DE3546014A1 - Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden tbg - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden tbg

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Description

Die Erfindung betrifft ein heterogenes Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG), auch als T-Uptake bezeichnet.
Die Thyroid-Hormone liegen im Blut weitgehen in proteingebundener Form vor. Dabei bindet Thyroxin (T4) insbesondere an das Thyroxin bindende Globulin (TBG). Die Bestimmung der Bindungskapazität von TBG ist im Rahmen der Schilddrüsendiagnostik von besonderer Bedeutung. Außerdem korreliert in der überwiegenden Anzahl der Fälle das Produkt aus Gesamt-T4-Konzentration und 1/TBG gut mit der FT4-Konzentration. (L. R. Witherspoon, Journal of Clinical Immunoassay 7, (1984)).
Bekannte Verfahren zur Bestimmung der TBG-Bindungskapazität sind in DE-A 28 25 650 der gleichen Anmelderin beschrieben. Der Nachteil der bekannten Verfahren liegt darin, radioaktive Markierungen verwenden zu müssen und/oder lange Inkubationszeiten (z. B 2 Stunden) in Kauf nehmen zu müssen. Das Verfahren der DE-A 28 25 560 weist ebenfalls noch gewisse Nachteile auf die darauf beruhen, daß es sich um ein kompetitives Verfahren handelt und sowohl T4 als auch T4-Enzym-Konjugat zugegeben werden müssen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, welches nicht kompetetiv abläuft, ohne radioaktives Material auskommt, nur kurze Zeiten benötigt und bei einfachster Testführung hohe Genauigkeit aufweist und ein Verfahren zur Herstellung einer für dieses Verfahren geeigneten Kontroll- oder Standardlösung bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG) im Serum nach dem Prinzip des heterogenen Enzymimmunassays, wobei man die zu untersuchende Serumprobe mit enzymmarkiertem T4 oder T3 und immobilisiertem Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert, die Phasen trennt und das Markierungsenzym in einer der Phasen mißt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Kontrolle anstelle der Serumprobe ein Kontroll- oder Standardhumanserum verwendet, welches monoklonale Anti-T4-Antikörper in bestimmter Menge enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich bei einfachster Testführung in kurzer Zeit mit maximal 15 Minuten Inkubationszeit durchführen. Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß zur Erstellung einer Eichkurve kein TBG erforderlich ist.
Im Gegensatz zu allen bekannten heterogenen Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität von TBG, die mit immobilisierten Anti-T4-Antikörpern arbeiten, so daß bei ihrer Durchführung TBG bzw. Anti-T4-Antikörper um das T4 bzw. ein T4-Konjugat konkurrieren, arbeitet das Verfahren gemäß Oberbegriff von Anspruch 1 mit immobilisierten Anti-TBG-Antikörpern. Es ist auch als sehr überraschend anzusehen, daß bei dieser Verfahrensführung exakte Resultate erhalten werden, da es bekannt war, daß enzymmarkiertes T3 oder T4 nicht von den Serumproteinen (TBG) gebunden wird. Auf diesen speziellen Eigenschaften beruht sowohl das der FR-A 81 17 997 (Corning) als auch das in der DE-A 28 25 650 beschriebene Verfahren.
Bei dem Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG) im Serum nach dem Prinzip des heterogenen Enzymimmunassays wird der Gehalt an TBG bestimmt über die Menge an fixiertem oder nicht fixiertem enzymmarkierten Thyroxin. Es wird eine Beziehung hergestellt zwischen der gemessenen Menge an Enzym und dem im Serum befindlichen Thyroxin. Dazu ist es notwendig, eine Eichkurve zu erstellen, worin der Uptake-Wert gegen den Enzymgehalt aufgetragen ist. Hierbei werden nach dem Prinzip des heterogenen Enzymimmunassay Proben mit enzymmarkiertem Thyroxin (T4) oder Trÿodthyronin (T3) und immobilisiertem Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert, die statt der zu untersuchenden Serumprobe ein Kontroll- oder Standardhumanserum enthalten, das eine bestimmte Menge monoklonaler Anti- T4-Antikörper enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das den monoklonalen Anti-T4- Antikörper enthaltende Kontroll- oder Standardhumanserum mit einer bestimmten Menge an enzymmarkiertem T4 oder T3 inkubiert und dann mit einer Festphase in Kontakt gebracht, an die Antikörper gebunden sind, die gegen den FCγ-Teil des monoklonalen Anti-T4-Antikörpers gerichtet sind. Anschließend wird die flüssige Phase von der festen Phase getrennt und das in der flüssigen Phase enthaltene Markierungsenzym in an sich bekannter Weise gemessen.
Als Enzymmarkierung für das T3 oder T4 können im Rahmen der Erfindung alle hierfür geeigneten, leicht bestimmbaren Enzyme verwendet werden, wie sie dem Fachmann zahlreich bekannt sind. Bevorzugte Beispiele hierfür sind Peroxidase und β-Galactosidase. Besonders bevorzugt wird ein T4-β-Galactosidase-Konjugat verwendet. Vorzugsweise wird das Enzym über ein Distanzstück (Spacer) an das Hormon gekoppelt, wobei die Distanzlänge 3 bis 8 C-Atome, vorzugsweise 4 bis 5 C-Atome betragen soll. Die Kopplung erfolgt beispielsweise über einen aktiven Ester des Hormons oder des Hormonderivats. Als Spacer für die Verbindung von T4 bzw. T3 und Markierungsenzym werden besonders bevorzugt Aminobuttersäure oder Glycylglycin und zwar zweckmäßig in Form ihrer Hydroxysuccinimidester verwendet.
Das enzymmarkierte T4 oder T3, im folgenden als Konjugat bezeichnet, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt in bekannter Konzentration eingesetzt.
Als Konjugat wird vorzugsweise ein solches verwendet, bei dem das molekulare Verhältnis von T4 bzw. T3 zum Markierungsenzym, wie insbesondere β-Galactosidase 1 bis 5 : 1 beträgt.
Aufgrund seiner größeren Bindungskapazität wird beim Verfahren der Erfindung bevorzugt mit einem T4-haltigen Konjugat gearbeitet, was zu einer besseren Empfindlichkeit führt. Die Erfindung läßt sich jedoch in gleicher Weise auch mit T3-Konjugat durchführen.
Als Anti-T4-Antikörper wird ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment eines solchen Antikörpers verwendet. Die Immobilisierung des Antikörpers kann in bekannter Weise erfolgen z. B. derart, daß der Antikörper direkt an den Träger gebunden wird oder unter Ausnützung seiner immunologischen Bindefähigkeit über einen immobilisierten Anti-Antikörper oder ein Fragment desselben fixiert wird. Die Immobilisierung des Anti-T4-Antikörpers über einen an die feste Phase gebundenen Anti-Antikörper oder ein Fragment davon hat den großen Vorteil, daß der Anti-T4-Antikörper praktisch zu 100% aktiv gebunden wird und damit in geringerer Menge eingesetzt werden kann als bei direkter Fixierung, die immer mit einem gewissen Aktivitätsverlust verbunden ist.
Besonders bevorzugt ist hierbei eine Ausführungsform, bei welcher ein Antikörper verwendet wird, der sowohl gegen den Fc-Teil des Anti-TBG-Antikörpers, als auch gegen den Fc-Teil des Anti-T4-Antikörpers gerichtet ist.
Das Verfahren der Erfindung kann zweistufig durchgeführt werden, wobei in erster Stufe das Kontrollserum mit dem Konjugat inkubiert und in zweiter Stufe dann mit dem immobilisierten Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert wird. Soweit hierbei Anti-T4-Antikörper verwendet werden, wird die zweite Inkubation zweckmäßig nicht länger als 5 Minuten, vorzugsweise 0,5 bis 2 Minuten, durchgeführt. Bei darüberhinausgehender Dauer der zweiten Inkubation können Konkurrenzreaktionen auftreten, welche die Genauigkeit herabsetzen.
Bei Verwendung von Antikörpern gegen TBG wird das Verfahren bevorzugt auch einstufig durchgeführt, derart, daß alle Komponenten, auch die feste Phase gleichzeitig zusammengegeben werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung. In dieser ist ein Eichkurvenvergleich bei Verwendung von TBG-Standards und erfindungsgemäßen Standards (AK) dargestellt.
Beispiel 1
1. Reagenzien:
  • a) Puffer:
    100 mmol/l Hepes
      2 mmol/l Mg-Aspartat
      1% RSA
      0,9% NaCl
      2‰ oberflächenaktives Mittel (Tween), pH = 7,25 (37°C)
  • b) T4-β-Galactosidase:
    600 mU/ml Puffer
  • c) monoklonaler Antikörper (gerichtet gegen TBG); 108 µg/ml
    (Die Entwicklung des monoklonalen Antikörpers erfolgte nach der Methode von Köhler und Milstein (Eur. J. Immunol. 6, 292- (1976), als Immunogen wurde TBG verwendet).
  • d) immobilisierter Antikörper (gerichtet gegen Fc-Teil des monoklonalen Antikörpers).
    Der Antikörper wurde durch Immunisierung von Schafen mit Fc-Teilen von Maus-Immunglobulinen nach üblichen Verfahren gewonnen. Das Antiserum wurde über Ammoniumsulfatfällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose aufgereinigt.
    Die Fixierung des Antikörpers auf Filterpapier erfolgte nach der von P. Gemeiner und M. Pasteka in Applied Biochemistry and Biotechnology 8, 381-393 (1983) beschriebenen Methode zur Herstellung von Protein-Cellulose-Konjugaten durch reduktive Alkylierung von perjodatoxidierter Cellulose. Angeboten wurden 15 mg gereinigter Antikörper/g Papier.
    Nach Kupplung wurde das Papier mit H2O und RSA-haltigem Phosphatpuffer gewaschen und bei 35°C getrocknet.
  • e) Chlorphenolrotgalactosid (CPRG)-Vlies:
    0,25 µmol/5 mg Papier, hergestellt nach DE-A 33 45 748.
    Testdurchführung:
    Serum wird im Volumenverhältnis von 1 : 75 mit folgendem Gemisch verdünnt:
    172 µl Puffer
     30 µl T4-β-Galactosidaselösung
     20 µl MAK⟨TBG⟩-Lösung (monoklonaler Antikörper gegen TBG)
    Nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C läßt man 50µl des Gemisches von 10 mg des gemäß d) hergestellten Kupplungs-Papieres aufsaugen und inkubiert weitere 5 Minuten bei 37°C. Durch anschließende Zentrifugation wird die Flüssigkeit, die den ungebundenen Anteil an T4-β-Galactosidase enthält, vom Papier abgetrennt, über das Chlorphenolrotgalactosid- Vlies geleitet und die Enzymkinetik (mE/min) bei 37°C und 578 nm in einer Mikroküvette mit einem Füllvolumen von 27µl und einer Schichtdicke von 0,6 cm gemessen.
    Die Umrechnung des Meßsignals in TBG-Bindungskapazitätswerte erfolgt über eine Eichkurve, die mit Proben, deren TBG-Wert bekannt ist, erhalten wurde (Fig. 1).
2. Herstellung des T4-β-Galactosidase-Konjugats mit Aminobuttersäure als Spacer
N-tertiär-Butyloxycarbonyl-Thyroxin (BOC-T4) wird aus Thyroxin-Na-Salz und Di-tertiärbutyldicarbonat analog der in Eu-A 01 08 400 angegebenen Vorschrift hergestellt.
N-tertiär-Butyloxycarbonyl-thyroxinyl-hydroxysuccinimidester (BOC-T4-OSu) wird aus 0,5 mmol BOC-T4, 3,6 mmol N-Hydroxysuccinimid und 3,6 mmol Dicyclohexyldiimid analog der Vorschrift zur Darstellung von BOC-Phenylalanin-OSu hergestellt (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band XV/2, Jahrgang 74, S. 150).
Der nach Eindampfen erhaltene Rückstand wird in Essigester gelöst und durch Zugabe von Petrolether ausgefällt.
N-tertiär-Butyloxycarbonyl-thyroxinyl-aminobuttersäure- hydroxy-succinimidester (BOC-T4-Abs-OSu) wird folgendermaßen dargestellt:
Zu einer Lösung von 0,5 g BOC-T4-OSu in 8 ml Dioxan wird eine Lösung von 0,27 g Aminobuttersäure in 0,5 ml 0,1 m Phosphatpuffer pH 8,5 getropft. Nach zweistündiger Reaktionszeit wird angesäuert und mit Essigester ausgeschüttelt. Die Essigesterphase wird mit H2O gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand wird in 20 ml Ethylenglycoldimethylether gelöst und mit 0,07 g N-Hydroxysuccinimid und 0,12 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 12stündiger Reaktionszeit wird abfiltriert. Das Lösungsmittel wird abgedampft, der Rückstand in Essigester gelöst und BOC T4 Abs OSu mit Petrolether ausgefällt.
DC (HPTLC, RP 18; Laufmittel: Nitromethan/Ethanol 9 : 1) Rf: 0,77 1H-NMR (d6-Dimethylsulfoxid), w (ppm): 1,32 (s, 9H), 1,77 (m, 4H), 2,80 (s, 4H), 7,03 (s, 2H), 7,79 (s, 2H).
15,8 mg β-Galactosidase werden in 2,5 ml 0,01 m Phosphatpuffer, pH = 7,0 gelöst. Unter Eiskühlung werden 0,307 ml einer 0,1%igen Lösung von BOC-T4- Abs-OSu langsam zugegeben. Das erhaltene Konjugat wird über Gelfiltration entsalzt und über Spherosil gekuppeltes TBG affinitätschromatographisch gereinigt.
Beispiel 2
  • a) Puffer: 110 mmol/l Hepes, 2,2 mmol/l Mg-Aspartat, 1% RSA, 0,9% NaCl, 2‰ Tween, pH = 7,25 (37°C)
  • b) T3-β-Galactosidase: 125 mU/ml Puffer
  • c) Auf Papier immobilisierter Antikörper, gerichtet gegen TBG
    Die Antikörper wurden durch Immunisierung von Schafen mit TBG nach üblichem Verfahren gewonnen.
    Die Antikörper wurden nach Ammoniumsulfatfällung und DEAE-Cellulose-Chromatographie zusätzlich über an Spherosil gekuppeltes TBG immunsorptiv gereinigt. Die Fixierung des Antikörpers an Papier erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben. Angeboten wurden 20 mg gereinigter Antikörper/g Papier.
  • d) Chlorphenolrotgalactosidlösung (5 mmol/l)
    Puffer: 100 mmol/l Hepes, 2 mmol/l Mg-Aspartat, 0,5% RSA, 0,9% NaCl, 2‰ Tween.
Testdurchführung:
Serum wird im Volumenverhältnis von 1 : 10 mit T3-β- Galactosidaselösung verdünnt. 50 µl dieses Gemisches werden von 10 mg des TBG-Antikörper tragenden Papiers aufgesaugt und 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Zur Entfernung von ungebundener T3-β-Galactosidase wird das Papier dreimal mit je 100 µl Puffer gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang die Waschlösung durch Zentrifugation entfernt wird. Anschließend wird das Papier mit 50 µl Chlorphenolrotgalactosidlösung getränkt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C wird die gebildete Farbstofflösung durch Zentrifugation vom Papier abgetrennt und in einer Mikroküvette mit einem Füllvolumen von 27 µl und einer Schichtdicke von 0,6 cm bei einer Wellenlänge von 578 nm gemessen.
Die gemessen Extinktion ist proportional der Bindungskapazität der Probe. Herstellung des T3-β-Galactosidasekonjugats
Die Herstellung des N-tertiär-Butyloxycarbonyl-trÿodthyronins (BOC-T3) und des N-tertiär-Butyloxycarbonyl- trÿodthyronin-hydroxysuccinimidesters (BOC-T3-OSu) erfolgt analog wie in Beispiel 1 beschrieben.
BOC-T3-OSu: DC (HPTLC, RP 18, Laufmittel: Nitromethan/ Ethanol 9 : 1) Rf = 0,6
Die Umsetzung der β-Galactosidase mit BOC-T3-OSu und die anschließende Aufreinigung wird ebenfalls wie im Beispiel 1 durchgeführt.
Beispiel 3
Reagenzien:
  • a) Puffer:
    100 mMol/l Hepes
      2 mMol/l Mg-Aspartat
      1% RSA (Rinderserumalbumin)
      0,9% NaCl
      2‰ Tween, pH = 7,25 (37°C)
  • b) T4-β-Galactosidase: 170 mU/ml Puffer (Herstellung nach Beispiel 1)
  • c) Auf Papier immobilisierter Anti-T4-Antikörper (S⟨T4⟩-Papier).
    Die Antikörper wurden durch Immunisierung von Schafen mit T4, das über Glutardialdehyld an Rinderserumalbumin gebunden ist, nach üblichem Verfahren gewonnen.
    Das Antiserum wurde über Ammoniumsulfatfällung und Chromatographie an DEAE-Cellulose aufgereinigt.
    Die Fixierung des Antikörpers an Papier erfolgte analog, wie im Beispiel 1 beschrieben.
    Eingesetzt wurden 10 mg gereinigter Antikörper/g Papier.
  • d) Chlorphenolrotgalactosid (CPRG-Vlies: 0,25 µmol/5 mg Papier (wie im Beispiel 1)
    Testdurchführung:
    Serum wird im Volumenverhältnis von 1 : 20 mit folgendem Gemisch verdünnt: 140 µl Puffer a)
     50 µl T4-β-Galactosidaselösung b)Nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C läßt man 50 µl des Gemisches von 10 mg des S⟨T4⟩-Papiers c) aufsaugen und inkubiert weitere 5 Minuten bei 37°C.
    Durch anschließende Zentrifugation wird die Flüssigkeit, die die Komplexe aus TBG und T4-β-Galactosidase enthält, vom Papier abgetrennt, über das Chlorphenolrotgalactosid- Vlies d) geleitet und die Enzymkinetik (mE/min) bei 37°C und 578 nm in einer Mikroküvette mit einem Füllvolumen von 27 µl und einer Schichtdicke von 0,6 cm gemessen.
    Die Umrechnung des Meßsignals in T-uptake-Werte erfolgt über eine Eichkurve, die mit Proben, deren uptake-Wert bekannt ist, erhalten wird
Beispiel 4
Eine Patientenserumprobe oder Plasmaprobe wird 1 : 75 mit 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt. Danach wird die Probe in ein Teströhrchen pipettiert und temperiert. Anschließend wird eine Lösung, die Puffer und Stabilisator enthält, zugegeben. Diese Lösung ist wie folgt zusammengesetzt:
55 mmol NaH2PO4.H2O
1% RSA.
Sodann wird mit einer Konjugatlösung inkubiert. Die Inkubatlösung enthält 150 mmol Hepes, 10 mmol Mg-Aspartat, 1% Rinderserumalbumin. Der pH ist 7,3. Weiterhin enthält diese Lösung ein T4-β-Galactosidase-Konjugat und monoklonale Antikörper gegen TBG. Es wird 5 Minuten inkubiert. In dieser Zeit läuft die folgende immunologische Reaktion in homogener Phase ab:
[TBG] + TBG + T4Gal → [TBG].TBG.T4-Gal.
Anschließend wird zur Abtrennung des Konjugat-Antikörperkomplexes zu der Reaktionslösung ein Antikörper gerichtet ist, zugegeben. Es wird 5 Minuten inkubiert. Nach dieser Zeit wird die flüssige Phase abgetrennt und mit Chlorphenolrot-Galactosid versetzt. In einer Küvette wird dann die Spaltung des Substrats kinetisch detektiert bei Lambda = 578 nm. Das um die Adsorption bei Lambda = 700 nm korrigierte Signal ist ein Maß für den T-Uptake der Probe. Dabei wurde der Uptake-Wert eines Normalserenkollektivs willkürlich als TU = 1 festgesetzt.
Als Standard- bzw. Kontrollserum wurde eine Lösung von T3,T4-Antikörper verwendet. Der Antikörper wird in 0,9%iger NaCl-Lösung aufgelöst und anschließend wird das Verfahren durchgeführt, wie mit dem Patientenserum beschrieben. Es werden verschiedene Seren hergestellt mit unterschiedlicher Konzentration an monoklonalem Antikörper. Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.
Beispiel 5
Es wurde überprüft, inwieweit Eichkurven, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erstellt wurden mit Eichkurven, die mit bekannten TBG-Mengen hergestellt wurden, übereinstimmen. Dabei wurde die in Fig. 1 gezeigte Eichgerade erhalten, welche für den TBG-Standard und den Antikörper-Standard identisch ist.

Claims (4)

1. Verfahren zur Bestimmung der Bindungskapazität des Thyroxin bindenden Globulins (TBG) im Serum nach dem Prinzip des heterogenen Enzymimmunassays, wobei man die zu untersuchende Serumprobe mit enzymmarkiertem Thyroxin (T4) oder Trÿodthyronin (T3) und immobilisiertem Antikörper gegen TBG oder T4 inkubiert, die Phasen trennt und das Markierungsenzym in einer der Phasen mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Kontrolle anstelle der Serumprobe ein Kontroll- oder Standardhumanserum verwendet, welches monoklonale Anti-T4-Antikörper in bestimmter Menge enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das den monoklonalen Anti-T4-Antikörper enthaltende Kontroll- oder Standardhumanserum mit einer bestimmten Menge an enzymmarkiertem T4 oder T3 inkubiert, dann mit einer festen Phase kontaktiert wird, an welche gegen den Fc-Teil des monoklonalen Anti-T4-Antikörpers gerichtete Antikörper fixiert sind und anschließend die flüssige Phase abgetrennt und das darin enthaltene Markierungsenzym gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein T4-β- Galactosidase-Konjugat verwendet und in einer Farbreaktion bestimmt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Festphasen gebundener Antikörper gegen den monoklonalen Anti-T4-Antikörper verwendet wird, welcher auch gegen den Anti-TBG-Antikörper gerichtet ist.
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