DE2731028C2 - Verwendung eines Antikörpergels zur immunologischen Bestimmung von Hormonen, Pharmaka und Vitaminen, welche in ungebundenem Zustand vorliegen - Google Patents

Verwendung eines Antikörpergels zur immunologischen Bestimmung von Hormonen, Pharmaka und Vitaminen, welche in ungebundenem Zustand vorliegen

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Description

aus dem Gel ausgewaschen.
Wird die Elution des Hormon/Bindungsprotein-Komplexes mit einer Lösung durchgeführt, die markiertes Hormon enthält, kann in einer zweiten Reaktion der noch nicht vom unmarkierten Hormon komplexierte Antikörper mit dem markierten Hormon erfaßt werden.
Da die Reaktionen des nidit-markierten Hormons und des markierten Hormons mit dem Antikörper nacheinander ablaufen, muß bei der Inkubation mit dem markierten Honnon nicht die Einstellung des Gleichgewichts abgewartet werden. Nach gewisser Zeit kann die Trennung des antikörpergebundenen und des nicht-gebundenen Hormons durch Elution mit Pufferlösung erfolgen.
Die Messung der Konzentration des markierten Hormons kann im Eluat oder im Gel in bekannter Weise radiologisch erfolgen. Die radioimmunologische Bestimmung von nicht-markierten Hormonen ist gleichfalls bekannt Eine ausführliche Beschreibung des Radioimmunoassays Findet sich beispielsweise in Clinical Chemistry, VoL 19, Nr. 2, 1973, Seite U5. Gegebenenfalls kommen auch alternative Bestimmungsmethoden, wie die fluoroimmunologische Bestimmung oder die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Betracht
Nach der Erfindung können Hormone, Pharmaka und Vitamine bestimmt werden, die im Serum oder Plasma zum Teil an spezifische oder nicht-spezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen. In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Thyroxin und Trl· jodthyronin, die Steroidhormone, wie Cortisol, Testosteron, Progesteron, östron, östradiol und Östriol und die Herzglycoside, wie Digitoxin und Digoxin. Ferner können bestimmt werden Vitamine, besonders Vitamin Bl2 und Folsäure, sowie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Antikoagulantien, Dicumarol, Analgctika und Salyzüatc.
Die Vorteile der in einer Matrix eingeschlossenen Antikörper liegen im Ausschluß von störenden Molekülen höheren Molekulargewichts, der Einsparung von Pipettier- und Zentrifugierschritten und der langen Haltbarkeit des immobilisierten Antikörpers bei Raumtemperatur.
Durch die Copolymerisation des Acrylamide mit damit copolymerisierbaren Verbindungen kann die Mikroumgebung der Polymermatrix beeinflußt werden. Die Wirkung beruht im wesentlichen auf hydrophoben und hydrophilen sowie elektrostatischen Effekten.
Durch die Variation der Polymermatrix mittels Copolymerisation ist eine wesentliche Erhöhung der Bindungsspezifität des Antikörpers und eine Unterdrükkung unerwünschter Kreuzreaktivitäten möglich.
Der Anteil des Acrylamide im Copolymerisat kann zwischen 1 und 99 Mol-%, vorzugsweise 5 bis 95 Mol-%, und insbesondere 20 bis 80 MoI-0Zb, betragen.
Besonders geeignet sind Copolymerisate aus Acrylamid und Methacrylsäure und insbesondere solche, bei denen der Methacrylsäureanteil 2C bis 60 Mol-% ausmacht.
Durch den Einsatz von Copolymerisaten, die Acrylsäure oder Methacrylsäure oder deren Salze enthalten, läßt sich ferner ein Neutralisationseffekt oder eine Pufferwirkung für saure bzw. alkalische Lösungen erzielen. Als Salze werden die Alkali- und/oder Erdalkalisalze bevorzugt.
Die Herstellung der Polyrnermatrices mit immobilisiertem Antikörper kann beispielsweise derart erfolgen, daß eine Lösung des Antikörpers dem Monomergemisch zugegeben wird. Der Ansatz wird beispielsweise radikalisch polymerisiert und das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und getrocknet
Zur Erzielung einer geeigneten Porengröße der PoIymermatrix wird die Monomerkonzentration variiert Eine Monomerkonzentration im Bereich von etwa 20% führt zu einer Porengröße von etwa 7 bis 10 A.
Eine Anordnung zur automatisierten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der Figur gezeigt
Der immobilisierte Antikörper befindet sich in kleinen Säulchen 5. Diese sind in einer Adapterplatte 4 fixiert Daninter werden die Aufgabe- und Auffanggefäße angeordnet die in einer Einheit 6 zusammengefaßt sein können. Die Säulchen 5 sind mittels Zufuhrleitungen 7 mit den Pumpen 1 und 2 verbunden. Die Anordnung wird durch ein elektronisches Steuergerät 3 gesteuert
Die zu bestimmende Probe wird in ein Reaktionsgefaß gegeben und unter ein Fertigsäulchen mit Antikörper geschoben. Dann wird durch dr.* Steuergerät folgendes Programm eingestellt:
Eine oder beide Pumpen laufen eine Zeitlang rückwärts, wodurch die Probe in das trockene Antikörpergel eingesaugt wird.
Anschließend erfolgt ein kurzes Pausenintervall. Während dieser Zeit erfolgt der Quellvorgang des Gels und die Trennung von freien und proteingebundenen Hormonen. Diese Quellphase liegt in der Größenordnung von 1 min.
In der nächsten Stufe laufen beide Pumpen, wobei die Pumpe 1 Eluierflüssigkeit, beispielsweise eine Pufferlösung oder Wasser, fördert und die Pumpe 2 Eluierflüssigkeit mit markiertem Hormon (Tracer) fördert oder nur die Pumpe 2 vorwärts. Auf diese Weise wird gleichzeitig die Proteinfraktion eluiert und der Tracer aufge-
6»·
Damit der Tracer vor der Aufgabe ins Gel sich nicht mit der Pufferlösung vermischt, d. h. verdünnt wird, werden Pufferlösung und Tracerlösung durch getrennte Kanäle zugeführt, die direkt über dem Gel enden.
Diese Elution und Traceraufgabe soll möglichst schnell erfolgen, damit das Hormon nicht Zeit hat, aus dem Gel herauszudiffundieren.
Die erforderliche Genauigkeit der Bestimmung wird erreicht wenn entweder die Zugabe des markierten Hormons in genauer Dosierung erfolgt oder im Sättigungsbereich des Antikörpers gearbeitet wird.
Anschließend erfolgt weiteres Pausenintervall, während dem das markierte Hormon mit den noch freien Bindungsstellen des immobilisierten Antikörpers reagiert Dieses Pausenintervall liegt üblicherweise in der Größenordnung von etwa 10 min. Anschließend erfolgt dir> El.irion mit reiner Pufferlösung, indem die Pumpe 1 vorwärtsläuft. Mit dieser Elution wird die Trennung des am Antikörper gebundenen und nicht-gebundtisen markierten Hormons bewirkt
Die im Eluat bzw. im Säulchen verbleibende Radioaktivität ist ein Maß für die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen.
Eine Eichkurve wird aufgestellt, indem bekannte Konzentration an Hormon ohne Protein der gleichen Schritten,unterworfen werden.
Ein Vergleich der bekannten Bestimmungen mittels Dialyse und Kohleadsorption hat gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren tatsächlich nur die freien, diffusiblen Hormone gemessen werden.
Das in der Zeichnung gezeigte System ist ein Mehrka-
nalsystem, das die Parallelbestimmung zahlreicher Proben gestattet.
Bei der praktischen Durchführung hat sich gezeigt, daß eine Thermostatisierung auf O0C zur Verminderung der Dissoziation nicht erforderlich ist, sondern vielmehr s auch bei 22"C durchgeführte Messungen identische Werte ergaben.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels, das die Bestimmung des diffusiblen Cortisols im Serum zeigt, näher beschrieben. to
Die Herstellung des Polymergels mit dem immobilisierten Antikörper wurde folgendermaßen durchgeführt. Für jeden Polymeransatz wurde die Konzentration so eingestellt, daß die totale Monomerkonzentration 3,13 Mol/l betrug. Für einen Ansatz wurden z. B. 5 g Acrylamid, 1,25 g N.N'-Methylenbisacrylamid in einem Becherglas in 24 ml Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst. Bei der Herstellung der Copolymerisate wurde Acrylamid äquimolar durch Acrylderivate ersetzt. Nach der Zuga-
1 j— a _*: :_ « 1 r»! 1 . ee i_ j:_
uc uca nniiaci ulna in ι im ruuauimipuiici wuiuc uic /υ Reaktion mit 0,15 mg Riboflavin und 0,10 ml Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin und UV-Bestrahlung gestartet. Während der Bestrahlungszeit von etwa 45 min wurde die Temperatur unter 500C gehalten. Der Gelblock wurde anschließend zerkleinert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Bei der Bestimmung des diffusiblen Cortisols wurden zwei Kolbenpumpen mit Fördergeschwindigkeiten von 0,68 ml/min (Pumpe 1) und 0,5 ml/min (Pumpe 2) verwendet, die sich vorwärts wie rückwärts bewegen können. 60 mg trockenes Anticortisolantikörpergel wurden in kleinen Säulchen mit eingelegtem Filter eindosiert. Aus einem Reaktionsgefäß wurden mit den Pumpen 320 μι Inkubationslösung in die Säulchen angesaugt, die folgende in Phosphatpufferlösung (pH 7,2) gelöste Substanzen enthielt: für die Dosiswirkungskurve nicht-markiertes Cortisol in ansteigender Konzentration (0,56 bis ! 7.66 pMol), für die Serumbestimmung verdünntes Serum (1 :12). Die Reaktionstemperatur wurde bei 00C ±03° C konstant gehalten. Mit den Pumpen erfolgte nach 4 min Quellungszeit die Proteinelution aus den Säulchen mit 630 μΐ 3H-Cortisollösung in Szintillationsgläschen. Nach 10 min Inkubationszeit mit dem 3H-Cortisol wurde das freie vom Antikörper gebundene Cortisol durch Elution mit der Pumpe 2, die Phosphatpufferlösung (pH 7,2) förderte, getrennt Das Eluat (1 ml bei 3 min Elutionsdauer) wurde in Szintillationsgläschen aufgefangen, mit 15 ml Szintillationslösung versetzt und die Radioaktivität im Flüssigkeitsszintillator gemessen. Aus den Impulsen je min (cpm) wurde die Konzentration des freien Indikatorhaptens 3H-Cortisol errechnet. Auf der Dosisw>kungskurve wurde dann der Gehalt des diffusiblen Cortisols im Serum abgelesen.
Es wurden Antikörpermatrices untersucht, die folgende Acrylderivate enthielten: 100% Acrylamid; 60% Acrylamid und 40% Methacrylsäureester; und 60% Acrylamid und 40% Methacrylsäure. Die Monomerkonzentration betrug jeweils 3,13 Mol/1, so daß eine Porengröße von ca. 0,8 bis 1,0 nm erreicht wurde. Die Gelkorngröße betrug im Mittel etwa 400 μπι. Bei einer Fordergeschwindigkeit /on 03 ml/min sind nach 4 min 92% der freien Heptene eluiert.
Die Bestimmung des diffusiblen Cortisols in μg/ 100 ml ergab unter verschiedenen Bedingungen folgende Werte: normal 13 bis 2,5; ACTH-Stimulationstest 45 bis 103; bei Dexamethasonsuppression 0,15 bis 1,0 und bei Schwangerschaft 3,0 bis 7,8. Diese Werte entsprechen jenen, die mit üblichen Methoden, wie der Gleichgewichtsdialyse, ermittelt werden.
Die Erfindung wurde auch zur Bestimmung von Testosteron herangezogen. Die Arbeitsweise entsprach im wesentlichen der vorstehend beschriebenen Bestimmung des Cortisols. Es wurden jedoch 160 mg Antikörpergel verwendet, 1 ml Inkubationslösung in die Säulchen gesaugt sowie mit 1580 μΙ 3H-Testosteronlösung einer Konzentration von 27Opg/1OOμl die Proteinelution durchgeführt Es ergab sich eine formale SensitivitätvonlOpg/ml.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1 2
des Hormons liefern. Bei diesen Techniken ist die Reak-
Patentanspruch: tionszeit ein kritischer Faktor, da die Bindung zwischen
Adsorbent und Steroid irreversibel ist
Verwendung eines Antikörpergels, bei dem die Die bekannten Trennverfahren sind sehr aufwendig Antikörper in ein Copolymerisat aus Acrylamid und 5 und liefern nur den prozentualen Anteil des freien Horeiner oder mehreren der Verbindungen Acrylsäure, mons. Der Absolutwert muß durch zusätzliche Ermitt-Methacrylsäure, Methacrylamid, Acrylsäurederiva- lung der Gesamthormonkonzentration berechnet werte, Acrylsäuresalze, Methacrylsäurederivate, Metha- den. Durch diese indirekte Bestimmung ist die Messung crylsäuresalze und Methacrylamidderivate einge- mit entsprechender Ungenauigkeit verbunden, abgeseschlossen sind, zur immunologischen Bestimmung io hen von den äußerst aufwendigen Techniken, die nötig von Hormonen, Pharmaka und Vitaminen, welche in sind, um den Prozentanteil zu bestimmen,
ungebundenem Zustand vorliegen. Aufgabe der Erfindung ist es, die Bestimmung von
Hormonen, Pharmaka und Vitaminen im ungebundenen
Zustand zu ermöglichen. Diese Aufgabe wird durch die
15 Verwendung eines Antikörpergels gelöst, bei dem die Antikörper in ein Copolymerisat aus Acrylamid und ei-
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung des ner oder mehreren der Verbindungen Acrylsäure, Me-
Antikörpergels nach der DE-PS 27 21 267. Bei diesem thacrylsäure, Methacrylamid, Acrylsäurederivate.
Antikörpergel sind die Antikörper in ein Copolymerisat Acrylsäuresalze, Methacrylsäurederivate, ivf ethacryl-
aus Acrylamid und einer oder mehrerer der Verbindun- 20 säuresalze und Methacrylamidderivate eingeschlossen
gen Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylamid, Salzen sind.
und Estern der Acrylsäure, am Stickstoffatom subsiitu- Das erfindungsgemäß verwendete Aniikörpergei ge-
ierte Methacrylamide und Acrylamide eingeschlossen. stattet die Bestimmung der absoluten Konzentration
Nach der DE-PS 27 21 267 wird das Antikörpergel von ungebundenen Hormonen, Pharmaka und Vitami-
zur Gesamtbestimmung von Hormonen, Pharmaka und 25 nen in einem Verfahren. Diese Bestimmungsmethode ist
Vitaminen eingesetzt äußerst einfach, schnell und automatisierbar.
Aus der US-PS 39 10 429 ist ?in Antikörpergel aus Der Erfindung liegt folgendes Prinzip zugrunde. Im
einem vernetzten Acrylamidpolymeren bekannt Es hat Serum oder Plasma befindet sich das Hormon oder
sich jedoch gezeigt, daß dieses Gel zur Bestimmung Pharmaka (H) entsprechend dem Massenwirkungsge-
ungebundener Hormone im Gemisch mit gebundenen 30 setz mit dem Transportprotein (B) im thermodynami-
Hormonen nicht geeignet ist sehen Gleichgewicht:
Steroide we*den im menschlichen Serum an Proteine
gebunden. In der klinisch-chemischen Hormonanalytik H + B *=* HB
basieren die Hormonbestimmungen fast ausschließlich
auf dem Prinzip, die Bindung der Transportproteine zu 35 Wird das Serum auf getrocknetes Antikörpergelpulden Hormonen zu lösen und die Gesamtkonzentration ver aufgegeben, so beginnt die Matrix stark zu quellen, des Hormons zu messen. Als Techniken zur Bindungslö- Dieser Queüvorgang, der sehr rasch verläuft, führt zur sung kommen die verschiedensten Verfahren, wie Lo- Trennung des diffusiblen, freien Hormons und dem Horsungsmittelextraktion, Hitzedenaturierung, enzymati- mon/Bindungsprctein-KompIex, da während des Quellsche Hydrolyse und Säure- oder Alkalieneinwirkung in 40 Vorgangs aufgrund der kleinen Posrcngröße der Matrix Frage, nur relativ kleine Moleküle in diese eindringen können. Der Gehalt der Bindungsproteine im menschlichen Das kleine freie Hormon wird mit der Flüssigkeit in das Serum ist aber nicht immer gleich groß. Es ist bekar.iu, Gelinnere V-, mitgenommen, während die Proteine und daß bei Patientinnen unter Antiovulantientherapie oder die proteingebundenen Hormone wegen der kleinen in der späten Schwangerschaft deutlich erhöhte Werte 45 Porengröße des Gels nur das die Gelpartikel umgebenvon z. B. cortisol-bindendem Globulin bzw. tyroxin-bin- de äußere Volumen V, benutzen können. Mit dem dendem Globulin gemessen werden. Daneben wurden Quellvorgang wird praktisch eine äußerst rasche, vollisolierte Vermehrungen oder Verminderungen des Bin- kommene Trennung von freiem und gebundenem Hördungsproteingehaltes gefunden, deren familiäre Hau- mon erreicht
fung und Erblichkeit noch diskutiert wird. 50 Da sich in dem von den Gelpartikeln umschlossenen
Solche veränderten Bindungsproteinspiegel führen Volumen Vb das etwa 80 bis 90% des gesamten Gelvolu-
bei der Bestimmung des Gesamthormons zu Werten, mens ausmacht, der Antikörper befindet, erfolgt dort
die ein Syndrom anzeigen, während die Patienten aber Jie Reaktion des Antikörpers mit dem einströmenden
das klinische Bild des entsprechenden Syndroms nicht Hormon:
zeigen, da die Regulation der Hormone offenbar nur 55
über den nicht an Protein gebundenen Anteil erfolgt, Ak+H*=* AkH
wogegen der an Protein gebundene Anteil biologisch
inaktiv ist. In einem zweiten Schritt erfolgt die Elution nur solan-Bekannte Techniken zur Bestimmung von proteinge- ge, daß das Außenkornvolumtn V1 eluiert wird. In Va bundenem und freiem Hormon sind entweder solche, 60 befinden sich unter anderem auch das Bindungsprotein bei denen das Gleichgewicht zwischen gebundenem und und der Hormon/Bindungsprotein-Komplex,
freiem Hormon während der Trennung aufrechterhal- Das diffusible Hormon befindet sich nach dem Quellten wird, wie z. B. bei der klassischen Gleichgewichts- Vorgang hauptsächlich in dem inneren Gelkornvolumen dialyse oder der Ultrafiltration, oder Techniken, bei de- V/. Während des Quellvorgangs hat sich der Antikörper nen zwar das Gleichgewicht während der Trennung 65 bereits mit dem Hormon umgesetzt. Ferner ist das VoIunicht aufrechterhalten wird, wie z. B. bei der Säulen- men V/ bedeutend größer als V1. Aus diesen Gründen Chromatographie oder den Adsorptionsmethoden, die wird durch eine Elution, die nur das äußere Gelkornvoaber dennoch ein Maß für den tatsächlich freien Anteil lumen V„ umfaßt, wenig von dem diffusiblen Hormon
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