HUT69994A

HUT69994A - Method for the determination of the amount of a ligand in a biological fluid and kit for carrying out such a method

Info

Publication number: HUT69994A
Application number: HU9402865A
Authority: HU
Inventors: Andreas Bergmann; Joachim Struck
Original assignee: Henning Berlin Gmbh
Priority date: 1992-05-06
Filing date: 1993-04-22
Publication date: 1995-09-28
Also published as: HU9402865D0; EP0639272B1; FI944658A; EP0639272B2; WO1993022675A1; DE69304528T2; CA2132830A1; EP0639272A1; JP3234947B2; KR950701075A; AU4040993A; ATE142339T1; NO943759D0; DE4214922A1; FI944658A0; DE69304528D1; US5639670A; NO943759L; JPH07507388A; DE69304528T3

Description

Német Szövetségi Köztársaság

A bejelentés napja: 1993. 04. 22.

Elsőbbsége:

1992. 05. 06. (P 42 14 922.3), NÉMETORSZÁGI SZÖVETSÉGI KÖZTÁRSASÁG

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP93/00981

A nemzetközi közzététel száma: WO 93/22675

A találmány tárgya módszer egy ligandum mennyiségének meghatározására egy biológiai folyadék mintájában.

Az eljárás során a meghatározandó ligandumot tartalmazó biológiai folyadékot inkubáljuk egy feloldott ligandumszármazék jelenlétében, amely oldhatatlanná alakítható; a folyadékfázisban egy olyan jelzett specifikus megkötőanyagnak a sztöchiometrikusnál kisebb mennyisége van jelen, ami megköti a meghatározandó ligandumot is és a ligandumszármazékot is, úgyhogy a meghatározandó ligandum és a ligandumszármazék versengenek a jelzett specifikus megkötőanyagért. Az eljárás során a ligandumszármazékot oldhatatlanná alakítjuk, és miután a meghatározó rendszer oldhatatlan alkotórészeit elválasztottuk a meghatározó rendszer folyadékfázisban maradó alkotórészeitől, a biológiai folyadékban a meghatározandó ligandum mennyiségét a ligandumszármazékhoz kötött jelzett specifikus megkötőanyag mennyiségéből számítjuk ki. A találmány kiterjed az eljárás megvalósítására szolgáló kitre is.

Találmányunk elsősorban egy fenti típusú módszerre vonatkozik egy egyértékú ligandum - azaz egy olyan ligandum, ami egy egyértékú antigén vagy egy haptén - meghatározására; az ilyen ligandumnak csak egy kötőhelye van egy specifikus megkötő partnerrel létesítendő immunológiai kötéshez. Az eljárás alkalmas egy ligandum szabad részének meghatározására, nevezetesen egy tiroid hormon meghatározására, amely biológiai folyadékokban részben fiziológiai megkötő proteinjéhez kötött formában és részben meg nem kötött, azaz szabad formában van jelen,· az eljárás célja ennek a szabad résznek a mennyiségi meghatározása.

A találmányunk szerinti eljárás az olyan immunológiai meghatározó eljárások egyike, amelyekben jelzett antitesteket (jelzett specifikus megkötőanyagokat) alkalmaznak, és amelyeket immunometriai meghatározási módszereknek is neveznek. Eljárásunk az ilyen módszerek azon változatához tartozik, amelyet kompetitív módszernek neveznek. A jellegzetes szendvics módszerekkel szemben, amelyek során a meghatározandó ligandum teljes mennyiségét egy szendvicsben kötik meg, a jelzett megkötő partner egy részét a meghatározandó ligandumhoz kötjük, és egy további részét ennek a ligandumnak egy versengő származékához. Az immunometriai meghatározási módszerek különböző fajtáiról további ismertetés található az EP-B-89806. számú szabadalmi leírás bevezető részében, ahol - éppúgy, mint az EP-B-103605. számú szabadalmi leírásban - egy a ligandumok szabad részeinek meghatározására szolgáló módszer immunometriai változatát írják le, amit az úgynevezett analóg kimutatási (analogue tracer) meghatározási módszerként ismertetnek az EP-B-26103. számú szabadalmi leírásban.

A találmány szerinti, ligandumok - elsősorban egyértékű ligandumok, úgymint tiroid hormonok - szabad részeinek meghatározására szolgáló immunometriai módszertípusnál a meghatározandó ligandumot és az ismert mennyiségben alkalmazott ligandumszármazékot engedik versengeni a fent leírt jelzett antitestek kis mennyiségéért. Ez az az alapvető módszer, amin a találmányunk szerinti megoldás alapul. A jelzett antitest lényegében teljesen a szabad ligandumhoz és a ligandumszármazékhoz kapcsolódik, és megoszlása a két kötő partner között viszszatükrözi a mintában a meghatározandó ligandum koncentráció ját. Annak érdekében, hogy információt kapjunk a ligandum meghatározandó koncentrációjáról, és a jelzett antitest megoszlásáról a mérendő ligandum és a ligandumszármazék között, a jelzett antitest és a ligandumszármazék reakciótermékét előnyösen rögzítjük a visszamaradó meghatározó oldattól való elválasztásra,· ezt az EP-P-103605. számú szabadalmi leírás szerint úgy végezzük, hogy a ligandumszármazékot oldhatatlanná alakítjuk a jelzett antitesttel való inkubálás előtt vagy után. Gyakorlatilag az ezidáig általánosan alkalmazott eljárás az volt, hogy először eltávolították a ligandumszármazékot a kapott keverékből, a szilárd szubsztrátumhoz kötve rögzített formában.

Ilyen típusú módszer megvalósítási módjait írják le az EP-A-303284. és az EP-A-324540. számú szabadalmi leírásokban.

Ennek a módszernek egyik változata esetében, amit az EP-A-149631. számú szabadalmi leírásban írnak le, a meghatározási módszerek szokásos alkotórészein kívül a ligandumszármazék számára egy külső megkötőanyagot is alkalmaznak. Ez a ligandumszármazékhoz alkalmazott külső megkötőanyag lehet egy további, ez utóbbira specifikus antitest. Szerepe az lenne, hogy egyfajta puffért képezzen a ligandumszármazék számára. Mivel az EP-A-149631. számú szabadalmi leírásban ismertetett módszernél a ligandumszármazékok kémiailag módosított ligandumok, melyek hapténjellegúek és ezért egyértékúek, az EP-A149631. számú szabadalmi leírás szerinti módszernél a külső megkötőanyag nem köti meg rögzítéssel a meghatározás során képződött komplexet, amely ligandumszármazékból és jelzett antitestből áll.

Egy másik, szabad anyagok meghatározására szolgáló módszer során, amit az EP-A-106615. számú szabadalmi leírásban ismertetnek, egy specifikus megkötőanyagot alkalmaznak, amely egyidejűleg kötődik a meghatározandó ligandumhoz és egy a specifikus megkötőanyaghoz való antitesthez, és a ligandumhoz való kötődés, valamint a további antitesthez való kötődés befolyásolná egymást, úgyhogy a kettő között versengés lép fel, és a meghatározandó szabad ligandum koncentrációját meg lehet állapítani az antitest kötődésének mértékéből.

Ha az EP-B-89806., EP-B-103605., EP-A-303284. vagy EP-A324540. számú szabadalmi leírások szerinti eljárásokban a jelzett antitesthez a meghatározandó szabad ligandummal versengő immobilizált ligandumszármazékot alkalmaznak, a gyakorlatban gyakran nehézségek (mátrixhatások) lépnek fel amiatt, hogy az immobilizált ligandumszármazék és jelzett antitest között végbemenő reakció a szilárd fázis felületén lezajló reakció, ahol a diffúziós folyamatok jelentős szerepet játszanak, és amelyeket a szilárd fázis bizonyos véletlenszerű tulajdonságai jelentősen meghatároznak. A gyakorlatban ezek a mátrixhatások azt jelenti, hogy a szilárd szubsztrátumok rögzített ligandumszármazékokkal alkotott egyedi előállított sarzsainak mindegyikének tulajdonságait alaposan meg kell vizsgálni, mert gyakran van jelen nagy százalékban használhatatlan szubsztrát, amit hulladékként el kell különíteni, és ez jelentősen megnöveli az előállítási eljárás, és ennek következtében a végső meghatározási módszer költségeit is.

Az EP-A-105714. számú szabadalmi leírásban továbbá azt is leírják, hogy a jellemző immunometriai szendvics módszereknél, amelyekben egy többértékű ligandum, mint például THS tökéletesen kötött formába kerül két különböző antitesttel való reakcióval, a kívánt inkubációs időket meg lehet rövidíteni úgy, hogy az aktuális szendvics képzést folyadékfázisú reakcióként hajtják végre, majd a képződött szendvicset a reakciórendszerből extrahálják egy olyan szilárd fázis hozzáadásával, amely megkötő partnert tartalmaz a szendvics antitestek egyikéhez. Ez a módszer csak olyan ligandum teljes koncentrációjának meghatározására alkalmas, amelynek specifikus megkötő partnerek számára legalább két kötőhelye van.

Találmányunk célkitűzése gyors és megbízható módszer biztosítása szabad ligandum mennyiségének meghatározására egy biológiai folyadékmintában, az 1. igénypont tárgyi köre szerint. Lényeges, hogy a módszer gyorsan, megbízhatóan és nagy pontossággal végrehajtható legyen, és elkerüljük a fent leírt mátrixproblémákat, amelyek hátrányosan befolyásolják a hasonló hagyományos módszerek költség-hatékonyság arányát.

Ezt a célkitűzést az 1. igénypont tárgyi köre szerinti módszerrel, az ennek az igénypontnak a jellemző részében ismertetett lépésekkel érjük el.

Eljárásunk előnyös megvalósítási módjait és az eljárás megvalósítására szolgáló kitet az aligénypontokban ismertetjük .

A találmány szerinti módszernél alkalmazott eljárás olyan, hogy a meghatározandó szabad ligandum és a ligandumszármazék közötti versengő reakció a jelzett antitesttel folyadékfázisban megy végbe, egy szilárd fázishoz kötött proteinjellegú anyag jelenlétében, amely specifikusan megköti egy konjugátumként alkalmazott ligandumszármazék szubsztrát protein részét, olyan reakcióban, amely lassabb, mint az aktuális immunreakció, és nem kovalens proteinkötést eredményez, így a folyékony reakciókeverékből extrahálja a ligandumszármazékból és a jelzett antitestből álló immunkomplexet.

A találmány szerinti módszernél a reakció végén a ligandumszármazékhoz kötött jelzett antitest egy szendvics szerkezet részeként, a ligandumszármazékon, szubsztrát protein részén és a rögzített proteinjellegű anyagon keresztül van kötve a szilárd szubsztrátumhoz. A szokásos szendvics módszerekkel ellentétben ezért nem a meghatározandó ligandum van kötve, hanem az előre meghatározott mennyiségben alkalmazott ligandumszármazék. Egyértékú ligandumok, úgymint egyértékű antigének vagy haptének, mint például tiroid hormonok esetében általában nem lehet szendvics szerkezetet képezni. Ez azonban lehetséges egy az EP-A-161107. számú szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel, egy oldható ligandumszármazék alkalmazásával, egy ligandumnak egy szubsztrát proteinnel képzett konjugátuma formájában. A meghatározandó szabad ligandum jelenléte az említett szendvics szerkezet kialakulásának zavara révén nyilvánul meg, abban, hogy a jelzett antitestek szabad ligandum által kötött részei nem rögzítődnek a szilárd fázison, hanem oldatban maradnak, és ezáltal információt szolgáltatnak a meghatározandó ligandum mennyiségéről.

Jelen bejelentésünkben - és például az EP-A-303284. számú szabadalmi leírásban is - a ligandum egy származékát, amelyben a ligandum vagy annak kémiailag módosított formája kovalensen kötődik egy protein szubsztrátum molekulához, egy ligandum

konjugátumaként határozzuk meg.

Olyan ligandumszármazék alkalmazásával, ami a ligandumnak egy szférikusán terjedelmes szubsztrát proteinnel képzett konjugátuma, a ligandumszármazék egyidejűleg egy differenciáltan megkötő ligandumszármazék, abban az értelemben, ahogy azt az említett technika állása szerinti leírásokban alkalmazzák, mely származéknak jelentősen csökkentett megkötő képessége van a fiziológiai megkötő proteinekkel összehasonlítva, és ezért lehetővé teszi a meghatározandó ligandum szabad részének nehézség nélküli meghatározását.

A találmány szerinti módszernél alkalmazott jelzett antitest előnyösen egy monoklonális antitest, amelynek affinitási tulajdonságai a meghatározandó szabad ligandummal és a ligandumszármazékkal szemben olyanok, hogy mindkettőhöz olyan mértékig kötődik, ami visszatükrözi a meghatározandó szabad ligandum mennyiségét, és az eltérő affinitások ki tudhatják egyenlíteni a két kötő partner közötti viszonylag nagy koncentrációkülönbségek hatását. Szabad tiroxin (FT4) meghatározása esetében például megfelelő egy olyan monoklonális antitest, amelynek asszociációs konstansa ΙΟ^θ mól/1 nagyságrendű .

Általában a ligandumszármazékot a moláris mennyiség 0,520-szorosának megfelelő nagyságrendű mennyiségben alkalmazzuk, a meghatározandó ligandumnak annak a mennyiségére számítva, ami egy normál betegtől vett mintában várható. A jelzett antitestet a meghatározandó ligandum a mintában várható menynyisége és a ligandumszármazék ismert hozzáadott mennyisége összegének megfelelő sztöchiometrikus mennyiségnél kisebb

mennyiségben alkalmazzuk.

A találmány szerinti módszert az alábbiakban részletesen leírjuk, példaként egy előnyös megvalósítási módot alkalmazva bevonatos cső teszt módszer formájában, szabad tiroxin (FT4) meghatározására szérumban. Ennek a módszernek a során egy T4IgG konjugátum (L-IgG) előre meghatározott mennyisége és a mintából származó szabad T4 (L) versengenek az oldatban a jelzett anti-T4 antitest (tracer,· Ak*) egy állandó mennyiségéért. A cső falain egy anti-IgG antitest (anti-IgG) van rögzítve, ami megköti a T4-IgG konjugátumot, és emiatt, mivel az a ligandumszármazékból és a tracer-ből álló immunkomplex része, azt a tracer részt is, amit a mintában levő szabad T4 frakciói nem kötnek meg, és ezért már nem köthető a T4-IgG konjugátumhoz. A mérés így egy T4-származék állandó mennyiségének szendvics képzéssel végzett immunometriai meghatározásának FT4 koncentráció-függő megzavarásán alapul.

A jelzett antitestet jelezhetjük az ismert jelzőanyagok vagy jelzőanyagrendszerek bármelyikével; ilyeneket részletesen felsorolnak például a bevezetőben ismertetett, technika állásához tartozó közlemények. Közelebbről a jelzést végezhetjük egy ismert radioaktív izotóppal, elsősorban jódizotóppal, és a mérési mód ekkor egy immunoradiometriás mérési módszer. A jelzett alkotórész azonban tartalmazhat más ismert jelzőanyagot is, például egy enzimet vagy egy fluoreszcenciás vagy - előnyösen - kemilumineszcenciás jelzőanyagot is.

A találmány szerinti módszert az alábbiakban részletesen ismertetjük egy előnyös megvalósítási módja leírásával, az ábrákra hivatkozva.

Az 1. ábra a vizsgálati elv sematikus bemutatása;

a 2. ábra a találmány szerinti módszer előnyös megvalósítási módjánál ligandumszármazékként alkalmazott T4-IgG konjugátum előállítására szolgáló reakciókeverék HPLC gélkromatográfiás eluciós profilját mutatja; az alábbi példákban alkalmazott természetes T4-IgG konjugátum 11 perc alatt eluálódik;

a 3. ábra a találmány szerinti, FT4 meghatározására szolgáló módszer jellemző standard görbéjét mutatja;

a 4. ábra a találmány szerinti módszer eredményeinek összehasonlítását mutatja egy az FT4 meghatározására szolgáló, kereskedelemben kapható teszttel (DYNOtest FT4, Henning Berlin).

Az előnyös megvalósítási módként ismertetett eljárásban az általánosan érvényes 1. ábra szerint a meghatározandó ligandumot tartalmazó szérummintát, egy T4 nyúl IgG konjugátum oldatot és egy jelzett anti-T4 antitesteket tartalmazó oldatot azonnal egymás után belepipettázunk egy kecske anti-nyúl antigénekkel bevont kémcsőbe. A jelzett anti-T4 antitest előnyösen egy monoklonális antitest, és nem lép keresztreakcióba sem a T4-IgG konjugátum szubsztrát protein részével, sem a kémcső bevonatával. A mintából származó FT4 így egy homogén folyadékfázisú reakcióban verseng a ligandumként szolgáló T4 nyúl IgG konjugátummal egy jelzett anti-T4 antitest formájában levő jelzett specifikus megkötőanyagért. Egyidejűleg, de lassabban, a T4 nyúl IgG konjugátum hozzákötődik a rögzített kecske antinyúl antitesthez és - a szérumminta FT4-tartalmával fordítva arányosan - a konjugátumhoz kötött, jelzett anti-T4 antitest11 • · *. :·· ..... ·.· .:..

hez. 2 órás inkubálás után a kémcsövet mossuk és a bennemaradó jelzett antitestet annak jelzett anyaga alapján mérjük.

Mivel a folyadékfázisban meghatározó kompetitív reakció lényegesen gyorsabban megy végbe, mint a folyadék-szilárd fázisú reakció, ennél a találmány szerinti módszernél nincsenek meg azok az alapvető kinetikai problémák, mint annál a megfelelő módszernél, amelynél az eredetileg immobilizált T4 konjugátumot alkjalmazzák.

A találmány szerinti módszer leírt megvalósítási módjánál a ligandumszármazékként használt T4 nyúl IgG konjugátum előállítása során szükséges biztosítani ennek a konjugátumnak az immunológiai felismerhetőségét, mind a jelzett antitest T4része, mind az IgG-rész vonatkozásában az immobilizáláshoz szendvics előállítása révén.

Ennek a követelménynek például úgy lehet megfelelni, hogy, mint az alábbi példában, a ligandumszármazékként alkalmazott T4 nyúl IgG konjugátumot egy kíméletes módszerrel állítjuk elő, amelynek során a szubsztrátprotein lényegesen nem denaturálódik, vagy amely lehetővé teszi a konjugátumok izolálását egy természetes, nem denaturáltt proteinlánc megtartásával .

Példa

a) T4 nyúl IgG konjugátum előállítása gg T4-NHS aktív észter (Henning Berlin) 50 μΐ acetonitrillel készített oldatát 1 mg nyúl IgG-vel (Sigma) inkubál juk 0,5 ml 8,0 pH-jú foszfátpufferben, 90 percig, szobahőmérsékleten. A T4-NHS aktív észterrel reagáltatott természetes nyúl IgG-t HPLC gélkromatográfiával elkülönítjük, és így elválasztjuk a T4-IgG aggregátumoktól, a nem reagált T4-NHS aktív észtertől és más reakciótermékektől. Egy példaként bemutatott elúciós profil látható a 2. ábrán. A T4-IgG töltési fokot egy többcsatornás UV abszorpciós detektorral határozzuk meg, ami folyamatosan méri az oszlopról lejövő áramot, az abszorbancia mérésével 325 és 280 nm-nél a kromatográfia során.

A meghatározás szerint a mérésenként! T4 nyúl IgG konjugátum mennyisége, amit a tesztben alkalmazunk, legfeljebb 20-szorosa az FT4 (moláris) mennyiségének egy normális beteg mintájában (körülbelül 20 pmól/1).

b) Jelzett anti-T4 antitest előállítása

Jelzett specifikus megkötőanyagkénti alkalmazásra egy önmagában ismert módon előállított monoklonális anti-T4 antitestet ismert reakcióval jelzetté alakítunk egy akridin-észterrel, így kemilumineszcenciásan jelzett anyagot kapunk. A jelzett antitestet a vizsgálati módszerben szub-sztöchiometrikus mennyiségben alkalmazzuk a T4 nyúl IgG kojugátumhoz és az FT4-hez viszonyítva. Az antitest lumineszcens jelzését a következőképpen végezzük:

μ<£ akridin-észter 10 μΐ acetonitrillel (Hoechst Behring) készített oldatát inkubáljuk 100 ^g monoklonális anti-T4 antitesttel (Henning Berlin) 90 μΐ 8,0 pH-jú foszfátpufferben 20 percig. A jelzett antitestet azután hidroxi-apa tit kromatográfiával tisztítjuk. A jelzett antitestnek körülbelül 110 000 RLU mennyiségét (Berthold gyártmányú Autoclinilumat készülékkel mérve) használjuk fel meghatározásonként.

c) Proteinanyaggal bevont kémcsövek előkészítése

A vizsgálatban használt kémcsöveket úgy készítjük elő, hogy megfelelő polisztirol csöveket 2,5 gg kecske anti-nyúl IgG-vel (Scantibodies) (0,5 ml 0,1 mólos, 8,0 pH-jú nátrium-hidrogén karbonátban) vonjuk be 24 órát szobahőmérsékleten. Ezt dekantálás, vizes mosás, majd 2 órát 3 %-os, kristályosodásgátolt szorbit szirupoldattal védjegye Karion), 0,5 % marha szérumalbuminnal és 0,005 % NaN^-dal végzett bevonás követi. Ezután újra dekantáljuk és a csöveket fagyasztva szárítjuk a későbbi felhasználásig való tároláshoz.

d) Mérési eljárás

A vizsgálatot a következőképpen hajtjuk végre, a fenti a)-c) lépésekben előállított alkotórészek alkalmazásával:

A következő anyagokat pipettázzuk azonnal egymás után egy-egy csőbe: 50 μΐ szérumminta vagy standard, 200 μΐ T4-IgG konjugátum oldat, 200 μΐ jelzett antitestet tartalmazó oldat. A két utóbbi oldat 50 mM 7,4 pH-jú HEPES-t, 150 mM nátrium-kloridot, 0,1 % zselatint és 0,05 % NaN₃~ot tartalmaz. A csöveket 2 órát inkubáljuk 170 fordulat/perc sebességgel rázatva. Végül mindegyik csövet 4 x 1 ml mosóoldattal mossuk és egy luminométerben megmérjük. A következő, a 3. és 4. ábrákon

- 14 : ί·» · .·

.....

szemléltetett eredményeket kapjuk:

a 3. ábra a leírt eljárás átlagos standard görbéjét mutatja, ami a vizsgálat mérésközi változásainak meghatározásából adódik;

a 4. ábra mutatja a 189 beteg széruma alapján kapott korrelációt a találmány szerinti vizsgálat és az ismert kereskedelmi teszttel (DYNOtest FT4 a Henning Berlintől) kapott eredmények között. A számítógépes programmal végzett értékelés 0,96-os koefficienst adott. A legjobb illesztési görbét a következőképpen számítjuk ki:

(a találmány szerinti FT4 teszt; pmól/1) =0,8 x (DYNOtest FT4; pmól/1) + 1,1 pmól/1.

e) Bizonyos mérési paraméterek a mérési módszerre kifejtett hatásának további vizsgálata el) A különböző T4-IgG töltési szinteken használt T4 nyúl IgG konjugátumok változásának hatása

Négy különböző T4-IgG konjugátumot állítunk elő és tisztítunk, és a T4 töltést a 325 nm-en és 280 nm-en fellépő abszorbancia mérésével határozzuk meg. Az alábbi 1. táblázat azt mutatja, hogy csak igen kis mennyiségű konjugátum szükséges a tracer megkötéséhez a találmány szerinti FT4 tesztben.

		.....’ »
1. táblázat
Konjugátum	T4-IgG töltési	A konjugátum meny-	% BO/T
	szint	nyisége meghatáro-
	325 nm/280 nm	zásonként
1	3,9 10E-2	20 ng	49
1	3,9 10E-2	5 ng	19
1	3,9 10E-2	1 ng	5
2	2,3 10E-2	20 ng	32
2	2,3 10E-2	5 ng	11
2	2,3 10E-2	1 ng	3
3	1,5 10E-2	20 ng	21
3	1,5 10E-2	5 ng	7
3	1,5 10E-2	1 ng	2
4	1,1 10E-2	2 0 ng	15
4	1,1 10E-2	5 ng	5
4	1,1 10E-2	1 ng	2

e2) A találmány szerint FT4 tesztben alkalmazott és anti-nyúl IgG-vel bevont tesztcsövek stabilitásának ellenőrzése

A csövek minőségében a tárolás folytán bekövetkező váltó12 5 „ zast I-dal jelzett nyúl IgG-vel es azonos mennyiségű olyan

125

I-dal jelzett nyúl IgG-vel végzett mkubalassal vizsgáljuk, melyet nem jelzett nyúl IgG feleslegével hígítottunk. Az alábbi 2. táblázat mutatja a nem jelzett nyúl IgG jelenlétében „ „ 125 eszlelt kötődést, a nem hígított, I-dal jelzett nyúl IgG kötődéséhez viszonyítva, és az ennek a kötődésnek 50 meghatá rozásával nyert varianciakoefficienst.

2. táblázat

Tárolás előállítás %-os kötődés + IgG hozzáadás, % CV után az IgG hozzáadás nélküli kö- (50-szer) tődéshez viszonyítva nap 45,42,4 hét, 4°C 45,32,1 hét, 37°C 43,61,8

Az eredmények azt mutatják, hogy a csövek igen stabilak, még növelt tárolási hőmérsékletek esetén is. Ezek a stabilitásértékek jelentősen jobbak, mint azokéi a hagyományos teszt csövekéi, amelyeknek falán rögzített T4-származék van jelen egy T4-IgG konjugátum formájában. Ezekben az ismert csövekben lényeges változások lépnek fel akkor is, ha csak 1 hetet tárolják őket 37°C-on, a frissen előkészített csövek adataival összehasonlítva. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárásnál alkalmazandó csövek több hétig stabilak 37°C-on.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egy tiroid hormon ligandum (L) szabad formája mennyiségének kvantitatív megghatározására egy biológiai folyadék mintájában, amely ligandum (L) részben az említett szabad formában, és részben egy fiziológiailag kötő proteinekhez kötött formában van jelen, az eljárás során a szabad ligandumot (L) tartalmazó biológiai folyadék inkubálásával egy ligandumszármazék jelenlétében, mely ligandumszármazék jelentősen csökkentett mértékben képes a fiziológiailag kötő proteinekhez kötődni, és oldhatatlan formájúvá alakítható, a folyadékfázisban egy jelzett specifikus kötőanyagnak (Ak ) a sztöchiometrikusnál kisebb mennyiségével, mely kötőanyag egy immunológiai megkötő reakcióban specifikusan megköti mind a meghatározandó szabad ligandumot (L), mind a ligandumszármazékot, úgy, hogy a meghatározandó szabad ligandum (L) és a ligandumszármazék versengenek a jelzett specifikus kötőanyagért ★

(Ak ), es a ligandumszármazék oldhatatlan formájúvá alakításával, és a mérési rendszer oldhatatlan alkotórészeinek elválasztásával a mérési rendszer azon alkotórészeitől, amelyek a folyadékfázisban maradnak, és a meghatározandó szabad ligandum (L) a biológiai folyadékban levő mennyiségének kiszámításával az oldhatatlanná tett 1igandumszármazékhoz kötődött jelzett specifikus kötőanyag (Ak ) mennyiségéből, azzal jellemezve, hogy a tiroid hormon ligandum egy immunoglobulinnal képzett oldható konjugátumát alkalmazzuk ligandumszármazékként (L

IgG), és a reakciót olyan tesztcsőben hajtjuk végre, melynek falai egy proteinjellegű anyaggal vannak bevonva (anti-IgG), amely specifikusan megköti a ligandumszármazék (L-IgG) immuno globulin részét anélkül, hogy befolyásolná a konjugátum ligandum-része és a specifikus kötőanyag (Ak*) közötti kötést, mely proteinjellegű anyag (anti-IgG) egy anti-idiotipikus immunoglobulin vagy egy anti-idiotipikus poli- vagy monoklonális antitest a ligandumszármazék (L-IgG) immunoglobulin-részével szemben, úgy, hogy a kötődés a ligandumszármazék (L-IgG) immunoglobulin-része és a proteinjellegű anyag (anti-IgG) kö zött lassabban megy végbe, mint az immunológiai kötődési reakció a szabad ligandum (L) vagy a ligandumszármazék (L-IgG) ligandum-része és a jelzett specifikus kötőanyag (Ak ) között.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás tiroxin (FT4) szabad részének meghatározására, azzal jellemezve, hogy ligandumszármazékként (L-IgG) egy tiroxin-IgG konjugátumot alkalmazunk, és a tesztcső falához kötött proteinjellegű anyagként (anti-IgG) egy anti-idiotipikus IgG-t a ligandumszármazék (L-IgG) IgG-részével szemben.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ligandumszármazékként (L-IgG) egy tiroxin-nyúl IgG konjugátumot alkalmazunk, és anti-idiotipikus IgG-ként (anti-IgG) egy kecske anti-nyúl IgG-t vagy egy kecske anti-nyúl antitestet .
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tesztcső falait a proteinjellegű anyag (anti-IgG) olyan mennyiségével vonjuk be, ami megegyezik az alkalmazott ligandumszármazék (L-IgG) teljes mennyiségének maradéktalan megkötéséhez szükséges mennyiséggel vagy több annál, és a ligandumszármazék (L-IgG) mennyisége molárisán 0,5-20-szoros nagyságrendű a meghatározandó szabad ligandum (L) azon mennyiségéhez képest, ami egy normális beteg esetében •A* várható, és a jelzett specifikus kötőanyagot (Ak ) szub-sztöchiometrikus mennyiségben alkalmazzuk, úgy, hogy a meghatározandó szabad ligandum (L) teljes mennyiségének és a mintában jelelevő ligandumszármazéknak (LIgG) csak egy része reagál a jelzett specifikus kötőanyaggal (Ak ).
5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal zz * jellemezve, hogy specifikus kötőanyagként (Ak ) a T4 olyan jelzett monoklonális antitestjét alkalmazzuk, ami nem reagál sem a ligandumszármazék (L-IgG) immunoglobulin-részével, sem a proteinjellegű anyaggal.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligandumszármazék (L-IgG) immunoglobulin-részeként egy természetes immunoglobulint alkalmazunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubálási lépéseket a következő sorrendben hajtjuk végre:

a) előkészítünk egy tesztcsövet, amelynek falai olyan fehérjejellegú anyag (anti-IgG) feleslegével vannak bevonva, ami ··· ··· ··* *·.* ♦ • · · · · 4 specifikusan megköti a ligandumszármazék (L-IgG) immunoglobulin-részét;

b) beletesszük egy a meghatározandó szabad tiroid hormon ligandum (L) ismeretlen mennyiségét vagy ennek a ligandumnak (L) egy standard oldatát tartalmazó biológiai folyadékot;

c) beleteszünk egy olyan oldatot vagy diszperziót, ami a ligandumszármazék (L-IgG) ismert mennyiségét tartalmazza; és

d) beleteszünk egy olyan oldatot vagy diszperziót, ami a

A, ' jelzett specifikus kötőanyag (Ak ) ismert mennyiseget tartalmazza;

és megfelelő inkubálási idő után a folyadékfázist eltávolítjuk a tesztcsőből, a tesztcsövet mossuk, majd meghatározzuk a mintában a szabad tiroid hormon ligandum (L) mennyiségét a jel/f * ' zett specifikus kötőanyagnak (Ak ) a tesztcso falához kötött arányát a standard mintákkal kapott eredményekhez viszonyítva.
8. Kit az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására, azzal jellemezve, hogy külön reagensekként a következőket tartalmazza: i) egy ligandumszármazék ismert mennyiségét egy tiroid hormon-immunoglobulin konjugátum formájában, ii) egy jelzett anti-ligandum antitest ismert mennyiségét, és kívánt esetben iii) a tiroid hormon standard oldatát mint ligandum standard mintát, és iv) megfelelő puffer- és hígitóoldatokat, valamint v) tesztcsöveket, amelyek falai egy a ligandumszármazék immunoglobulin-részével szembeni anti-idiotipikus immunglobulin feleslegével vannak bevonva.
9. A 8. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a ligandumszármazékot, a jelzett antitestet, kívánt esetben a ligandum standard mintát és a bevont tesztcsöveket tartalmazza, valamennyit fagyasztva szárított formában.