qu'on s'en
rapproche beaucoup. Normalement, des durées d'incuba-
tion d'environ une heure à 370 sont suffisantes., mais des durées plus longues ou plus courtes peuvent souvent
8tre utilisées.
La troisième étape comprend la séparation d'une phase solide d'une phase liquide. Cette séparation
peut 8tre effectuée par des moyens connus quelconques.
Par exemple, avec un support en particules, cette
séparation peut 8tre effectuée par filtration ou centri-
fugation, la centrifugation étant préférée pour des raisons de vitesse et de commodité. Quand le support est un article tridimensionnel tel qu'un tube à essai,
la séparation peut être effectuée en décantant sim-
plement la phase liquide ou en l'aspirant hors du tube.
La phase solide, évidemment, quelle que soit la configuration du support, est constituée d'anticorps
immobilisé et/ou de complexe anticorps immobilisé-
haptène. De plus, il est évident que le complexe peut contenir de l'haptène provenant de deux sources: (1) l'haptène libre qui était initialement présent dans
l'échantillon et (2) de l'haptène sous la forme du pro-
duit de conjugaison. En fait, le succès du procédé
dépend de la présence dans le complexe d'haptène prove-
nant des deux sources, car il y a compétition entre l'haptène provenant des deux sources pour un nombre limité de sites de fixation d'anticorps. En maintenant constantes les quantités de produit de conjugaison et d'anticorps immobilisé, la quantité d'haptène provenant de la seconde source présente dans le complexe est inversement proportionnelle à la quantité d'haptène provenant de la première source, c'est-à-dire d'haptène
libre initialement présent dans l'échantillon.
La quatrième étape comprend la mesure de la quantité de produit de conjugaison présente dans chaque
phase. De préférence, on mesurera la quantité de pro-
duit de conjugaison présente dans la phase solide. Evi-
demment, la méthode de mesure dépendra de la nature du produit de conjugaison. Une partie intégrante de l'étape de mesure est la corrélation de la quantité de
produit de conjugaison présente sur l'anticorps immo-
bilisé avec une courbe de référence qui représente la relation entre la quantité de produit de conjugaison
présente et la concentration d'haptène libre initiale-
ment présente dans l'échantillon. La préparation de la courbe de référence est effectuée selon des méthodes bien connues et est bien à la portée de l'homme de l'art. La présente invention est encore illustrée, mais pas limitée, par les exemples qui suivent. A moins d'indication contraire, toutes les températures sont
en oc.
EXEMPLE 1
Détermination de la thyroxine libre dans des échantillons
de sérum humain par détermination immunologigue enzymati-
que en utilisant un anticorps immobilisé sur un support
en particules.
Matières et réactifs 1. On prépare des étalons de thyroxine libre en utilisant la détermination cinétique de thyroxine
libre de Corning (IMO PHSE F) ree Thyroxine Radio-
immunoassay, Corning Medical, Medfield, Massachusetts). Ces étalons sont à base de sérum et conprennment 0,5, 1, 2, 4 et 6 ng de thyroxine libre, respectivement, par
décilitre de sérum.
2. On obtient de l'anticorps anti-thyroxine
par l'immunisation de lapins blaoncs de Nouvelle Zélande.
L'anti-sérum résultant a un titre d environ 1:50 000.
3. Le support utilisé pour immobilisation de l'anticorps est le dérivé aryliamne de verre silanisé à pores contrôlés La grosseur moyene des particules
est d'environ 1Am avec un diamèetre moyen des pores d'en-
viron 550. 'atis immobilisé (nticorps immobilisé, IMA) est préparé selon Weetall et Filbert, en utilisant un rapport de 0,5 grame de verre par om3 d'antis6rum; voir W.B. Jakoby et H1. Wilchek, Editeurs, "Methods in Enzymology", Volume 34B9 Aeadeuic Press, Inc., New York, 1974, pages 5972. Brièvement, le verre est nettoyé dans une solution à 5 % d'acide nitrique, lavé et traité par une solution à 10% de gammaaminopropyltriéthoxysilane
dans de l'eau distillée à un pH de 3,45. le verre sila-
nisé résultant est mis à réagir avec du chlorure de p-
nitrobenzoyle dans du chloroforme contenant 10 % (v/v) de triéthylamine conmme agent de fixation de l'acide chlorhydrique. On effectue ensuite une réduction du
groupe nitro en traitant le dérivé 7-nitrobenzoylamino-
alcoylé du verre par une solution aqueuse à 10% de
dithionite de sodium. Le dérivé paminobenzoylamino-
alcoylé résultant est diazoté au moyen d'acide nitreux produit in situ à partir d'acide chlorhydrique et de nitrite de sodium. On lave le produit diazoté et on l'ajoute à de l'antisérum à un pH de 8-9. L'IMA résultant est lavé plusieurs fois et remis en suspension dans un tampon. La suspension d'IMA résultante contient 50 mg
de verre par cm3 et environ 50/.tg d'IMA par cm3.
4. Le produit de conjugaison utilisé est un produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase
(Organon Diagnostics, El Monte, Californie).
5. Le tampon utilisé dans toutes les expériences est une solution O,03M de phosphate de sodium au pH
7,4 contenant 0,1% d'albumine de sérum bovin.
6. la composition de la solution servant de substrat pour l'enzyme est la suivante: 0,033 M acide
citrique, 0,066 M phosphate de sodium; 0,0065 M dichlor-
hydrate d'o-phénylênediamine et 0,0021M peroxyde d'urée;
le pH du tampon est de 5,0 + Osl0,1.
7. La solution arrgtant le développement de couleur est une solution 1,0M d'acide citrique contenant
0,1 % d'acide de sodium.
8. La solution de lavage de l'IMA contieXt 0,05 % de TWEENW 80 (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pennsylvanie) dans une solution aqueuse & 0, 85% de
chlorure de sodium.
9. Des échantillons de sérum humain sont fournis
par Metpath et un gynécologue local. Tous les échantil-
lons sont analysés d'abord en ce qui concerne la thyroxine
libre et totale par des procédés de la technique anté-
rieure (c'est-à-dire dialyse à l'équilibre et d4termi-
nation radioimmunologique).
Préparation de la courbe de référence A 20 /1 de chaque étalon de thyroxine dans un tube à essai en matière plastique séparé, de 12 x 75 am, on ajoute 0,1 cm3 de produit de conjugaison (environ
200 pg de thyroxine par détermination radioimmunologique).
Au mélange résultant, on ajoute I cm3 (environ 50 g) de IMA. On met le mélange à incuber pendant 30 minutes à 37e0. On centrifuge le mélange et on lave deux fois la phase solide en ajoutant chaque fois 2 cm3 de solution de lavage, en faisant tourbillonner le mélange et en le
centrifugeant pendant cinq minutes à environ 3 000 tpm.
A la phase solide lavée, on ajoute ensuite, selon un programme déterminé dans le temps, en mélangeant, 2 cm3 de solution de substrat pour enzyme. Après une
période d'incubation de 15 minutes exactement & la tem-
pérature ambiante, on arrgte le développement de cou- leur par l'addition de 1 cm3 de solution d'arrêt. On détermine spectrophotométriquement la densité optique à 455 nu de chaque solution. Les résultats ainsi obtenus sont reportés en densité optique en fonction de la concentration de thyroxine libre en ng/dl. Voir la figure
1 qui montre clairement que la détermination est sensi-
ble à de petits changements dans la concentration de thyroxine libre dans l'intervalle d'environ 0,5 à
environ 6 ng/dl.
Analyse d'échantillons de sérum humain On répète le mode opératoire utilisé pour l'obtention des résultats pour la courbe de référence, à ceci près que chaque étalon de thyroxine est remplacé
par un échantillon de sérum humain (expériences effec-
tuées en double). La lecture de densité optique obtenue dans chaque cas est comparée & la courbe de référence
pour donner une concentration de thyroxine libre.
les résultats ainsi obtenus sont résumés dans le
Tableau I qui indique aussi les concentrations de thy-
roxine libre déterminées précédemment.
TABLEAU I
Teneurs en thyroxine libre d'échantillons de sérum humain (ng/dl) Echantillon Présent Procédé selon la N procédé technique antérieure
2-B 1,7 1,4
4-B 2,4 2,4
6-A 2,4 2,0
8-A 1,8 1,4
9-A 1,4 1,3
-A 1,8 1,8
13-A 1,6 1,5
14-A 2,1 2,2
A-2 2,0 1,7
A-13 2,5 2,2
A-14 2,2 2,2
A-15 1,6 2,1
A-17 2,5 2,2
Evaluation des constantes de fixation Une mesure de la solidité de la liaison entre un antigène ou haptène et un anticorps est donnée par la valeur de la constante d'équilibre ou de fixation qui est définie comme suit: [Ag/Ab] K=M [Ag][Ab] o K - constante d'équilibre ou de fixation [Ag/Ab] - concentration du complexe antigène (ou haptène)-anticorps [Ag] concentration de l'antigène (haptène) libre ou non lié [Ab] concentration de l'anticorps libre ou
non lié.
Clairement, plus la valeur de K est grande, plus fortement l'antigène est lié à l'anticorps. Si l'antigène lié et l'antigène libre peuvent 9tre séparés et si on peut mesurer la quantité liée, alors on peut déterminer la valeur de K en construisant une courbe de Scatchard; voir, par exemple, E. D. Day, "Advanced Immunochemistry", Williams and Wilkens Company,Baltimore, Md., 1972, pages 118 et suivantes. Un tel mode opéra- toire convient particulièrement bien pour des systèmes de détermination immunologique en phase solide car l'antigène lié est séparé facilement de l'antigène
libre ou non lié.
Pour le produit de conjugaison thyroxine-
raifort peroxydase, la valeur de K est déterminée
comme suit. Une solution de réserve du produit de con-
jugaison est analysee en ce qui concerne la teneur totale
en thyroxine au moyen d'une détermination radioimmunolo-
gique classique pour donner la concentration du produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase. Une certaine quantité de l'anticorps immobilisé utilisé ci-dessus est ajoutée à une portion aliquote de la solution de - réserve de produit de conjugaison et le mélange résultant est mis à incuber. La phase solide est ensuite séparée par centrifugation. La phase liquide est analysée
en ce qui concerne la thyroxine totale comme ci-dessus.
La différence entre les deux concentrations de produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase représente la quantité de produit de conjugaison qui a été complexée par l'anticorps immobilisé. On analyse ensuite l'anticorps immobilisé, ou la phase solide, par la méthode colorimétrique décrite ci-dessus, ce qui donne une valeur de densité optique qui est attribuable à
la quantité connue de produit de conjugaison lié à l'anti-
corps immobilisé. Cela permet d'exprimer en unités de densité optique la quantité de produit de conjugaison
lié. On ajoute ensuite diverses dilutions de cette so-
lution de réserve dans une série de tubes contenant des quantités identiques de IMA. Les mélanges résultants sont mis à incuber pendant une heure et centrifugés. On décante le liquide surnageant et on détermine par la méthode colorimétrique déjà décrite la quantité de produit de conjugaison liée à l'IMA ou complexée avec lui. D'après la quantité liée et la quantité totale connue ajoutée initialement, on calcule pour chaque dilution la fraction de produit de conjugaison qui s'est liée a l'IMA. Les valeurs nécessaires pour la courbe de Scatchard
sont données dans le Tableau II.
TABLEAU II
Résultats pour établissement de la courbe de Scatchard
concernant le produit de conjugaison thyroxine-
raifort peroxydase Dilution de la Fraction Quantité liée solution de réserve liée/libre x 1013 moles Série Ia
1:1000 0,023 0,50
1: 500 0,021 0,91
1: 250 0,018 1,52
1: 125 0,013 2,28
1:62,5 0,0085 2,95
1:31,2 0,0059 4,10
1:16 0,0032 4,45
Série Ib
1:1000 0,0089 0,18
1: 500 0,0077 0,32
S1: 250 0,0063 0,52
1:125 0,0066 1,09
1: 62,5 0,0055 1,68
1: 31,2 0,0051 3,38
1: 16 0,0036 4,7
aSérie I: en l'absence de protéine de sérum humain ajoutée bSérie II: en présence de protéine de sérum humain ajoutée On utilise les résultats du Tableau Il en portant en ordonnées ceux de la deuxième colonne et en abscisses ceux de la troisiSme colonne. Les courbes résultantes sont sensiblement linéaires, leurs pentes - 24 étant égales à K. Ainsi, les constantes de fixation draprès les résultats ci-dessus, ainsi que la constante
pour une thyroxine non conjuguée (résultats non repré-
sentés) sont les suivantes:
K
Produit de conjugaison thyroxine- 10 raifort peroxydase, Série I 6 x 10 Produit de conjugaison thyroxine- 10 raifort peroxydase, Série II 7,2 x 10 Thyroxine librea 3 x 1010
adans du sérum humain contenant du merthiolate.
Les différences dans les valeurs ci-dessus
de K ne sont pas expérimentalement significatives.
Ainsi, les résultats montrent clairement que l'affinité du produit de conjugaison pour l'anticorps immobilisé particulier, même en présence d'un sérum contenant
de la globuline fixant la thyroxine, n'est pas notable-
ment différente de l'affinité de la thyroxine non conjuguée pour le même anticorps, cette thyroxine libre
ayant été emptchée par la présence d'un agent de bloca-
ge de se lier à la globuline fixant la thyroxine
présente dans le sérum.
Non-interaction du produit de conjugaison avec la protéine du sérum Evidemment, les valeurs ci-dessus de K indiquent la caractéristique de non-interaction du
produit de conjugaison thyroxine-raifort peroxydase.
L'expérience suivante, toutefois, a été prévue pour montrer cette absence d'interaction et pour comparer la caractéristique de fixation sur TBG du produit de conjugaison et celle de la thyroxine libre ou non conjuguée. Une solution de réserve de TBG (globuline fixant la thyroxine) purifiée est diluée en série, en double, dans des tubes & essai en matière plastique de 12 x 75 mm. Ainsi, on prépare deux séries identiques de six tubes chacune, A et B, chaque tube contenant tl de solution. Les six tubes dans chaque série contiennent, respectivement, 10 'og, 1 /4g, 100 ng, ng, I ng et pas du tout de TBG. Dans chaque tube, on ajoute alors I cm3 de tampon contenant 200/t g d'IMA. De plus, chaque tube de la série A reçoit aussi /À1 de thyroxine marquée par 125I (Stock N 474119-A, Corning Medical) et chaque tube de la série B reçoit /41l de produit de conjugaison. Tous les tubes sont mis & incuber à 37 C pendant une heure. On centrifuge ensuite tous les tubes et dans chaque cas la phase solide
est lavée deux fois comme on l'a déjà décrit. On déter-
mine la quantité de thyroxine contenue dans la phase solide de chaque tube de la série A en mesurant la radiation gamma correspondante et les résultats sont enregistrés en comptes par minute. En utilisant une courbe de référence construite de manière appropriée, on transforme ces résultats en la fraction de thyroxine liée dans chaque tube. La quantité de thyroxine contenue dans la phase solide de chaque tube dans la série B est
déterminée colorimétriquement comme on l'a déjà décrit.
De nouveau, en utilisant une courbe de référence appro-
priée, on transforme les résultats en la fraction de
thyroxine liée dans chaque tube.
Les deux groupes de résultats, quand ils sont normalisés en B/Bmax (o B représente la thyroxine liée) et reportés en fonction de la concentration de TBG (figure 2), indiquent un très bas niveau d'interaction entre le produit de conjugaison et TBG par rapport à
l'interaction de la thyroxine non conjuguée avec TBG.
On répète sensiblement le mode opératoire ci-dessus, à ceci près que la suspension d'anticorps est constituée de 400yg d'IMA dans 0,5 cm3 de tampon, les tubes de la série A étant omis, et la TBG est remplacée par de la préalbumine fixant la thyroxine (TBPA) à des concentrations de 1,28 mg/ml, 640/tg/ml,
320 /g/ml, 160/4g/ml, 80/g/ml et zéro/Ag/ml, respec-
tivement, par échantillon de 25/k1 de solution de TBPA que l'on ajoute dans chaque tube. Ainsi, la quantité totale de TBPA présente dans chaque tube est de 32 mg,
16 mg, 8 mg, 4 mg, 2 mg et zéro mg, respectivement.
Les résultats, quand ils sont normalisés et reportés en lfonction de la concentration de T3BPAI indiquent qu'il n'y a pratiquement pas d'interaction entre le produit de conjugaison et TBPA dans l'intervalle
de concentration étudié (figure 3).
EXE!PILE 2 -
Détermination de la thyroxine libre dans des échantillons
de sérum humain par détermination immuJ1oloSique enuyma-
ticque en utilisant lun anticorps immobilisé dans un tube
en matière plasticU!e.
On répète la détermination immunologique enzyma-
1.5 tique de l'exemple i, à ceci près que l'anticorps immobi-
lisé sur un support em'particules est remplacé par des tubes revt-us d'anticorps anti-thyroxine, c'est-à-dire qu 'on utilise un anticorps immobilisé dans un tube en matière plastique. Ces tubes sont fournis par Clinical
Assays.
Cette substitution exige évidemment des modi-
fications dans le mode opératoire, & savoir que toutes les étapes de centrifugation sont éliminées et que la séparation du liquide surnageant ou de la phase liquide
est effectuée par décantation.
Ainsi, la courbe de référence est établie de la manière usuelle en reportant la densité optique en fonction de la concentration de thyroxine libre. Une courbe de référence typique est représentée par la
figure 4.
On effectue aussi l'analyse d'échantillons de sérum humain, les résultats obtenus étant résumés dans le Tableau III qui indique aussi les teneurs en thyroxine
libre déterminées antérieurement.
TABLEAU III
Teneurs en thyroxine libre d'échantillons de sérum humain (ng/dl) Echantillon Présent Procédé selon la Ne procédé technique antérieure
0-10 0,62 0,98
0-12 1,17 1,08
M-11 0,39 0,13
T-17 3,7 4,1
EXEMPLE 3 s
Préparation d'une courbe de référence pour détermination radioimmunologique On répète le mode d'établissement d'une courbe de référence de l'exemple 1, à ceci près que le produit de conjugaison thyroxineraifort peroxydase est remplacé _ par un produit de conjugaison 5Ithyroxine-raifort peroxydase préparé par l'oxydation au periodate de l'enzyme suivie d'une réaction avec la thyroxine marquée par 125I, selon la méthode de P.K. Nakane et A. Kawaoi,
J. Eistochem. Cytochem., 22, 1084 (1974).
La raifort peroxydase est fournie par Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New
Jersey, et a une activité de peroxydase de 1058 U.I./mg.
La thyroxine marquée par traceur radio-actif, la 125I-tÉyroxine, ayant une activité d'environ 600/OCi/^ g, e est fournie par Corning Medical, Medfied, Massachusetta. Brièvement, les groupes amine sur l'enzyme sont bloqués en faisant réagir 10 mg de raifort peroxydase avec I mg d'isothiocyanate de fluorescéine dans 2 cm3 de solution 0,3 M de bicarbonate de sodium ayant un pH
de 8,1 pendant une heure à la température ambiante.
On ajoute du periodate de sodium au mélange de réaction en quantité suffisante pour obtenir une concentration d'environ 0,01 M. On continue ensuite la réaction pendant 30 minutes supplémentaires, également à la température ambiante. Au mélange de réaction, on ajoute ensuite 1 cm3 de solution 0,16 M d'éthylène-glycol dans
de l'eau distillée; on continue la réaction & la tempé-
rature ambiante pendant une heure. On dialyse ensuite le mélange de réaction contre trois portions de quatre litres de solution aqueuse 0,01 M de carbonate de sodium, pH 9,5. Une solution d'environ 50 ng de 125Ithyroxine dans I cm3 de solution 0,3 Mi de carbonate de sodium au pH 8,1 est ajoutée au mélange de réaction dialysé et la solution résultante est agitée doucement à la température ambiante pendant 90 minutes. A la solution de réaction, on ajoute 5 mg de borohydrure de sodium solide et on continue l'agitation toute une nuit à 40 C. Le produit de conjugaison 125I-thyroxine-raifort peroxydase ainsi préparé est isolé par chromatographie sur colonne sur G-25 Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,
Suède) et conservé à 40 C.
Une portion aliquote (50'1l) du produit de conjugaison marqué par traceur radio-actif, portion qui contient environ 20 000 COH de radio-activités, est combinée avec 20o 1 de chaque étalon de thyroxine, comme dans l'exemple 1. L'incubation est effectuée
pendant une heure, au lieu de 30 minutes. Comme ci-
dessus, la phase solide est lavée deux fois. La radio-
activité liée à la phase solide est ensuite comptée pendant une minute. Les résultats sont reportés en fonction de la concentration de thyroxine libre en ng/dl
pour donner une courbe de référence (figure 5).
Des études supplémentaires avec la détermi-
nation immunologique enzymatique effectuée comme dans
l'exemple I ont montré que, comme prévisible, la prépa-
ration de la courbe de référence dépend à la fois du temps et de la température. Si l'incubation conduisant à la formation du complexe est effectuée à 37 0C,
l'équilibre est sensiblement atteint après une heure.
A la température ambiante, toutefois, l'équilibre
n'est apparemment pas atteint après 90 minutes.
De plus, d'autres études ont montré que la détermination immunologique enzymatique telle qu'effectuée dans l'exemple 1 est en bonne corrélation (r - 0,91) avec une détermination radio-immunologique selon la technique antérieure basée sur le brevet des E.U.A.
N 4 046 870 (IMM0 PHASE @ Free Thyroxine Radio-
immunoassay, Corning MedicAl). Cette corrélation résulte de l'application des résultats des deux procédés pour 54 échantillons de sérum à un programme de régression
linéaire sur ordinateur.
Il est évident que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et qu'on peut
y apporter toutes variantes. Ainsi, la présente inven-
tion envisage l'utilisation de traceurs autres que des isotropes radioactifs ou l'utilisation de l'activité enzymatique de la raifort peroxydase dans le produit de conjugaison. Comme on l'a déjà indiqué, des exemples de tels traceurs comprennent des traceurs fluorescents et chimioluminescents. De plus, la présente invention ne doit pas 9tre considérée comme limitée par la
méthode de mesure.
Claims (10)
1. Procédé de détermination immunologique pour la mesure directe de la thyroxine libre ou de la ,5,5'-triiodothyronine libre dans un échantillon liquide dans lequel la thyroxine ou la 3,5e3-triiodo- thyronine, respectivement, est présente à la fois à
l'état libre et dans un état combiné, ce procédé com-
prenant les étapes selon lesquelles: A. on combine l'échantillon avec un produit de conjugaison marqué thyroxine-raifort perexydase ou
un produit de conjugaison marqué 3,5,3'-triiodothyronine-
raifort peroxydase, respectivement, qui ne réagit pas notablement avec la globuline fixant la thyroxine et la préalbumine fixant la thyroxine initialement présentes dans l'échantillon et un anticorps immobilisé qui est
spécifique pour la thyroxine-ou la 3Â5,33-triiodo-
thyronine, respectivement; B. on fait incuber le mélange résultant; 5. on sépare une phase solide de la phase liquide; et
D. on mesure la quantité de produit de con-
jugaison marqué thyroxine-raifort peroxydase ou de produit de conjugaison marqué 3,5,3 -triiodothyronine-raifort peroxydase, respectivement, présente dans chaque phase
au moyen de l'activité du traceur.
2. Procédé selon la revendication 1, carac-
térisé en ce que le produit de conjugaison est marqué
par un traceur radio-actif.
3. Procédé selon la revendication 2, carac-
térisé en ce que le produit de conjugaison est marqué
par de l'iode radio-actif, spécialement par 1125.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'anticorps est immobilisé
sur un support inorganique.
5. Procédé selon la revendication 4, carac-
térisé en ce que le support est une matière en particu-
les relativement fines et de préférence une matière
siliceuse, spécialement du verre.
6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé
en ce que le support est un article tridimensionnel.
7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support est un tube à essai.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé
en ce que le tube à essai est en matière plastique.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'anticorps est appliqué en couche
sur la partie intérieure inférieure du tube à essai.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendi-
cations 1 à 9, caractérisé en ce que le produit de con-
jugaison est marqué par un traceur fluorescent, par un
traceur chimioluminescent ou par un enzyme.
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