**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.
PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Nachweis von menschlichem carcinoembryonalen Antigenen im Blut durch a) Zusatz einer bestimmten Menge von Anti-carcinoem bryonalem Antigen-Antiserum zu einer Probe von mit Per chlorsäure extrahiertem Blutserum, b) Inkubieren des Gemisches, c) Zusatz einer bestimmten Menge von radioaktiv markiertem menschlichem carcinoembryonalem Antigen zu dem Gemisch, d) Inkubieren des Gemisches, e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zu dem inkubierten Gemisch, wobei alle menschlichen carcinoembryonalen Antigen-Anti-carcinoembryonalen Antigen-Komplexe copräzipitiert werden, f) Bestimmung der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes und g) Vergleiche mit einer Standardinhibitionskurve, dadurch gekennzeichnet,
dass das radioaktiv markierte menschliche carcinoembryonale Antigen eine Radioaktivität von mindestens 5-10 Ci/g aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe a) das Anti-carcinoembryonale Antigen-Antiserum mit normalem Blutserum, das mit einem Borat-Puffer vom pH 8,4 auf eine Verdünnung von 1:100 gebracht wurde, verdünnt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe c) das menschliche carcinoembryonale Antigen mit l25Jod markiert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe e) das nicht umgesetzte menschliche carcinoembryonale Antigen in Lösung verbleibt und das Proteinfällungsmittel wässrige gesättigte Ammoniumsulfatlösung ist.
5. Reagenziengarnitur zur Bestimmung von menschlichem carcinoembryonalem Antigen, enthaltend a) menschliches carcinoembryonales Antigen-J'25 mit einer Radioaktivität von mindestens 5-10 Ci/g oder b) carcinoembryonales Antigen-Antiserum, wie es erhältlich ist, wenn man ein warmblütiges Tier mit menschlichem carcinoembryonalem Antigen, welches ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, eine einzige Präzipitationslinie mit einem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum bei Geldiffusionstests bildet, bei der Blockelektrophorese in einem Boratpuffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 bei 400 V und einer Stromstärke von etwa 20 mA 10-14 cm in anodischer Richtung wandert,
wenn gleichzeitig Ferritin als Standard 18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert und an welches in der Jodierung mit der Chloramin-T-Methode 20-50% des eingesetzten Jods gebunden werden kann, immunisiert und die vom Tier gebildeten Antikörper isoliert, oder c) als Standard menschliches carcinoembryonales Antigen, welches ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, eine einzige Präzipitationslinie mit einem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum bei Geldiffusionstests bildet, bei der Blockelektrophorese in einem Boratpuffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 bei 400 V und einer Stromstärke von etwa 20 mA 10-14 cm in anodischer Richtung wandert,
wenn gleichzeitig Ferritin als Standard 18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert und an welches in der Jodierung mit der Chloramin-T-Methode 2050% des eingesetzten Jods gebunden werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an carcinoembryonischem Antigen (CEA) in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, von Personen mit Krebs oder Krebsverdacht sowie eine Reagenziengarnitur zur Durchführung dieses Verfahrens. Insbesondere wurde gemäss vorliegender Erfindung eine Radioimmunoassay-Technik entwickelt, die sehr spezifisch, einfach durchzuführen und von hoher Reproduzierbarkeit ist.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von carcinoembryonalen Antigenen im Blut durch a) Zusatz einer bestimmten Menge von Anti-CEA-Antiserum zu einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum, b) Inkubieren des Gemisches, c) Zusatz einer bestimmten Menge von radioaktiv markiertem CEA zu dem inkubierten Gemisch, d) Inkubieren des Gemisches, e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zu dem inkubierten Gemisch, wobei alle CEA-Anti-CEA-Komplexe copräzipitiert werden, f) Bestimmung der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes und g) Vergleiche mit einer Standardinhibitionskurve, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktiv markierte CEA eine Radioaktivität von mindestens 5-10 Ci/g aufweist.
Beim erfindungsgemässen Radioimmunoassay ist es wichtig, dass das radioaktive Atom mit dem zu kennzeichnenden Molekül hinreichend reagiert, um eine entsprechende Intensität der Radioaktivität für die Bestimmung zu schaffen, und dass das radioaktive Atom eine ausreichende Zerfallsgeschwindigkeit besitzt, um eine hinreichend grosse Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung zu gewährleisten. Weiterhin darf im Falle des Radioimmunoassays von Antigenen die Antigenwirksamkeit durch die Verbindung des radioaktiven Atoms mit dem Antigen nicht beeinträchtigt werden.
Mittels vorliegender Erfindung ist es möglich, etwa 1,0 ng CEA pro ml Serum zu bestimmen. Die Empfindlichkeit der Prüfung wird nur durch die spezifische Aktivität des radioaktiven Atoms begrenzt. Diese Begrenzung kann jedoch weitgehend überwunden werden, da praktisch das gesamte, in einem Teilvolumen des Serums vorhandene CEA durch das nachstehend erwähnte Extraktionsverfahren extrahiert werden kann, wodurch es möglich wird, die spezifische Aktivität des radioaktiven Atoms zu erhöhen. Weiterhin kann die Hemmung der Copräzipitation des markierten CEA vergrössert werden, um die Empfindlichkeit der Methode zu erhöhen.
CEA kann durch verschiedene radioaktive Atome markiert werden. Es wurde gefunden, dass 125Jod besonders geeignet ist.
Die Markierung erfolgt mittels bekannter Verfahren mit geringen Modifikationen bezüglich der Konzentration und Volumina. Die Chloramin T-Methode von Hunter und Greenwood [Biochem. J. 91, 46 (1964)] bei der 125Jod benutzt wird, ist besonders vorteilhaft; die Jodierung erfolgt hier mit 20-50%-ige Ausbeute.
Es werden zweckmässig etwa 0,25-0,4 mg gereinigtes CEA mit 125Jod in Form von KJ oder NaJ in Gegenwart von Chloramin T, d.i. Na[WCH3-C6H4-SO2NCl], jodiert. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa einer Minute und wird vorteilhaft durch Zugabe von Natrium- oder Kaliummetabisulfit unterbrochen. Die Funktion des Chloramin T ist, das Jodid zum Jod zu oxidieren, während das Metabisulfit nicht umgesetztes 125Jod zum Jodid reduziert. Man kann auch andere Oxydationsund Reduktionsmittel verwenden, doch darf durch sie das CEA nicht geschädigt werden. Das Produkt kann durch Chromatographie an einer Säule mit einem vernetzten Dextrangel, zum Beispiel Sephadex G-100 > , gereinigt werden.
Dieses Gel hat eine Ausschlussgrenze von etwa 100 000, ein Wasserretentions
vermögen von 10,0 + 1,0 g H2O/g Trockensubstanz, eine Teilchengrösse von 40-120 u und ein Bettvolumen von 15-20 ml/g Trockensubstanz. Das Produkt hat die folgenden Eigenschaften:
Es ist mit einem spezifischen Antikörper reaktionsfähig, zeigt das CEA-Elektrophoresebild, hat ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und eine spezifische Aktivität von etwa 1 000-25 000, vorzugsweise von etwa 10 000-20 000 Impulsen pro Minute und Nanogramm, d.h. etwa 5-10 Ci/g CEA.
Gemäss vorliegender Erfindung wird unter Verwendung von radiojodiertem CEA die Anwesenheit von CEA im menschlichen Serum nach einem Verfahren festgestellt, das eine Modifikation der von Farr beschriebenen Technif der Hemmung der Copräzipitation [J. Infect. Dis. 103, 239 (1958)] darstellt.
Bei der genannten Methode muss das gesamte im Blut vorhandene CEA nach Abtrennung von störenden Materialien in dem schliesslich verwendeten Serum vorliegen. Dies kann durch Behandeln des Blutserums mit einem Glycoprotein Lösungsmittel, das also ein CEA lösendes Mittel ist und ggf.
vorhandene CEA-Antikörper-CEA-Komplexe zerstört und durch Klären der erhaltenen Lösung erreicht werden.
Das für dieses Verfahren geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel ist Perchlorsäure, vorzugsweise 0,2 m Perchlorsäure. Die erhaltene, das gegebenenfalls vorhandene CEA enthaltende Lösung wird dann, vorzugsweise durch Zentrifugieren, geklärt, 24-48 Stunden gegen Wasser/dialysiert und gefriergetrocknet.
Bei Anwendung dieses Verfahrens wird ein gereinigter Serumextrakt erhalten, der mehr als etwa 95 % des ursprünglich vorhandenen CEA enthält. Anfangs vorhandene CEA-Anti CEA-Komplexe werden gespalten und deren CEA miterfasst.
Für die Durchführung des Radioimmunoassays ist es ferner erforderlich, dass CEA-spezifische Antikörper vorhanden sind.
Die wird z.B. durch Immunisierung von Tieren mit gereinigtem CEA in üblicher Weise erreicht.
Dem in einer Salzlösung befindlichen CEA fügt man zweckmässig ein Emulgiermittel zu, zum Beispiel komplettes Freund 'sches Adjuvans. Die Emulsion kann bei Tieren intramuskulär in den Fussballen und/oder subkutan injiziert werden. Geeignete Tiere sind z.B. Geflügel, Kaninchen, Pferde, Ziegen oder Schafe. Bei Kaninchen werden zum Beispiel wöchentlich zwei bis fünf Injektionen vorgenommen. Nach der letzten Injektion wird dem Tier Blut entnommen. Das Serum aus diesem Blut ist nichtabsorbiertes Anti-CEA-Antiserum.
Bei einem bevorzugten Verfahren werden 400 ug CEA in 1 ml 0,9%-iger Salzlösung verwendet. Der in dem Antiserum vorhandene Antikörper ist nach Absorption an normalen Gewebebestandteilen spezifisch gegen CEA.
Die Ergebnisse des auf die gepulverten Perchlorsäureextrakte angewandten Radioimmunoassays nach der Methode der Copräzipitationshemmung, die Angaben über den CEA-Gehalt des Blutes enthalten, gestatten damit eine Aussage zu machen, ob beim untersuchten Patienten Krebstumoren des Verdauungssystems vorliegen oder nicht.
Das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete CEA kann wie folgt hergestellt werden: a) Homogenisieren von CEA enthaltendem Gewebe, das entweder embryonales Gewebe aus Verdauungsorganen von Föten aus dem ersten und zweiten Trimester oder Adenokarzinomgewebe von Tumoren des Verdauungssystemepithels ist, b) Behandlung des Homogenates mit einem Glycoprotein Lösungsmittel, c) Abtrennung des Niederschlages und Klären der erhaltenen Lösung, d) Dialys.E der geklärten Lösung, e) Konzentrieren des Dialysats, f) Klären der erhaltenen Lösung, g) Trocknen der geklärten Lösung, h) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-% Agarose und einer Teilchengrösse von 40-190 u und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel darstellt,
i) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000, j) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate und k) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Startzone etwa 10-14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer Richtung wandert.
Das CEA enthaltende Gewebe wird zweckmässig mit einer für die Solubilisierung des gesamten vorhandenen CEA ausreichenden Menge Wasser homogenisiert. Im allgemeinen ist eine grössere Menge als etwa 2 Liter Wasser Pro Kilogramm Gewebe nicht erforderlich.
Das Homogenat wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel und damit CEA-lösenden Mittel, behandelt. Dies ist erforderlich, damit präzipitierbare normale Proteine und störende antigenische Materialien vom CEA-Material abgetrennt werden können. Hierfür geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind zum Beispiel Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure und dergleichen, wobei Perchlorsäure bevorzugt wird.
Jede Temperatur von Raumtemperatur und darunter ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels zum Gewebehomogenat geeignet. Vorzugsweise arbeitet man bei Raumtemperatur, d.h. bei 20-25" C. Die Temperatur des Glycoprotein Lösungsmittels, das dem Gewebehomogenat zugefügt wird, kann ebenfalls variieren; auch hier wird Raumtemperatur bevorzugt. Im allgemeinen wird eine konzentrierte 0,5-2 N, insbesondere 2 N Säure bevorzugt. Dem Homogenat wird zweckmässig innerhalb von 10-30 Minuten etwa die gleiche Volumenmenge Lösungsmittel zugefügt. Ein langsamerer Zusatz kann zum Verlust der Antigenwirksamkeit führen.
Man erhält ein Präzipitat, das vom Überstand, der das gelöste CEA enthält, nach einem der üblichen Verfahren wie z.B. Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden kann.
Zur Abtrennung wird Zentrifugieren bevorzugt, i.a. bei etwa 3 000-8 000 U/min. Es wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, etwa 4-10 C, zentrifugiert.
Zur weiteren Reinigung, d.h. zur Entfernung niedermolekularer Substanzen, wie Perchlorsäure oder Salzen, wie Natriumchlorid hat sich die Dialyse gegen Wasser als am geeignetsten erwiesen. Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da durch sie alle diffusionsfähigen löslichen Substanzen mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, wozu auch die CEA-Fraktion gehört, entfernt werden. Sie kann zuerst mit Leitungswasser während etwa 24-48 Stunden und dann mit kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa 4-10 C durchgeführt werden. Jedoch ist es auch möglich, nur destilliertes Wasser zu verwenden. Das Dialyseverfahren nimmt insgesamt etwa 48-96 Stunden in Anspruch.
Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt, wird konzentriert. Die Methode der Wahl ist die Gefriertrocknung, obgleich auch andere Verfahren in Frage kommen wie z.B.
Sprühtrocknung. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, dass das Material zuerst in Schalen gefroren und dann lyophylisiert wird, was insgesamt etwa 32-36 Stunden in Anspruch nimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird jedoch, um Zeit zu sparen, die Lyophylisierung nach etwa 24-30 Stunden abgebrochen, so dass das Produkt noch nicht vollständig trocken ist.
Das nicht ganz bis zur Trockene lyophylisierte Material kann dann bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, wie etwa 37 C, aufgetaut werden. Es kann auch durch Verdünnen mit einer sehr geringen Menge Wasser aufgetaut werden.
Danach können die zurückbleibenden Teilchen entfernt werden. Wird das Volumen auf einem Minimum gehalten, dann kann die Klärung durch Filtration und/oder Zentrifugieren erreicht werden. Alle Teilchen, die ein 0,22 Filter nicht passieren können (d.h. bis zur Grösse der kleinsten Bakterien), werden so aus der Lösung entfernt.
Das bevorzugte Verfahren ist das des 15-45 minütigen Zentrifugierens mit hoher Geschwindigkeit, d.h. mit etwa
14 000 bis 30 000, vorzugsweise mit etwa 14 000 u/min, bei Temperaturen bis zu etwa 10 C, vorzugsweise von 4-10" C.
Höhere Temperaturen sind anwendbar, jedoch nicht zweckmässig, da sie die Sedimentation verzögern. Nach dem Zentrifugieren ist es erforderlich, die überstehende Lösung weiter zu klären und zu sterilisieren. Dies kann man durch Filtrieren durch Filter erreichen, deren Porengrösse zwischen 1,2 und 0,20 u variiert.
Bevorzugt verwendet man Filter mit einer Porengrösse von
1,2 Cm, 0,45 ,0,22 u in der angegebenen Reihenfolge.
Das Filtrat wird getrocknet, vorzugsweise gefriergetrocknet.
Die Abtrennung des CEA von anderen Substanzen des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers kann durch subsequente Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen und anschliessende Elektrophorese erreicht werden.
Es wurde gefunden, dass die eluierten Fraktionen der Säu lenchromatographie, die ein Molekulargewicht von etwa
200 000 und ein definiertes Absorptionsmaximum bei 280 nm besitzen, das CEA enthalten. Es wurde weiter gefunden, dass, wenn die das CEA enthaltenden Fraktionen bei pH 8,6 in einem
Boratpuffer mit einer Ionenstärke von 0,05 einer Elektropho rese unterworfen werden, man ein charakteristisches Wande rungsbild erhält. Die Länge des zurückgelegten Weges hängt von der Stromstärke, der Spannung, vom Puffer, von dessen pH-Wert und dessen Ionenstärke ab. Bei einer Spannung von
400 V und einer Stromstärke von 20 mA wandert das CEA etwa 10-14 cm in anodischer Richtung während Ferritin (ein gefärbtes Protein) als Vergleichssubstanz in der gleichen Zeit
18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert.
Die anschliessende Säulenchromatographie kann in der
Weise durchgeführt werden, dass man das gelöste lyophylisierte
Material an zwei verschiedenen Gelsäulen in beliebiger Reihenfolge chromatographiert. Zweckmässigerweise verwendet man eine Gelsäule aus Agarose-Gel, dem neutralen Anteil von Agar.
Es wurde Gelmaterial der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), das unter dem Warenzeichen Sepharose im
Handel erhältlich ist, verwendet. Die Gele sind als wässrige
Suspensionen in 0,02 %igem Natriumazid als Schutzmittel erhältlich. Die Konzentration der Agarose im Gel bestimmt seinen Fraktionierungsbereich. Die zweckmässigsten Gele besitzen eine Teilchengrösse von etwa 40-190u und enthalten 4 Gew.-% Agarose. Dieses als Sepharose 4B bezeichnete
Material hat einen Fraktionierungsbereich von 3 X 105-3 X 106.
Mit Sepharose 4B gelingt eine Anreicherung von CEA, da andere Verbindungen mit höherem oder niedrigerem Moleku largewicht wie auch kolloidale Teilchen abgetrennt werden.
Die andere Säule enthält zweckmässig ein hydrophiles, was serunlösliches vernetztes Dextrangel. Ein solches Material wird von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem
Namen Sephadex in den Handel gebracht. Die Fähigkeit des
Gelmaterials, Wasser aufzunehmen, ist dem Vernetzungsgrad der Dextransubstanzen im Gelmaterial umgekehrt proportional.
Das Gelmaterial ist in einer Vielzahl von Graden erhältlich, die sich im Hinblick auf den Porositätsgrad unterscheiden. Das bovorzugte Gel hat eine annähernde Ausschlussgrenze von
200 000, ein Wasserretentionsvermögen von 20 j2,0 g H2O/g
Trockensubstanz, eine Teilchengrösse von 40-120 u und ein
Bettvolumen von 30-40 ml/g Trockensubstanz. Dieses Gel trägt die Bezeichnung Sephadex G-200 .
Sephadex G-200 > wird zweckmässig zur weiteren Reinigung der das CEA enthaltenden Fraktion verwendet. Die Sephadex G-200-Säule hat ein grösseres Auftrennungsvermögen für den Molekulargewichtsbereich von 150 000 bis 250 000 als die erstgenannte und sollte nur verwendet werden, nachdem die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teilchen die Sephadex-Säule sonst verstopfen und sie unwirksam machen würden.
Die Säulenchromatographie wird beispielsweise folgendermassen durchgeführt: das lyophylisierte Material wird in einem wässrigen Puffer beim pH-Wert des isoelektrischen Punktes des CEA, d.h. bei pH 4,5, gelöst. Die Lösung wird auf die erste Säule aufgegeben. Die gesammelten aktiven Fraktionen des Eluats werden wie oben beschrieben, dialysiert, lyophylisert, wiederum in einem wässrigen Puffer vom pH 4,5 gelöst und auf die zweite Säule gegeben. Die aktiven Fraktionen (Absorptionsmaximum bei 280 nm) werden nochmals dialysiert und lyophylisiert. Obwohl alle üblichen wässrigen Puffer geeignet sind, wird die Verwendung eines 0,9%gen Phosphatpuffers bevorzugt. Der Vorteil der Anwendung niedriger Temperaturen, d.h.
von etwa 4-10" C, liegt darin, dass man ein verbessertes Auflösevermögen erreicht. Die aus der zweiten Säule gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm.
Die aktiven, konzentrierten Fraktionen des Eluats der zweiten Säule werden schliesslich einer Elektrophorese beispielsweise in einem Puffer vom pH etwa 8,2-9,2 und einer Ionenstärke von etwa 0,0125-0,10, vorzugsweise in einem Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und einer Ionenstärke von etwa 0,05 unterworfen.
Die Blockelektrophorese ist die bevorzugte Elektrophoresemethode, jedoch kann man andere Typen der Elektrophorese ebenfalls anwenden. Zweckmässig arbeitet man bei etwa 300-500 V, vorzugsweise bei 400 V mit etwa 20 mA. Bei dem bevorzugten Elektrophoreseverfahren wird geeigneterweise ein vernetztes Dextrangel, zum Beispiel Sephadex G-25, fein verwendet, mit einer Ausschlussgrenze von etwa 5 000, einem Wasserretentionsvermögen von 2,5 + 0,2 g H2O/g Trockensubstanz, einer Teilchengrösse von 20-80 p und einem Bettvolumen von 5 ml/g Trockensubstanz. Das Gel wird in dem Puffer angequollen und auf einem nichtleitfähigen Block, zum Beispiel Lucite , angeordnet. Als geeigneter Standard kann zum Beispiel Ferritin verwendet werden, das am Kathodenende des Blocks aufgebracht wird.
Nach etwa 24-stündiger Elektrophorese wird der die CEA-Aktivität enthaltende Bereich entfernt.
Unter den genannten speziellen Betriebsbedingungen ist das die Zone, die in anodischer Richtung 10-14 cm vom Start entfernt ist. Das Ferritin ist in diesem Fall 18 cm in anodischer Richtung gewandert. Die CEA-Aktivität wird eluiert und das Material vorzugsweise durch Dialyse gegen destilliertes Wasser gereinigt.
Man erhält ein Material, das im wesentlichen reines CEA ist.
Dies wird entweder durch die Hemmung der Präzipitation oder unmittelbar durch die Ouchterlony Prüfung gegen nicht-absorbiertes Tumor-Antiserum gezeigt. Eine einzige Präzipitationslinie zeigt reines CEA an.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Umsetzung von CEA mit 125Jod.
500 u1 eines Gemisches, das 100 ug Chloramin T, 250 ug CEA und 4 mit25 Jod in Form von KJ enthält, werden nach 1 Minute bei Raumtemperatur mit 240 ug Natriummetabisulfit versetzt. Das erhaltene Produkt, 125J-CEA, wird von nichtumgesetztem 125 Jod durch Chromatographie an einer Sephadex G-100-Säule abgetrennt. Das Produkt hat eine spezifische Aktivität von etwa 5 Ci/g.
Das als Ausgangsmaterial verwendete CEA wird wie folgt hergestellt: a) Isolierung der CEA-Fraktion.
Es wird Tumorgewebe vom Adenokarzinom des Colons herausgeschnitten und möglichst viel normales Gewebe entfernt. Das restliche Tumorgewebe wird durch einen Fleischwolf gedreht und in 1 000 g-Mengen bei -20" C gelagert. 1 000 g des zerkleinerten Gewebes werden mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4 000 ml suspendiert und eine Stunde in einem wassergekühlten Homogenisator bei 15 000 U/min zerkleinert. Unter ständigem Rühren fügt man bei 4" C langsam ein gleiches Volumen 2N Perchlorsäure zu, rührt das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugiert dann 30 Minuten bei 4" C mit 6 000 U/min in einer gekühlten Zentrifuge. Das Überstehende wird entfernt und in einen flachen, etwa 7,6 cm weiten Dialysierschlauch gegeben, der zuvor 1 Stunde in destilliertes Wasser getaucht wurde, um ihn geschmeidiger zu machen.
Es wird 48 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und weitere 48 Stunden gegen destilliertes Wasser bei 4" C dialysiert. Der dialysierte Rückstand wird nicht ganz bis zur Trockene lyophylisiert, aufgetaut und die erhaltene Lösung in einer gekühlten Zentrifuge bei 4" C 30 Minuten mit 14 000 U/min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und nacheinander durch Membranfilter von 1,2 ,0,45 u und 0,22 u Porengrösse filtriert. Die geklärte Lösung wird in Schalen gefroren und zur Trockene lyophylisiert.
1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man in 50 ml eines 0,05 m NaH2PO4-Puffers (pH 4,5) in normaler Salzlösung. Der Phosphat-Salz-Puffer vom pH 4,5 dient bei allen nachfolgenden Säulenchromatographien als Elutionsmittel. Die Probe wird dann über eine Säule (Pharmacia K 100/100 (100 cm X 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm) mit Sepharose 4B gegeben. Die Temperatur wird auf 4-5" C gehalten. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 150 ml/Stunde. Man sammelt 25 ml-Fraktionen, deren Absorption bei 280 nm gemessen wird. Die aktiven Fraktionen erscheinen nach 4 750 ml im Eluat. Die aktiven Fraktionen (750 ml) werden vereinigt, 48 Stunden bei 4" C gegen destilliertes Wasser dialysiert, in Schalen gefroren und lyophylisiert.
200 mg des erhaltenen getrockneten Materials werden dann in 10 ml des Standard-Puffers gelöst und an Sephadex G-200 chromatographiert. (Säule Pharmacia K 50/100 (100 cm X 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm). Die Temperatur wird auf 4" C gehalten. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 40 ml/Stunde werden 10 ml-Fraktionen gesammelt und bei 280 nm in einem Spektrophotometer gemessen. Die aktiven Fraktionen (190 ml) erscheinen nach 820 ml im Eluat, werden vereinigt, 48 Stunden bei 4" C gegen destilliertes Wasser dialysiert, in Schalen gefroren und lyophylisiert.
b) Reinigung des isolierten CEA durch Blockelektrophorese.
Das Blockelektrophoresematerial Sephadex G-25, fein, wird zwei Stunden bei 80" C in Wasser gequollen, mit Borat Puffer (pH 8,6; Ionenstärke 0,05) gewaschen und dann durch eine gesinterte Glasplatte unter Anwendung von Unterdruck filtriert.
Man verteilt eine Gelaufschlämmung gleichmässig auf einem Lucite Blockträger (Masse 61 7,5 X 1 cm) und behandelt die Oberfläche mit einem Wattebausch, bis sie fest aber nicht vollständig trocken ist. Der Block wird dann mit Chromatographiepapierkontakten (3 mm), die alle in Fliessrichtung des Papiers ausgerichtet sind, versehen und eine Stunde unter den Betriebsbedingungen (400 V und etwa 20 mA) bei 4" C äquilibriert. Dann entfernt man von der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm, vermengt das Material gut mit 60 mg trockenem CEA aus Beispiel 1, das zuvor in einer möglichst geringen Menge (etwa 0,5 ml) von 0,05 m Boratlösung gelöst wurde. Der erhaltene Brei wird in den Mittelstreifen zurückgegossen.
Dann tupft man 1-2 Tropfen einer Ferritinlösung (6::umkristallisiert; Konzentration 100 mg/ml) auf das Kathodenende des Blocks und beginnt die Elektrophorese.
Nach 24 Stunden hat sich der Ferritin-Standard etwa 18 cm, in anodische Richtung bewegt. Nach beendeter Elektrophorese werden aus dem Block Streifen von 2 cm zwischen der Startzone und dem Anodenende geschnitten. Die Hauptaktivität wird in einer Entfernung von 10-14 cm von der Startzone in anodischer Richtung lokalisiert; eine schwächere Aktivität lässt sich in einer Entfernung von 8-10 cm nachweisen.
Jeder aktive Streifen wird mit 2 m NaC1-Lösung, die vorher eine 0,20 u Membran passieren musste, eluiert und das Eluat 48 Stunden bei 4" C mit destilliertem Wasser dialysiert. Das Dialysat wird in Schalen eingefroren und gefriergetrocknet. Das getrocknete, gereinigte CFA wird unter vermindertem Druck über Calciumchlorid bei 4" C gelagert.
Das Produkt hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften:
Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nichtabsorbiertem Antiserum bei Geldiffusionsprüfungen; ist in Perchlorsäure löslich; wandert bei der Blockelektrophorese anodisch
10-14 cm, wobei gleichzeitig ein Ferritin Standard anodisch
18 cm wandert (Borat-Puffer von pH 8,6 und einer lonenstärke von 0,05, Spannung 400 V, Stromstärke 20 mA); Molekulargewicht 200 000; Absorptionsmaximum bei 280 nm.
Beispiel 2
Herstellung von Blutproben für den Radioimmunoassay.
Man fügt 5 ml einer 2,0 m Perchlorsäure zu je 5 ml Serum, das von Blutproben von 200 Menschen stammt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 9 000 X g während
10 Minuten bei 4" C entfernt. Das erhaltene Sediment wird verworfen und das Überstehende 24 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und dann zusätzliche 24 Stunden gegen destilliertes Wasser bei 4" C dialysiert. Der dialysierte Rückstand wird dann zu einem trocknen Pulver lyophylisiert.
Beispiel 3
Herstellung des Anti-CEA-Antiserums.
12 ausgewachsene, männliche, weisse Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von je 2,0 kg wurden in 3 Gruppen zu je 4 Tieren eingeteilt. Die verschiedenen Gruppen wurden mit den folgenden Materialien immunisiert: normaler Colongewebeextrakt, Tumorgewebeextrakt des gleichen Individuums, von dem der normale Gewebeextrakt stammt und menschliches Plasma. Der Tumorgewebeextrakt stammte von Tumorproben, die als Adenokarzinome des Colons diagnostiziert und bestätigt worden waren. Die normalen Gewebeextrakte und die Tumorgewebeextrakte wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gebildet. Das menschliche Plasma stammte von 30 normalen Spendern aller Hauptblutgruppen.
Die Injektionen, die 4 Wochen lang zweimal wöchentlich gegeben wurden, enthielten 3 mg Protein in 0,6 ml Gewebeextrakt oder Plasma und dem gleichen Volumen kompletten Freund'schen Adjuvans'. Es wurden 0,1-0,2 ml in den Fussballen und der Rest intramuskulär in die Flankengegend injiziert.
12 Tage nach den letzten Injektionen wurde den Tieren Blut aus ihren marginalen Ohrvenen entnommen, und die von jeder Gruppe erhaltenen Seren wurden gesondert gesammelt.
Die Seren jeder Gruppe wurden an normalem Gewebe absorbiert und das erhaltene Präzipitat wurde abgetrennt. Die überstehenden Lösungen wurden dann nach der Ouchterlony Technik einer zweidimensionalen Diffusion in Agargel unterworfen. Diese wurde in einer 1 %gen Lösung von Agar in Salzlösung mit Merthiolat durchgeführt, das als Schutzstoff verwendet wurde und in einer Konzentration von 1:10 000 verlag.
Die Vertiefungen wurden so in die Gelplatten geschnitten, dass die zentralen und peripheren 1 cm von einander entfernt waren.
Jede Vertiefung wurde mit 0,15 ml des zu untersuchenden Materials gefüllt. Die Antigenkonzentration betrug 10 mg pro ml. Die Anfangsinkubation der Platten betrug 24 Stunden in feuchter Umgebung bei 37" C. Dann wurde 7 Tage in der gleichen feuchten Atmosphäre bei 25" C entwickelt. Die Flekken aus den Seren von den Tieren, die mit dem Tumorgewebeextrakt immunisiert worden waren, bildeten eine einzige Linie.
die anzeigte, dass das Serum für den Tumor spezifische Antikörper enthielt. Die Ergebnisse aus den Seren der Tiere, die mit normalem Gewebe oder mit normalem menschlichen Plasma immunisiert worden waren, waren negativ.
Beispiel 4
Radioimmunoassay von CEA.
Normales menschliches Serum wird mit Borat-Puffer (Tonenstärke 0,1 pH 8,4) auf 1:100 verdünnt und als Verdünnungsmittel für das Anti-CEA-Antiserum, das aus Ziegen nach dem Verfahren des Beispiels 3 gewonnen wurde, und für das '25J-CEA verwendet, das nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt wurde.
a) Herstellung einer Standardinhibitionskurve.
Man fügt 5 ml Standard-CEA einer Reihe von Röhrchen zu, von denen jedes den gepulverten Extrakt von 5 ml normalem menschlichen Serum enthält und der nach dem Verfahren des Beispiels 2 hergestellt wurde. Dann gibt man in jedes Röhrchen 50() u1 verdünntes Anti-CEA-Antiserum. Es wird 18 Stunden bei 4" C inkubiert und danach jedes Rörchen mit 500 u1 Jod CEA versetzt. Die Inkubation wird weitere 2 Stunden bei 37" C fortgesetzt. Dann fügt man jedem Röhrchen 1 ml einer auf 4" C gekühlten gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung hinzu.
Bei der vorliegenden Ammoniumsulfatkonzentration (50 %-ige Sättigung) erleidet das an den Antikörper gebundene CEA eine Copräzipitation, während das freie CEA in Lösung bleibt. Nach Waschen mit 3,0 ml einer zu 50% gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung bei 4" C wird der 25Jod-CEA-Gehalt des Präzipitats in einem Zweikanal-Szintillationszähler bestimmt.
Auf diese Weise erhält man eine Standardinhibitionskurve.
b) Radioimmunoassay von Serum.
Das zu untersuchende Serum wird in gleicher Weise behandelt, mit dem Unterschied, dass zu keiner der Proben Standard CEA zugefügt wurde. Der Gehalt an CEA wird durch Vergleich mit der Standardinihibitionskurve bestimmt.
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS
1. A method for the detection of human carcinoembryonic antigens in the blood by a) adding a certain amount of anti-carcinoem bryonal antigen antiserum to a sample of blood serum extracted with perchloric acid, b) incubating the mixture, c) adding a certain amount of radioactive labeled human carcinoembryonic antigen to the mixture, d) incubating the mixture, e) adding a protein precipitant to the incubated mixture, whereby all human carcinoembryonic antigen-anti-carcinoembryonic antigen complexes are coprecipitated, f) determining the radioactivity of the coprecipitate or the supernatant and g) comparisons with a standard inhibition curve, characterized in that
that the radioactively labeled human carcinoembryonic antigen has a radioactivity of at least 5-10 Ci / g.
2. The method according to claim 1, characterized in that in step a) the anti-carcinoembryonic antigen antiserum is diluted with normal blood serum which has been brought to a dilution of 1: 100 with a borate buffer of pH 8.4.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that in step c) the human carcinoembryonic antigen is labeled with I25 iodine.
4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that in stage e) the unreacted human carcinoembryonic antigen remains in solution and the protein precipitant is aqueous saturated ammonium sulfate solution.
5. Reagent set for the determination of human carcinoembryonic antigen, containing a) human carcinoembryonic antigen-J'25 with a radioactivity of at least 5-10 Ci / g or b) carcinoembryonic antigen antiserum, as it is available if one has a warm-blooded animal with human carcinoembryonic antigen, which has a molecular weight of approximately 200,000 and an absorption maximum at 280 nm, forms a single precipitation line with a specific antibody in non-absorbed antiserum in gel diffusion tests, in block electrophoresis in a borate buffer of pH 8.6 and an ionic strength of 0 , 05 at 400 V and a current of about 20 mA 10-14 cm in the anodic direction,
if at the same time ferritin as the standard migrates 18 cm from the cathode end in the anodic direction and to which 20-50% of the iodine used can be bound in the iodination using the chloramine T method, immunized and the antibodies formed by the animal isolated, or c) as Standard human carcinoembryonic antigen, which has a molecular weight of approximately 200,000 and an absorption maximum at 280 nm, forms a single precipitation line with a specific antibody in non-absorbed antiserum in gel diffusion tests, in block electrophoresis in a borate buffer of pH 8.6 and an ionic strength of 0.05 at 400 V and a current of about 20 mA travels 10-14 cm in the anodic direction,
if at the same time ferritin as standard moves 18 cm from the cathode end in the anodic direction and to which 2050% of the iodine used can be bound in the iodination with the chloramine T method.
The present invention relates to a method for determining the content of carcinoembryonic antigen (CEA) in body fluids, in particular blood, of people with cancer or suspected cancer and a reagent set for carrying out this method. In particular, according to the present invention, a radioimmunoassay technique has been developed which is very specific, easy to carry out and of high reproducibility.
More specifically, the present invention relates to a method for the detection of carcinoembryonic antigens in blood by a) adding a certain amount of anti-CEA antiserum to a sample of blood serum extracted with perchloric acid, b) incubating the mixture, c) adding a certain amount of radiolabelled CEA to the incubated mixture, d) incubating the mixture, e) adding a protein precipitant to the incubated mixture, all CEA-anti-CEA complexes being coprecipitated, f) determining the radioactivity of the coprecipitate or the supernatant and g) comparisons with a standard inhibition curve, characterized in that the radioactively labeled CEA has a radioactivity of at least 5-10 Ci / g.
In the radioimmunoassay according to the invention, it is important that the radioactive atom reacts sufficiently with the molecule to be labeled in order to create a corresponding intensity of the radioactivity for the determination, and that the radioactive atom has a sufficient decay rate for a sufficiently high sensitivity and accuracy of the determination to guarantee. Furthermore, in the case of radioimmunoassay of antigens, the antigen activity must not be impaired by the connection of the radioactive atom with the antigen.
By means of the present invention it is possible to determine approximately 1.0 ng CEA per ml serum. The sensitivity of the test is only limited by the specific activity of the radioactive atom. However, this limitation can largely be overcome, since practically all of the CEA present in a partial volume of the serum can be extracted by the extraction method mentioned below, which makes it possible to increase the specific activity of the radioactive atom. Furthermore, the inhibition of coprecipitation of the labeled CEA can be increased in order to increase the sensitivity of the method.
CEA can be labeled with various radioactive atoms. 125 iodine has been found to be particularly suitable.
Marking is carried out using known methods with minor modifications in terms of concentration and volume. The chloramine T method from Hunter and Greenwood [Biochem. J. 91, 46 (1964)] using 125 iodine is particularly advantageous; iodination takes place here with a yield of 20-50%.
About 0.25-0.4 mg of purified CEA with 125 iodine in the form of KJ or NaJ in the presence of chloramine T, d.i. Na [WCH3-C6H4-SO2NCl], iodinated. The reaction takes about one minute at room temperature and is advantageously interrupted by adding sodium or potassium metabisulphite. The function of chloramine T is to oxidize the iodide to iodine, while the metabisulphite reduces unreacted 125 iodine to iodide. Other oxidizing and reducing agents can also be used, but they must not damage the CEA. The product can be purified by chromatography on a column with a cross-linked dextran gel, for example Sephadex G-100>.
This gel has an exclusion limit of approximately 100,000, a water retention
assets of 10.0 + 1.0 g H2O / g dry substance, a particle size of 40-120 u and a bed volume of 15-20 ml / g dry substance. The product has the following characteristics:
It is reactive with a specific antibody, shows the CEA electrophoresis image, has a molecular weight of about 200,000 and a specific activity of about 1,000-25,000, preferably about 10,000-20,000 pulses per minute and nanogram, i.e. about 5-10 Ci / g CEA.
According to the present invention, using radioiodinated CEA, the presence of CEA in human serum is determined by a method which is a modification of the technique described by Farr of inhibiting coprecipitation [J. Infect. Dis. 103, 239 (1958)].
With the method mentioned, all of the CEA present in the blood must be present in the serum that is ultimately used after separation of disruptive materials. This can be done by treating the blood serum with a glycoprotein solvent, which is a CEA solvent and
existing CEA-antibody-CEA complexes can be destroyed and achieved by clarifying the solution obtained.
The glycoprotein solvent suitable for this process is perchloric acid, preferably 0.2 M perchloric acid. The resulting solution, which may contain CEA, is then clarified, preferably by centrifugation, for 24-48 hours against water / dialyzed and freeze-dried.
Using this method, a purified serum extract is obtained which contains more than about 95% of the CEA originally present. Initially existing CEA-Anti CEA complexes are split and their CEA also recorded.
To carry out the radioimmunoassay, it is also necessary that CEA-specific antibodies are present.
It will e.g. achieved by immunization of animals with purified CEA in the usual way.
It is advisable to add an emulsifier to the CEA, which is in a saline solution, for example complete Freund's adjuvant. In animals, the emulsion can be injected intramuscularly in the balls of the foot and / or subcutaneously. Suitable animals are e.g. Poultry, rabbits, horses, goats or sheep. For example, rabbits are given two to five injections a week. Blood is drawn from the animal after the last injection. The serum from this blood is non-absorbed anti-CEA antiserum.
A preferred method uses 400 µg of CEA in 1 ml of 0.9% saline. The antibody present in the antiserum is specific against CEA after absorption on normal tissue components.
The results of the radioimmunoassay applied to the powdered perchloric acid extracts according to the method of coprecipitation inhibition, which contain information about the CEA content of the blood, thus allow a statement to be made as to whether the examined patient has cancerous tumors of the digestive system or not.
The CEA suitable for the purposes of the present invention can be prepared as follows: a) homogenizing tissue containing CEA which is either embryonic tissue from digestive organs of fetuses from the first and second trimester or adenocarcinoma tissue from tumors of the digestive system epithelium, b) treatment of the homogenate with a glycoprotein solvent, c) separating the precipitate and clarifying the solution obtained, d) dialysing E. the clarified solution, e) concentrating the dialysate, f) clarifying the solution obtained, g) drying the clarified solution, h) chromatography of the solution obtained Material on two different gel columns, the first of which is an agarose gel with about 4% by weight of agarose and a particle size of 40-190 u and the second a hydrophilic water-insoluble cross-linked dextran gel,
i) collecting and concentrating the fractions of the eluate with an absorption maximum at 280 nm and a molecular weight of about 200,000, j) preparative electrophoresis of the collected eluates and k) collecting those fractions which are about 10-14 cm in have migrated in the anodic direction if at the same time ferritin migrates 18 cm from the cathode end in the anodic direction.
The tissue containing CEA is expediently homogenized with an amount of water sufficient to solubilize all of the CEA present. In general, an amount greater than about 2 liters of water per kilogram of tissue is not required.
The homogenate is treated with a glycoprotein solvent and thus a CEA-dissolving agent. This is necessary so that precipitable normal proteins and interfering antigenic materials can be separated from the CEA material. Glycoprotein solvents suitable for this are, for example, perchloric acid, trichloroacetic acid, phosphotungstic acid and the like, with perchloric acid being preferred.
Any temperature from room temperature and below is suitable for adding the glycoprotein solvent to the tissue homogenate. It is preferable to work at room temperature, i.e. at 20-25 "C. The temperature of the glycoprotein solvent that is added to the tissue homogenate can also vary; here too, room temperature is preferred. In general, a concentrated 0.5-2 N, in particular 2 N, acid is preferred. The homogenate is preferred It is advisable to add approximately the same volume of solvent within 10-30 minutes, a slower addition can lead to a loss of antigen activity.
A precipitate is obtained which is obtained from the supernatant containing the dissolved CEA by one of the usual methods such as e.g. Centrifugation or filtration can be separated.
Centrifugation is preferred for separation, i.a. at about 3,000-8,000 rpm. It is preferably centrifuged at low temperatures, around 4-10 ° C.
For further cleaning, i.e. dialysis against water has proven to be the most suitable for removing low molecular weight substances such as perchloric acid or salts such as sodium chloride. Dialysis is a critical part of the process because it removes all diffusible soluble substances except for those of higher molecular weight, which includes the CEA fraction. It can be done first with tap water for about 24-48 hours and then with cold distilled water at temperatures of around 4-10 ° C. However, it is also possible to use only distilled water. The dialysis procedure takes a total of about 48-96 hours.
The cloudy solution that remains after dialysis is concentrated. Freeze drying is the method of choice, although other methods are also possible, such as
Spray drying. The preferred method is to first freeze the material in trays and then lyophilize, which takes a total of about 32-36 hours. In a preferred embodiment of the process according to the invention, however, in order to save time, the lyophylization is terminated after about 24-30 hours, so that the product is not yet completely dry.
The not completely dry lyophilized material can then be thawed at room temperature or higher, such as 37 ° C. It can also be thawed by diluting it with a very small amount of water.
The remaining particles can then be removed. If the volume is kept to a minimum, clarification can be achieved by filtration and / or centrifugation. All particles that cannot pass a 0.22 filter (i.e. up to the size of the smallest bacteria) are removed from the solution.
The preferred method is that of centrifuging at high speed for 15-45 minutes, i.e. with about
14,000 to 30,000, preferably at about 14,000 rpm, at temperatures up to about 10 C, preferably from 4-10 "C.
Higher temperatures can be used, but are not practical because they delay sedimentation. After centrifugation, it is necessary to further clarify and sterilize the supernatant solution. This can be achieved by filtering through filters whose pore size varies between 1.2 and 0.20 u.
Filters with a pore size of preferably are used
1.2 cm, 0.45, 0.22 u in the order given.
The filtrate is dried, preferably freeze-dried.
The separation of the CEA from other substances of the freeze-dried powder obtained can be achieved by subsequent chromatography on two different gel columns and subsequent electrophoresis.
It was found that the eluted fractions of column chromatography, which have a molecular weight of about
200,000 and have a defined absorption maximum at 280 nm that contain CEA. It was further found that when the fractions containing the CEA were at pH 8.6 in one
Borate buffers with an ionic strength of 0.05 are subjected to an electrophoresis to obtain a characteristic migration pattern. The length of the distance covered depends on the current strength, the voltage, the buffer, its pH value and its ionic strength. At a tension of
400 V and a current of 20 mA, the CEA migrates about 10-14 cm in the anodic direction while ferritin (a colored protein) as a reference substance in the same time
18 cm from the cathode end in the anodic direction.
The subsequent column chromatography can be carried out in the
Be carried out by lyophilized the dissolved
Material chromatographed on two different gel columns in any order. It is expedient to use a gel column made of agarose gel, the neutral part of agar.
It was gel material from AB Pharmacia, Uppsala (Sweden), which was sold under the trademark Sepharose in
Commercially available is used. The gels are considered watery
Suspensions in 0.02% sodium azide available as a protective agent. The concentration of the agarose in the gel determines its fractionation range. The most convenient gels have a particle size of about 40-190u and contain 4 wt .-% agarose. This is referred to as Sepharose 4B
Material has a fractionation area of 3 X 105-3 X 106.
With Sepharose 4B an enrichment of CEA succeeds, since other compounds with higher or lower molecular weight as well as colloidal particles are separated.
The other column suitably contains a hydrophilic, cross-linked dextran gel, which is insoluble in serum. Such a material is from AB Pharmacia, Uppsala (Sweden), under the
Marketed the name Sephadex. The ability of
Gel material to take up water is inversely proportional to the degree of crosslinking of the dextran substances in the gel material.
The gel material is available in a variety of grades, which differ with regard to the degree of porosity. The preferred gel has an approximate exclusion limit of
200,000, a water retention of 20 j2.0 g H2O / g
Dry matter, a particle size of 40-120 u and a
Bed volume of 30-40 ml / g dry substance. This gel is called Sephadex G-200.
Sephadex G-200> is expediently used for further purification of the fraction containing the CEA. The Sephadex G-200 column has a larger separation capacity for the molecular weight range of 150,000 to 250,000 than the former and should only be used after the colloidal particles have been removed by the first column, as these particles would otherwise clog the Sephadex column and would render them ineffective.
Column chromatography is performed, for example, as follows: the lyophilized material is in an aqueous buffer at the pH of the isoelectric point of the CEA, i.e. at pH 4.5, dissolved. The solution is applied to the first column. The collected active fractions of the eluate are dialyzed as described above, lyophilized, again dissolved in an aqueous buffer of pH 4.5 and added to the second column. The active fractions (absorption maximum at 280 nm) are dialyzed again and lyophilized. Although all common aqueous buffers are suitable, the use of a 0.9% phosphate buffer is preferred. The advantage of using low temperatures, i.e.
of about 4-10 "C, is that an improved resolving power is achieved. The fractions collected from the second column have a molecular weight of 200,000 and an absorption maximum at 280 nm.
The active, concentrated fractions of the eluate of the second column are finally subjected to electrophoresis, for example in a buffer with a pH of about 8.2-9.2 and an ionic strength of about 0.0125-0.10, preferably in a borate buffer with a pH of about 8. 6 and subjected to an ionic strength of about 0.05.
Block electrophoresis is the preferred electrophoresis method, but other types of electrophoresis can also be used. It is expedient to work at about 300-500 V, preferably at 400 V with about 20 mA. In the preferred electrophoresis method, a cross-linked dextran gel, for example Sephadex G-25, is suitably used, with an exclusion limit of approximately 5,000, a water retention capacity of 2.5 + 0.2 g H2O / g dry substance, a particle size of 20-80 p and a bed volume of 5 ml / g dry substance. The gel is swelled in the buffer and placed on a non-conductive block, for example Lucite. For example, ferritin applied to the cathode end of the block can be used as a suitable standard.
After approximately 24 hours of electrophoresis, the area containing the CEA activity is removed.
Under the special operating conditions mentioned, this is the zone that is 10-14 cm away from the start in the anodic direction. In this case, the ferritin has migrated 18 cm in the anodic direction. The CEA activity is eluted and the material is preferably purified by dialysis against distilled water.
A material is obtained which is essentially pure CEA.
This is shown either by inhibition of precipitation or directly by the Ouchterlony test against non-absorbed tumor antiserum. A single precipitation line indicates pure CEA.
The following examples illustrate the invention.
example 1
Implementation of CEA with 125 iodine.
500 μl of a mixture containing 100 μg of chloramine T, 250 μg of CEA and 4 with 25 iodine in the form of KJ are mixed with 240 μg of sodium metabisulphite after 1 minute at room temperature. The product obtained, 125J-CEA, is separated from unreacted 125 iodine by chromatography on a Sephadex G-100 column. The product has a specific activity of about 5 Ci / g.
The CEA used as the starting material is produced as follows: a) Isolation of the CEA fraction.
Tumor tissue from the colon adenocarcinoma is cut out and as much normal tissue as possible is removed. The remaining tumor tissue is rotated through a meat grinder and stored in 1,000 g quantities at -20 ° C. 1,000 g of the comminuted tissue are suspended with distilled water to a total volume of 4,000 ml and one hour in a water-cooled homogenizer at 15,000 With constant stirring, an equal volume of 2N perchloric acid is slowly added at 4 "C., the mixture is stirred for 30 minutes at room temperature and then centrifuged for 30 minutes at 4" C. at 6000 rpm in a cooled centrifuge The excess is removed and placed in a flat, 7.6 cm wide dialysis tube, which has been immersed in distilled water for 1 hour to make it more supple.
It is dialyzed against cold tap water for 48 hours and for a further 48 hours against distilled water at 4 ° C. The dialyzed residue is not completely lyophilized, thawed and the solution obtained in a cooled centrifuge at 4 ° C. for 30 minutes at 14,000 rpm / min centrifuged. The supernatant is removed and successively filtered through membrane filters of 1.2, 0.45 u and 0.22 u pore size. The clarified solution is frozen in dishes and lyophilized to dryness.
1.5 g of the dried raw extract is dissolved in 50 ml of a 0.05 m NaH2PO4 buffer (pH 4.5) in normal saline. The phosphate salt buffer of pH 4.5 serves as an eluent in all subsequent column chromatography. The sample is then passed through a column (Pharmacia K 100/100 (100 cm X 10 cm) with a bed length of 90 cm) with Sepharose 4B. The temperature is kept at 4-5 "C. The flow rate is 150 ml / hour. 25 ml fractions are collected, the absorption of which is measured at 280 nm. The active fractions appear after 4 750 ml in the eluate. The active fractions (750 ml) are combined, dialyzed against distilled water at 4 ° C. for 48 hours, frozen in dishes and lyophilized.
200 mg of the dried material obtained are then dissolved in 10 ml of the standard buffer and chromatographed on Sephadex G-200. (Column Pharmacia K 50/100 (100 cm X 10 cm) with a bed length of 90 cm). The temperature is kept at 4 ° C. At a flow rate of 40 ml / hour, 10 ml fractions are collected and measured at 280 nm in a spectrophotometer. The active fractions (190 ml) appear after 820 ml in the eluate, are combined, 48 Dialysed at 4 "C against distilled water, frozen in dishes and lyophilized.
b) Purification of the isolated CEA by block electrophoresis.
The block electrophoresis material Sephadex G-25, fine, is swollen in water at 80 ° C. for two hours, washed with borate buffer (pH 8.6; ionic strength 0.05) and then filtered through a sintered glass plate using negative pressure.
Spread a gel slurry evenly on a Lucite block carrier (mass 61 7.5 x 1 cm) and treat the surface with a cotton ball until it is firm but not completely dry. The block is then provided with chromatography paper contacts (3 mm), which are all aligned in the flow direction of the paper, and equilibrated for one hour under the operating conditions (400 V and about 20 mA) at 4 "C. Then one is removed from the center of the block Strips of 1 cm, the material is mixed well with 60 mg of dry CEA from example 1, which has previously been dissolved in the smallest possible amount (about 0.5 ml) of 0.05 m borate solution, and the porridge obtained is poured back into the central stripe.
Then 1-2 drops of a ferritin solution (6 :: recrystallized; concentration 100 mg / ml) are dabbed onto the cathode end of the block and the electrophoresis is started.
After 24 hours, the ferritin standard has moved about 18 cm in the anodic direction. After electrophoresis is complete, strips of 2 cm are cut from the block between the start zone and the anode end. The main activity is located at a distance of 10-14 cm from the start zone in the anodic direction; weaker activity can be demonstrated at a distance of 8-10 cm.
Each active strip is eluted with 2 m NaCl solution, which previously had to pass through a 0.20 u membrane, and the eluate is dialyzed for 48 hours at 4 ° C. with distilled water. The dialysate is frozen in dishes and freeze-dried. The dried, purified CFA is stored under reduced pressure over calcium chloride at 4 "C.
The product has the following characteristics:
It forms a single precipitation line with non-absorbed antiserum in gel diffusion tests; is soluble in perchloric acid; migrates anodically during block electrophoresis
10-14 cm, at the same time a ferritin standard anodic
18 cm migrates (borate buffer of pH 8.6 and an ionic strength of 0.05, voltage 400 V, current strength 20 mA); Molecular weight 200,000; Absorption maximum at 280 nm.
Example 2
Preparation of blood samples for the radioimmunoassay.
5 ml of 2.0 m perchloric acid are added to 5 ml of serum, which comes from blood samples from 200 people. The mixture is stirred for 20 minutes at room temperature. The precipitate obtained is centrifuged at 9,000 X g for
10 minutes at 4 ° C. The sediment obtained is discarded and the supernatant dialyzed against cold tap water for 24 hours and then for an additional 24 hours against distilled water at 4 ° C. The dialyzed residue is then lyophilized to a dry powder.
Example 3
Production of the anti-CEA antiserum.
12 adult male New Zealand white rabbits, each weighing 2.0 kg, were divided into 3 groups of 4 animals. The various groups were immunized with the following materials: normal colon tissue extract, tumor tissue extract from the same individual from whom the normal tissue extract originated and human plasma. The tumor tissue extract came from tumor samples that had been diagnosed and confirmed as colon adenocarcinomas. The normal tissue extracts and the tumor tissue extracts were formed according to the procedure described in Example 1. The human plasma came from 30 normal donors from all major blood groups.
The injections given twice weekly for 4 weeks contained 3 mg protein in 0.6 ml tissue extract or plasma and the same volume of complete Freund's adjuvant. 0.1-0.2 ml was injected into the balls of the foot and the rest intramuscularly into the flank region.
Blood was drawn from the marginal ear veins of the animals 12 days after the last injections and the sera obtained from each group were collected separately.
The sera from each group were absorbed into normal tissue and the resulting precipitate was separated. The supernatant solutions were then subjected to a two-dimensional diffusion in agar gel using the Ouchterlony technique. This was carried out in a 1% solution of agar in saline with merthiolate, which was used as a protective substance and was in a concentration of 1:10 000.
The wells were cut into the gel plates so that the central and peripheral were 1 cm apart.
Each well was filled with 0.15 ml of the material to be examined. The antigen concentration was 10 mg per ml. The initial incubation of the plates was 24 hours in a humid environment at 37 "C. Then 7 days were developed in the same humid atmosphere at 25" C. The spots from the sera from the animals immunized with the tumor tissue extract formed a single line.
which indicated that the serum contained antibodies specific for the tumor. The results from the sera of the animals immunized with normal tissue or with normal human plasma were negative.
Example 4
Radioimmunoassay from CEA.
Normal human serum is diluted to 1: 100 with borate buffer (clay strength 0.1 pH 8.4) and as a diluent for the anti-CEA antiserum obtained from goats by the method of Example 3 and for the ' 25J-CEA used, which was prepared according to the procedure of Example 1.
a) Preparation of a standard inhibition curve.
5 ml of standard CEA are added to a series of tubes, each containing the powdered extract of 5 ml of normal human serum, which was prepared according to the procedure of Example 2. Then 50 () u1 diluted anti-CEA antiserum is added to each tube. Incubate for 18 hours at 4 "C and then add 500 µl of iodine CEA to each tube. The incubation is continued for a further 2 hours at 37" C. Then 1 ml of a saturated aqueous ammonium sulfate solution cooled to 4 ° C. is added to each tube.
At the present ammonium sulfate concentration (50% saturation), the CEA bound to the antibody suffers a coprecipitation, while the free CEA remains in solution. After washing with 3.0 ml of a 50% saturated aqueous ammonium sulfate solution at 4 ° C., the 25 iodine CEA content of the precipitate is determined in a two-channel scintillation counter.
In this way a standard inhibition curve is obtained.
b) Serum radioimmunoassay.
The serum to be examined is treated in the same way, with the difference that standard CEA has not been added to any of the samples. The CEA content is determined by comparison with the standard inhibition curve.