DE2132112B2

DE2132112B2 - Verfahren zur in vitro Bestimmung von Serumthyroxin

Info

Publication number: DE2132112B2
Application number: DE2132112A
Authority: DE
Inventors: Amirav Gordon; Jack Gross; Lloyd Alan Elkhart Ind. Schick (V.St.A.)
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1970-06-29
Filing date: 1971-06-28
Publication date: 1974-02-21
Also published as: DE2132112A1; DE2132112C3; JPS5331399B1; FR2100008A5; CA955159A; ES392664A1; HU166424B; SE392346B; GB1351836A; US3659104A; ZA713408B; IL37046A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitro-Bestimmung des Gesamt-Thyroxins iim Serum, wobei man eine vorher bestimmte Menge des zu untersuchenden Serums und eine genau bestimmte Menge einer radioaktiven Thyroxinlösung mit einem zweiten bindenden Mittel in Berührung bringt, mit einer wäßrigen Lösung wäscht, die in dem zweiten bindenden Mittel verbleibende Aktivität mißt und daraus durch Vergleich mit bekannten Proben den Thyroxingehalt des Serums berechnet.

Die Schilddrüse ist wegen ihre! Wirkung auf den Grundumsatz äußerst wichtig fiii ilen tieiisclien und menschlichen Kölner. Diese Wirkung wird gesteuert durch 11πs Schilddrüsenhormon Thyroxin (1-4), das als Reaktion auf nervöse oder hormonelle Stimulation freigesetzt wird. Das Thyroxin geht in den Kreislauf und wirkt entweder direkt auf die Zelle oder indirekt auf andere Hormonsysteme. Anormale Aktivität der Schilddrüse ist eine übliche Krankheit beim Menschen. Bei Hypothyreose ist die Aktivität der Schilddrüse vermindert, was zu Krankheiten wie Kretinismus und Myxödem führen kann. Hyperthyreose ist der Zustand der übermäßig starken Schilddrüsenaktivität, die zu Nenosität, Pulsbeschleunigung und manchmal zur Kropfbildung führt.

Bereits 1895 wurde eine mangelnde Schilddrüsenfunktion mit einem verminderten Grundumsatz j_n Verbindung gebracht und es wurden verschiedene auf der Messung des Grundumsatzes beruhende Verfahren zur Bestimmung der Schilddrüsenaktivität entwickelt. Derartige Verfahren waren jedoch nicht zuverlässig und es wurde nach direkteren und genaueren Verfahren gesucht. Im Jahre 1896 wurde Jod in Schilddrüsenextrakt gefunden, aber die Beziehung zwischen dem Jodspiegel im Blut und der Schilddrüsenfunktion wurde erste 1933 sicher festgestellt. Das führte dazu, daß man an Protein gebundenes Jod (PBl) als Mittel zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion verwendete und bis 1955 war der PBl-Test das Standardverfahren zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion. Es wurde bald deutlich, daß dieser Test durch Verabreichung anderer jodhaltiger Verbindungen an den Patienten beeinflußt wurde. So wurde der BEl-Test (Bestimmung des mit Butanol extrahierbaren Jods) entwickelt, der zu einer besseren Beziehung zwischen dem Jodgehalt im Serum und den klinischen Befunden führte, jedoch ebenfalls für T-4 nicht spezifisch war.

Ein großer Fortschritt bei der T-4 Analyse wurde im Jahre 1959 erreicht, als es gelang T-4 aur Serumalbumin durch Hydrolyse freizusetzen und es von anderen jodhaltigen Verbindungen mit Hilfe einer ein Harz enthaltenden Säule abzutrennen (Galton et al, Biochem. J. 72, 310 [1959]). Dieses säulenchromatographische Verfahren wurde später zu einem klinisch anwendbaren Verfahren weiterentwickelt (Pileggi et al, J. Clin. Endocr. Met. 21, S. 1271 [1961]).

Im Jahre 1964 wurde ein Verfahren zur Bestimmung von T-4 entwickelt, das auf der konkurrierenden Proteinbindung und Isotopenverdünnung beruht, bei dem zunächst das T-4 mit Alkohol aus dem Serum extrahiert und anschließend zentrifugiert und getrocknet werden muß (Murphy et al, J. Clin. Endocr. Met. 24, S. 187 [1964]). Obwohl dieser Test sehr spezifisch war, konnten nur 80% des T-4 aus dem Serum gewonnen werden.

In der USA.-Patentschrift 3 471553 »st noch ein weiteres säulenchromatographisches Verfahren zur Bestimmung von T-4 beschrieben, bei dem ein Anionenaustauscherharz auf einen alkalischen pH-Wert von ungefähr 12 eingestellt wird, um das Thyroxin von den Albumin- und Globulinträgern abzuspalten. Die verdünnte Serumlösung wird dann auf das Harz gegossen, von dem Proteine, Aminosäuren, Thyroxin, Jodthyrosin und anorganisches Jod adsorbiert werden. Beim anschließenden Auswaschen mit Acetat gepuffertem Isopropanol und Essigsäure weiden die Seruniproteine, Jodlhyronine und einit.e organische Jodverbindungen entfernt. Bei einer weiteren Behandlung des Harzes mit 5ü"„iger Essigsäure bei einem pH-Wert von 2 wird das Γ-4 quantitativ entfernt. Obwohl viele Modifikationen der ursprünglichen von Galton et al beschriebenen T-4-Bestimniuiig durch Säulenschromato-

graphie durchgeführt worden sind, ist das Verfahren im wesentlichen das gleiche, d. h. eine verdünnte Scr um probe wird auf ein Ionenaustauscherharz gegeben. Die unerwünschten Verunreinigungen werden dann aus der Säuleeluiert und verworfen. Anschließend ν erden die zu bestimmenden Hormone eluiert, gesamrielt und das T-4 durch Jodanalyse bestimmt.

In der Zeitschrift für klinische Chemie und klinische Biochemie, 6. Jahrgang 1968, H. 4, S. 326 bis 33!, ist h

die mit einer sehr geringen Menge eines radioaktiven Isotopen markiert ist. Hierzu wird ein Mittel zugegeben, das eine ganz bestimmte Anzahl Moleküle bindet. Da für das bindende Mittel kein Unterschied besteht zwischen den markierten und nicht markierten Molekülen, treten diese in Konkurrenz um die bindenden Stellen. Diese Moleküle sind gleichmäßig vermischt, so daß das bindende Mittel sie in dem gleichen Verhältnis bindet, in dem sie in freiem oder nichtgebun-

i·:: Verfahren zur Bestimmung des freien Thyroxin- 10 denem Zustand vorliegen. Mitzunehmender Konzenjjjhalts im Serum mittels Gelfiltration beschrieben. tration an nicht-markierten Molekülen wird das Verl.ubei wird Serum mit einer Lösung inkubiert, die hältnis kleiner und es werden weniger markierte markiertes Thyroxin enthält, und dieses Gemisch auf Moleküle an das bindende Mittel gebunden und es tine Dextrangelsäule aufgebracht, die mit einer Phos- verbleiben mehr markierte Moleküle in freiem Zuphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,9 oder 9,5 15 stand, indem man die Bindung der markierten MoIee!uiert wird, wobei der niedrigere pH-Wert bevorzugt küle in Gegenwart einer bestimmten Menge nicht is.t. Bei diesem Verfahren erhält man eine Trennung markierter Moleküle eicht, erhält man ein quantitatives zwischen dem proteingebundenen und dem freien Verfahren.

Thyroxin. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-

in »Das ärztliche Laboiatorium«, 16. Jahrgang, 20 fahrens wirkt die Säule mit dem vernetzten Dextran-1970, H. 3, S. 65 bis 72, ist ein Verfahren zur Gesamt- gel als sekundäres oder zweites bindendes Mittel für Thyroxinbestimmung beschrieben, bei dem das Thyr- das nichtgebunder;e oder freie T-4, während das o.dn zunächst mit Alkohol aus dem Serum extrahiert primäre oder erste bindende Mittel thyroxinbindendes und dann mit einem Ionenaustauscher als zweitem Globulin (TBG) aus menschlichem Serum ist. Zunächst bindenden Mittel zusammengegeben wird. Dabei wer- 25 wird eine abgemessene Menge des Serums mit etwas den von dem Ionenaustauscherharz neben dem mit' radioaktivem Jod markiertem T-4 am oberen Thyroxin auch die Proteine gebunden, die nur unspe- Ende der Säule vermischt. Sowohl die Säure als auch zifisch und unter sauren Bedingungen eluiert werden das T-4-Gemisch haben einen pH-Wert von 12 bis 13. und es ist notwendig, das Thyroxin vorher aus dem Bei diesem pH-Wert sind die das T-4 bindende Serum-Serum zu extrahieren. Bei dieser Extraktion wird das 30 proteine wie Prealbumin, Albumin und thyroxinbin-Thyroxin nie vollständig aus dem Serum extrahiert und dendes Globulin vollständig abgespalten von dem T-4. der Extraktionsgrad muß extra bestimmt und bei der Wenn das Gemisch durch die Säule nach unten fließt, Berechnung des Thyroxingehaltes berücksichtigt wer- wird das T-4 von dem Dextrangel gebunden. Die ₍i_en. Serumproteine werden mit einem Barbitalpuffer mit

Es ist nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein 35 einem pH-Wert von 8,6 ausgewaschen, der automa-Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Thyroxins im tisch den pH-Wert der Säule auf denjenigen des Puffers Serum zu entwickeln, das auf jinfache Weise zu ge- einstellt. Bei diesem pH-Wert wird der Übergang aes ηauc 11 und reproduzierbaren Werten führt. T-4 von der Säule auf das erste bindende Mittel

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch erleichtert. Das erste bindende Mittel, in Barbitalcin Verfahren zur In-vitro-Bestimmung des Gesamt- 40 puffer gelöst, wird dann zugegeben. Es stellt sich Thyroxins im Serum, wobei man eine vorher bestimmte schnell ein Gleichgewicht zwischen den beiden bin-Menge des zu untersuchenden Serums und eine genau denden Mitteln ein und das erste bindende Mittel wird bestimmte Menge einer radioaktiven Thyroxinlösung ausgewaschen, wobei es einen Teil des T-4 mitnimmt mit einem zweiten bindenden Mittel in Berührung Durch Messung der Radioaktivität der Säule vor und bringt, mit einer wäßrigen Lösung wäscht, die in dem 45 nach der Behandlung mit dem ersten bindenden Mittel zweiten bindenden Mittel verbleibende Aktivität mi.3t und Vergleich des von der Säule zurückgehaltenen und daraus durch Vergleich mit bekannten Proben den Prozentgehaltes mit einer Standardkurve, in der der Thyroxingehalt des Serums berechnet, das dadurch zurückgehaltene Anteil in Prozent gegen die 1-4-gekennzeichnet ist, daß man als zweites bindendes Konzentration aufgetragen ist, kann die Menge an Mittel eine Säule verwendet, die mit einem mit 50 T-4 in dem Serum bestimmt werden. Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einem Das erfindungsgemäße Verfahren beruht aut der

Wasseraufnahmevermögen von 1 bis 5 g/g trockenes Feststellung, daß eine Dextrangelsäule radioaktives Gel mit einem pH-Wert von mindestens ungefähr 11 T-4 bis zu einem pH-Wert von 9 gut festhalt Bei gefüllt ist, mit einer alkalischen Lösung wäscht und einem pH-Wert zwischen 9 und 11 wird radioaktives vor der Messung der in der Säule verbleibenden 55 T-4 schnell von der Säule eluiert, wahrend bei einem Aktivität das Thyroxin aus der Säule teilweise mit pH-Wert von mehr als 11 die Retention von T-4 durch einer vorher bestimmten Menge eines thyroxinbinden- die Säule stark erhöht wird. So bindet Dextrangel den Elutionsmittels entfernt. T-4, aber kein Protein, während Anionenaustauscher-

Es hat sich gezeigt, daß bei einem solchen verhältnis- harze sowohl T-4 als auch Protein binden, die unspemäßig hohen pH-Wert, die das T-4 bindenden Serum- 60 zifisch und nur unter sauren Bedingungen eluiert

Proteine vollständig abgespalten sind und eluiert wer- werden. .

Die in der Säule verwendeten Dextrangele sind

den können, während das Thyroxin bei diesem pH-Wert von der Säule sehr gut festgehalten wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur T-4-Bestimmung beruht auf dem Prinzip der konkurrierenden ⁶S Proteinbindung, das eine modifizierte Form der SaUigungsanalyse darstellt. Das zubustimmende T-4 wird mit einer genau bestimmten Probe von T-4 vermischt,

vernetzt mit verschiedenen Mengen an Epichlorhydrin (USA.-Patentschrift 3 042 667) und besitzen ein Wasser-Aufnahmevermögen von 1 bis 5 g pro g trockenes Gel. Derartige Gele werden technisch hergestellt und sind im Handel mit verschiedenen Molekulargewichten und Korngrößen erhältlich.

Die erfindungsgemäß verwendete Dextrangelsäule 7. Man entfern*, die untere Kappe wieder und gibt

wird hergestellt, indem man 500 g trockenes Gel in 1 ml 0,15%iges Human-oglobulin, gelöst in 0,075mo-

2 1 destilliertem Wasser suspendiert und über Nacht larem Barbitaipuffer, zu.

hydratisieren läßt. Feine Bestandteile werden entfernt, 8. Man gibt 4 ml 0,075molaren Barbitaipuffer mit

indem man das Gel in einer 0,1 «-Natriumhydroxid- 5 einem pH-Wert von 8,6 zu und läßt ihn durch die

lösung ungefähr 5 Minuten lang aufschlämmt, es Säule fließen.

15 Minuten absetzen läßt und dann die überstehende 9. Man setzt die untere Kappe wieder auf und beFlüssigkeit absaugt. Dieses Verfahren wird dreimal stimmt erneut die Radioaktivität der Säule,
wiederholt und dann wird das Gel id 4400 ml einer 10. Man bestimmt die prozentuale, in der Säule 0,1 «-Natriumhydroxidlösung suspendiert. 4 ml dieser io zurückgehaltene Radioaktivität und berechnet den Suspension werden in einen 6 ml Plastikzylinder einer T-4-Gehalt der Serumprobe durch einen Vergleich der Spritze mit einem Durchmesser von 13 mm und einer prozentualen Retention mit einer Standardkurve, die Länge von 66 mm gegeben. Jeder Zylinder wird vorher mit T-4-Lösungen bekannter Konzentration erhalten am unteren Ende mit einem Verschluß, z. B. einer worden ist.
abnehmbaren Kappe versehen und eine mit einem 15

Detergens behandelte Scheibe aus gesintertem Poly- Obwohl das erfindungsgemäße Testverfahren an äthylen mit einer Dicke von ungefähr 1,5 mm und Hand einer speziellen Ausführungsform beschrieben einem Durchmesser von 13 mm wird koaixal auf den worden ist, ist es selbstverständlich, daß verschiedene Boden des Zylinders gepreßt. Nachdem die Suspension Variationen möglich sind. So kann die Gelsäule mit in den Spritzenzylinder gegeben worden ist, rührt man ao Kalium oder Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht sie und läßt sie frei von Luftblasen sich absetzen. An- werden. An Stelle von Human-a-globulin kann eine schließend wird eine zweite, mit einem Detergent äquivalente Menge von menschlichem Serum, Rinderbehandelte Scheibe aus gesintertem Polyäthylen ent- serum oder Rinder-y-globulin als primär bindendes sprechend der ersten Scheibe in den Spritzenzylinder Mittel zugegeben werden. Wäßrige alklaische Lösuneingeführt und koaxial in dichten Kontakt mit dem *5 gen, die mit Natriumphosphat oder Tris(hydroxy-GeI gebracht. Hierbei bleiben ungefähr 1,5 ml der methyl)aminomethan auf einen pH-Wert von 8 bis 10 Natriumhydroxidlösung oberhalb der oberen Scheibe. gepuffert sind, können in Konzentrationen von 0,01 Das obere Ende der Spritze wird mit einer neuen bis 0,2 m verwendet werden. Eine wäßrige Barbital-Polyäthylenkappe verschlossen. Bei diesem Ver- lösung ist jedoch bevorzugt, da sie eine quantitative fahren erhält man eine Säule, enthaltend ungefähr 3° Bestimmung erleichtert, wenn sie verwendet wird, um 450 mg Gel. menschliches α-Globulin oder andere bindende Mittel

Die im folgenden beschriebene T-4-Bestimmung zu lösen.

wird mit Hilfe der so hergestellten Gelsäule folgender- Eine andere Variation des erfindungsgemäßen Vermaßen durchgeführt: fahrens besteht darin, daß man die Radioaktivität der

35 Lösungen vor der Aufgabe auf die Gelsäule und nach

I. Die obere Kappe der Säule wird entfernt, die dem Eluieren der Säule bestimmt und nicht die Radioüberstehende Flüssigkeit dekantiert und die Säule aktivität der Säule selbst. Die prozentuale Retention aufrecht gestellt. wird dann durch Differenzbildung bestimmt. Aus

2. Es werden 0,45 ml einer 0,1 «-Natriumhydroxid- Gründen der Effektivität ist es jedoch vorzuziehen, die lösung zugegeben, enthaltend ungefähr 0,10 Micro- 4° Radioaktivität dei Säule vor und nach dem Eluieren curie radioaktives T-4, das 60000 bis 120000 Impulse zu bestimmen.

pro Minute Gammaradioaktivität gibt. Die bekannten T-4-Bestimmungsverfahren mit Hilfe

3. Es werden 0,1 ml einer Serumprobe zugegeben der Säulenchromatographie dürfen nicht mit dem und mit dem radioaktiven T-4 vermischt. Wenn ein erfindungsgemäßen Verfahren verwechselt werden, das Standard bestimmt werden soll, wird nicht-radioaktives 45 eine Sättigungsanalyse unter Verwendung eines radio-T-4 zugegeben. aktiven Tracers umfaßt. Früher wurde.eine Säule nur

4. Man entfernt die untere Kappe und läßt das mit verwendet, um störendes Jod vor der Analyse des Jods dem radioaktiven T-4 vermischte Serum in die Säule zu entfernen. In bestimmten Fällen wurde das durch fließen. Ionenaustauscherharze bei einem alkalischen pH-Wert

5. Man wäscht die Säule mit 4 ml einer O,075molaren 5» erreicht und die Jodanalyse wurde an dem aus der wäßrigen Barbitallösung, die auf einen pH-Wert von Säule zurückgewonnenen T-4 durch Bestimmung der 8,6 gepuffert ist. Wirkung des Jods auf die Cer-IV-Salz/arsenige Säure-

6. Man setzt die untere Kappe wieder auf und be- Reaktion gemessen. Die hier beschriebene Sättigungsstirrunt die Radioaktivität der Säule in Impulsen pro analyse ist eine direkte Bestimmung für das Gesaint-Minute mit einer Zählvorrichtung für Gammastrah- 55 Thyroxin und nicht eine indirekte Messung des lung. Thyroxins durch die Jodbestimmung.

Claims

2 !32 i Patentansprüche:

1. Verfahren zur in-vitro-Bestimmung de.» Gesamt-Thyroxins im Serum, wobei man eine vorher bestimmte Menge des zu untersuchenden Serums und eine genau bestimmte Menge einer radioaktiver, Thyroxinlösuing mit einem zweiten bindenden Mittel in Berührung bringt, mit einer wäßrigen Lösung wäscht, die in dem zweiten bindenden Mittel verbleibende Aktivität mißt und daraus durch Vergleich mit bekannten Proben den Thyroxingehalt des Serums berechnet, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites bindendes Mittel eine Säule verwendet, die mit einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrangel mit einem Wasseraufnahmevermögen von 1 bis 5 g/g trockenes Gel mit einem pH-Wert von mindesten;; ungefähr

1) gefüllt ist, mit einer alkalischen Lösung wäscht und vor der Messung der in der Säule verbleibenden Aktivität das Thyroxin aus der Säule teilweise mit einer vorher bestimmten Menge eines thyroxinbindenden Elutionsmitteis entfernt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Radioaktivität der Gelsäule »5 vor und nach dem Eluieren bestimmt und daraus das Verhältnis des zurückgehaltenen radioaktiven Thyroxins zu dem ursprünglich zugegebenen berechnet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Waschen eine alkalische Lösung verwendet, die auf einen pH-Wert von ungefähr 8 bic 10 gepulfert ist

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkalische Lösung einen Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Säule auf ungefähr 11 bis 13 hält. 4"

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als thyroxinbiridendes Elutionsmittel Serum verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als thyroxinbiridendes Elutionsmittel Human-α-globulin verwendet.