DE69304528T2 - Verfahren zur bestimmung der menge eines schilddrüsenhormon-liganden in einer biologischen flüssigkeit und satz zur durchführung dieses verfahrens - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der menge eines schilddrüsenhormon-liganden in einer biologischen flüssigkeit und satz zur durchführung dieses verfahrens

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Liganden in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, bei dem man die biologische Flüssigkeit mit dem zu bestimmenden Liganden in Gegenwart eines gelösten Ligandenderivats, das in eine unlösliche Form überführbar ist, in der flüssigen Phase mit einem Unterschuß eines markierten spezifischen Binders inkubiert, der sowohl den zu bestimmenden Liganden als auch das Ligandenderivat so bindet, daß der zu bestimmende Ligand und das Ligandenderivat um den markierten spezifischen Binder konkurrieren, und bei dem man das Ligandenderivat in eine unlösliche Form überführt und nach einer Trennung der unlöslichen von den in der flüssigen Phase verbleibenden Bestandteilen des Bestimmungssystems aus der Menge des an das Ligandenderivat gebundenen markierten spezifischen Binders die Menge des zu bestimmenden Liganden in der biologischen Flüssigkeit errechnet, sowie einen Kit zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung dabei ein Verfahren der genannten Art zur Bestimmung des freien Anteils eines monovalenten Liganden, d.h. eines Liganden, der ein monovalentes Antigen oder ein Hapten darstellt, was heißen soll, daß er nur eine Bindungsstelle für eine immunologische Bindung durch einen spezifischen Bindungspartner aufweist, nämlich eines Schilddrüsenhormons, das in biologischen Flüssigkeiten teilweise in einer an seine physiologischen Bindeproteine gebundenen Form als auch teilweise ungebunden, d.h. frei, vorliegt, und das Ziel des Verfahrens ist die quantitative Bestimmung dieses freien Anteils.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren gehört zu den immunologischen Bestimmungsverfahren, bei denen mit markierten Antikörpern (markierten spezifischen Bindern) gearbeitet wird und die man auch als immunometrische Bestimmungsverfahren bezeichnet. Es gehört dabei zu der Variante derartiger Verfahren, die man als kompetitive Verfahren bezeichnet. Anders als bei typischen Sandwich-Verfahren, bei denen man die Gesamtmenge des zu bestimmenden Liganden in einem Sandwich bindet, wird dabei ein Anteil des markierten Bindungspartners an den zu bestimmenden Liganden und ein weiterer Anteil an ein konkurrierendes Derivat dieses Liganden gebunden. Weitere Ausführungen zu verschiedenen Typen immunometrischer Bestimmungsverfahren finden sich in der Einleitung der EP-B-89806, in der genau wie in der EP-B-103605 die immunometrische Variante eines Verfahrens zur Bestimmung freier Anteile von Liganden beschrieben wird, das als sogenanntes Analogtracer-Bestimmungsverfahren in der EP-B-26103 beschrieben ist.
  • Bei immunometrischen Verfahren des erfindungsgemäßen Typs zur Bestimmung der freien Anteile von Liganden, insbesondere monovalenten Liganden wie den Schilddrüsenhormonen, läßt man den zu bestimmenden Liganden und ein in einer bekannten Menge vorgelegtes Ligandenderivat um einen Unterschuß des markierten Antikörpers im Sinne der obigen Beschreibung des der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Grundverfahrens konkurrieren. Der markierte Antikörper wird dabei im wesentlichen vollständig an den freien Liganden und das Ligandenderivat gebunden, und seine Verteilung auf beide Bindungspartner spiegelt die zu bestimmende Konzentration des Liganden in der Probe wider. Um aus der Verteilung des markierten Antikörpers auf den zu messenden Liganden bzw. das Ligandenderivat auf die zu bestimmende Konzentration des Liganden zurückschließen zu können, wird vorzugsweise das Umsetzungsprodukt aus Ligandenderivat und markiertem Antikörper zur Abtrennung von der restlichen Bestimmungslösung immobilisiert, was gemäß EP-- P-103605 dadurch erfolgt, daß man das Ligandenderivat vor oder nach der Inkubation mit dem markierten Antikörper in eine unlösliche Form überführt. In der Praxis wird dabei bisher in der Regel so vorgegangen, daß man das Ligandenderivat von Anfang an in einer durch Bindung an einen festen Träger immobilisierten Form vorlegt.
  • Ausgestaltungen eines derartigen Verfahrens sind beschrieben in der EP-A-303284 und der EP-A-324540.
  • Bei der in der EP-A-149631 beschriebenen Variante eines Verfahrens der genannten Art wird zusätzlich zu den üblichen Bestandteilen des Bestimmungsverfahrens noch ein exogener Binder für das Ligandenderivat eingesetzt. Dieser exogene Binder für das Ligandenderivat kann ein für letzteres spezifischer zusätzlicher Antikörper sein. Seine Funktion soll es sein, als eine Art Puffer für das Ligandenderivat zu bilden. Da bei dem in der EP-A-149631 diskutierten Verfahren die Ligandenderivate chemisch modifizierte Liganden sind und wie diese Haptencharakter aufweisen und daher wie diese monovalent sind, kommt es bei dem Verfahren gemäß EP-A-149631 nicht dazu, daß der exogene Binder den bei der Bestimmung gebildeten Komplex aus Ligandenderivat und markiertem Antikörper unter Immobilisierung bindet.
  • Bei einem anderen Verfahren zur Bestimmung freier Substanzen gemäß EP-A-106615 wird ein spezifischer Binder verwendet, der gleichzeitig an den zu bestimmenden Liganden und einen Antikörper zu dem spezifischen Binder bindet, wobei sich die Bindung des Liganden und die Bindung des zusätzlichen Antikörpers so beeinflussen sollen, daß es zu einer Konkurrenz zwischen beiden kommt und aus dem Ausmaß der Bindung des Antikörpers auf die Konzentration des zu bestimmenden freien Liganden geschlossen werden kann.
  • Wenn man bei Verfahren gemäß EP-B-89806 bzw. EP-B-103605 bzw. EP-A-303284 bzw. EP-A-324540 mit immobilisierten Ligandendenvaten arbeitet, die mit dem zu bestimmenden freien Liganden um den markierten Antikörper konkurrieren, treten in der Praxis häufig Probleme ("Matrixeffekte") auf, die darauf zurückzuführen sind, daß die Reaktionen zwischen dem immobilisierten Ligandenderivat und dem markierten Antikörper Reaktionen an der Oberfläche einer Festphase darstellen, wo Diffusionsvorgänge eine wichtige Rolle spielen und die Reaktionen stark durch bestimmte zufällige Eigenschaften der Festphase bedingt sind. Diese Matrixeffekte führen in der Praxis dazu, daß die einzelnen Produktionschargen von festen Trägern mit den immobilisierten Ligandenderivaten alle sorgfältig auf ihre Eigenschaften geprüft werden müssen, wobei häufig hohe prozentuale Anteile an unbrauchbaren Trägern festgestellt werden, die als Ausschuß ausgesondert werden müssen und die Kosten des Herstellungsverfahrens und dadurch auch des endgültigen Bestimmungsverfahrens erheblich in die Höhe treiben.
  • Aus der EP-A-105 714 ist es ferner bekannt, bei typischen immunometrischen Sandwichverfahren, bei denen ein polyvalenter Ligand wie z.B. TSH durch Umsetzung mit zwei verschiedenen Antikörpern vollständig gebunden wird, zur Verkürzung der erforderlichen Inkubationszeiten die eigentliche Sandwichbildung als Flüssigphasenreaktion durchzuführen und den gebildeten Sandwich anschließend durch Zugabe einer Festphase mit einem Bindungspartner für einen der Sandwich-Antikörper aus e dem Reaktionssystem zu extrahieren. Dieses Verfahren eignet sich nur zur Bestimmung der Gesamtkonzentration eines Liganden, der mindestens zwei unterschiedliche Bindungsstellen für spezifische Bindungspartner aufweist.
  • Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnell und zuverlässig arbeitendes Verfahren zur Bestimmung der Menge eines freien Liganden in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1 zu schaffen, das schnell, zuverlässig und mit hoher Genauigkeit durchführbar ist und bei dem die oben geschilderten Matrixprobleme umgangen werden, die die Wirtschaftlichkeit der bisherigen entsprechenden Verfahren belastet haben.
  • -Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1 durch die im kennzeichnenden Teil dieses Anspruchs wiedergegebenen Maßnahmen gelöst.
  • Vorteilhafte und bevorzugte Ausgestaltungen eines derartigen Verfahrens sowie ein der Verwirklichung des Verfahrens dienender Kit werden in den Unteransprüchen wiedergegeben.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird so gearbeitet, daß die konkurrierende Umsetzung des zu bestimmenden freien Liganden und des Ligandenderivats mit dem markierten Antikörper in der flüssigen Phase in Gegenwart eines an eine Festphase gebundenen proteinischen Materials erfolgt, das in einer gegenüber der eigentlichen Immunreaktion langsameren, zu einer nicht-kovalenten proteinischen Bindung führenden Reaktion spezifisch den Trägerproteinteil eines als Konjugat eingesetzten Ligandenderivats bindet und dadurch den Immunkomplex aus Ligandenderivat und markierten Antikörper aus der flüssigen Reaktionsmischung extrahiert.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist am Ende der Umsetzung der an das Ligandenderivat gebundene markierte Antikörper als Teil eines Sandwich-Aufbaus über das Ligandenderivat, dessen proteinischen Trägerproteinteil und das immobilisierte proteinische Material an den festen Träger gebunden. Gebunden wird somit, anders als bei herkömmlichen Sandwich-Verfahren, das in einer vorgegebenen Menge eingesetzte Ligandenderivat, nicht der zu bestimmende Ligand. Der Aufbau einer Sandwich-Struktur ist normalerweise bei monovalenten Liganden wie monovalenten Antigenen oder Haptenen, wie z.B. den Schilddrüsenhormonen, nicht möglich. Er wird jedoch bei einem Verfahren, wie es in der EP-A 161 107 beschrieben wird, durch die Verwendung eines löslichen Ligandenderivats in Form eines Konjugats aus dem Liganden mit einem Trägerprotein ermöglicht. Die Anwesenheit des zu bestimmenden freien Liganden äußert sich als eine Störung des Aufbaus der genannten Sandwich-Struktur, indem diejenigen Anteile an markiertem Antikörper, die von dem freien Liganden gebunden werden, nicht an der Festphase immobilisiert werden, sondern in Lösung bleiben und dadurch Rückschlüsse auf die Menge des zu bestimmenden Liganden ermöglichen.
  • Als ein Konjugat eines Liganden wird dabei in der vorliegenden Anmeldung - wie z.B. auch in der EP-A-303284 - ein Derivat des Liganden bezeichnet, in dem dieser oder eine chemisch modifizierte Form davon kovalent an ein proteinisches Trägermolekül gebunden vorliegt.
  • Durch die Verwendung eines Ligandenderivats, das ein Konjugat aus dem Liganden mit einem sterisch anspruchsvollen Trägerprotein ist, ist das Ligandenderivat gleichzeitig ein "differenziell bindendes Ligandenderivat" im Sinne des eingangs geschilderten Standes der Technik, das eine erheblich verminderte Bindefähigkeit gegenüber den physiologischen Bindeproteinen aufweist und dadurch eine störungsfreie Bestimmung des freien Anteils eines zu bestimmenden Liganden ermöglicht.
  • Der in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte markierte Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der solche Affinitätseigenschaften bezüglich des zu bestimmenden freien Liganden und des Ligandenderivats aufweist, daß er in einem die Menge des zu bestimmenden freien Liganden widerspiegelnden Ausmaß an beide gebunden wird, wobei unterschiedliche Affinitäten ggf. den Einfluß größerer Konzentrationsunterschiede beider Bindungspartner etwas ausgleichen können. Im Falle einer Bestimmung von freiem Thyroxin (FT4) ist z.B. ein monoklonaler Antikörper mit einer Assoziationskonstanten in der Größenordnung von 10¹&sup0; l/mol geeignet.
  • Das Ligandenderivat wird i.d.R. in einer Menge eingesetzt, die in der Größenordnung der 0,5- bis 20-fachen molaren Menge der in einer Probe eines Normalpatienten zu erwartenden Menge des zu bestimmenden Liganden liegt. Der markierte Antikörper wird in einem Unterschuß gegenüber der Summe aus in der Probe zu erwartender Menge des zu bestimmenden Liganden und bekannter zugesetzter Mange des Ligandenderivats eingesetzt.
  • Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren am Beispiel einer bevorzugten Ausführungsvariante in Form eines Coated-- Tube-Testverfahrens zur Bestimmung von freiem Thyroxin (FT4) in Serum noch näher beschrieben. Bei diesem Verfahren konkurrieren in Lösung eine konstante, vorgegebene Menge eines T4-IgG-Konjugats (L-IgG) und freies T4 (L) aus der Probe um eine konstante Menge an markiertem anti-T4-Antikörper (Tracer; Ak*). An den Röhrchenwänden ist ein anti-IgG-Antikörper (anti- IgG) immobilisiert, der das T4-IgG-Konjugat bindet und damit, als Bestandteil des Immunkomplexes aus Ligandenderivat und Tracer, auch denjenigen Traceranteil, der nicht durch die in der Probe vorhandenen Anteile an freiem T4 gebunden ist und dadurch für eine Bindung an das T4-IgG-Konjugat nicht mehr zur Verfügung steht. Die Messung basiert also auf einer FT4-konzentrationsabhängigen Störung der immunometrischen Bestimmung einer konstanten Menge eines T4-Derivats durch Sandwichbildung.
  • Der markierte Antikörper kann dabei mit irgendeinem der bekannten Marker oder Markersysteme markiert sein, die z.B. in den eingangs abgehandelten Druckschriften des Standes der Technik ausführlicher aufgezählt sind. Insbesondere kann er mit einem bekannten radioaktiven Isotop, insbesondere einem Jodisotop, markiert sein, und das Bestimmungsverfahren ist dann ein immunoradiometrisches Best immungsverf ahren. Der Markierungsbestandteil kann jedoch auch ein anderes bekanntes Label sein, beispielsweise ein Enzym oder ein Fluoreszenzoder, bevorzugt, ein Chemilumineszenz-Marker.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf Figuren noch näher erläutert. Dabei zeigen: IgGFig. 1 eine schematische Darstellung des Testprinzips;
  • Fig. 2 ein Elutionsprofil einer HPLC-Gelchromatographie eines Reaktionsgemischs zur Herstellung des bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ligandenderivat verwendeten T4-IgG-Konjugats, wobei das native T4-IgG-Konjugat, das im nachfolgend beschriebenen Beispiel Verwendung findet, bei 11 Minuten eluiert wird;
  • Fig. 3 eine typische Standardkurve für das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von FT4; und
  • Fig. 4 einen Vergleich der Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit denen eines kommerziell erhältlichen Bestimmungsverfahrens für FT4 (DYNOtest FT4 der Fa. Henning Berlin).
  • Bei dem als bevorzugtes Ausführungsbeispiel geschilderten Verfahren gemäß dem in Fig. 1 dargestellten allgemeingültigen Schema werden in ein mit Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper 4 beschichtetes Teströhrchen unmittelbar hintereinander die Serumprobe mit dem zu bestimmenden Liganden, eine T4-Kaninchen IgG-Konjugat-Lösung und eine Lösung mit markiertem anti-T4-Antikörper pipettiert. Der markierte anti-T4-Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper und kreuzreagiert weder mit dem Trägerproteinteil des T4-IgG-Konjugats, noch mit der Beschichtung des Teströhrchens. Damit konkurrieren in einer homogen Flüssigphasenreaktion FT4 aus der Probe mit dem T4-Kaninchen-IgG-Konjugat als Ligandenderivat um einen markierten spezifischen Binder in Form eines markierten anti- T4-Antikörpers. Gleichzeitig, jedoch langsamer, wir das T4-Kaninchen-IgG-Konjugat an den immobilisierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper gebunden und dabei auch - umgekehrt proportional zum FT4-Gehalt der Serumprobe - konjugat-gebundener, markierter anti-T4-Antikörper. Nach zweistündiger Inkubation wird das Teströhrchen gewaschen, und der im Röhrchen verbliebene markierte Antikörper wird entsprechend seiner Markierung gemessen.
  • Da die entscheidende Konkurrenzreaktion in der Flüssigphase wesentlich schneller abläuft als die Flüssig-Festphasen-Reaktion, kennt dieses erfindungsgemäße Verfahren nicht die prinzipiellen kinetischen Probleme eines entsprechenden Verfahrens, bei dem mit einem von vornherein immobilisierten T4-Konjugat gearbeitet wird.
  • Für die beschriebene Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bei der Herstellung des als Ligandenderivat verwendeten T4-Kaninchen-IgG-Konjugats die immunologische Erkennbarkeit desselben sowohl hinsichtlich des T4-Anteils durch den markierten Antikörper wie auch des IgG-Anteils für die Immobilisierung durch Aufbau eines Sandwiches zu gewährleisten.
  • Diese Forderung kann beispielsweise erfüllt werden, indem, wie im nachfolgenden Beispiel, das als Ligandenderivat verwendete T4-Kaninchen-IgG-Konjugat nach einem schonenden Verfahren gewonnen wird, bei dem das Trägerprotein nicht nennenswert denaturiert wird bzw. das eine Isolierung von Konjugaten mit nativem, nicht denaturiertem Proteinteil ermöglicht.
    • Beispiel a) Herstellung eines T4-Kaninchen-IgG-Konjugats
  • 34 µg T4-NHS-Aktivester (Henning Berlin) in 50 µl Acetonitril werden mit 1 mg Kaninchen IgG (SIGMA) in 0,5 ml Phosphatpuffer, pH 8,0, für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Durch HPLC-Gelchromatographie wird natives, mit T4-NHS-Aktivester umgesetztes Kaninchen IgG isoliert und dabei abgetrennt von T4-IgG-Aggregaten, unumgesetzten T4-NHS-Aktivester und anderen Reaktionsprodukten. Das Beispiel für ein Elutionsprofil ist in Fig. 2 gezeigt. Der T4-IgG-Beladungsgrad wird mittels eines kontinuierlich den Säulenausfluß messenden UV-Absorptions-Mehrkanaldetektors durch Messung der Absorption bei 325 und 280 nm während der chromatographie ermittelt.
  • Bei der Bestimmung werden von dem T4-Kaninchen-IgG-Konjugat pro Bestimmung maximal das 20-fache (molar) der FT4-Menge einer Probe eines Normalpatienten (ca. 20 pmol/l) in den Test eingesetzt.
    • b) Herstellung eines markierten anti-T4-Antikörpers
  • Als markierter spezifischer Binder wird vorzugsweise ein auf an sich bekannte Weise gewonnener monoklonaler anti-T4-Antikörper durch bekannte Umsetzung mit einem Acridiniumester als Chemilumineszenzlabel markiert. Der markierte Antikörper wird bei der Bestimmung im Unterschuß gegenüber dem T4-Kaninchen- IgG-Konjugat und gegenüber FT4 in das Testverfahren eingesetzt. Die Lumineszenz-Markierung des Antikörpers wird dabei wie folgt durchgeführt:
  • 10 µg Acridiniumester in 10 µl Acetonitril (Hoechst Behring) werden mit 100 µg monoklonalem anti-T4-Antikörper (Henning Berlin) in 90 µl Phosphatpuffer, pH 8,0, für 20 Minuten inkubiert. Der markierte Antikörper wird anschließend durch Hydroxylapatit-Chromatographie gereinigt. Pro Bestimmung werden etwa 110.000 RLU (gemessen mit einem Autoclinilumat der Fa. Berthold) des markierten Antikörpers eingesetzt.
    • c) Herstellung der mit dem proteinischen Material beschichteten Teströhrchen
  • Die in den Test eingesetzten Röhrchen werden dadurch hergestellt, daß man geeignete Polystyrol-Röhrchen mit 2,5 µg Ziege-anti-Kaninchen-IgG (SCANTIBODIES)/0,5 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 8,0, für 24 Stunden bei Raumtemperatur beschichtet. Anschließend wird dekantiert, mit Wasser gewaschen und für zwei Stunden mit 3%iger Lösung eines kristallisationsverzögerten Sorbitsirups (Kanon, Wz), 0,5 % BSA, 0,005 % NaN&sub3; nachbeschichtet. Es wird wieder dekantiert, und die Röhrchen werden zur Aufbewahrung für ihren nachfolgenden Einsatz gefriergetrocknet.
    • d) Durchführung der Bestimmung
  • Unter Verwendung der wie oben unter a) bis c) hergestellten Komponenten wird der Test folgendermaßen durchgeführt:
  • Pro Röhrchen werden unmittelbar hintereinander pipettiert: 50 µl Serum-Probe bzw. Standard, 200 µl T4-IgG-Konjugat-Lösung, 200 µl Lösung mit markiertem Antikörper. Beide zuletzt genannten Lösungen enthalten 50 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % Gelatine, 0,05 % NaN&sub3;. Die Röhrchen werden 2 Stunden unter Schütteln bei 170 U/Min. inkubiert. Schließlich werden die Röhrchen mit je 4x1 ml Waschlösung gewaschen und im Luminometer vermessen. Es wurden die folgenden, durch die Figuren 3 und 4 erläuterten Ergebnisse erhalten:
  • Fig. 3 zeigt den mittleren Standardkurvenverlauf des beschriebenen Verfahrens, der aus der Ermittlung der Inter-Assay- Variation des Test resultiert.
  • Fig. 4 zeigt die mit 189 Patientenseren erhaltene Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Test und einem bekannten handelsüblichen Test (DYNOtest FT4 der Fa. Henning Berlin). Die rechnerische Auswertung unter Verwendung eines Rechenprogramms ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,96. Die Ausgleichsgerade wurde errechnet als:
  • (erfindungsgemäßer FT4-Test; pmol/l) = 0,8 x (DYNOtest) FT4; pmol/l) + 1,1 pmol/l.
    • e) Weitere Prüfungen des Einflusses von bestimmten Assayparametern auf das Bestimmungsverfahren
  • e1) Einfluß der Variation der Menge an eingesetztem T4-Kaninchen IgG-Konjugat bei verschiedenen T4-IgG-Beladungsverhältnissen:
  • Es wurden vier verschiedene T4-IgG-Konjugat synthetisiert und gereinigt, und der T4-Beladungsgrad wurde durch Messung der Absorptionen bei 325 nm und 280 nm bestimmt. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt, daß nur sehr geringe Konjugat-Mengen benotigt werden, um bei dem erfindungsgemäßen FT4-Test eine Bindung des Tracers zu erreichen. Tabelle 1
  • e2) Prüfung der Stabilität der bei dem erfindungsgemäßen FT4-Test verwendeten, mit anti-Kaninchen IgG beschichteten Teströhrchen:
  • Die lagerungsbedingte Veränderung der Qualität der Röhrchen wurde getestet durch Inkubation mit ¹²&sup5;J-markiertem Kaninchen IgG sowie der gleichen Menge an ¹²&sup5;J-markiertem Kaninchen IgG, das mit einem Überschuß an nicht markiertem Kaninchen IgG verschnitten war. In der nachfolgenden Tabelle 2 ist angegeben die in Anwesenheit des nicht markierten Kaninchen IgG's gefundene Bindung, bezogen auf die Bindung des nicht verschnittenen ¹²&sup5;J-markierten Kaninchen IgG's sowie der Variationskoeffizient von 50-fach Bestimmungen dieser Bindungen. Tabelle 2
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die Röhrchen - auch bei erhöhter Lagertemperatur - eine sehr große Stabilität aufweisen. Diese Stabilitäten sind erheblich besser als die von herkömmlichen Teströhrchen, an deren Wänden ein immobilisiertes T4-Derivat in Form eines T4-IgG-Konjugats vorhanden ist. Bei diesen bekannten Röhrchen treten häufig schon bereits nach einer Woche Lagerung bei 37ºC im Vergleich zu den Daten für die frisch produzierten Röhrchen erhebliche Veränderungen auf. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Röhrchen sind dagegen über mehrere Wochen bei 37ºC stabil.

Claims (9)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Anteils der freien Form eines Schilddrüsenhormon-Liganden (L) in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, wobei dieser Ligand (L) teilweise in der genannten freien Form und teilweise in einer Form vorliegt, in der er an physiologische Bindeproteine gebunden ist, wobei man bei dem Verfahren die den zu bestimmenden freien Liganden (L) enthaltende biologische Flüssigkeit in Gegenwart eines Ligandenderivats, das gegenüber den physiologischen Bindeproteinen eine beträchtlich verminderte Bindungsfähigkeit aufweist und in eine unlösliche Form überführbar ist, in der flüssigen Phase mit einem stöchiometrischen Unterschuß eines markierten spezifischen Binders (Ak*) inkubiert, der in einer immunologischen Bindungsreaktion sowohl den zu bestimmenden freien Liganden (L) als auch das Ligandenderivat spezifisch so bindet, daß der zu bestimmende freie Ligand (L) und das Ligandenderivat um den markierten spezifischen Binder (Ak*) konkurrieren, und bei dem man das Ligandenderivat in eine unlösliche Form überführt und nach einer Trennung der unlöslichen Bestandteile von den in der flüssigen Phase verbleibenden Bestandteilen des Bestimmungssystems die Menge des zu bestimmenden freien Liganden (L) in der biologischen Flüssigkeit aus der Menge des an das insolubilisierte Ligandenderivat gebundenen markierten spezifischen Binders (Ak*) errechnet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein lösliches Konjugat aus einem Schilddrüsenhormonliganden mit einem Immunglobulin als Ligandenderivat (L-IgG) verwendet und daß man die Umsetzung in einem Teströhrchen durchführt, dessen Wände mit einem proteinischen Material (anti- IgG) beschichtet sind, das spezifisch den Immunglobulinteil des Ligandenderivats (L-IgG) bindet, ohne die Bindung zwischen dem Ligandenteil des Konjugats und dem spezifischen Binder (Ak*) zu beeinflussen, wobei das proteinische Material (anti- IgG) ausgewählt ist aus anti-idiotypischen Immunglobulinen und anti-idiotypischen poly- oder monoklonalen Antikörpern gegen den Immunglobulinteil des Ligandenderivats (L-IgG), so daß die Bindung zwischen dem Immunglobulinteil des Ligandenderivats (L-IgG) und dem proteinischen Material (anti-IgG) langsamer erfolgt als die immunologische Bindungsreaktion zwischen dem freien Liganden (L) oder dem Ligandenteil des Ligandenderivats (L-IgG) und dem markierten spezifischen Binder (Ak*).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Verfahren zur Bestimmung des freien Anteils von Thyroxin (FT4) ist, daß das Ligandenderivat (L-IgG) ein Thyroxin-IgG- Konjugat ist und daß das an die Wände des Teströhrchen gebundene proteinische Material (anti-IgG) ein anti-idiotypisches IgG gegen den IgG-Teil des Ligandenderivats (L-IgG) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ligandenderivat (L-IgG) ein Thyroxin-Kaninchen-IgG-Konjugat ist und daß das anti-idiotypische IgG (anti-IgG) ein Ziegen-anti-Kaninchen-IgG oder ein ziegen-anti-Kaninchen- Antikörper ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände des Teströhrchens mit einer solchen Menge an proteinischem Material (anti-IgG) beschichtet sind, die mindestens zur vollständigen Bindung der Gesamtmenge des verwendeten Ligandenderivats (L-IgG) ausreicht, daß die Menge des verwendeten Ligandenderivats (L-IgG) in einer Größenordnung der 0,5- bis 20-fachen molaren Menge, bezogen auf die bei einem Normalpatienten zu erwartende Menge des zu bestimmenden freien Liganden (L), liegt und daß der markierte spezifische Binder (Ak*) in einem solchen stöchiometrischen Unterschuß eingesetzt wird, daß nur ein Bruchteil der Gesamtmenge von zu bestimmendem freiem Liganden (L) und in der Probe vorhandenem Ligandenderivat (L-IgG) mit dem markierten spezifischen Binder (Ak*) reagiert.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Binder (Ak*) ein markierter monoklonaler Antikörper gegen T4 ist, der weder mit dem Immunglobulin-Teil des Ligandenderivats (L-IgG) noch mit dem proteinischen Material (anti-IgG) reagiert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunglobulin-Teil des Ligandendenvats (L-IgG) ein natives Immunglobulin ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man es in der folgenden Reihenfolge von Inkubationsschritten durchführt:
a) - Bereitstellen eines Teströhrchens, dessen Wände mit einem Überschuß des proteinischen Materials (anti-IgG) belegt sind, das spezifisch den Immunglobulinteil des Ligandenderivats (L- IgG) bindet;
b) - Zugeben der biologischen Flüssigkeit, die eine unbekannten Menge des zu bestimmenden freien Liganden (L) enthält, oder einer Standardlösung des Liganden (L);
c) - Zugeben einer Lösung oder Dispersion, die eine bekannte Menge des Ligandenderivats (L-IgG) enthält; und
d) - Zugeben einer Lösung oder Dispersion, die eine bekannte Menge des markierten spezifischen Binders (Ak*) enthält;
und daß man nach einem angemessenen Inkubationszeitraum die flüssige Phase aus dem Teströhrchen entfernt, letzteres wäscht und dann die Menge des freien Schilddrüsenhormonliganden (L) in der Probe anhand des Anteils des an die Wände des Teströhrchens gebundenen markierten spezifischen Binders (Ak*) unter Bezugnahme auf die Ergebnisse für Standardproben bestimmt.
8. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet, daß er in Form einzelner Reagenzien enthält (i) eine bekannte Menge eines Ligandenderivats in Form eines Schilddrüsenhormon- Immunglobulin-Konjugats, (ii) eine bekannte Menge eines markierten anti-Ligand-Antikörpers und ggf. (iii) Standardlösungen des Schilddrüsenhormons als Liganden-Standardproben und (iv) geeignete Puffer- und Verdünnungslösungen, sowie (v) Teströhrchen, deren Wände mit einem Überschuß eines anti-idiotypischen Immunglobulins gegen den Immunglobulinteil des Ligandenderivats beschichtet sind.
9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er das Ligandenderivat, den markierten Antikörper, ggf. die Ligand- Standardproben und die beschichteten Teströhrchen alle in lyophilisierter Form enthält.
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