FI67760B - Foerfarande foer bestaemning av koncentrationen av en fri ligand fraon en biologisk vaetska - Google Patents

Description

ΓΒ1 m^«ULUTUSJULKAISU 577 £0 •*®S '1 UTLÄGGNINGSSKRIFT °//OU

c (45) Γ-^η’. Ί : L i y 1C C3 1/C5 (51) Kv.lk.*/lnt.CI.4 G 01 N 33/537 SUOMI —FINLAND (21) Patenttihakemus—Patentansökning 80299^ (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 23.09.80 (*=i) (23) Alkupäivä— Giltighetsdag 23.09.80 (41) Tullut julkiseksi — Bllvit offentlig 25.03.81

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväks ipanon ja kuul.julkaisun pvm.—

Patent-och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 31.01.85 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 24.09.79 1 ^.01.80 Englanti-England(GB) 7933072, 8001124 (71) Amersham International PLC., White Lion Road, Amersham, Buckinghamshire HP7 9LL, Englanti-England(GB) (72) John Edward Midgley, Amersham, Buckinghamshire, Terence Arthur Wilkins, Amersham, Buckinghamshire, Englanti-England(GB) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä vapaan ligandin konsentraation määrittämiseksi biologisesta nesteestä - Förfarande för bestämning av koneenirationen av en fri ligand frän en biologisk vätska Tämä keksintö koskee biologisissa nesteissä sekä proteiiniin sitoutuneessa muodossa (tai muihin sitoviin aineisiin, joita on nesteessä) että ei-sitoutuneessa eli vapaassa muodossa olevien orgaanisten aineiden tai ligan-dien vapaan osuuden määritysmenetelmää. Se liittyy ligan-dien kilpailevaan sitoutumiseen, tarkemmin sanottuna im-munomäärityksiin, joita käytetään ei-proteiiniin sitoutuneen aineen kuten hormoonin, biokemiallisen välittäjäaineen, steroidin, lääkeaineen, lääkemetaboliitin, polypep-tidin tai proteiinin, vitamiinin, tuumorin antigeenin, toksiinin, alkaloidin, mono-, di- tai polysakkaridin kon-sentraation määrittämiseksi mainitun aineen proteiiniin sitoutuneen muodon tai sitoutuneiden muotojen läsnäollessa biologisista nesteistä kuten veriplasmasta tai seerumista.

Useimpien fysiologisesti vaikuttavien aineiden suhteen, joita on yhtäaikaisesti sekä vapaassa muodossa 2 67760 ' . * että proteiiniin sitoutuneessa muodossa biologisissa nesteissä kuten veressä, ajatellaan tavallisesti että juuri vapaan muodon konsentraatio säätää näihin aineisiin liittyvän fysiologisen vasteen ja saattaa sen vuoksi olla kliinisesti tärkeämpi kuin koko aineen konsentraatio, johon kuuluu sekä vapaa (tai sitoutumaton) että proteiiniin sitoutunut aine.

Tämän yleisen käsityksen merkitystä valaisee eri-koisesimerkki tyroidihormoonien ja niihin liittyvien sitovien proteiinien osuudesta määrättäessä kilpirauhassairauden kliinistä statusta. Tyroidihormoonien tapauksessa (tyroksiini ja tri-jodityroniini) noin 99,98 % tyroksiinista (T 4) ja 99,7 % tri-jodityroniinistä (T 3) on sitoutuneena luonnossa esiintyviin sitoviin proteiineihin, tyroksiinia sitovaan globuliiniin (TNG), tyroksiinia sitovaan pre-albumiiniin (TBPA) ja albumiiniin (Alb), joita on veren seerumissa tai plasmassa. Kuitenkin tiedetään hyvin, että kilpirauhassairauden luonne ja sen vaikeusaste saattaa usein korreloida paremmin vapaan tyroidi-hormoonin konsentraation kuin kokonais-tyroidihormoonin tai proteiiniin sitoutuneen tyroidihormoonin konsentraation kanssa. Lisäksi on olemassa määrättyjä tiloja, kuten raskaus tai estrogeenihormooni-lääketerapia, jotka muuttuvat huomattavasti sekä sitovan proteiinin että kokonais-tyroidihormoonin pitoisuutta ilman huomattavaa vaikutusta vapaan tyroidihormoonin konsentraatioon tai kilpirauhassairauden kliiniseen statukseen.

Toinen esimerkki tämän yleisen käsityksen tärkeydestä on steroidihormooni kortisolin osuus adrenaalirauhas-ten mekanismin säätelyssä. Kortisolia on veriplasmassa sekä vapaassa muodossa (noin 8 %) että myös sitoutuneena (noin 92 %) luonnossa esiintyviin plasman proteiineihin transkortiiniin ja albumiiniin. Yleisesti ajatellaan, että juuri vapaan (sitoutumattoman) kortisolin konsentraatio säätelee kuivattua aivolisäkettä feed-back mekanismissa lisämunuaisen ja kuivatun aivolisäkkeen välillä terveissä yksiköissä. Tyroidihormoonin säätelyn tavoin aiheuttaa raskaus huomattavaa lisäystä sekä kortisolissa että pääasiallisessa sitovassa proteiinissa (transkortiinissa) ai- 3 67760 heuttamatta mitään huomattavaa lisäystä lisämunuais-kuivat-tu aivolisäke-toiminnassa tai vapaan kortisolin konsentraa-tioissa. Samanlaisia argumentteja voidaan esittää steroidi-sukupuolihormoonien kuten progesteronin, testosteronin ja estradiolin vapaiden (sitoutumattomien) osien tärkeästä osuudesta säätelyssä sukurauhasten ja aivolisäkkeen välillä, sillä tässä tapauksessa on hyvin suuri osa (> 90 %) näistä hormooneista sitoutuneena plasman proteiineihin kuten sukupuolihormooneja sitoviin globuliiniin ja albumii-miin.

Tätä nykyä käytettyihin klassisiin menetelmiin, joiden avulla määrätään aineen vapaan tai sitoutumattoman osan konsentraatio proteiiniin sitoutuneen materiaalin ohella, kuuluu tasapainodialyysin käyttö. Näiden kalibroin-timenetelmien uskotaan antavan kohtuullisen tarkan arvon useimpien aineiden vapaan osan konsentraatiosta, joita esiintyy biologisissa nesteissä sekä vapaassa että proteiiniin sidotussa muodossa, mutta ne ovat liian hitaita, liian pitkällisiä ja liiaksi alttiita koevirheille kliinisessä rutiinissa käytettäviksi. Tyroidihormoonien määrityksissä on kehitetty vaihtoehtoisia menetelmiä, jotka perustuvat suurelta osalta immunokoetekniikkaan. Viime vuosina on markkinoille tullut useita kittejä, joiden väitetään mittaavan vapaan tyroksiinin konsentraatiot, nimittäin seuraavia: A. Lepatit-kitti. Näyte absorboidaan siinä Sephadex/puskuri pylvääseen ja inkuboidaan 37°:ssa C yhden tunnin ajan. Proteiinit eluoidaan puskurilla. Vapaa T 4 eluoidaan erilleen metanolilla testiputkiin. Metanoli haihdutetaan pois ja korvataan puskurilla. T 4-liuoksia tutkitaan sitten radioimmunokokeiden avulla 4°:ssa C, jonka jälkeen seuraa inkubointivaihe 4 h ajaksi. Lepetit myöntää itse, että tämä menetelmä sekottaa proteiinisitoutumisen tasapainoa. Menetelmä on hyvin pitkällinen ja vaatii useita operaatioita. Kokeen kestoaika on kokonaisuudessaan 1 1/2 päivää ja sen tarkkuus on kehno.

B. Kliinisten kokeiden kitti. Näytettä inkuboidaan tässä tapauksessa puskurin kanssa vasta-aineilla päällys- 4 67760 tetyssä putkessa lämpötilassa 37°C 1/2 h ajan. Näyte ja purkuri otetaan pois ja putki pestään. Lisätään merkki-125 ainetta (J -merkittyä T 4:ää) ja puskuria ja putkea in-kuboidaan 37°:ssa C vielä yhden tunnin ajan. Putki de-kantoidaan, pestään ja suoritetaan laskenta.

Tässä kitissä tapahtuu kilpailua vasta-aineen ja luonnollisten T 4:ää sitovien proteiinien välillä ja se tulkitaan siten, että saadaan selville T 4:n kokonaismäärä systeemissä ja luonnollisten sitovien proteiinien sitomiskapasiteetti ja täten epäsuorasti vapaan T 4:n määrä, mitä ei saada mittaamalla suoraan vapaa T 4.

Tällä kitillä on varjopuolena hyvin epäselvä annos-herkkyys käyrä ja epätarkkuus. Koe on altis virheille ja sen vuoksi vain pieni määrä tuntemattomia voidaan tutkia tunnettujen standardien perusteella. Kokeen kestoaika on kokonaisuudessaan noin 2 1/2 h.

C. Damon kitti. Tässä tapauksessa liuosta, joka sisältää nailon-mikropallosiin kapseloituneen antiseerumin suspensiota, joka on etukäteen tasapainoitettu merkkiaineen avulla, pipetoidaan putkeen näytteen kanssa. Putkia inku-boidaan 37°:ssa C 1 h ajan, niitä pyöritetään ja inkuboi-daan vielä yhden tunnin ajan 37°:ssa C. Lisätään vielä puskuria kuhunkin putkeen. Sitten ne sentrifugoidaan, de-kantoidaan ja lasketaan.

Tämän kitin työskentelytapa voidaan selittää kehittyneen dialyysin ja kineettisen mekanismin tutkimuksen avulla, mutta vaikka se on hyvin rationaalinen, menetelmä kärsii epäselvästä annos-herkkyydestä ja epätarkkuudesta. Meidän käsissämme tulokset näyttivät korreloivan paremmin T 4:n kokonaismäärän kuin vapaan T 4:n kanssa. Kokeen kestoaika oli kokonaisuudessaan noin 3 h.

D. Pantex kitti. Tämä on kaksi-koetta-yhdessä kitti.

Kokonais-T 4:n erillinen RIA suoritetaan. Tätä seuraa T 4-sitoutumistesti (so. T 3-sitoutumistesti, jossa T 3-J125 125 on korvattu T 4-J :llä). Tulokset T 4-sitoutumis-testistä arvioidaan vapaan T 4:n arvojen prosentteina. Vapaan T 4:n arvot saadaan kertomalla molempien testien tulokset keskenään.

5 67760 Tämän kitin varjopuolena on se, että tarvitaan kaksi erillistä koetta. T 4-sitoutumistesti häiritsee hyvin pahasti proteiinin sitoutumistasapainoa.

E. Corning kitti. Tämä on samanlainen kuin Patex-kitti, paitsi että Corning käyttää antiseerumia, kun taas Pantex käyttää Sephadexiä absorboimaan sitoutumaton merkkiaine T 4-sitoutumis-testissä, ja että laskutavat ovat jonkin verran erilaiset.

Tällä kitillä on varjopuolena, kuten Pantex-ki-tilläkin se, että tarvitaan kaksi erillistä koetta. Sen tiedetään olevan epätarkka matalan TBG:n omaavalle eutoroi-dipotilaille. Se ei myöskään mittaa vapaata T 4:ää, vaan jonkinlaisen kompromissin sen ja kokonais-T 4:n välillä.

Brittiläisessä hakemusjulkaisussa GB 2 030 290,

Baxter Travenol Laboratories Inc., ehdotetaan menetelmää vapaiden analysoitavien aineiden määräämiseksi siten, että pannaan näyte, joka sisältää analysoitavan aineen vapaassa ja sitoutuneessa muodossa, kontaktiin merkitsemättömän reseptorin kanssa vapaan analysoitavan aineen sitomiseksi, ja merkitsemätön reseptori kontaktiin analysoitavan aineen merkityn analogin kanssa ja mitataan reseptoriin sitoutuneen merkkiaineen osuus.

Tämän ehdotuksen varjopuolena ovat tarvittavat kaksi vaihetta. Sitäpaitsi on myös välttämätöntä, että ensimmäisessä vaiheessa käytetään riittävästi merkitsemätöntä reseptoria sitomaan kaikki läsnäoleva vapaa analysoitava aine ja tämä pakostakin häiritsee tasapainoa vapaan/si-dotun analysoitavan aineen välillä.

On olemassa tarve saada aikaan menetelmä, jonka avulla on mahdollista tutkia biologisissa nesteissä olevien orgaanisten aineiden vapaata osaa, ja jossa vältyttäisiin edellä mainittujen menetelmien haitoista. Kyseessä olevan keksinnön pyrkimyksenä on täyttää tämä tarve.

Tämä keksintö koskee menetelmää vapaan ligandin kon-sentraation määrittämiseksi biologisesta nesteestä, joka sisältää ligandia myös sitoutuneena yhteen tai useampaan luonnolliseen sitovaan aineeseen, jolloin ligandin sitoutunut osuus ja vapaa osuus ovat tasapainossa keskenään. Menetelmälle on tunnusomaista, että ligandin merkitty johdannainen valitaan 6 67760 siten, että se sitoutuu lisättyyn spesifiseen sideaineeseen, mutta ei sitoudu lainkaan tai huomattavasti heikommin kuin itse ligandi biologisessa nesteessä oleviin luonnollisiin sitoviin aineisiin, ja spesifistä sitovaa ainetta käytetään sellainen määrä, joka on riittämätön oleellisesti häiritsemään sitoutuneen ligandin ja vapaan ligandin välistä tasapainoa.

Ligandi on tavallisesti jokin hormooni, biokemiallinen välittäjäaine, steroidi, lääke, lääkkeen metabo-liitti, polypeptidi tai proteiini, katekolamiini, vitamiini, tuumoriantigeeni, toksiini, alkaloidi tai mono-di- tai polysakkaridi.

Spesifinen sideaine on tavallisesti mitattavan ligandin vasta-aine, tai sellaiseen vasta-aineeseen perustuva reagenssi tai mahdollisesti sopivista biologisista materiaaleista eristetty, luonnossa esiintyvä sitova proteiini.

Ligandin merkitty johdannainen muunnetaan kemiallisesti siten, että estetään sen sitoutuminen luonnollisiin ligandia sitoviin aineisiin samalla kun sen kyky sitoutua kokeessa käytettyyn spesifiseen sitovaan aineeseen säilytetään .Ligandin merkityn johdannaisen ei siis pitäisi sitoutua lainkaan, tai hyvin paljon heikommin kuin itse ligandi, luonnollisiin ligandia sitoviin aineisiin. Merkityn johdannaisen affiniteettivakion ei tulisi olla kunkin pääasiallisen luonnossa esiintyvän sitovan aineen suhteen yli 10 %, ja ihanteellisessa tapauksessa lähellä 0 %:a ligandin affiniteettivakiosta luonnollisen sitovan aineen suhteen. Ligandin merkityn johdannaisen sitoutumis-voimakkuuden spesifiseen, kokeessa käytettyyn sitovaan aineeseen tulisi sopivasti olla verrattavissa ligandin sitoutumisvoimakkuuteen spesifiseen kokeessa käytettyyn sitovaan aineeseen; tämä vertailu ei kuitenkaan ole ehdottoman tarkka, vaan melkoista vaihteluakin voidaan sallia ja silti koe on hyväksyttävä. Olennaista kuitenkin on, että tämä ligandin merkitty johdannainen sitoutuu paljon heikommin (tai ei laisinkaan) luonnollisiin ligandia 67760 sitoviin aineisiin biologisessa näytteessä kuin kokeeseen lisättyyn spesifiseen sitovaan aineeseen, mutta ligandin merkityn johdannaisen sitoutuminen jonkin verran biologisessa näytteessä olevien luonnollisten ligandia sitovien aineiden vähemmistönä oleviin, heikosti sitoviin komponentteihin ei välttämättä tee menetelmää arvottomaksi.

Koska merkitty johdannainen ei sitoudu huomattavassa määrässä luonnollisiin ligandia sitoviin proteiineihin, se on käytännöllisesti katsoen kokonaan käytettävissä kilpailemaan vapaan ligandin kanssa spesifisen sitovan aineen kanssa tapahtuvasta reaktiosta. On siis mahdollista käyttää spesifisen sitovan aineen alhaista konsentraatiota ja saada silti tyydyttävä annosherkkyyskäyrä. On edullista käyttää alhaista spesifisen sitovan aineen konsentraatiota sen vuoksi, että tällöin ei aiheudu ligandin huomattavaa poistumista luonnollisista sitovista proteiineista systeemissä .

Tämä johdannainen sisältää tai siihen on liitetty samanaikaisesti fysikaalinen merkkiatomi kuten radioaktiivinen atomi (tai atomeja), fluorofori, kevyt kromofori, entsyymi tai kemilumenisoiva ryhmä. Kun käytetään radioaktiivista merkitsemistä on jodi-125 sopiva isotooppi, mutta asiantuntijat voivat helposti keksiä muita.

Vaiheessa c) voidaan ligandin ja sen merkityn johdannaisen se osa, joka on sitoutunut spesifiseen sitovaan aineeseen, erottaa siitä osasta, joka ei ole sillä tavoin sitoutunut, konventionaalisin menetelmin kuten saostamalla kemiallisesti ja sen jälkeen sentrifugoimalla. Vaihtoehtoisesti voi olla sopivaa tuoda spesifinen sitova aine reaktioväliaineeseen kiinteän alustan päällä kuten esimerkiksi polystyreenipallosten tai polystyreenilateksin päällä, jota voidaan sentrifugoida. Vaihtoehtoisesti voidaan spesifinen sitova aine tuoda reaktioastian sisäseinä-män päällysteen muodossa.

Joissakin menettelytavoissa, joissa merkkinä on entsyymi tai fluoresoiva molekyyli, voi olla tarpeetonta 8 67760 erottaa sitoutunut merkitty ligandi merkitsemättömästä. Erottaminen on välttämätöntä kuitenkin silloin, kun käytetään radioaktiivista merkkiä.

Konventionaalisessa radioimmuunikokeessa on ligandin spesifistä sitovaa ainetta (esimerkki vasta-ainetta) läsnä riittämätön määrä reagoimaan koko ligandin ja sen merkityn version kanssa. Ensi silmäykseltä näyttäisi sen vuoksi, että kyseessä olevassa keksinnössä tulee spesifistä sitovaa ainetta olla läsnä riittämätön määrä reagoimaan koko vapaan ligandin ja sen merkityn johdannaisen kanssa. Näin ei ole laita. Jonkin verran merkittyä ligandin johdannaista saattaa sitoutua näytteen luonnollisiin ligandia sitoviin aineisiin ja myöskin, koska jonkin verran vapaata ligandia poistuu spesifisten sitovien aineiden kanssa, luonnollisista sitovista aineista vapautuu enemmän ligandia sen tilalle. Saattaa olla edullista käyttää suurempi määrä spesifistä sitovaa ainetta kuin tarvitaan reagoimaan koko alunperin läsnäolleen vapaan ligandin määrän kanssa ja sen merkityn johdannaisen kanssa. Yläraja määräytyy ilmeisesti spesifisen sitovan aineen määrän mukaan, mikä reagoisi koko läsnä olevan ligandin kanssa, joko vapaan tai luonnollisiin sitoviin aineisiin, sitoutuneen, plus sen merkityn johdannaisen kanssa, mutta tämä ei ole hyvin helppo toimintaohje käytännössä .

On huomattava, että merkityn ligandin johdannaisen jakaantumistasapaino spesifisen sitovan aineen ja muun välillä määräytyy läsnä olevien luonnollisten ja spesifisten sitovien aineiden määrien mukaan, niiden affiniteettivaki-oiden mukaan ligandin ja sen merkityn johdannaisen suhteen ja läsnä olevien ligandin ja sen merkityn johdannaisen määrien mukaan. Vaikka teoreettisesti saattaisi olla mahdollista laskea vapaassa muodossa olevan ligandin määrä, kun tiedetään läsnä olevan merkityn ligandin johdannaisen määrä spesifisessä sitovassa aineessa sekä muun relevantin tiedon perusteella, tämä ei ole käytännössä sopiva menetelmä, vaan on turvauduttava radioimmuunikokeen vakiomenetelmään, nimittäin "annosherkkyys-käyrään" tai "vakiokäyrään". Tässä mene- 67760 telmässä mitataan useita standardiseerumeja, joissa vapaan ligandin määrä (joka on määrätty esimerkiksi tasapainodia-lyysin avulla) on tunnettu ja sijaitsee menetelmässä vaadittavalla työskentelyvälillä. Tulokset merkitään graafisesti ja tuntemattomat näytteet tulkitaan tästä käyrästä. Näytteen, spesifisen sitovan aineen ja merkityn antigeenin johdannaisen todelliset määrät optimoidaan, niin että saadaan sopivan jyrkkyyden omaava annosherkkyyskäyrä (ja siis sopiva koeherkkyys) kokeen halutulla työskentelyalueella. Tämä kokeen optimointimenetelmä on tuttu niille, jotka tekevät ra-dioimmuunikokeita tai vastaavia kokeita.

On kuitenkin olemassa sellainen rajoitus spesifisen sitovan aineen määrissä, mitä käytetään vapaan ligandin kokeissa, että mitä suurempi määrä käytetään, sitä enemmän tasapainoasema vapaan ligandin ja luonnolliseen sitovaan aineeseen sitoutuneen ligandin välillä muuttuu eli sitä enemmän vapaan ligandin konsentraatio tasapainossa muuttuu. Jossakin määrin annosherkkyyskäyrän käyttäminen korjaa tätä, sillä tasapainoasema muuttuu samalla tavoin sekä tuntemattomissa että normaalinäytteissä. Mutta koska ei voida välttää sitä, että normaaliseerumeissa ja potilasnäytteissä on eri suuria määriä luonnollisia sitovia aineita (juuri erilaiset määrät luonnollisia sitovia aineita eri potilaiden seerumeissa tekevät vapaan ligandin kokeen arvokkaaksi), on erittäin toivottavaa että luonnollisesta sitovasta aineesta irronneen ligandin fraktio (suhteessa luonnolliseen sitovaan aineeseen sitoutuneen ligandin kokonaismäärään) olisi niin pieni kuin mahdollista. Tähän kriteerioon päästään helposti sellaisissa tapauksissa kuin T-4 ja T-3, joissa vapaassa muodossa oleva fraktio on hyvin pieni. Ei kuitenkaan voida antaa mitään yleisiä sääntöjä siitä, että ligandin fraktio, joka saa irrota luonnollisesta sitovasta aineesta on riippuvainen lääkärin juuri määrätyssä kokeessa tarvitsemasta tarkkuudesta, normaalisti vapaassa tilassa läsnä olevan ligandin osuudesta, potilasnäytteissä havaituista luonnollisten sitovien aineiden konsentraatioiden vaihteluista jne. Kuten tavallisesti kliinisissä radioimmuunikokeissa se on kokeen optimoi-miskysysmys kulloinkin kyseessä olevaan tarkoitukseen.

67760 10 Tästä johtuen on edullisinta käyttää niin pientä määrää spesifistä sitovaa ainetta kuin mahdollista, jolloin saadaan sopivan jyrkkä annosherkkyyskäyrä ja vältetään häiritsemästä tasapainoa sitoutunut/vapaa ligandi enempää kuin on välttämätöntä.

Tässä keksinnössä selostettuja periaatteita noudattaen on kehitetty esimerkkinä koe, erityisesti radioimmuunikoe, jonka avulla voidaan mitata vapaan tyroksiinin konsentraatio seerumissa. Tyroksiini (T 4) kulkee ihmisen verivirrassa hyvin suuressa määrässä sitoutuneena kolmeen luonnossa esiintyvään T 4:ää sitovaan proteiiniin, TBG, TBPA ja albumiini. Kuhunkin näistä sitoutuneen T 4:n prosentuaalinen määrä on suunnilleen 70 %, 20-25 % ja 5-10 %. Kun syntesoidaan merkkiainetta tätä erityistä koetta varten, on tärkeätä että merkkiaineen sitoutuminen TBG:en ja TBPA:an kokeessa on nolla tai hyvin paljon vähemmän kuin merkkiaineen sitoutuminen kokeeseen lisättyyn spesifiseen sitovaan aineeseen. Tässä erityisessä kokeessa eivät merkkiaineen sitou-tumisvaatimukset seerumialbumiiniin. ole niin ehdottoman jyrkät, koska vain pieni murto-osa T 4:stä on sitoutunut albumiiniin ja albumiinin tyhjien sitoutumiskohtien lukumäärä on hyvin suuri verrattuna niiden kohtien lukumäärään, joihin T 4 on sitoutunut. Tämä merkitsee sitä, että hyvin huomattavat määrät merkkiainetta voi sitoutua seerumialbumiiniin ilman sitoutuneen T 4:n pois tunkemista .

T 4:n ja sen johdannaisten sitoutumista TBG:en ja TBPA:n käsitteleviä tärkeitä artikkeleja ovat "Thyroid Hormones and Analogs II Structure Activity Relationships" kirjoittanut E.C. Jorgensen teoksessa "Hormonal Proteins and Peptides" osa IV, toimittanut C.H.Li, julkaisija Academic Press, 1978, ja siinä olevat viitelähteet. Näistä käy selville, että T 4:n sitoutuminen sekä TBG:n että TBPA:n on hyvin riippuvainen T 4-molekyylin karbok-syylihapporyhmästä ja aminohappopäätteen aminoryhmästä. Kun kyseessä ovat T 4-johdannaiset, joista joko toinen tai molemmat näistä ryhmistä on poistettu tai kemiallisesti muunneltu niiden ionisoitumisen ehkäisemiseksi tavalliseen tapaan, tai ne on muunneltu kiinnittämällä suurikokoisia kemiallisia ryhmiä, on johdannaisten sitoutuminen TBG:n ja TBPA:n huomattavasti pienentynyt verrattuna T 4:ään. Toisaalta on näiden johdannaisten sitoutumis- 11 67760 voimakkuus antiseerumien kanssa, jotka on muodostettu immunogeeniksi, joka voi olla esimerkiksi T 4-metyylieste-ri, joka on liitetty aminoryhmien välityksellä T 4:ään, suureen proteiiniin kuten naudan seerumialbumiiniin usein verrattavissa itse T 4:ään sitoutumisvoimakkuuteen. Monet muut immunogeenityypit ovat sopivia tässä käytettäviksi ja ne ovat alan asiantuntijain tuntemia.

Näitä ominaisuuksia saadaan aikaan tyroksiinin tapauksessa (samanlaisia argumentteja voidaan käyttää T 3:n suhteen) muuntelemalla T 4:ään rakennetta yhdellä tai useammalla seuraavista tavoista: 1. Muunnellaan T 4:ään tai T 3:n alaniini-sivu-ketjun karboksyylihapon ja päissä olevan aminoryhmän sähkövarausta (chsrge); 2. Lisätään suurikokoinen ryhmä joko yhteen tai molempiin päissä oleviin karboksyylihappo aminoryh-miin.

3. Valmistetaan T 4:n tai T 3:n johdannaisia, joilla on mieluimmin D-konfiguraatio kuin L-konfiguraatio.

Aminohappo-sivuketjujen rakenne on seuraava / /NHT\ f /NH3\ — CH„_ CH ) tai CH, _ CH , .

^^co2h)

Tyyppiä 1 ja 2 olevat muunnokset voidaan esittää lyhyesti karboksyylikohdan (-COOH) ja aminokohdan (-NH2) muunnoksina seuraavasti:

- CH2- CH

^R2 67760

Mahdolliset karboksyyli-kohdan muunnokset: a) = NH2 R2 = H (tyroksamiini) b) esterit R2 = C02Me, -CC>2Et, -C02Pr c) amidit R2 - -CONH2, CONHMe, CONHEt, -CON(Me)2 d) peptidit R2 = -CO(GLY), -CO(ALA) e) proteiinit R2 = -CO(BSA) f) amiinit R2 = -NH2, -NHMe, -N(Me)2, g) ketonit R2 = -CO-CH^

Mahdolliset amino-kohdan muunnokset: a) R2 = C02H R^ = H (tyroetikkahappo) b) amidit R = NHCOMe, -NHCOEt c) peptidit R = -NH(GLY), -NH(ALA) d) proteiinit R^ = NH(BSA) e) amiinit R^ = -NHMe, -N(Me)2, -N (Me)

Ryhmät R^ ja R2 voitaisiin luonnollisesti korvata muilla ryhmillä kuten -CN, -OH, -CHO, -R (R = alkyyli tai aryyli), -X (X = halogenidi), -Ο-Me (eetteri), or-gaanometalliryhmällä tai metallikelaatilla.

D-tyroksiini-johdannaisten käyttäminen saattaa myös olla edullista. D-tyroksiini sitoutuu yhtä lujasti vasta-aineisiin kuin luonnossa esiintyvä L-tyroksiini, kun taas D-tyroksiinin sitoutuminen TBG:n ja TBPA:n on olennaisesti vähäisempää kuin L-tyroksiinin.

Toisena esimerkkinä voidaan konstruoida koe, tarkemmin sanottuna radioimuunikoe plasmassa olevan vapaan kortisolin konsentraation mittaamiseksi käyttämällä samoja periaatteita kuin on selostettu edellä vapaan tyroksiinin määräämisen yhteydessä. Kortisoli kulkeutuu verivirrassa ihmisillä suureksi osaksi sitoutuneena kahteen luonnossa esiintyvään sitovaan proteiiniin, kortikosteroidia sitovaan globuliiniin (joka tunnetaan CBG:nä tai transkortiinina) ja seerumialbumiiniin. Suunnilleen 92 % kortisolista ter- 67760 veillä yksilöillä on sitoutuneena näihin kahteen plasman proteiiniin, ja CBGieen sitoutunut osa on suurempi. Kun syntesoidaan merkkiainetta tähän nimenomaiseen kokeeseen, on tärkeätä että merkkiaineen sitoutuminen CBG:een on nolla tai hyvin paljon vähäisempää kuin merkkiaineen sitoutuminen kokeeseen lisättyyn spesifiseen sitovaan aineeseen. Analogisella tavalla vastaavan vapaata tyroksiinia koskevan kokeen kanssa ovat merkkiaineen sitoutu-misvaatimukset seerumialbumiiniin vähemmän tarkat, koska vain pienen prosentuaalisen osan kortisolista uskotaan olevan sitoutuneena albumiiniin ja tyhjien albumiinikoh-tien lukumäärä on hyvin suuri verrattuna kohtien lukumäärään, joihin kortisoli on sitoutunut. Tämä merkitsee sitä, että olennaisen suuria määriä merkkiainetta voi sitoutua seerumialbumiiniin ilman sitoutuneen kortisolin poistyöntämistä.

Kortisolin ja sen johdannaisten sitoutumista CBG:n selostavia tärkeitä artikkeleita ovat seuraavat: a) F. Le Guillard ja M. Dantrevaux, Biochimica et Biophysica Acta, 495 (1977) sivut 312-323.

b) M. Basset, G. Defaye ja E.M. Chambaz, F.E.B.S. Letters, 60, (1975) sivut 364-368.

c) M.K. Agarwal, Arch. Biochem & Biophys, 180 (1977), sivut 140-145, ja d) A.A. Akhrem, A.A. Avvakumov, G.V. Kukushkina, I.I. Sviridov, O.V. Strelchenole, ja O.A. Chashchim, Vestsi, Akad Navuk, BSSR Ser.

Khim. Navuk, 2 (1978) sivut 122-124.

Näistä käy selville, että kortisolin (ja samaten progesteronin) sitoutuminen CBG:een tapahtuu A- ja B-ren-kaiden kautta, joiden uskotaan sopivan halkeamaan CBG-molekyylissä.

1.4 67760

CH2-OH

c=o

CH3 . °H

H0 CH3 c d Λγυ —

A B

Steroidiytimessä, kaukana A ja B renkaista substi-tuentteina olevilla polaarisilla ryhmillä näyttää olevan vain vähän vaikutusta johdannaisen sitoutumiseen, kun taas sopivan suurikokoisten tai polaaristen ryhmien additio tai substituutio A ja B renkaissa tai niiden lähellä näyttää estävän johdannaisen sitoutumisen CBG:een.

Kortisolin ja sen johdannaisten sitoutumisesta see-rumialbumiiniin tekee selkoa US patentti 4 069 305, tammikuun 17 päivältä 1978 (A.J. Pollito ja W.S. Knight); sen mukaan johdannainen joka valmistetaan liittämällä polaarinen histamiiniryhmä karboksimetyylioksiimi-sillan välityksellä kortisolin A renkaan asentoon 3, sitoutuu paljon heikommin seerumialbumiiniin kuin kortisoli itse.

Kortisolille spesifisiä antiseerumeja valmistetaan immunogeeniksi, jollainen on alifaattisen sillan välityksellä suureen proteiiniin kuten naudan seerumialbumiinin liitetty kortisoli. Vaikka periaatteessa siltaa muodostava ryhmä voisi olla liittyneenä melkeinpä mihin tahansa ste-roidimolekyylin hiiliatomiin, ovat 3-, 6- ja 21-asennot parhaana pidettyjä helppouden ja spesifisyyden vuoksi. Kor-tisoli-immunokokeissa käytetyt merkkiaineet sytesoidaan, poik- 67760 keuksena mahdollisesti vain H-3 merkitty kortisoli, liittämällä merkkiryhmä alifaattisen sillan välityksellä steroidimolekyyliin. Merkkiryhmä saattaa olla histamiini- tai tyrosiini-metyyliesteri-osia, jotka steroidiin liitettyinä voidaan merkitä J-125:n avulla. Vaihtoehtoisesti saattaa merkkiryhmä olla entsyymi, fluo-rofori, kevyt kromofori tai kemiluminesoiva ryhmä. Voidaan sopivasti yhdistää tarve liittää merkkiryhmä steroidiin ja tarve estää merkkiaineen sitoutuminen VBGreen ja albumiiniin liittämällä sellainen ryhmä, joka on suurikokoinen, polaarinen ja joka toimii fysikaalisena merkkinä, alifaattisen sillan välityksellä steroidiytimen A tai B renkaaseen, mieluimmin 3- tai 6-sentoihin. Tällä tavoin syn-tesoitu merkkiaine ei sitoudu lainkaan tai ainoastaan hyvin vähän CBG:een ja albumiiniin verrattuna kortisoliin.

Sopivia merkkiaineita vapaata kortisolia koskevaa koetta varten voidaan syntesoida esimerkiksi seuraavalla tavalla: 1) Liitetään histamiini- tai tyrosiinijohdannaisia 3- tai 6-asentoihin sillan välityksellä, joka muodostuu joko O-karboksi-metyyli-oksiimiryhmästä tai karboksietyyli-tio-eetteriryhmästä, tai hemisukkinaatista, tai hemifuma-raatista tai hemi-adipaatista tai hemi-glutaraatista tai hemi-ftalaatista.

2) Tehdään radioaktiiviseksi näin kiinnittynyt merkkiryhmä J-125:n avulla.

On tärkeätä, että näin syntesoidut merkkiaineet sitoutuvat voimakkaasti spesifiseen kortisolin antiseeru-meihin samoin kuin se, että ne sitoutuvat hyvin vähän tai ei lainkaan CBGieen ja albumiiniin. Tämä ominaisuus on helpoimmin saavutettavissa käyttämällä immunogeeniksi muodostettua antiseerumia, joka on rakenteellisesti homologinen merkkiaineen kanssa. Esimerkiksi histamiini-3-karboksimetyylioksiimi-kortisoli-J-125-merkkiaineen sopiva antiseerumia saataisiin käyttämällä naudan seerumi-al-bumiini-3-karboksimetyyli-oksiimi-kortisoli immunogeeniä muodostamaan vasta-aineita. Olennaisen tärkeätä ei kui- 16 67760 tenkaan ole käyttää yhteensovitettua homologista merkki-aine-immunogeeni-paria. Joissakin tapauksissa saatetaan käyttää heterologista merkkiaineimmunogeeni-paria. Esimerkiksi etäällä antiseerumilla, joka on muodostettu 21-hemisukkinaatti-kortisoli konjugaatiksi naudan see-rumialbumiinille, on riittävästi affiniteettiä histamii-ni-3-karboksimetyylioksiimi-kortisoli-J-125 merkkiaineen suhteen, niin että sitä voidaan käyttää vapaan kortisolin radioimmuunikokeessa.

Vapaan kortisolin koetta koskevat periaatteet soveltuvat myös steroideihin progesteroni, estradioli ja testosteroni. On hyvin tunnettua, että progesteroni sitoutuu CBG:een sen A ja B renkaiden kautta samalla tavoin kuin kortisoli. Samalla tavoin seksuaalihormoonit testosteroni ja estradioli sitoutuvat voimakkaasti proteiiniin, joka sitoo seksuaalihormooneja, globuliiniin (SHBG) ja tämän sitoutumisen uskotaan tapahtuvan A ja B renkaiden kautta.

Mielenkiintoisia artikkeleita tämän suhteen ovat: a) C. Bonne ja J. Raymond, Steroids, 27 (1976) sivut 497-507.

b) D. Phillibert ja J.P. Raymond, Endocrinol, 94, (1974) sivu 627.

c) J.P. Raymond, Steroids, 21 (1973) sivu 249.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Vapaan T 4:n koe

Ligandin merkitty johdannainen oli N-asetyyli-ty- roksiini-metyyliesteri, joka merkittiin jodi-125:n vaih- 125 don avulla käyttäen natriumjodidi-J :ä ja kloramiini-T:ä. Ominaisvaikutus oli 1500 millicurietä milligrammaa kohti. Merkkiaineen konsentraatio oli 90 picomoolia.

Spesifinen sitova aine oli lampaan anti-T 4 seerumi liuos, joka oli muodostettu tyroksiini-metyyliesterille, joka oli liitetty naudan seerumialbumiiniin karbodi-imidin 67760 avulla. Lopullinen laimennus oli 1/60,000 puskurissa.

Puskuri sisälsi 13,6 g/1 KI^PO^, 9,0 g/1 NaCl, 0,07 g/1 NaN3 ja 1,0 g/1 gelatiinia.

50 μΐ seeruminäytettä sekoitettiin 200 μ1:η kanssa radioaktiivisen ligandin johdannaisen liuosta ja 200 μΐ spesifisen sitovan aineen liuosta ja seosta inku-boitiin huoneenlämmössä 1 h ajan. Sen jälkeen lisättiin 1 ml polyetyleeniglykolin liuosta (20 %) ja reaktioseos sentrifugoitiin. Päällä kelluva neste dekantoitiin ja sakan radioaktiivisuus mitattiin.

Seuraavat tulokset ovat tyypillisiä tämän tekniikan avulla saaduille.

Vapaa T4 Radioaktiivisuusprosentti (ng/dl) kiinteässä faasissa_ 0,0 58 0,2 55 1.0 47 3.0 34 5,8 22

Esimerkki 2

On saatu joitakin preliminäärisiä kliinisiä datoja ja tulokset on esitetty kuvioissa 1 ja 2, joissa kukin piste esittää potilasta. Kuvio 1 esittää vapaan T 4:n konsentraatioita näytteissä eri kliiniseen kategoriaan kuuluvilta potilailta, mitattuina tämän keksinnön mukaisen menetelmän avulla. Kuvio 2 esittää kokonais-T 4:n konsentraatioita samojen potilaiden näytteistä mitattuina konventionaalisia menetelmiä käyttäen. On huomattava, että raskailla naisilla ja eutyroidi-potilailla, joilla on korkeat tai matalat tyroksiinia sitovan globuliinin tasot, kaikki vapaan T 4:n arvot sattuvat normaaleihin rajoihin, kuten pitääkin.

18 67760

Esimerkki 3 Laimennuskoe

Kun näytteitä laimennetaan vedellä tai puskurilla ja sen jälkeen suoritetaan kokonais-T 4 RIA, niin mitatut kokonais-T 4 arvot pienenevät suhteessa näytteen laimennukseen.

Oppenheimer ja Surks (J.H.H. Oppenheimer ja M.I. Surks, J.Clin. Endocrinology and Metabolism, 24, sivut 785-793, (1964) ovat osoittaneet teoreettisesti, että vapaan T 4:n konsentraatio ihmisseerumissa ei ole riippuvainen laimennuksesta määrätyissä rajoissa.

Täten on mahdollista todellisissa vapaan T 4:n kokeissa laimentaa seeruminäytteitä ilman että se merkitsevästi vaikuttaisi mitattuun vapaan T 4:n konsentraatioon.

Tämän keksinnön mukaisen kokeen testaamiseksi tämän seikan suhteen laimennettiin eutyroidinäytettä samassa puskurissa kuin käytettiin kokeessa. Tulokset olivat seu-raavat:

Laimennus Odotettu kokonais- Mitattu T4 (ug/dl)_ vapaa -T4 (ng/dl) ei lainkaan 7,3 2,3 1:2 3,7 2,0 1:5 1,5 1,9 1:10 0,7 2,7

Esimerkki 4 Tämä koe on suunniteltu siten, että verrataan 125 kortisoli-3-karboksimetyylioksiimi-histamiini J :n sitoutumista transkortiiniin sen tai itse kortisolin kanssa.

Työjärjestys oli seuraava: A) 100 ui hiileen uutettua ihmisseerumia (joka si- 3 sälsi 0,01 uCi joko kortisoli (H )-merkkiainetta tai 125 kortisoli-3-karboksimetyylioksiimi-histamiini J -merkkiainetta) .

19 67760 B. 200 μΐ puskuria (joka sisälsi joko 0 tai 600 yg 6-aniliininaftaleenisulfonihappoa(ANS) aineena, joka salpaa kortisolia sitovan kohdan).

A:n ja B:n seosta inkuboitiin 37°:ssa C 1 h ajan. Hartsia (1 ml puskuroitua Biorad AG 1-X2 anionin-vaihto-hartsin suspensiota (200-400 mesh) kloridin muodossa 15 % paino/volyymi) lisättiin sen jälkeen. Reaktioputkia sekoitettiin 1 h ajan huoneenlämmössä. 0,5 ml:n suuruinen erä päällä kelluvaa nestettä otettiin laskemista varten. Tulokset olivat seuraavat: % Merkkiainetta sitoutunut seerumiproteiineihin (korjattu ei-spesifisen sitoutumisen vuoksi)

Merkkiaine ANS konsentraatio (pg/putki) 0 600

Kortisoli (H^) 28 3,5

Kortisoli-3-karboksi- metyylioksiimi- histamiini jl^5 η 5 3 (H )-merkkiaine sitoutuu voimakkaasti transkor- tiiniin, mutta korkeissa konsentraatioissa sen paikan 125 ottaa salpaava aine ANS. 3-CMO-histamiini-J -merkkiaine sitoutuu hyvin heikosti transkortiiniin ja salpaava aine ANS ei työnnä sitä syrjään huomattavassa määrin, mikä viittaa siihen, että kyseessä oleva sitoutuminen on luonteeltaan erilainen kuin kortisolin ja transkortiinin välillä.

Esimerkki 5 Tämän kokeen tarkoituksena on testata kortisoli-3- 125 karboksimetyyli-oksiimi-histamiini-J -merkkiaineen sitoutumista antiseerumiin, joka on muodostettu kortisoli-3- 20 67760 karboksimetyylioksiimi-tyroglobuliini-konjugaatiksi . Menettelytapa oli seuraava: 50 μΐ seerumia sekoitettiin 200 μ1:η kanssa kor- 125 tisoli-3-karboksimetyylioksiimihistamiini-J -merkkiaineen liuoksen kanssa. Merkkiaineen ominaistehokkuus oli 3,9 curietä/mg. Merkkiaineen konsentraatio oli 125 pikomoolia. Puskuri sisälsi 28 g/1 Na2HP04-12 H20, 4,6 g/1 sitruunahappo-monohydraattia, 9 g/1 NaCl, 3 g/1 E.D.T.A. dinatriumsuolaa, 0,5 g/1 NaN^, 1 g/1 gelatiinia ja 1 g/1 8-aniliinonaftaleenipsulfonihappoa (jälkimmäinen sen vuoksi että estettäisiin kortisolin sitoutuminen transkortiiniin ja albumiiniin).

Merkkiaineen ja seerumin seokseen lisättiin 200 μΐ polystyreeni lateksipartikkelisuspensiota (diametri 0,9 μ), jotka oli päällystetty kanin anti-kortisoli-see-rumilla. Puskuri oli 28 g/1 Na2HP04· 12 H20, 4,6 g/1 sitruunahappomonohydraattia, 0,5 g/1 NaN^ ja 2 g/1 naudan seerumialbumiinia. Vaikuttava antiseerumilaimennus koeputkessa oli 1/20000.

Saatua seosta pyöritettiin ja inkuboitiin 37 :ssa C 1 h ajan. Vasta-aineella päällystetyt partikkelit sentri-fugoitiin alas kiihtyvyydellä 1500 g 15 min ja nestefaasi dekantoitiin pois.

Seuraavat tulokset olivat tyypillisiä tämän tekniikan avulla saaduille:

Plasman kortisolin Radioaktiivisuus- kokonaismäärä prosentti vasta- (pg/dl) aineella päällystetyissä _ partikkeleissa__ 0 65,4 1 56,6 4 43,0 10 30,6 28 19,2 60 12,2 21 67760

Esimerkki 6

Vapaata T 4:ää koskeva koe käyttämällä N-asetyyli-tyroksiini-dimetyyliamidia

Ligandin merkitty johdannainen oli N-asetyyli- 125 tyroksiini-dimetyyliamidi, joka oli merkitty jodi :n 125 vaihdon avulla käyttäen natriumjodidi J :ä ja kloramii-ni-T:ä. Ominaistehokkuus oli 1000 millicueietä/mg. Merkkiaineen konsetraatio oli 0,5 pCi/ml.

Spesifinen sitova aine oli etukäteen saostettu kaksois-vasta-aine kompleksi, joka oli tehty lampaan anti-T 4 seerumista ja apinan anti-kani- f^-globuliini seerumista. Tätä reagenssia nimitetään t 4:ä sitovaksi reagenssiksi.

Puskuri oli 0,01 molaarinen fosfaatti, pH 7,4, joka sisälsi 0,0 g/1 NaCl 1,0 g/1 NaN^ ja 1,0 g/1 gelatiinia .

50 pl seeruminäytettä tai standardia sekoitettiin 500 μ1:η kanssa merkkiaineliuosta ja 1000 μΐ T 4:ää sitovaa reagenssia. Seosta inkuboitiin 2 h ajan 37°:ssa C, sentrifugoitiin, dekantoitiin ja suodatettiin. Sakan radioaktiivisuus mitattiin.

Seuraavat tulokset ovat keskiarvoja kaksoisputkis-sa saaduista tuloksista.

Vapaa T4 Radioaktiivisuusprosentti (ng/dl) kiinteässä faasissa_ 0 38 0,18 22 0,9 11 3,0 6,0 5,7 3,6

Ei-raskaana oleva autyroidi kontrolli antoi luvun 7,1 %, mikä merkitse vapaan tyroksiinin konsentraa-tiota 1,8 ng/dl.

67760

Raskaana oleva eutyroidi kontrolli antoi luvun 6,8 %, mikä merkitsi vapaan tyroksiinin konsentraatiota 2,0 ng/dl.

Kun tämän esimerkin koe suoritettiin kaikenkaikkiaan 55 potilaan seerumista, saatiin seuraavat tulokset ilmaistuina vapaan T 4:n konsentraationa ng/dl:

Hypotyroidi (10 potilasta) välillä 0,2-1,2 keskimäärin 0,78 Hypertyroidi (8 potilasta) välillä 2,7-4,5 keskimäärin 3,5 Eutyroidi (11 potilasta) välillä 0,9-1,8 keskimäärin 1,47 Raskaana oleva eutyroidi välillä 1,4-2,4 keskimäärin 1,87 (9 potilasta)

Matala TBG eutyroidi välillä 0,8-2,1 keskimäärin 1,18 Matala TBG euryroidi lääkkeillä välillä 0,8 - 1,9 keskimäärin 1,24 (4 potilasta ).

Tässä tukimuksessa saatuja lukuja verrattiin vapaan tyroksiinin indeksiin (FTI), jotka oli saatu samoista potilaista konventionaalisin keinoin. Korrelaatiovakio oli 0,94.

Esimerkki 7

Luettelo T 4 johdannaisista, jotka valmistettiin ja joihin liitettiin jodia testiä varten vapaan T 4 kokeen systeemissä D - T4 L - T4/A (N-asetyyli-L-T4-metyyliesteri) D - T4/A (N-asetyyli-D-T4-metyyliesteri) L - T4/F (N-asetyyli-L-T4) L - T4/L (N-asetyyli-L-T4-monoetyyliamidi) L - T4/M (N-asetyyli-L-T4-dimetyyliamidi)

Menetelmä, jonka avulla voidaan testata T 4 johdannaisten sitoutumista TBG:hen

Dominoiva sitova proteiini T 4:lie seerumissa on TBG ja T 4:n sitoutumiskohta tässä proteiinissa voidaan salvata lisäämällä sopiva konsentraatio tiomersalaat-tia puskuriin. On siis mahdollista saada hyvin selville 67760 Τ 4 johdannaisen sitoutuminen TBG:hen vertaamalla sitoutumista antiseerumiin salpaavan aineen ollessa läsnä tai ilman sitä.

Merkittyä T 4 johdannaista liuotettiin 0,01 molaa-riseen fosfaattiin, pH 7,4, joka sisälsi 0,9 % natrium-kloridia ja 0,1 % gelatiinia, niin että saatiin radioaktiivinen konsentraatio suunnilleen 0,05 pcurietä/ml.

Siinä osassa koetta, jossa käytettiin salpaavaa ainetta, tämä puskuri sisälsi 1,8 % tiomersaalia.

Käytettiin kiinteässä faasissa olevaa T 4 spesifistä vasta-ainetta, joka oli etukäteen saostettua kaksois-vasta-ainekompleksia, joka oli tehty antamalla lampaan anti-T 4 seerumin reagoida apinan anti-kani-gammaglobulii-niseerumin kanssa edellä mainitussa fosfaattipuskurissa. Tämän kiinteässä faasissa olevan T 4 vasta-aineen suspension konsentraatio valittiin siten, että se sitoi suun-125 nilleen 50 % J -T 4 merkkiainetta salpaavan aineen läsnäollessa käytetyissä koeolosuhteissa.

Merkittyjen T 4 johdannaisten sitoutumista kokeiltiin seuraavasti: 50 ytl ihmisseerumia (jota oli tyhjennetty T 4 hartsin avulla uuttamalla) 500 yil merkittyä T 4 johdannaista (salpaavan aineen kanssa tai ilman sitä) 1,0 ml kiinteässä faasissa olevaa T 4 vasta-aine-suspensiota.

Putkia inkuboitiin 2 h ajan 37°:ssa C ja sentrifu-goitiin sitten niin, että kiinteässä faasissa oleva vasta-aine laskeutui alas. Päällä kelluva liuos dekantoitiin ja radioaktiivisuus kiinteässä faasissa mitattiin.

Tätä tekniikkaa käyttämällä saatiin tyypillisesti seuraavia tuloksia: 125 24 67760 % T4-johdannaisesta sitoutunut vasta-aineeseen J :llä merkitty Ei tiomersaalia Tiomersaalia Suhde T4-johdannainen läsnä läsnä L - T4 12 50 0,24 D - T4 24 50 0,48 L - T4/L 21 60 0,35 L - T4/F 22 52 0,42 L - T4/A 36 40 0,90 D - T4/A 38 38 1,00 L - T4/M 50 50 1,00

Havaitaan, että L-T 4 on sitoutunut huomattavasti TBGrhen, sillä vähemmän on sitoutunut vasta-aineeseen sal-paavan aineen ollessa poissa kuin salpaavan aineen ollessa mukana. D-T 4 on kuitenkin sitoutunut vähemmän TBG:hen. Molemmat nämä tulokset olivat sellaisia kuin oli odotettu.

L-T 4/L ja L-T 4/F sitoutuvat molemmat TBGrhen suunnilleen samassa määrässä kuin D-T4. L-T 4/A näyttää sitoutuvan paljon heikommin TBGrhen kuin L-T 4, koska sitoutuminen vasta-aineeseen salpaavan aineen ollessa läsnä tai ilman sitä on melkein sama. T 4/Arn D-isomeerin käyttäminen näyttää vähentävän tätä sitoutumista TBGrhen vielä enemmän, koska D-T 4/Arn sitoutuminen vasta-aineeseen on ilmeisesti riippumaton salpaavan aineen mukanaolosta tai sen puuttumisesta. L-T 4/M näyttää samaten sitoutuvan vain minimaalisesti TBGrhen.

Tämä osoittaa, että on mahdollista muunnella tyroksiinin sivuketjua niin, että estetään sen sitoutuminen TBGLhen ja että T 4 johdannaisen D-isomeerin käyttäminen voi olla tässä suhteessa edullista. Vaikka D-T 4, L-T 4/L ja L-T 4/F sitoutuvat vähemmän TBGrhen, se ei ole vähentynyt riittävästi, että niitä voitaisiin pitää T 4 johdannaisena vapaan T 4rn kokeessa. Mutta L-T 4/A, D-T4/A ja L-T 4/M ovat 25 67760 riittävästi heikentäneet sitoutumistaan TBGrhen, jotta niitä voidaan käyttää vapaan T 4:n kokeessa.

Edellä olevan taulukon oikean puoleisessa sarakkeessa esitetään kahden muun sarakkeen lukujen suhde. Peukalosääntönä voidaan sanoa, että tämän suhteen tulisi olla vähintäin 0,6, etupäässä vähintäin 0,9 testatulle yhdisteelle, jotta sitä kannattaisi käyttää vapaan T 4:n kokeessa. On kuitenkin huomattava, että nämä luvut pätevät ainoastaan vapaan T 4:n kokeeseen, eivätkä välttämättä muihin vapaan ligandin kokeisiin.

Claims (9)

2S Patenttivaatimukset 6 7 7 6 0

1. Menetelmä vapaan ligandin konsentraation määrittämiseksi biologisesta nesteestä, joka sisältää ligandia myös yhteen tai useampaan luonnolliseen sitovaan aineeseen sitoutuneena, jolloin ligandin sitoutunut osuus ja vapaa osuus ovat tasapainossa keskenään, jossa menetelmässä a) nestenäyte sekoitetaan ligandin merkityn johdannaisen kanssa ja ligandin spesifisen sideaineen kanssa; b) vapaa ligandi, sen merkitty johdannainen ja spesifinen sideaine saatetaan reagoimaan keskenään, c) tarvittaessa se osa ligandia ja sen merkittyä johdannaista, joka on sitoutunut spesifiseen sideaineeseen, erotetaan siitä osasta, joka ei ole sitoutunut; d) ligandin merkityn johdannaisen määrä, joka on sitoutunut tai ei ole sitoutunut spesifiseen sideaineeseen mitataan, ja e) mittausta käytetään biologisessa nesteessä olevan vapaan ligandin konsentraation määrittämiseksi, tunnet-t u siitä, että ligandin merkitty johdannainen valitaan siten, että se sitoutuu lisättyyn spesifiseen sideaineeseen, mutta ei sitoudu lainkaan tai huomattavasti heikommin kuin itse ligandi biologisessa nesteessä oleviin luonnollisiin sitoviin aineisiin, ja spesifistä sitovaa ainetta käytetään sellainen määrä, joka on riittämätön oleellisesti häiritsemään sitoutuneen ligandin ja vapaan ligandin välistä tasapainoa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on hormooni, biokemiallinen välittäjäaine, steroidi, lääke, lääkemetaboliitti, polypep-tidi, proteiini, katekolamiini, vitamiini, tuumoriantigeeni, toksiini, alkaloidi tai mono-, di- tai polysakkaridi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on tyroidi hormooni, korti-soli, progesteroni, estradioli tai testosteroni.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifinen sideaine on ligandin vasta-aine. 67760 27

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandin merkittyyn johdannaiseen on liittynyt yksi tai useampi radioaktiivinen atomi, fluorofori, valokromofori, entsyymi tai kerniluminesoiva ryhmä.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on tyroksiini (T4) tai tri-joditryoniini (T3) ja ligandin merkitty johdannainen on tyroksiinin tai trijoditryoniinin johdannainen, jonka kar-boksyyliryhmä tai aminoryhmä tai molemmat on modifioitu.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T 4:n tai T 3:n modifiointi on suoritettu yhdellä tai useammalla seuraavista tavoista: a) modifioidaan T 4:n tai T 3:n alaniinisivuketjun karboksyylihapon ja terminaalisen aminoryhmän sähkövarausta; b) lisätään suurikokoinen ryhmä joko toiseen tai kumpaankin terminaaliseen karboksyylihappo- ja aminoryhmään: c) valmistetaan T 4:n tai T 3:n johdannaisia, joilla on mieluimmin D-konfiguraatio kuin L-konfiguraatio.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandin merkitty johdannainen on D-T3:n, L-T3:n, D-T4:n tai L-T4:n N-asetyyli-metyyliesteri tai N-asetyylidimetyyliamidi, joka on merkitty jodi-125:n avulla.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on kortisoli, progesteroni, estradioli tai testosteroni ja ligandin merkitty johdannainen on modifioitu ainakin yhden suurikokoisen tai polaarisen ryhmän addition tai substituution avulla joko sen A tai B renkaaseen, tai niiden lähelle. 28 67760