DE3650437T2

DE3650437T2 - Verfahren zum Messen von Freiliganden in biologischen Flüssigkeiten.

Info

Publication number: DE3650437T2
Application number: DE3650437T
Authority: DE
Inventors: El Shami A Said
Original assignee: Diagnostic Products Corp
Current assignee: Siemens Medical Solutions Diagnostics Inc Canada
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-01-17
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2006-01-18
Also published as: NO168002C; IE60715B1; DK169365B1; ES8707342A1; FI863186A; IE861495L; EP0661540A1; NO168002B; JPS6283666A; ATE169410T1; DE3650691T2; IL79283A; CA1299984C; AU602864B2; EP0218309B1; AU5752186A; NO862278L; ES555425A0; NO862278D0; FI92878B

Description

Hintergrund der Erfindung

Für mehrere Jahrzehnte waren Techniken der Gleichgewichtsdialyse die einzig verfügbare Methode für die Messung von freien Hormonen im Serum, und waren bis jetzt die einzigen Verfahren, die als zuverlässig angesehen wurden. Verfahren der Gleichgewichtsdialyse leiden in diesem Zusammenhang an mehreren Nachteilen, die eine schlechte Genauigkeit, Weitschweifigkeit und so weiter beinhalten; aber in erster Linie sind die Ergebnisse stark abhängig von der Reinheit der verwendeten Tracer.
Ellis und Ekins, R (Acta Endocr. (KbH.) Suppl. 177; 106, 1973) gaben eine direkte Methode für Bestimmungen von freiem Hormon in ihrer Veröffentlichung "Direkte Messung der freien Thyroidhormonkonzentration im Serum durch ein Radioimmunoassay (Direct Measurement By Radioimmunoassay of the Free Thyroid Hormone Concentration in Serum)" bekannt. Dies stellte eine wichtige Verbesserung gegenüber den Verfahren der Gleichgewichtsdialyse dar, weil es die direkte Messung von freien Ligandwerten in Serum-Dialysaten durch einen Radioimmunoassay (RIA) ermöglichte und somit das Problem der Reinheit der Tracer umging. Diese Methode wird jetzt von vielen als die Referenzmethode für die Messungen an freiem Hormon betrachtet. Jedoch ist sie immer noch zeitanwendig und vom Anwender abhängig, und für die meisten kleinen Laboratorien nicht verfügbar.
Indirekte Verfahren für die Abschätzung der Konzentrationen von freiem Hormon, die kurz danach eingefiihrt wurden, schließen das Verhältnis zwischen Testosteron/Steroidhormon bindendem Globtilin (SHBG), das Verhältnis zwischen Thyroxin (T4)/Thyroid-bindendes Globulin (TBG), den Index an freiem T4 (basierend auf dem Produkt von Trijodthyronin (T3)- Aufiiahme und T4) und den Index an freiem Androgen mit ein.
Ekins, R (Free Thyroid Hormones; Proceedings of the International Symposium held in Venice, Dezember 1978, Amsterdam: Excerpta Medica, 1979, 72-92) führte das Konzept der "direkten dynamischen Verfahren" ein, bei dem während der Dialyse ein Antikörper gegen freien Ligand in direktem Kontakt mit der biologischen Flüssigkeit eingesetzt wird. Dies schafft die Basis für die sogenannten "Immunoextraktions"-Verfahren.
Eine derartige Methode wird im U.S.-Patent Nr. 4 046 870 berichtet, bei der eine Zwei-Gefäß Immunoassay-Methode die Transferrate von T4 von bindenden Proteinen auf einen T4- spezifischen Antikörper mißt. Diese Methode ist mit vielen analytischen und knischen Unzulänglichkeiten behaftet, so daß sie tatsächlich nur ein anderes Assay für den freien T4-Index ist.
Eine zweite Methode, eingeführt durch Clinical Assays (Cambridge, MA 02139) war eine echte Immunoextraktionsmethode. Sie verwendete eine sequentielle (Rücktitrations-)Technik in einem Einzel-Röhrchen, in zwei Schritten. Bei dieser Methode wird eine Serumprobe mit immobilisiertem Antikörper inkubiert: dann werden, einem Waschschritt nachfolgend, die unbesetzten Stellen auf dem immobilisierten Antikörper unter Einsatz von markiertem Liganden "zurücktitriert". Bei dieser Methode ist das Serum nie mit dem markierten Liganden in Kontakt. Obwohl theoretisch solide, leidet sie an schlechter Sensitivität und Präzision, und beide Reaktionen erfordern eine genaue Wahl des Zeitpunktes.
Verfahren der Immunoextraktion zur Bestimmung der Konzentrationen an freiem Liganden in einem Schritt bei biologischen Proben waren offenkundig der nächste Schritt in der Entwicklung eines Testsystems für einen freien Liganden. Diese Verfahren beruhen eher auf der chemischen als auf der physikalischen Trennung des markierten Liganden von den endogenen Bindungspartnern. Um dieses Ziel zu erreichen, können viele Wege eingeschlagen werden, wie nachfolgend ausführlich angeführt wird.
Der Stand der Technik offenbart daß durch die chemische Veränderung der Struktur eines gegebenen Liganden, dessen Bindung an endogene Bindepartner eingeschränkt oder vermindert wird. Dies wurde in breitem Umfang fiir Steroidhormone gezeigt. (Siehe auch die Diskussion über freies Testosteron im folgenden.) Im Fall der Thyroidhormone haben Ross J.E. und Tapley, D. F. (Wirkung von verschiedenen Analogen auf die Bindung von markiertem Thyroxin an thyroxinbindendes Globulin und Präalbumin (Effect of various analogues on the binding of labeled thyroxine to thyroxine-binding globulin and prealbumin), Endocrinology 79: 493. 1966) gezeigt, daß die Bindung von TBG (thyroidbindendes Globulin) an T4 verhindert wird, wenn eine einigermaßen sperrige Substitution an der 3'-Position des T4-Moleküls vorgenommen wird. Zusätzlich haben Schall R.F., et al. (Ein Enzym-markierter Immunoassay zur Messung der Bindungskapazität von ungesättigtem Thyroidhormon in Serum und Plasma (An enzyme-labeled immunoassay for the measurement of unsaturated thyroid hormone binding capacity in serum and Plasma). Clin. Chef 25. 1078 (Zusammenfassung) 1978) und Kleinhammer, G., et al. (Enzym-Immunoassay zur Bestimmung des Thyroxin bindenden Index (Enzyme immunoassay for deterimnation of thyroxine bindmg index), Clin. Chem. 24: 1033, 1979) unabhangig voneinander gezeigt. daß es TBG nicht gelingt, an Konjugate, die durch Markierung von T4 mit Merrettichperoxidase gebildet wurden, zu binden. Diese Tatsache schafft die Basis für eine Immunoextraktionsmethode in einem Schritt, beschrieben in dem U.S.-Patent Nr. 4 410 633 an Corning Glass Works zur Messung von freiem Thyroxin und freiem 3,5,3'-Trijodthyronin, wobei Merrettichperoxidase chemisch an T4 und T3 angeheftet und später radioaktiv markiert wird.
Zusätzlich zeigt der Stand der Technik auch, daß T3 und T4 die folgende molekulare Struktur für die maximale Bindung an endogene Bindungsproteine, d.h. TBG thyroidbindendes Präalbumin (TBPA), Albuinin Snyder, S.M. et al. (Bindung von Thyroidhormonen und deren Analoga an Thyroxinglobulin in humanem Serum (Binding of thyroid hormones and their analogues to thyroxine-globulin in human serum), J. Biol. Chent 251: 6489, 1976); Sterling, K. et al. (Studien zur Gleichgewichtsdialyse der Bindung von Thyroxin durch humanes Serumalbumin (Equilibrium dialysis studies of the binding of thyroxine by human serum albumin). J. Clin. Invest. 41:1021, 1962) benötigen:
1. die L-Alanin-Konfiguration der Seitenkette;
2. die Gegenwart einer 4'-Hydroxylgruppe (in erster Linie für TBPA und die Albumin Bindung); und
3. die Gegenwart von zwei (Halogen-) Substituenten an den inneren und äußeren Ringen (Positionen 3,5,3' und 5')
Mehrere hundert T3- und T4-Analoga wurden synthetisiert und auf ihre Fähigkeit hin, an Thyroidhormon-bindende Proteine zu binden, studiert.
Das U.S.-Patent Nr. 4 366 143 und sein europäisches Gegenstück, Patent Nr. 00 26 103, beschreiben umfassend die Anwendung solcher Analoga als Tracer in einer einzelnen Immunoextraktion unter Verwendung gleichzeitiger anstatt aufeinanderfolgender Titration des Antikörpers ihr die Messung der freien Hormone. (Zur Vereinfachung werden diese Patente zusammenfassend im nachfolgenden als das "Amersham"-Patent bezeichnet.)
Eine intakte Alanin-Seitenkette ist für die optimale Bindung von T4 und T3 an TBG erforderlich: die Aminogruppe der Alanin-Seitenkette ist der wesentliche Bestandteil. Analoga, die in dem Amersham-Patent beschrieben wurden, sind T3- und T4-Moleküle, welche an der Alanin- Seitenkette modifiziert wurden. Obwohl diese Analoga theoretisch in keinem signifikanten Ausmaß an TBG binden, binden sie zweifelsfrei signifikant an Albumin und TBPA, da die 4'- Hydroxylgruppe auf den T3- und T4-Molekulen unverandert beibehalten wird. Es ist gut bekannt, daß die Bindung von Albumin und TBPA an die Thyronine quantitativ ist, besonders unter physiologischen Bedingungen, Sterling, K. (Molekulare Struktur von Thyroxin im Verhältnis zu seiner Bindung durch humanes Serumalbumin (Molecular structure of thyroxine in relation to its binding by human serum albumin), J. Clin. Invest. 43: 1721, 1964) und Pages, et al. (Die Bindung von Thyroxin und Throxinanaloga an humanes Serum-Präalbumin (Binding of thyroxine and thyroxine analogs to human serum prealbumin), Biochem 12: 2773, 1973).
Die Unfähigkeit des Amersham-Patentes die Wichtigkeit der Bindung von Albumin und TBPA an Thyronine zu erkennen, macht die Lehrinformation des Patents für die wahrheitsgetreue Messung von freiem T3 und freiem T4 in biologischen Flüssigkeiten unpassend. Tatsächlich erbrachten die kommerziell verfügbaren Reagenzien, die auf dem Patent basierten, irreführende und ungenaue Ergebnisse an freien Hormonen. Dies trifft in erster Linie bei verschiedenen pathologischen Zuständen zu, die durch signifikante Veränderungen der zirkulierenden Albuminspiegel charakterisiert sind.
Jüngste Literaturangaben haben gezeigt daß die Albuminkonzentration direkt mit den Konzentrationen an freiem T4, welches durch das Testsystem von Amersham erzeugt wird, korreliert. Zusätzlich ist es gut dokumentiert, daß die Amersham-Methode durchweg fälschlicherweise erniedrigte Ergebnisse für freies T4 bei Schwangerschaften im dritten Trimester und bei Patienten, die an einer schwerwiegenden nicht-thyroidalen Krankheit leiden, ergibt, wohingegen sie fälschlicherweise erhöhte Spiegel an freiem T4 in Fällen von familiärer dysalbuminämischer Hyperthyroxinämie, ein Zustand, bei dem T4 abnorm an zirkulierendes Albumin gebunden ist, ergibt.
Während der Schwangerschaft zirkuliert Albumin in einem niedrigeren Ausmaß als bei normalen Spiegeln, besonders während dem dritten Trimester. Da der markierte analoge T4- Tracer von Amersham Albumin und TBPA in einem nennenswerten Ausmaß (mehr als 99%) bindet, könnte man erwarten, daß das Amersham-Assay-System niedrigere Werte als die normalen T4-Ergebmsse während dem dritten Trimester liefert: mehr analoger Tracer ist verfügbar um den T4-Antikörper zu binden, was in einer höheren Bindungsrate und einer offensichtlich niedrigeren Dosis resultiert.
Nicht veresterte freie Fettsäuren sind dazu in der Lage, das markierte Analog vom Albumin zu verdrängen: überdies zirkulieren sie während der Schwangerschaft in höheren Konzentrationen als normalerweise. Dies könnte die T4- Werte, die niedriger als erwartet sind, die während der Schwangerschaft auftreten, wenn mit der Amersham Methode untersucht wurde, erklären, die scheinbaren Spiegel an freiem T4 waren bedeutend niedriger als erwartet, wenn die Bindung von Albumin gegenüber dem markierten Analog wesentlich ist.
Dieser Sachverhalt ist auch in Fällen einer Heparintherapie, wo eine signifikante Erhöhung der nicht veresterten freien Fettsäuren auftritt, gut belegt. Die Spiegel an freiem T4 und freiem T3 zeigen. wenn sie mit der Amersham-Methode bei mit Heparin behandelten Patienten gemessen wurden, niedrigere Werte als normal.
Das gleiche Problem tritt bei nicht-thyroidaler Krankheit auf, wo für die Werte an freiem T3 und T4, die durch die Amersham-Methode erzeugt wurden, gezeigt wurde, daß diese signifikant niedriger als für eine euthyroide Population sind, wenn sie mit einer direkten Methode der Gleichgewichtsdialyse verglichen werden.
Das EP-A-155 104 beschreibt ein Assay-System für. z.B. Thyroxin (T4) in einer biologischen Flüssigkeit in der T4 teilweise an natürliche Proteinbindungspartner gebunden ist. Freies T4 und ein T4-Abkömmling konkurrieren um die Reaktion mit einem spezifischen Bindungspartner und ein unterscheidendes blockierendes Agens wird verwendet, um die Bindung des T4-Derivates, aber nicht von T4 an die natürlichen Proteinbindungspartner zu reduzieren.
Das Verfahren des Amersham-Patentes erwies sich bei Beschäftigten auf dem Fachgebiet als mangelhaft, wie sich durch die Beobachtung von falschen und irrigen Messungen an freien Ligandenwerten offenbarte. Der Anmelder hat entdeckt, daß das Problem von der Bindung des analogen Liganden-Tracers an bestimmte endogene Proteine ausgeht, z.B. Albumin in biologischen Flüssigkeiten. Ich habe entdeckt, daß dieses Problem durch die Verwendung von spezifischen chemischen Hemmstoffen überwunden werden kann. Diese Entdeckung verkörpert einen wichtigen Fortschritt im Stand der Technik.
Die Erfindung liefert eine Methode zur Messung der Konzentration an freiem Thyroxin- oder Trijodthyronin-Ligand in einer biologischen Flüssigkeit in Anwesenheit von gebundenem Liganden und endogenen Bindungsproteinen, welche Albumin mit einschließen, ohne das Gleichgewicht zwischen dem freien Liganden und dem Protein-gebundenem Liganden zu stören, wobei die Methode folgendes umfaßt:
(a) die Inkubation einer Probe der biologischen Flüssigkeit mit (i) einem, dem Liganden analogen Tracer, der aufgrund seiner chemischen Struktur, an einige der endogenen Bindungsproteine nicht bindet der aber an zumindest ein anderes Bindungsprotein, Albumin eingeschlossen, bindet (ii) einer Konzentration eines spezifischen Liganden-Bindungsstoffes, der eine Affinitätskonstante und Selektivität für den freien Liganden besitzt derart daß das Gleichgewicht zwischen freiem Liganden und proteingebundenem Liganden nicht gestört wird und, (iii) 25 mg/ml Natriumsalicylat und 0.15 mg/ml 2.4-Dinitrophenol;
(b) die Abtrennung des zum Liganden analogen Tracers, der an den spezifischen Liganden-Bindungsstoff gebunden ist, von dem ungebundenen Tracer; und
(c) Bestimmung der Konzentration an freiem Liganden in der biologischen Flüssigkeit.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figuren 1 bis 16 stellen die Ergebnisse von Beispiel 3 dar, bei dem jeder mögliche Effekt von an Aktivkohle absorbiertem humanem Serumalbumin (CAHSA) auf das Assay-System für freies T3 und T4 bestimmt wurde.
Die Figuren 17 bis 20 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 7, welches demonstriert, daß das Ergebnis welches durch den Assay für freies T4 erzeugt wird, nicht durch Schwangerschaft und nicht-thyroidale Krankheit beeinflußt wird.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Mängel, die in dem Amersham-Patent auftreten an und korrigiert wirksam die Unstimmigkeiten in den Ergebnissen für freies Thyroid, die durch die Analogen-Methode von Amersham erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindungen kann markierte Analoga für T3 und T4 nützen, die an der Alanin- Seitenkette modifiziert sind. Insbesonder kann die α-Aminogruppe modifiziert werden, um ihre Bindung an TBG zu verhindern. Unterdessen wurden Schritte unternommen, um derartige markierte Analoga an der Bindung an Albumin und TBPA zu hindern. Dies wird durch die Verwendung von Natriumsalicylat und 2,4-Dinitrophenol bewerkstelligt, die dazu in der Lage sind unbesetzte Bindungsstellen auf den Albumin- und TBPA-Molekülen zu binden, wodurch diese bindenden Proteine absättigt werden und wirksam deren Kapazität, an Thyroninanaloga und an andere endogene Substanzen wie nicht veresterte freie Fettsäuren zu binden, ausgeschaltet wird. Natriumsalicylat und 2,4-Dinitrophenol binden nicht an TBG, und ihre Konzentration sollte so sein, daß kein gebundenes Hormon vom Albumin oder TBPA verdrängt wird.
Die Assoziationskonstante ihr Albumin und T4 ist ungefähr 500 000. (Diese Schätzung basiert auf der Annahme, daß die Zahl der Bindungsstellen, die auf dem Albuminmolekül für Thyroxin verfügbar sind, gleich 1 ist, und daß die offensichtliche Assoziationskonstante in Litern pro Mol - d.h. die Gleichgewichtskonstante in Richtung der Komplexbildung - 5 × 10&sup5; ist.) Ähnlicherweise ist die Assoziationskonstante für Albumin und T3 ungefähr 24 600. Es ist allgemein anerkannt, daß Albumin eine größere Affinität ihr freies T3 und T4 und deren Analoga hat als für anionische Farbstoffe, aber eine viel größere Affinität für freie Fettsäuren besitzt als ihr T3 und T4 und deren Analoga.
Albumin besitzt eine relativ niedrige Assoziationskonstante für einzelne aromatische Verbindungen: die höchsten Assoziationskonstanten sind jene für 2,4-Dinitrophenol (11 000) und Salicylat (2 800).
Für den Zweck, genaue Gleichgewichtsbedingungen beizubehalten, muß man in vitro während der Immunextraktionsreaktion streng physiologische Bedingungen einhalten; dies hat die Verwendung eines pH von = 7,4 zur Folge. Bei diesem pH besitzen Thyroninmoleküle drei geladene Gruppen: das anionische Carboxylation, die kationische α-Aminogruppe und das anionische Phenolation. (Das letztere ist zu 82 % ionisiert.) Die Anwesenheit von Albumin oder TBPA unter diesen physiologischen Bedingungen ergibt ein stark geladenes Albumin mit einer relativ großen Anzahl an kationischen Aminogruppen. Diese kationischen Aminogruppen auf dem Albuminmolekül binden das anionische Phenolation auf den Thyroninmolekülen. Eine derartige Wechselwirkung ist der Hauptgrund, daß Albumin, sowohl bei der Amersham- Patent-Methode und als auch der Corning-Patent-Methode, an das markierte Analog bindet.
Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der Tatsache, daß 2,4-Dinitrophenol (DNP) und Natriumsalicylat mit ihren relativ hohen Assoziationskonstanten für Albumin und TBPA ebenfalls unter diesen physiologischen pH-Bedingungen ionisiert und geladen werden, wobei ein geladenes anionisches Phenolation entsteht, das zur Interaktion mit den Ladungen auf dem Albumin und den TBPA-Molekülen befähigt ist. Wenn 2,4-Dinitrophenol und Natriumsalicylat im Überschuß anwesend sind, wird die Bindung von markierten T3- und T4-Analoga an Albumin und TBPA praktisch ausgeschaltet. Diese Methode, Albumin und TBPA durch geeignete Konzentrationen an 2,4-Dinitrophenol und/oder Natriumsalicylat zu blockieren, ist ein effektives Mittel zur Beseitigung fehlerhafter Testergebnisse, die durch Albumin in analogen Immunoextraktions-Verfahren ihr freie Thyroidhormone hervorgerufen werden.
Im allgemeinen ist der spezifische Ligandenbinder einer, der an den freien Liganden ankoppelt oder bindet und er kann ein spezifischer Antikörper für den freien Liganden oder ein anderer Bindungsstoff sein. Spezifische Ligandenbindungsmoleküle sind bekannt und brauchen nicht weiter beschrieben werden.
Der zu dem Liganden analoge Tracer wird auf eine Weise markiert, so daß er nachweisbar oder beobachtbar ist. Markierungen mit Radioaktivität sind gut bekannt und anwendbar, wie auch die anderen Markierungsmittel die früher auf diesem Fachgebiet angewendet wurden, einschließlich Enzymen, Fluorophoren, Chromophoren und chemilumineszenten Gruppen, die in dem Liganden-analogen Tracermolekül integriert sind.
Antikörper gegen beides, L-Thyroxin und 3.5,3'-Trijodthyronin wurden in Kaninchen durch gut etablierte, konventionelle Techniken unter Verwendung von Rinderserumalbumin -T4 und -T3 als Immunogene hergestellt.
Analoga von Dijodthyronin (T2) und T3 wurden durch Succinylierung der α-Aminogruppe an der Alaninseitenkette hergestellt, um N-L-Dijodthyronin-Succimid bzw. N-L-Trijodthyronin herzustellen, die dann jeweils durch konventionelle Verfahren zur Jodierung jodiert wurden, um N-¹²&sup5;I-L-Trijodthyroninsuccinimid und N-¹²&sup5;I-L-Thyroxinsuccimidin herzustellen. Die Tracer wurden dann in 0,01 M HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)- Puffer, pH 7,4, und 0,01 % Natriumazid zusammengebracht. 0,1% an Aktivkohle absorbiertes humanes Serumalbumin (CAHSA), frei von jeglichem erkennbarem T3 oder T4, und blockierende Substanzen wurden wie in den spezifischen Beispielen nachfolgend beschrieben dazugegeben. Verschiedene Mengen von T3 und T4 wurden zu humanem Serum, das frei von jeglichem erkennbaren T3 und/oder T4 ist, kalibriert unter Bedingungen der direkten Gleichgewichtsdialyse und zugeordneten Werten für jeden Spiegel, zugegeben.
T3- und T4-Antikörper wurden an den inneren Wänden der Polypropylengefäße 12×75 mm durch passive Adsorption, wie in Catt, K., et al. (Solid phase radioimmunassay in antibody- coated tubes, Science 158:1570, 1967) beschrieben, immobilisiert.
Für den Assay für freies T4 werden 50 ul an Kalibrator oder Patientenprobe in Anti-T4- Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert, gefolgt von 1,0 ml des markierten T4-Analogons. Die Röhrchen werden dann 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation werden die Röhrchen dekantiert und die gebundene Radioaktivität wird gezählt. Die Ergebnisse werden anhand der Kalibrierungskurve berechnet und in ng/dl angegeben.
Für den Assay auf freies T3 werden 100 ul Kalibrator oder Patientenprobe in Anti-T3- Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert, gefolgt von 1,0 ml an markiertem T3-analogem Tracer. Die Röhrchen werden drei Stunden lang bei 37ºC inkubiert, dann dekantiert und die Radioaktivität gezählt. Die Ergebnisse werden wie ihr freies T4 berechnet und in pg/ml angegeben.

Beispiel 1:

Die Auswahl der Antikörper für die Assay-Systeme ihr freies T3 und freies T4 wurde durch die Tatsache bestiniint, daß das freie Hormon in einem physiologischen Gleichgewicht mit seinen Transportproteinen steht. Dieses Gleichgewicht sollte erhalten bleiben wenn ein Antikorper, der gegen das Hormon gerichtet ist, zum System zugegeben wird. Es ist wesentlich, einen Antikörper auszuwählen, der in Bezug auf seine Affinitätskonstante und seine Spezifitat für die freie Analysesubstanz geeignet ist. Derartige Antikörper sollten auch langsame Reaktionskinetiken besitzen.
Für das freie Thyroxin (T4) wurde ein Antikörper mit einem Anwendungstiter oder einer -verdünnung von 1 : 250 000 ausgewahlt (2,0 ng IgG/Röhrchen). Um den Effekt der Bindung des Tracers an den Antikörper in Gegenwart und in Abwesenheit von Albumin und Albumin- blockierenden Mitteln zu überprüfen, wurden Antikörper-beschichtete Röhrchen unter Verwendung von Titern mit 1 : 250 000 (2,0 ng IgG/Röhrchen) und 1 : 25 000 (20 ng IgG/Röhrchen) hergestellt. Maximale Bindung wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll für freies T4 bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 1 tabellarisch geordnet. Tabelle 1. Freies T4 Ak.-Titer Tracer ohne CAHSA: kein Null-Kalibrator (System ohne Albumin) Albumin/Röhrchen, beigesteuert vom Null-Kalibrator (50 ul) mit 1 mg CAHSA/Röhrchen: kein Null-Kalibrator Na-Salicylat 2,4-Dinitrophenoll
In Abwesenheit von Albumin oder irgendeinem anderen Protein ist die Bindung des analogen ¹²&sup5;I-T4-Tracers an den Antikörper bei beiden Titerstufen der Antikörper von gleicher Größenordnung. In der Anwesenheit von Albumin - 2 mg Albumin/Röhrchen, gemeinsam eingebracht von dem Tracer und dem Null-Kalibrator - bindet der analoge Tracer nicht an den Antikörper mit dem höheren Titer, während er an den Antikörper mit dem niedrigeren Titer nur mit 9,4 % (Tracer D) bindet. In Anwesenheit von nur 1 mg Albumin/Röhrchen ist die Bindung der Tracer B und C an den Antikörper mit dem hohen Titer vernachlässigbar- 2,6 % bzw. 1,4 % - wohingegen die Bindung an den Antikörper mit den niedrigeren Titer signifikant ist- 18,1 % bzw. 15,0%.
Die nachfolgenden Schlußfolgerungen können aus den Ergebnissen dieser Experimente gezogen werden:
1. Albumin in Konzentrationen von 1 bis 2 mg/Röhrchen bindet im wesentlichen an das Traceranalog in Gegenwart von 2,0 ng IgG-Antikörper/Röhrchen.
2. 2,0 ng IgG-Antikörper/Röhrchen hat eine niedrigere Affinität für den analogen Tracer als Albumin.
3. In Anwesenheit von Albumin-blockierenden Mitteln wird die Bindung des markierten T4-Analogen an den Antikörper wiederhergestellt.
Die gleichen Experirnente wurden auch für die freien T3-Assays durchgefilhrt. Die tabellierten Ergebnisse unterstützen ähnliche Schlußfolgerungen (Tabelle 2). Tabelle 2. Freies T3 Ak.-Titer Tracer ohne CAHSA: kein Null-Kahbrator (System ohne Albumin) ohne CAHSA: mit Null-Kalibrator (100 ul) mit CAHSA/Röhrchen: kein Null-Kalibrator Na-Salicylat 2,4-Dinitrophenol
Demzufolge ist die Konzentration des Antikörpers, der in einer Untersuchung an freiem Hormon verwendet wird, kritisch und muß sorgfältig eingestellt werden, um dabei gebundenen Analyt von den endogenen Proteinen nicht zu verdrängen. Die Anweisungen des Amersham- und des Corning-Patents offenbaren nicht die Konzentrationen der Antikörper, die verwendet wurden, um freies T3 und freies T4 zu messen. Jedoch kann, basierend auf den oben zusammengefaßten Experimenten, angenommen werden, daß beide, das Amersham- und das Corning-Patent, wesentlich höhere Antikörperkonzentrationen benützt haben müssen, um eine angemessene Bindung zwischen Antikörper und dem analogen Tracer zustandezubringen, da kein Patent blockierende Mittel verwendet.

Beispiel 2:

Die Ahwendungs-Antikörperkonzentrationen, die auf der Grundlage von Beispiel 1 obenstehend etabliert wurden, sind 5,5 und 2,0 ng IgG/Röhrchen an T3-Antikörper bzw. T4- Antikörper. Um die angemessene Albumin-blockierende Substanz oder Substanzen für die Verwendung in den Untersuchungssystemen für freies T3 und freies T4 zu bestimmen, wurden die folgenden Verbindungen zu den analogen Tracern in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. (Jeder Tracer enthielt auch 1 mg/ml an Aktivkohle absorbiertes humanes Serumalbumin.) Die maximale Bindung wurde für jeden Tracer bestimmt. Der Null-Kalibrator wurde ebenfalls zu jeder Gruppe der maximal bindenden Röhrchen zugegeben.
Die Beispiele, die in den Tabellen 3 bis 11 verwendet werden, werden hier dargestellt, um zu zeigen, daß bei der ausgewählten Antikörperkonzentration die Bindung der analogen Tracer mit steigenden Mengen an zugegebenen Albumin-blockierenden Reagenzien anwachsen wird, bis es ein Plateau erreicht. Dies zeigt auch, daß die Bindung der T3- und T4-markierten Analogen durch die Verwendung einer geeigneten Konzentration von spezifischen Albuminblockierenden Mitteln aufgehoben wird. Tabelle 3. Freies T3 2,4-Dinitrophenol Tabelle 4. Freies T3 Ölsäure Tabelle 5. Freies T3 Natriumsalicylat Tabelle 6. Freies T3 Natriumsalicylat 2,4-Dinitrophenol Tabelle 7. Freies T4 2,4-Dinitrophenol Tabelle 8. Freies T4 Ölsäure Tabelle 9. Freies T4 Natriumsalicylat Tabelle 10. Freies T4 Natriumsalicylat 2,4-Dinitrophenol

Beispiel 3:

Das folgende Experiment wurde entworfen, um zu demonstrieren, daß Albumin keinen Effekt auf die Untersuchungssysteme für freies T3 und freies T4 besitzt.
Zehn Proben - 5 von normalen Individuen und 5 von Frauen im dritten Trimester der Schwangerschaft - wurden jeweils in 4 Aliquots aufgeteilt. Zu dreien dieser Aliquots wurde lyophilisiertes, an Aktivkohle absorbiertes humanes Serumalbumin in Konzentrationen von 10, 20 und 50 mg/ml zugegeben. Die vier Aliquots wurden dann in Duplikaten, wie oben beschrieben, in Assay für freies T3 und freies T4 unter Verwendung von vier verschiedenen Tracern bearbeitet. Der Mittelwert für jede Albumikonzentration (N=5) wurde dann für jeden Tracer (Figuren 1 bis 16) aufgetragen. Für freies T3 und freies T4 sind die Tracer wie folgt: Tabelle 11. Tracer für freies T4 Tracer enthält Natriumsalicylat 2,4-Dinitrophenol Tabelle 12. Tracer für freies T3 Tracer enthält Natriumsalicylat 2,4-Dinitrophenol
Es ist aus den Ergebnissen dieser Experimente offensichtlich, daß die Resultate, die durch Tracer IV erzeugt werden, für beides, freies T3 und freies T4, unbeeinflußt sind durch die Zugabe von Albumin bis zu 5,0 g/dl, bis zu einer ungefähren Gesamtalbuminkonzentration von 8,0 g/dl.

Beispiel 4:

Um festzustellen, ob das Thyroid-bindende Globulin (TBG) die markierten freien T3- und freien T4-analogen Tracer bindet, wurde das folgende Experiment unter Verwendung von Tracer IV aus Beispiel 3 durchgeführt. Ein TBG-Harz, von allen offensichtlichen T4 und T3 gereinigt, wurde zu dem jeweiligen Null-Kalibrator für jeden Assay für freies T4 und freies T3 in den im folgenden angegebenen Konzentrationen zugegeben. Die beobachteten gebundenen Prozentwerte (B/B&sub0;) sind in der Tabelle gezeigt. Tabelle 13. Null-Kalib.

Beispiel 4a:

Dieses Experiment war darauf ausgerichtet, den Effekt der Zugabe von Albumin zum Null-Kalibrator unter Einsatz von Tracer IV aus Beispiel 3 zu überprüfen. Humanes Serumalbumin wurde an Aktivkohle absorbiert, um jegliches vorhandene T3 und T4 zu entfernen und wurde zu dem jeweiligen Null-Kalibrator für freies T3 und T4 in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Erneut wurden die Prozentanteile der gebundenen Werte überprüft. Tabelle 14. Null-Kalib.
Es ist aus Beispiel 4 und 4a ersichtlich, daß weder Albumin noch TBG die analogen Tracer unter den spezifizierten Bedingungen bindet.

Beispiel 5:

Bei hohen Konzentrationen ist Sulfobromphthalein- ein Farbstoff, der fähig ist an Albumin zu binden- in der Lage, T3 und T4 vom Albuminmolekül zu verdrängen. Sulfobromphthalein ist in niedrigen Konzentrationen ineffektiv in der Blockierung der Bindung von T3- und T4-analogen Tracern an Albumin. Jodiertes T4-Analog wurde wie oben beschrieben zubereitet und in fünf Aliquots aufgeteilt. Zu jedem Aliquot wurden die folgenden Reagenzien zugegeben. Tabelle 15 Tracer Natriumsalicylat 2,4-Dinitrophenol (w/v) Sulfobromphthalein Sulfobromphthalein Sulfobromphthalein Ölsäure
Jeder Tracer wurde in einem getrennten Assay für die Messung an freiem T4 in 20 Proben unter identischen experimentellen Bedingungen verwendet.
Wenn man Tracer 1 als Referenzwert betrachtet und die anderen mit diesem vergleicht, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. Tabelle 16 Tracer Gesamt-CPM Kalibrierungsbereich (B/B&sub0;) 0,1 - 9,0 ng/dl Interzepts ng/dl Mittelwert von 20 Proben ng/dl * Korrelationskoeffizient (ein Maß für die Linearität) Tabelle 17. Regressionen Tracer
Die Ergebnisse der Verwendung von Tracer 3 mit 0,05 % Sulfobromphtalein korreliert signifikant mit denen, die unter Verwendung von Tracer 1 erhalten werden. Ergebnisse, die unter Verwendung von Tracer 3 erzeugt wurden, sind jedoch ungefähr 20 % niedriger als diejenigen, die durch Tracer 1 erzeugt wurden. Obwohl Tracer 4 gut mit Tracer 1 korreliert, ergeben sich signifikant höhere Werte an freiem T4, vermutlich aufgrund der Freisetzung von Albumin-gebundenem T4 durch die hohen Konzentrationen (0,1 %) an Sulfobromphthalein.
Ölsäure, die zum Tracer 5 zugegeben wird, ist in der Lage, den analogen Tracer vom Albumin zu verdrängen. Jedoch zeigen die Daten der Patienten, die mit diesem Tracer gewonnen wurden, eine schlechte Korrelation mit den Daten, die mit Tracer 1 erhalten werden, vorausgesetzt, daß Ölsäure in dieser Konzentration zugegeben wird. Höhere Konzentrationen der Ölsäure in dem Tracer -Konzentrationen größer als 1,0 mmol/l- verdrängen gebundenes, unmarkiertes T4 vom Albumin.

Beispiel 6:

Um die Effekte von nicht-veresterten freien Fettsäuren auf die Assay-Systeme von freiem T4 und freiem T3 zu überprüfen, wurden Patientenproben aliquotiert, lyophilisiert und dann mit verschiedenen Konzentrationen von Ölsäure in destilliertem Wasser rekonstituiert. Die rekonstituierten Proben wurden gemäß dem oben angegebenen Protokoll unter Verwendung der gleichen vier Tracer, die in Beispiel 13 beschrieben wurden, auf freies T3 und freies T4 untersucht. Die Ergebnisse, zusammengefaßt in Tabelle 18, zeigen klar, daß Tracer 1 für freies T4 im wesentlichen an Albumin gebunden ist, und daß die Zugabe von Ölsäure den Tracer vom Albumin verdrängt, was zweifelhaft niedrige Ergebnisse an freiem T4 erbringt. Die Tracer II und III sind ebenfalls an Albumin gebunden aber in einem viel geringeren Ausmaß. Tracer IV jedoch ist im Grunde durch Albumln unberührt, wie in Beispiel 3 gezeigt; überdies hat Ölsäure keinen signifikanten Effekt auf die Werte von freiem T4.
Die Ergebnisse für freies T3 sind denen für freies T4 in dem Punkt ähnlich, daß sie zeigen daß Tracer IV im wesentlichen von nicht-veresterten freien Fettsäuren unbeeinflußt ist, und bestätigen nochmals die Ergebnisse, die in Beispiel 3 erhalten werden. Tabelle 18. Wirkung von Ölsäure Tracer freies pur

Beispiel 7:

Um zu etablieren, daß die Ergebnisse, die durch das oben beschriebene Testsystem für freies T4 erzeugt werden, nicht durch Schwangerschaft und nicht-thyroidale Krankheit beeinflußt werden, wurden 185 euthyroide Proben unter Verwendung des im Beispiel 3 oben beschriebenen Tracer IV untersucht und mit 25 Proben des ersten Trimesters und 49 Proben des dritten Trimesters einer Schwangerschaft und 14 Proben von Patienten mit nicht- thyroidaler Krankheit verglichen. Die Ergebnisse, zusammengestellt in Tabelle 19 und den Figuren 17-20. zeigen, daß keine statistischen oder klinisch signifikanten Unterschiede der freien T4-Werte während Schwangerschaft oder nicht-thyroidaler Krankheit, im Vergleich mit einer euthyroiden Population, auftreten.
Dies bestätigt erneut die Tatsache, daß, wenn geeignete Albumin-bockierende Reagenzien verwendet werden, das Testsystem für freies T4 nicht durch in vivo-Veränderungen der Albumin-Konzentrationen verändert wird. Tabelle 19. Freies T4 Median Euthyroide Schwangerschaft Trimester * Absoluter Bereich

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von freien Thyroxin- oder Triiodthyronin- Liganden in einer biologischen Flüssigkeit in Gegenwart von gebundenem Liganden und endogenen Bindungsprotemen, einschließlich Aibumin, ohne Beeinträchtigung des Gleichgewichtes zwischen freiem Liganden und Protein-gebundenem Liganden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) das Inkubieren einer Probe der biologischen Flüssigkeit mit (i) einem Ligandenanalogon-Tracer, welcher aufgrund seiner chemischen Struktur an einigen der endogenen Bindungsproteine nicht bindet, jedoch an mindestens einem anderen endogenen Bindungsprotein, einschließlich Albumin bindet, (ii) einer Konzentration eines spezifischen Liganden-Bindungsstoffes mit einer Affinitätskonstanten und Selektivität für den freien Liganden, so daß das Gleichgewicht zwischen freiem Liganden und Protein-gebundenem Liganden nicht beeinträchtigt wird, und (iii) 25 mg/ml Natriumsalicylat und 0,15 mg/ml 2,4-Dinitrophenol;

(b) das Abtrennen des an dem spezifischen Liganden-Bindungsstoff gebundenen Ligandenanalogon-Tracers vom ungebundenen Tracer: und

(c) das Bestimmen der Konzentration des freien Liganden in der biologischen Flüssigkeit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt (c) die Konzentration des freien Liganden in der biologischen Flüssigkeit bestimmt wird, indem die gebundene Fraktion des Ligandenanalogon-Tracers in der Probe mit der gebundenen Fraktion in einem gegebenen Satz von Kalibratoren freier Liganden verglichen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der spezifische Liganden-Bindungsstoff ein Antikörper gegen den freien Liganden ist.

4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der spezifische Liganden-Bindungsstoff auf einem festen Substrat immobilisiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das feste Substrat Polypropylen ist.

6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Ligandenanalogon-Tracer mit mindestens einem radioaktiven Atom, einem Enzym Fluorophor, Lichtchromophor oder einer Chemilumineszenz-Gruppe markiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Ligandenanalogon-Tracer N-¹²&sup5;I-L-Triiodthyroninsuccinimid oder N-¹²&sup5;I-L-Thyroxinsuccinimid ist.

8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, welches bei etwa 37ºC und bei einem pH-Wert von etwa 7.4 durchgeführt wir.

9. Verfahren nach Anspruch 2 wobei die Kalibratoren freier Liganden durch Hinzusetzen unterschiedlicher Mengen des Liganden zum ligandenfreien menschlichen Serum, Kalibrieren durch Gleichgewichtsdialyse und Zuweisung von Werten für freien Liganden erhalten worden sind.