DE2132112C3

DE2132112C3 - Verfahren zur in vitro Bestimmung von Serumthyroxin

Info

Publication number: DE2132112C3
Application number: DE2132112A
Authority: DE
Inventors: Schick Lloyd Alan; Amirav Grodon; Jack Gross
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1970-06-29
Filing date: 1971-06-28
Publication date: 1974-09-19
Also published as: IL37046A; DE2132112B2; DE2132112A1; FR2100008A5; CA955159A; US3659104A; HU166424B; GB1351836A; SE392346B; ES392664A1; JPS5331399B1; ZA713408B

Description

graphk durchgeführt worden sind, ist das Verfahren die mit einer sehr geringen Menge eines radioaktiven im wesentlichen das gleiche, d. h. eine verdünnte Isotopen markiert ist. Hierzu wird ein Mittel zugege-Serumprobe wird auf ein Ionenaustauscherharz ge- ben, das eine ganz bestimmte Anzahl Moleküle bindet, geben. Die unerwünschten Verunreinigungen werden Da für das bindende Mittel kein Unterschied besteht dann aus der Säule eluiert und verworfen. Anschließend 5 zwischen den markierten und nicht markierten Molewerden die zu bestimmenden Hormone eluiert, gesam- külen, treten diese in Konkurrenz um die bindenden melt und das T-4 durch Jodanalyse bestimmt. Stellen. Diese Moleküle sind gleichmäßig vermischt,

In der Zeitschrift für klinische Chemie und klinische so daß das bindende Mittel sie in dem gleichen VerBiochemie, 6. Jahrgang 1968, H. 4, S. 326 bis 331, ist hältnis bindet, in dem sie in freiem oder nichtgebunein Verfahren zur Bestimmung des freien Thyroxin- ίο denero Zustand vorliegen. Mit zunehmender Konzengehalts im Serum mittels Gelfiltration beschrieben. tration an nicht-markierten Molekülen wird das Ver-Dabei wird Serum mit einer Lösung inkubiert, die hältnis kleiner und es werden weniger markierte markiertes Thyroxin enthält, und dieses Gemisch auf Moleküle an das bindende Mittel gebunden und es eine Dextrangelsäule aufgebracht, die mit einer Phos- verbleiben mehr markierte Moleküle ia freiem Zuphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,9 oder 9,5 15 stand, indem man die Bindung der markierten MoIeeluiert wird, wobei der niedrigere pH-Wert bevorzug» küle in Gegenwart einer bestimmten Menge nicht ist. Bei diesem Verfahren erhält man eine Trennung markierter Moleküle eicht, erhält man ein quantitatives zwischen dem proteingebundenen und dem freien Verfahren.
Thyroxin. ^ Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-

In »Das ärztliche Laboratorium«, 16. Jahrgang, ao fahrens wirkt die Säule mit dem vernetzten Dextran-1970, H. 3, S. 65 bis 72, ist ein Verfahren zur Gesamt- gel als sekundäres oder zweites bindendes Mittel für Thyroxinbestiru-aung beschrieben, bei dem das Thyr- das nichtgebundene oder freie T-4, während das oxin zunächst mit Alkohol aus dem Serum extrahiert primäre oder erste bindende Mittel thyroxinbindendes und dann mit einein Ionenaustauscher als zweitem Globulin (TBG) aus menschlichem Serum ist Zunächst bindenden Mittel zusammengegeben wird. Dabei wer- 35 wird eine abgemessene Menge des Serums mit etwas den von dem Ionenaustauscherharz neben dem mit' radioaktivem Jod markiertem T-4 am oberen Thyroxin auch die Proteine gebunden, die nur unspe- Ende der ^eT-n~ vermischt. Sowohl die Säure als auch zifisch und unter sauren Bedingungen eluiert werden das T-4-Gemisc" ■ haben einen pH-Wert von 12 bis 13. und es ist notwendig, das Thyroxin vorher aus dem Bei diesem pH-Wert sind die das T-4 bindende Serum-Seruni zu extrahieren. Bei dieser Extraktion wird das 30 proteine wie Prealbumin, Albumin und thyroxinbin-Thyroxin nie vollständig aus dem Serum extrahiert und dendes Globulin vollständig abgespalten von dem T-4. der Extraktiottägrad muß extra bestimmt und bei der Wenn das Gemisch durch die Säule nach unten fließt, Berechnung des Thyroxingehaltes berücksichtigt wer- wird das T-4 von dem Dextrangel gebunden. Die den. Serumproteine werden mit einem Barbitaipuffer mit

Es ist nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein 35 einem pH-Wert von 8,6 ausgewaschen, der automa-

Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Thyroxins im tisch den pH-Wert der Säule auf denjenigen des Puffers

Serum zu entwickeln, das auf einfache Weise zu ge- einstellt. Bei diesem pH-Wert wird der Übergang des

nauen und reproduzierbaren Werten führt. T-4 von der Säule auf das erste bindende Mittel

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch erleichtert. Das erste bindende Mittel, in Barbital-

ein Verfahren zur In-vitro-Bestimmung des Gesamt- 4» puffer gelöst, wird dann zugegeben. Es stellt sich

Thyroxins im Serum, wobei man eine vorher bestimmte schnell ein Gleichgewicht zwischen den beiden bin-

Menge des zu untersuchenden Serums und eine genau denden Mitteln ein und das erste bindende Mittel wird

bestimmte Menge einer radioaktiven Thyroxinlösung ausgewaschen, wobei es einen Teil des T-4 mitnimmt,

mit einem zweiten bindenden Mittel in Berührung Durch Messung der Radioaktivität der Säule vor und

bringt, mit einer wäßrigen Lösung wäscht, die in dem 45 nach der Behandlung mit dem ersten bindenden Mittel

zweiten bindenden Mittel verbleibende Aktivität mißt und Vergleich des von der Säule zurückgehaltenen

und daraus durch Vergleich mit bekannten Proben den Prozentgehaltes mit einer Standardkurve, in der der

Thyroxingehalt des Serums berechnet, das dadurch zurückgehaltene Anteil in Prozent gegen die T-4-

gekennzeichnet ist, daß man als zweites bindendes Konzentration aufgetragen ist, kann die Menge an

Mittel eine Säule verwendet, die mit einem mit 50 T-4 in dem Serum bestimmt werden.

Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einem Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der

Wasseraufnahmevermögen von 1 bis 5 g/g trockenes· Feststellung, daß eine Dextrangelsäule radioaktives

Gel mit einem pH-Wert von mindestens ungefähr 11 T-4 bis zu einem pH-Wert von 9 gut festhält. Bei

gefüllt ist, mit einer alkalischen Lösung wäscht und einem pH-Wert zwischen 9 und 11 wird radioaktives

vor der Messung der in der Säule verbleibenden 55 T-4 schnell von der Säule eluiert, während bei einem

Aktivität das Thyroxin aus der Säule teilweise mit pH-Wert von mehr als 11 die Retention von T-4 durch

einer vorher bestimmten Menge eines thyroxinbinden- die Säule stark erhöht wird. So bändet Dextrangel

den Elutionsmittels entfernt. T-4, aber kein Protein, während Anionenaustauscher-

Es hat sich gezeigt, daß bei einem solchen verhältnis- harze sowohl T-4 als auch Protein binden, die unspe-

mäßig hohen pH-Wert, die das T-4 bindenden Serum- ⁶<> zifisch und nur unter sauren Bedingungen eluiert

Proteine vollständig abgespalten sind und eluiert wer- werden.

den können, während das Thyroxin bei diesem pH- Die in der Säule verwendeten Dextrangele sind

Wert von der Säule sehr gut festgehalten wird. vernetzt mit verschiedenen Mengen an Epichlorhydrin

Das erfindungsgemäße Verfahren zur T-4-Bestim- (USA.-Patentschrift 3 042 667) und besitzen ein Was-

mung beruht auf dem Prinzip der konkurrierenden 65 ser-Aufnahmevermögen von 1 bis 5 g pro g trockenes

Proteinbindung, das eine modifizierte Form der Sätti- Gel. Derartige Gele werden technisch hergestellt und

gungsanalyse darstellt. Das zubestimmende T-4 wird sind im Handel mit verschiedenen Molekulargewichten

mit einer geuau bestimmten Probe von T-4 vermischt, und Korngrößen erhältlich.

ν Τ

5 6

Die erfindungsgemäß verwendete Dextrangelsäule 7. Man entfernt die untere Kappe wieder und gibt

wird hergestellt, indem man 500 g trockenes Gel in 1 ml 0,15%iges Human-a-globulm, gelost in 0,075mo-

2 1 destilliertem Wasser suspendiert und über Nacht larem Barbitalpuffer, zu.

hydratisieren läßt. Feine Bestandteile werden entfernt, 8. Man gibt 4 ml O,075molaren Barbitalpuffer mit

indem man das Gel in einer 0,1 «-Natriumhydroxid- 5 einem pH-Wert von 8,6 zu und laßt ihn durch die

lösung ungefähr 5 Minuten lang aufschlämmt, es Säule fließen.

15 Minuten absetzen läßt und dann die überstehende 9. Man setzt die untere Kappe wieder auf und beFlüssigkeit absaugt. Dieses Verfahren wird dreimal stimmt erneut die Radioaktivität der uauie. wiederholt und dann wird das Gel in 4400 ml einer 10. Man bestimmt die prozentuale, in der Säule 0,1 «-Natriumhydroxidlösung suspendiert. 4 ml dieser xo zurückgehaltene Radioaktivität und berechnet den Suspension werden in einen 6 ml Plastikzylinder einer T-4-Gehalt der Serumprobe durch einen Vergleich der Spritze mit einem Durchmesser von 13 mm und einer prozentualen Retention mit einer Standardkurve die Länge von 66 mm gegeben. Jeder Zünder wird vorher mit T-4-Lösungen bekannter Konzentration erhalten am mteren Ende mit einen V Schluß, z. B. einer worden ist.

abnehmbaren Kappe verse .■ ' ^:ne mit einem 15 _, . , Detergens behandelte- Sch < sinterten FoIy- Obwohl das erfi.idungSKemaße 1 estverfahren an äthylen mit einer Dicke - - g- V 1,5 mm und Hand einer speziellen Ausfuhrungsform beschrieben einem Durchmesser von 1, mm wird koaixal auf den worden ist, ist es selbstverständlich, daß verschiedene Boden des Zylinders gepreßt. Nachdem die Suspension Variationen möglich sind._ So kann die ueisauie mit in den Spritzenzylinder gegeben worden ist, rührt man *° Kalium oder Ammoniumnyaroxm a^a iscu gemacht sie und läßt sie frei von Luftblasen sich absetzen. An- werden. An Stelle von Human-a-globulin kann eine schießend wird eine zweite, mit einem Detergent äquivalente Menge von menschlichem Serum, Rinderbehandelte Scheibe aus gesintertem Polyäthylen ent- serum oder Rinder-y-globuim als pnmar bindendes sprechend der ersten Scheibe in den bpritzenzylinder Mittel zugegeben werden. Waunge alk.aische Losuneingeführt und koaxial in dichten Kontakt mit dem »5 gen, die mit Natriumphosphat oüeri ris(hyoroxy-GeI gebracht. Hierbei bleiben ungefähr 1,5 ml der methy!)aminomethan auf einen pH-Wert von 8 bis 10 Natriumhydroxidlösung oberhalb der oberen Scheibe. ^puffert sind, können in Konzentrationen von um Das obere Ende der Spritze wird mit einer neuen bis 0,2 m verwendet werden Eine wäßrige Barbital-Polyäthylenkappe verschlossen. Bei diesem Ver- lösung ist jedoch bevorzugt, da sie eine quantitative fahren ernält man eine Säule, enthaltend ungefähr 3° Bestimmung erleichtert, wenn sie verwendet wird um 450 mg Gel. menschliches α-Globulin odes andere bindende Mittel

Die im folgenden beschriebene T-4-Bestimmung zu lösen.

wird mit Hilfe der so hergestellten Gelsäule folgender- Eine andere Variation des erfindungsgemauen Vermaßen durchgefüht: fahrens besteht darin, daß man die Radioaktivität der

35 Lösungen vor der Aufgabe auf die Gelsaule und nach

1. Die obere Kappe &3Γ Säule wird entfernt, die dem Eluieren der Säule bestimmt und nicht die Radioüberstehende Flüssigkeit dekantiert und die Säule aktivität der Säule selbst. Die prozentuale Retention aufrecht gestellt. wird dann durch Differenzbildung bestimmt. Aus

2. Es werden 0,45 ml einer 0,1 «-Natriumhydroxid- Gründen der Effektivität ist es jedoch vorzuziehen, die lösung zugegeben, enthaltend ungefähr 0,10 Micro- 4o Radioaktivität dei Säule vor und nach dem Eluieren curie radioaktives T-4, das 60000 bis 120000 ImpuUe zu bestimmen.

pro Minute Gammaradioaktivität gibt. Die bekannten T-4-Bestimmungsverfahren mit Hilfe

3. Es werden 0,1 ml einer Serumprobe zugegeben der Säulenchromatographie dürfen nicht mit dem und mit dem radioaktiven T-4 vermischt. Wenn ein erfindungsgemäßen Verfahren verwechselt werden das Standard bestimmt werden soll, wird nicht-radioaktives 45 eine Sättigungsanalyse unter Verwendung eines radio-T-4 zu_£egeben. aktiven Tracers umfaßt. Früher wurde eine Säule nur

4. Man entfernt die untere Kappe und läßt das mit verwendet, um störendes Jod vor der Analyse des Jods dem radioaktiven T-4 vermischte Serum in die Säule zu entfernen. In bestimmten Fällen wurde das durch fließen Ionenaustauscherharze bei einem alkalischen pH-Wert

5. Man wäscht dit Säule mit 4 ml einer O,075molaren 5<> erreicht und die Jodanalyse wurde an dem aus der wäßrigen Barbitallösung, die auf einen uH-VVert von Säule zurückgewonnenen T-4 durch Bestimmung der 8 6 gepuffert ist. ' Wirkung des Jods auf die Cer-IV-Saiz/arsenige Saure-

6. Man setzt die untere Kappe wieder auf und be- Reaktion gemessen. Die hier beschriebene battigungsstimmt die Radioaktivität der Säule in Impulsen pro analyse ist eine direkte Bestimmung fur^das Gesamt-Minute mit einer Zählvorrichtung für Gammastrah- 55 thyroxin und nicht cmc mu.fe.Ue »r.cssung *,cs lun". Thyrcxins durch die Jodbestimmung.

Claims

1 2 als Reaktion auf nervöse oder hormonelle Stimulation Patentansprüche: freigesetzt wird. Das Thyroxin geht in den Kreislauf und wirkt entweder direkt auf die Zelle oder indirekt

1. Verfahren zur in-vitro-Bestimmung des Ge- auf andere Hormonsysteme. Anormale Aktivität der samt-Thyroxins im Serum, wobei man eine vorher 5 Schilddrüse ist eine übliche Krankheit beim Menschen, bestimmte Menge des zu untersuchenden Serums Bei Hypothyreose ist die Aktivität der ochilddrüse und eine genau bestimmte Menge einer radioakti- vermindert, was zu Krankheiten wie Kretinismus und ven Thyroxinlösung mit einem zweiten bindenden Myxödem führen kann. Hyperthyreose ist der Zustand Mittel in Berührung bringt, mit einer wäßrigen der übermäßig starken Schilddrusenaktivitäi, die zu Lösung wäscht, die in dem zweiten bindenden Mit- io Nervosität, Pulsbeschleunigung und manchmal zur tel verbleibende Aktivität mißt und daraus durch Kropfbildung führt.

Vergleich mit bekannten Proben den Thyroxin- Bereits 1895 wurde eine mangelnde achilddrusen-

gehalt des Serums berechnet, dadurch ge- funktion mit einem verminderten Grundumsatz in kennzeichnet, daß man als zweites binden- Verbindung gebracht und es wurden verschiedene auf des Mittel eine Säule verwendet, die mit einem mit 15 der Messung des Grundumsatzes beruhende Verfahren Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einem zur Bestimmung der Schilddrüsenaktivität entwickelt Wasseraufnahmevermögen von Ibis 5 g/g trockenes Derartige Verfahren waren jedoch nicht zuverlässig Gel mit einem pH-Wert von mindestens ungefähr und es wurde nach direkteren und genaueren Verfahren H gefüllt ist, mit einer alkalischen Lösung wäscht gesucht. Im Jahre 1896 wurde Jod in Schilddrüsenimd vor der Messung der in der Säule verbleibenden =0 extrakt gefunden, aber die Beziehung zwischen dem Aktivität das Thyroxin aus der Säule teilweise mit Jodspiegel im Blut und der Schilddrüsenfunktion wureiner vorher bestimmten Menge eines thyroxinbin- de erste 1933 sicher festgestellt. Das führte dazu, daß denden Elutionsmittels entfernt. man an Protein gebundenes Jod (PBI) als Mittel zur

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Bestimmung der Schilddrüsenfunktion verwendete und zeichnet, daß nan die Radioaktivität der Gelsäule 35 bis 1955 war der PBI-Test das Standardverfahren zur vor und nach dem Eluieren bestimmt und daraus Bestimmung der Schilddrüsenfunktion. Es wurde bald das Verhältnis des zurückgehaltenen radioaktiven deutlich, daß dieser Test durch Verabreichung anderer Thyroxins zu dem ursprünglich zugegebenen jodhaltiger Verbindungen an den Patienten beeinflußt berechnet. wurde. So wurde der BEI-Test (Bestimmung des mit

3. Verfahren nach Anspruch I oder 2, dadurch 30 Butanol extrahierbaren Jods) entwickelt, der zu einer gekennzeichnet, daß man zum Waschen eine alka- besseren Beziehung zwischen dem Jodgehalt im Serum lische Lösung verwendet, die auf einen pH-Wert und den klinischen Befunden führte, jedoch ebenfalls von ungefähr 8 bis 10 gepuffert ist. für T-4 nicht spezifisch war.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- Ein großer Fortschritt bei der T-4 Analyse wurde im zeichnet, daß man als alkalische Lösung einen 35 Jahre 1959 erreicht, als es gelang T-4 aus Serum-Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 ver- albumin durch Hydrolyse freizusetzen und es von wendet. anderen jodhaltigen Verbindungen mit Hilfe einer ein

5. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekenn- Harz enthaltenden Säule abzutrennen (GaIton et al, zeichnet, daß man den pH-Wert der Säule auf Biochem. J. 72,310 [1959]). Dieses säulenchromatograungefähr II bis 1? hält. 40 phische Verfahren wurde später zu einem klinisch

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- anwendbaren Verfahren weiterentwickelt (Pileggi zeichnet, daß man als thyroxinbindendes Elutions- et al, J. din. Endocr. Met. 21, S. 1271 [1961]).
mittel Serum verwendet. im Jahre 1964 wurde ein Verfahren zur Bestimmung

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- von T-4 entwickelt, das auf der konkurrierenden zeichnet, daß man als thyroxinbindendes Elutions- 45 Proteinbindung und Isotopenverdünnung beruht, bei mittel Human-a-globulin verwendet. dem zunächst das T-4 mit Alkohol aus dem Serum

extrahiert und anschließend zentrifugiert und getrocknet werden muß (Murphy et al, J. Clin. Endocr. Met. 24, S. 187 [1964]). Obwohl dieser Test sehr

50 spezifisch war, konnten nur 80% ües T-4 aus dem

Se« um gewonnen werden.

In der USA.-Patentschrift 3 471 553 ist noch ein weiteres säulenchromatographisches Verfahren zur Bestimmung von T-4 beschrieben, bei dem ein Anionen-

Dis Erfiudun" be'riffi ein Verfahren zur in-vitre- 55 austauschsrhsrz -id einen alkalisch?¹¹ nH-Wert vnn Bestimmung des Gesamt-Thyroxins im Serum, wobei ungefähr !2 eingestellt wird, um das Thyroxi.i von den man eine vorher bestimmte Menge des zu unter- Albumin- und Globulinträgern abzuspalten. Die versuchenden Serums und eine genau bestimmte Menge dünnte Serumlösung wird dann auf das Harz gegossen, einer radioaktiver. Thyroxinlösung mit einem zweiten von dem Proteine, Amino'wen, Thyroxin, Jodthyrobindenden Mittel in Berührung bringt, mit einer ^6o sin und anorganisches Jod adsorbiert werden. Beim wäßrigen Lösung wäscht, die in dem zweiten bindenden anschließenden Auswaschen mit Acetat gepuffertem Mittel verbleibende Aktivität mißt und daraus durch Isopropariol und Essigsäure werden die Serumproteine, Vergleich mit bekannten Proben den Thyroxingehalt Jodthyronine und einige organische Jodverbindungen des Serums berechnet. entfernt. Bei einer weiteren Behandlung des Harzes

Die Schilddrüse äst wegen ihrer Wirkung auf den ⁶S mit 50%iger Essigsäure bsi einem pH-Wert von 2 wird Grundumsatz äußerst wichtig für den tierischen und das T-4 quantitativ entfernt. Obwohl viele Modifikamenschlichen Körper. Diese Wirkung wird gesteuert tionen der ursprünglichen von Galton et al beschriedurch das Schilddrüsenhormon Thyroxin (T-4), das benen T-4-Bestimmung durch Säulenschromato-