DE1798170C2

DE1798170C2 - Method for determining the presence of reagin immunoglobulins (Reagin-Ig) directed against certain allergens in aqueous samples

Info

Publication number: DE1798170C2
Application number: DE19681798170
Authority: DE
Inventors: Hans H. Dr. Uppsala; Johansson Stig Gunnar Olof Dr. Storvreta; Wide Leif Edvin Uppsala; Bennich (Schweden)
Original assignee: Pharmacia AB; Uppsala (Schweden)
Priority date: 1967-09-06
Filing date: 1968-09-03
Publication date: 1976-09-30

Description

Es ist bekannt, daß eine bestimmte Zahl von immunogenen Substanzen, sogenannte Allergene, von denen viele die Natur eines Proteins, Peptids oder Kohlehydrats aufweisen, allergische Reaktionen wie beispielsweise Asthma oder Heuschnupfen hervorrufen können. (Solche Allergene sind weit verbreitet und können beispielsweise aus tierischen Schuppen, Pflanzenpollen, Mikroorganismen, einigen Parasiten usw. gewonnen werden.) In Verbindung damit zeigt sich —■ in der Regel in sehr niedrigen Konzentrationen — beispielsweise im Blut des Patienten ein bestimmter Typ von Antikörpern, sogenannte Reagine, welche Immunoglobuline darstellen und welche spezifisch gegen das Allergen oder die Allergene gerichtet sind; die Antikörper können im Blutserum gezeigt werden. Diese speziellen Immunoglobuline werden im folgenden als Reagin-Immunoglobuline oder Reagin-Ig bezeichnet.It is known that a certain number of immunogenic Substances called allergens, many of which have the nature of a protein, peptide or Carbohydrates, cause allergic reactions such as asthma or hay fever be able. (Such allergens are widespread and can, for example, from animal dandruff, Plant pollen, microorganisms, some parasites, etc.) In connection with it shows - ■ usually in very low concentrations - for example in the patient's blood certain types of antibodies called reagins, which are immunoglobulins and which are specific are directed against the allergen or allergens; the antibodies can be shown in the blood serum will. These special immunoglobulins are hereinafter referred to as reagin immunoglobulins or reagin Ig designated.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von gegen bestimmte Allergene wirkenden Reagin-lmmunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Testproben.The invention relates to a method for determining the presence of allergens which are active against certain allergens Reagin immunoglobulins (Reagin-Ig) in aqueous test samples.

Es ist besonders wichtig, die Anwesenheit von Reagin-Ig in Verbindung mit der Diagnose der Hyperscnsitivitüt von Tieren und Menschen festzustellen.The presence of Reagin-Ig is especially important in connection with the diagnosis of hypersensitivity of animals and humans.

Bisher hat man für die Bestimmung Hauttests verwendet, bei welchen ein Testallergen beispielsweise mit Hilfe einer Spritze auf die Haut des Patienten gebracht wurde; ist der Patient überempfindlich bzw. hyperscnsibel (allergisch), so findet in vivo eine Reaktion statt zwischen dem Allergen und den Antikörpern, die gegen das fragliche Allergen gerichtet sind. Durch diese Reaktion treten bestimmte Symptome, z. B. eineSo far, skin tests have been used for the determination, in which a test allergen, for example was placed on the patient's skin with the help of a syringe; is the patient hypersensitive or hypersensitive (allergic), a reaction takes place in vivo between the allergen and the antibodies, which are directed against the allergen in question. This reaction causes certain symptoms, such as: Legs

Rötung oder Schwellung der Haut, an der die Injek- andere chemische und biologische Eigenschaften alsRedness or swelling of the skin where the inject- other chemical and biological properties than

tion gemacht wurde, auf, aus denen auf das Ausmaß die übrigen Antigene und Immunantikörper besitzen,tion was made on, from which on the extent to which the remaining antigens and immune antibodies possess,

der Reaktion geschlossen werden kann. ist diese Methode nicht für die quantitative In-vitro-the reaction can be closed. this method is not suitable for quantitative in vitro

In-vivo-Tests sind auch sogenannte Provokations- Bestimmung von Reagin-Ig geeignet,In-vivo tests are also suitable for so-called provocation determination of reagin-Ig,

tests, bei welchen der Patient ein Allergen in Form 5 Schließlich ist aus Nature, Vol. 203. 8. August 1964,tests in which the patient has an allergen in Form 5 Finally, from Nature, Vol. 203. August 8, 1964,

eines Aerosols inhaliert. 1st der Patient gegen das Seite 648 und 649 eine Methode zur Bestimmung voninhaled an aerosol. If the patient is against the page 648 and 649 a method of determining

Allergen hypersensibel, so beobachtet man eine Reak- Antikörpern bekannt, bei der die Testprobe mit einemAllergen hypersensitive, so one observes a known reac antibody, in which the test sample with a

tion, die sich beispielsweise in Asthmasymptor.ien an ein wasserunlösliches Polymer gebundenes nicht-tion, which can be found, for example, in asthma symptoms.

äußern kann. Die beiden vorstehend erwähnten Tests markiertes Antigen zusammengebracht wird, wobeican express. The two tests mentioned above are brought together labeled antigen, wherein

sind zeitraubend und, in bestimmten Fällen, unar.ge- io die gegen das Antigen gerichteten Antikörper mit demare time-consuming and, in certain cases, unrelated to the antibodies directed against the antigen with the

nehm und gefährlich für den Patienten. In einer Zahl Antigen reagieren, und anschließend das gleichetedious and dangerous for the patient. In a number antigen react, and then the same

von Fällen können keine Tests durchgeführt werden. Antigen, wie das an das Polymer gebundene, jedochof cases, tests cannot be performed. Antigen, like that bound to the polymer, however

Außerdem muß eine Vielzahl von In-vivo-Tests durch- markierte Antigen zugesetzt wird,In addition, marked antigen must be added to a large number of in vivo tests,

geführt werden, damit eine sichere Diagnose gestellt Diese Methode eignet sich zwar für die übrigenbe guided so that a reliable diagnosis can be made. This method is suitable for the rest

werden kann, ob ein Patient gegen ein bestimmtes 15 Antigene und Antikörper, jedoch nicht für AllergeneIt can be determined whether a patient is against a certain antigens and antibodies, but not for allergens

Allergen bzw. gegen bestimmte AHergene hy]>er- und Reagin-Ig.Allergen or against certain AHergens hy]> er and reagin-Ig.

sensibel ist. D_er Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde.is sensitive. T _he invention was therefore based on the object.

Die bisher zur Verfugung stehenden In-vitro- eine einfache und verläßliche ln-vitro-Methode zurThe previously available in-vitro method is a simple and reliable in-vitro method

Methoden haben keine praktische Bedeutung. Bestimmung der Anwesenheit von gegen bestimmteMethods have no practical meaning. Determination of the presence of against certain

So wird beispielsweise in »Immunological Diseases«, 20 AHergene gerichtetes Reagin-Ig zu schaffen, die ohne Editors: Max Samter et al. (J. A. Churchill Ltd., Unannehmlichkeiten oder Risiko für den Patienten London 1965), Seite 511, 519 bis 538 und 549 bis 555, durchgeführt werden kann, so daß die Nachteile auseine Vielzahl von In-vitro-Methoden beschrieben, die geschallet werden.For example, in "Immunological Diseases", 20 AHergene are used to create directed Reagin-Ig, those without Editors: Max Samter et al. (J. A. Churchill Ltd., inconvenience or risk to patient London 1965), pages 511, 519 to 538 and 549 to 555, so that the disadvantages are eliminated A large number of in vitro methods that are sonicated are described.

sich zwar zur immunologischen Bestimmung von Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine Antikörpern, die keine Reagine sind, als brauchbar as sehr genaue und verläßliche Methode sich dadurch erwiesen haben, in den zahlreichen Versuchen zur erzielen läßt, daß man die Probe, z. B. eine Körperquantitativen In-vitro-Bestimmung von Reaginen je- flüssigkeit, wie Blutserum oder Blutplasma, in vitro doch teilweise völlig versagten, teilweise nur unbe- mit einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein fiicdigende Ergebnisse lieferten. Testallergen gebunden worden ist, zusammenbringt.Surprisingly, it has now been found that a Antibodies that are not reagents are considered useful as a very accurate and reliable method have proven in the numerous experiments to achieve that the sample, for. B. a body quantitative In vitro determination of reagents of any liquid, such as blood serum or blood plasma, in vitro but sometimes completely failed, sometimes only insoluble with a water-insoluble polymer to which a gave satisfactory results. Test allergen has been linked.

Diese Ergebnisse sind offenbar darauf zurück- 30 so daß eine Reaktion zwischen dem Testallergen anThese results are apparently due to the fact that there was a reaction between the test allergen

zuführen, daß, wie in gleicher Literaturstelle ausge- dem Polymer und dem entgegenwirkenden Reagin-Igadd that, as in the same reference from the polymer and the counteracting Reagin-Ig

führt wird, AHergene und Reagin-Ig, obgleich zur stattfindet und das Reagin an das an dem unlöslichenleads to AHergene and Reagin-Ig, although the takes place and the Reagin to the insoluble

Klasse der Antigene bzw. Antikörper gehörend, völlig Polymer befindliche Testallergcn gebunden wird,Belonging to the class of antigens or antibodies, completely polymer-based test allergies are bound,

andere Eigenschaften als die übrigen Antigene und worauf man das Polymer mit dem Testallergen unddifferent properties than the other antigens and what to do with the polymer with the test allergen and

Immunantikörper besitzen. 35 dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern, die spezi-Own immune antibodies. 35 the Reagin-Ig either with antibodies that specifically

In J. of Immunology, Vol.97, No. 4, 1966, Seiten fisch gegen Reagin-Ig gerichtet sind und mit einem 840 bis 853, werden wissenschaftliche Untersuchungen zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom beschrieben über die Eigenschaften von gegen ein be- oder einer Gruppe markiert worden sind, oder mit stimmtes Allergen (Pollen einer in Nordamerika hei- Antikörpern, die spezifisch gegen Reagin-Ig gerichtet mischen Pflanze der Gattung Ambrosia) gerichteten 40 sind, und Reagin-Ig, welches mit einem zur Aus-Reagin-Antikörpern. Diesen Untersuchungen isi. zu sendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer entnehmen, daß die hautsensitierenden Antikörper Gruppe markiert worden ist, zusammenbringt, angegen eine bestimmte mit E bezeichnete aller:»ene schließend das unlösliche Polymer mit den daran Komponente in dieser Pflanze zu einer bis dahin befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt unentdeckten Klasse von Antikörpern gehören. Diese 45 und schließlich die Strahlung, die von dem unlöslichen Untersuchungen beziehen sich jedoch nur auf ein Polymer mit den danin befindlichen Substanzen auseinziges Allergen und wurden mit Hilfe von Techniken, gestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der abgcwie Radioimmundiffusion und Radioimmunoelektro- trennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, mißt oder die phorese durchgeführt, wie sie bereits in vorstehender Wirkung derselben untersucht.
Literaturstelle genannt wurden. 50 Dies war um so überraschender, als bekannt war.In J. of Immunology, Vol. 97, No. 4, 1966, pages fisch are directed against Reagin-Ig and with an 840 to 853, scientific studies on the emission of a radiation-capable atom are described on the properties of have been marked against a certain or a group, or with a certain allergen (pollen a in North America he-antibodies, which are directed specifically against Reagin-Ig mixed plant of the genus Ambrosia), and Reagin-Ig, which is directed against a Reagin-Ig antibodies. These investigations are. to send a radiation capable atom or one inferring that the skin-sensitizing antibody group has been marked, brings together against a certain with E denoted all: »ene closes the insoluble polymer with the component in this plant to one of the substances from the plant until then Liquid separates belonging to undiscovered class of antibodies. These 45 and finally the radiation from the insoluble investigations, however, relate only to a polymer with the substances contained in it from the sole allergen and were made with the help of techniques that are radiated, or the radiation that is separated from the liquid, such as radioimmunodiffusion and radioimmunoelectrically is broadcast, measures or the phoresis carried out, as already examined in the above effect of the same.
Reference were mentioned. 50 This was all the more surprising as it was known.

Die letztgenannte Methode erfordert u. a. hoch- daß Reagine eine überaus starke Affinität an ZeIl-The latter method requires inter alia. high - that Reagine has an extremely strong affinity for cell

gereinigte Allergenfraktionen und ist weder generell wände und menschliche Gewebe besitzen und manpurified allergen fractions and is neither generally walls and human tissue and one

als Allergietest noch bei diesem einzigen Allergen im der Meinung war, daß eine starke Bindung zwischenas an allergy test for this single allergen, I was of the opinion that there was a strong bond between

größeren Maßstab anwendbar. Reaginen und Allergenen nur dann erhalten würde,larger scale applicable. Would only receive reagins and allergens

Aus Proc. Soc. Exp. Biol., Vol. 86, 1954, Seiten 789 55 wenn die Reagine an Zellen gebunden sind,
bis 794, ist es bekannt, zum Nachweis spezifischer Es bestand außerdem Jie starke Vermutung, daß Antikörper im Huinanserum dieses zuerst mit einem Reagin-Antikörper die starke Bindungs-Affinität geVirus als dem entsprechenden Antigen reagieren zu genüber Zellenoberflächen auch gegenüber Proteinlassen und dann mit einem Antiserum, das gegen bedeckten Festkörperoberflächen aufweisen würden Humanimmunoglobuline gerichtete Antiköiper ent- 60 und sich mit Bezug auf den Polymerkomplex unspezihält, die mit einer zur Aussendung einer Strahlung fisch binden wurden, d. h., sich über den Weg seiner befähigten Gruppe markiert worden sind. für die Bindung an den Zellen benutzten Bindungs-From Proc. Soc. Exp. Biol., Vol. 86, 1954, pages 789 55 when the reagins are bound to cells,
to 794, it is known for the detection of specific There was also strong suspicion that antibodies in the human serum react with a reagin antibody, the strong binding affinity of the virus as the corresponding antigen, to protein compared to cell surfaces and then with an antiserum , which against covered solid surfaces would have antibodies directed against human immunoglobulins and is unspecific with respect to the polymer complex, which bind to a fish to emit radiation, ie have been marked via the path of its capable group. binding agents used for binding to cells

Diese Methode läßt sich im Zusammenhang mit stellen an den Polymer-Protein-Komplex als solchenThis method can be used in connection with the polymer-protein complex as such

üblichen Antigenen, wie hier mit Viren und gegen unspezifisch binden wurden, wodurch dann völligusual antigens, like here with viruses and against nonspecific bind, whereby then completely

dieselben gerichteten, nicht zu einer einzigen Im- 65 unbrauchbare Ergebnisse erzielt worden wären,the same directed results, which would not have resulted in a single impractical 65

munoglobulinklasse gehörenden Antikörpern mit eini- Ist in der Probe ein Reagin-Ig vorhanden, welchesAntibodies belonging to the munoglobulin class with some- If a reagin-Ig is present in the sample, which

gern Erfolg anwenden. Nachdem jedoch, wie bereks gegen das Allergen gerichtet ist, so wird markierteslike to apply success. However, after, as bereks is directed against the allergen, it is marked

vorstehend ausgeführt, AHergene und Reagin-Ig völlig Reagens an die unlösliche Phase gebunden, die an-stated above, AHergene and Reagin-Ig completely reagent bound to the insoluble phase, which

schließend eine Strahlung emittieren wird. Die letztere können leicht Brücken in Form von Bindungenwill eventually emit radiation. The latter can easily be bridges in the form of bonds

;rhöht sich, wenn die Konzentration an Reagin-lg kovalenten Charakters zu de« Testallergen bilden,; increases when the concentration of Reagin-Ig of a covalent character to form the test allergen,

in der Testprobe zunimmt. Die Strahlung der flüssigen Das Polymer wird vorzugsweise in einet solchenincreases in the test sample. The radiation of the liquid polymer is preferably in one such

Phase wird im Gegensatz dazu bei sich erhöhender Form verwendet, daß eine große Oberfläche für dieIn contrast, phase is used with increasing shape, that a large surface for the

Konzentration an Reagin-Ig abnehmen, weil mehr 5 Berühreng zur Verfugung steht, z. B. in Form vonDecrease the concentration of Reagin-Ig because more 5 touches are available, e.g. B. in the form of

markiertes Reagens an die unlösliche Phase gebunden kleinen Teilchen.labeled reagent small particles bound to the insoluble phase.

wird. Die gemessenen Strahlungswerte, die bei dieser Das Testallergen wird an das Trägerpolymer unterwill. The measured radiation values, which in this case, the test allergen is attached to the carrier polymer

Methode für die Testprobe erhalten werden, können milden Bedingungen gebunden, damit die immuno-Method for the test sample can be obtained, mild conditions can be tied so that the immuno-

mit den Werten von Kontroll proben verglichen chemische Reaktivität des Allergens nicht nennenswertThe chemical reactivity of the allergen was negligible compared with the values from control samples

werden. 10 beeinträchtigt wird.will. 10 is affected.

Wasserunlösliche Polymere werden als Träger- Zur chemischen Bindung des Allergens an dasWater-insoluble polymers are used as carriers to chemically bind the allergen to the

materialien für die Testallergene verwendet. Sie können Polymer werden reaktive Gruppen, wie Aminogrup-materials used for the test allergens. They can be polymer reactive groups, such as amino groups

beispielsweise in Form von Teilchen mit verschiedener pen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen, Amido-for example in the form of particles with different pen, hydroxyl groups, mercapto groups, amido

Gestalt und Größe vorliegen. Die Polymere können gruppen und Carboxylgruppen, verwendet, wobeiShape and size are available. The polymers can have groups and carboxyl groups, where

beispielsweise auch die Form von flachen Gegen- 15 eine Brücke in Form einer chemischen Bindung mitfor example, the shape of flat counterparts with a bridge in the form of a chemical bond

ständen wie Scheiben oder Streifen aufweisen oder in vorzugsweise kovalentem Charakter zwischen demstands such as discs or strips or in a preferably covalent character between the

Form von Rohrwänden, z. B. in Form einer Innen- Testallergen und dem Polymer gebildet wird, und Shape of pipe walls, e.g. B. is formed in the form of an indoor test allergen and the polymer, and

auskleidung eines Reagenzrohres vorliegen. Die Bin- zwar folgender Art:
dung zwischen dem Polymer und dem Tcstallergenlining of a reagent tube. The bin of the following kind:
formation between the polymer and the stableergen

sollte derart sein, daß bei normalen Waschvorgängen io Allergen — NH — CS — NH — Polymer
das Testallergen sich nicht von dem Polymer ablöst.should be such that with normal washing processes io allergen - NH - CS - NH - polymer
the test allergen does not separate from the polymer.

Damit dies erreicht wird, kann das Testallergen Allergen NH CO NH PolymerIn order to achieve this, the test allergen Allergen NH CO NH Polymer

chemisch oder gegebenenfalls auch physikalisch gebunden sein. Bei einer geeigneten Form einer chemi- Allergen — N-N — Polymer
sehen Bindung liegen zwischen dem Polymer und dem 25chemically or possibly also physically bound. With a suitable form of a chemical allergen - NN - polymer
see bond between the polymer and the 25th

Tcstallergen Brücken mit kovalentem Charakter vor. Allergen — O — CO — PolymerTcstallergic bridges with a covalent character. Allergen - O - CO - polymer

Um diese Art der Bindung zu erreichen, wird das _ .To achieve this type of bond, the _.

Polymer so ausgewählt, daß es entweder geeignete Allergen-NH - CO - PolymerPolymer selected to be either suitable allergen-NH - CO - polymer

reaktive Gruppen, z. B. Aminogruppen, Hydroxyl- Allergen — CO — NH — Polymerreactive groups, e.g. B. amino groups, hydroxyl allergen - CO - NH - polymer

gruppen oder Carboxylgruppen, enthält oder aber 30groups or carboxyl groups, or contains 30

mit solchen Gruppen versehen werden kann, die es Allergen NH C O — Polymercan be provided with groups that make it allergen NH C O polymer

erlauben, daß das Testallergen leicht an das Polymer πallow the test allergen to easily attach to the polymer π

gebunden werden kann. Die Bindungsart, bei der q
zwischen dem Polymer und dem Allergen chemischecan be bound. The type of tie where q
chemical between the polymer and the allergen

Bindungen in Form von Brücken mit kovalentem 35 Allergen NH C NH — PolymerBonds in the form of bridges with covalent 35 allergen NH C NH polymer

Charakter vorliegen, wird bevorzugt. IlCharacter is preferred. Il

Es ist besonders günstig, Polymere auszuwählen, ^j_j
die eine dreidimensionale Netzstruktur aufweisen, die
durch Bindungen kovalenten Charakters zusammengehalten wird. Solche Polymere sind, obwohl quellbar 40 Die Brücke zwischen dem Allergen und dem Polymer in Wasser oder wäßrigen Medien, vollständig unlös- braucht ihre Struktur nach nicht bekannt zu sein lieh, so daß nichts von dem polymeren Material oder und kann verschiedenen Charakter haben; die Brücke den Substanzen, die daran gebunden sind, während muß nur dem Zweck entsprechen, daß das Allergen anschließender Waschverfahren abgegeben werden von dem unlöslichen Polymer nicht weggewaschen kann. Beispiele für solche Polymere sind Misch- 45 werden kann.It is particularly beneficial to choose polymers, ^ j_j
that have a three-dimensional network structure that
held together by bonds of a covalent character. Such polymers, although swellable 40 The bridge between the allergen and the polymer in water or aqueous media, are completely insoluble; their structure need not be known, so that nothing of the polymeric material or and can have different characters; the bridge to the substances that are bound to it, while only has to serve the purpose that the allergen can not be washed away by the insoluble polymer in subsequent washing processes. Examples of such polymers are blending 45 can be.

polymerisate, die man durch Vernetzen von Sub- Das erfindungsgemäße neue Verfahren beruht auf stanzen mit einer größeren Anzahl von Hydroxyl- der Beobachtung, daß Reagin-Ig sowohl an ein Allergruppen, wie Kohlehydrate und Zuckeralkohole, gen, gegen welches es spezifisch gerichtet ist, als auch 7. B. Dextran, Stärke, Dextrine ixter andere Poly- an Antikörper, die allgemein gegen Reagin-Ig gesaccharide sowie Vinylalkohol mit einer bifunktionel- 50 richtet sind, gebunden werden kann. Solche Antilen Substanz, beispielsweise einer bifunktionellen körper sind wenigstens zweiwertig, d. h., sie können Substanz vom Typ X- R —Z erhält, wobei im an wenigstens 2 Moleküle Reagin-lg gebunden werden, letztgenannten Fall X und Z Halogen oder Epoxy- Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, wie gruppen und R den Rest der bifunktionellen Substanz, auch Reagin-Ig selbst, können mit Atomen oder z. B. einen aliphatischen Rest mit 3 bis 10 Kohlen- 55 Gruppen, die eine Strahlung hervorrufen, markiert Stoffatomen, bedeutet. werden, z. B. mit radioaktiven Isotopen oder fluores-The novel process according to the invention is based on punching with a greater number of hydroxyls, the observation that Reagin-Ig to aller groups, such as carbohydrates and sugar alcohols, against which it is specifically directed also 7. B. dextran, starch, dextrins ixter other poly- can be bound to antibodies that are generally directed against reagent-Ig saccharides and vinyl alcohol with a bifunctional 50. Such antile substances, for example a bifunctional body, are at least bivalent, ie they can contain substances of the X-R -Z type, in which case reagents are bound to at least 2 molecules, the latter case X and Z halogen or epoxy antibodies, which are directed against Reagin-Ig, such as groups and R the rest of the bifunctional substance, including Reagin-Ig itself, can with atoms or z. B. an aliphatic radical with 3 to 10 carbon groups, which cause radiation, marked atoms of matter, means. be e.g. B. with radioactive isotopes or fluorescent

Für die Zwecke der Erfindung kann beispielsweise zierenden Gruppen.For the purposes of the invention, for example, ornamental groups.

ein durch Glyzerin-Ätherbrücken vernetztes Dextran, Im Vergleich zu bekannten Methoden zur Durchweiches durch Behandlung von Dextran mit Epichlor- führung von Hauttests und Provozierungstests weist hydrin gewonnen wird, verwendet werden. Das Pro- 60 das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil auf, daß dukt kann beispielsweise in Form kleiner Körner die Anwesenheit und auch die Menge von Reagin-Ig, verwendet werden. Dieses und in ähnlicher Weise welches befähigt ist, mit einer bestimmten Art eines gewonnene Produkte sind in Wasser quellbar, jedoch Allergens oder einer bestimmten Gruppe von Alierunlösliche Gele, und können in Teilchenform her- genen, z. B. Tier- oder Pflanzenallergenen, zu reagieren, gestellt werden. Sie enthalten Hydroxylgruppen, so 65 in vitro in einer Blutprobe des Patienten bestimmt daß sie leicht mit anderen Gruppen substituie:t werden kann, und zwar mit Hilfe einer sehr empfindwerden können, z. B. mit Gruppen, die Aminogruppen liehen und einfachen Methode, die für den Patienten oder Carboxylgruppen enthalten; diese Gruppen vollkommen sicher ist. Es ist wesentlich für das Ver-a dextran cross-linked by glycerine-ether bridges, compared to known methods for soaking by treating dextran with epichlor- guiding skin tests and provocation tests hydrin is obtained. The advantage of the method according to the invention is that For example, in the form of small grains, the presence and also the amount of Reagin-Ig, be used. This and similarly which one is able to work with a certain type of one The products obtained are swellable in water, but they are allergens or a certain group of aluminum insolubles Gels, and can be produced in particulate form, e.g. B. animal or plant allergens to react, be asked. They contain hydroxyl groups, so 65 determined in vitro in a patient's blood sample that it can easily be substituted with other groups, with the help of a very sensitive can e.g. B. with groups that borrowed amino groups and simple method for the patient or contain carboxyl groups; these groups is perfectly safe. It is essential for the

fahren, daß das Testallergen, gegen welches das zu bestimmende Reagin-lg gerichtet ist. sehr fest an das wasserunlösliche Trägermaterial gebunden ist. Das Reagin-Ig, welches mit dem Allergen reagiert hat, kann dann leicht von den nicht-Allergen-gebundencn Immunoglobulinen abgetrennt werden. Während der weiteren Stufe des Verfahrens lassen sich die Antikörper und das Reagin-lg, die nicht an das Polymer gebunden worden sind, außerdem sehr leicht von denen abtrennen, die an das Polymer gebunden worden sinddrive that the test allergen against which the to determinant Reagin-Ig is directed. very firmly attached to that water-insoluble carrier material is bound. The Reagin-Ig, which reacted with the allergen, can then be easily removed from the non-allergen-bound Immunoglobulins are separated. During the further stage of the process, the antibodies can and the Reagin-Ig, which have not been bound to the polymer, also very easily from separate those that have been bound to the polymer

Das Polymer mit den daran befindlichen Substanzen kann sehr leicht von der Flüssigkeit abgetrennt werden. Die Abtrennung ist unempfindlich gegen Veränderungen des Salz- und Proteingehai'cs der Flüssigkeit innerhalb der physiologischen Grenzen. Das vollständige Bestimmungsverfahren einschließlich der Abtrennung der freien, markierten Antikörper und des Reagin-Ig bzw. der Polymer-gebundenen markierten Antikörper und des Reagin-Ig kann beispielsweise in demselben Reagenzrohr ohne Zugabe von Fällungsmitteln u. ä. durchgeführt werden. The polymer with the substances on it can very easily be separated from the liquid. The separation is insensitive to changes in the salt and protein content of the liquid within physiological limits. The complete determination procedure including the separation the free, labeled antibodies and the Reagin-Ig or the polymer-bound labeled ones Antibodies and the Reagin-Ig can, for example, be carried out in the same reagent tube without the addition of precipitants and the like.

Für das erfindungsgemäße Verfahren werden isoliertes Reagin-Ig sowie dagegenwirkende Antikörper benötigt.For the method according to the invention, isolated reagin-Ig and antibodies acting against it are used needed.

Reagin-lg kann aus dem Serum allergischer Patienten sowie in seltenen Fällen aus dem Serum von Patienten, die Reagin-Ig-bildende Tumoren im Gewebe aufweisen, gewonnen werden. Reagin-lg kann mit den verschiedenen Methoden zur Abtrennung von Proteinen gereinigt werden, z. B. durch Gelfiltration, Ionenaustauscher-Chromatographie und
Elektrophorese. Ähnlich wie andere Immunoglobuline kann Reagin-Ig chemisch oder enzymatisch in ein Antigen-bindendes Fragment und ein Fragment, welches die 1 rägersubstanz für die klassenspezifisch bestimmenden Gruppen ist, gespalten werden.Reagin-Ig can be obtained from the serum of allergic patients and, in rare cases, from the serum of patients who have reagin-Ig-forming tumors in the tissue. Reagin-Ig can be purified using various methods for separating proteins, e.g. B. by gel filtration, ion exchange chromatography and
Electrophoresis. Similar to other immunoglobulins, Reagin-Ig can be cleaved chemically or enzymatically into an antigen-binding fragment and a fragment which is the carrier substance for the class-specific determining groups.

Antikörper gegen Reagin-Ig können nach bekannten Methoden zur Immunisierung von Versuchstieren hergestellt werden, z. B. durch wiederholte subkutane Injektionen kleiner Mengen von Antigenen in Mischung mit einem geeigneten Zusatzmittel, z. B. Freundscher Mineralölsuspension. Die Antikörper, die von dem Tier, z. B. einem Kaninchen, gebildet werden, können aus dem Blutserum des Tieres gewonnen werden.Antibodies against Reagin-Ig can be used for the immunization of test animals by known methods be produced, e.g. B. by repeated subcutaneous injections of small amounts of antigens mixed with a suitable additive, e.g. B. Freund's mineral oil suspension. The antibodies that of the animal, e.g. B. a rabbit, can be obtained from the blood serum of the animal will.

Spezifische Antikörper, das sind Antikörper, die gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen des Reagin-Ig gerichtet sind, können erhalten werden, indem man die Immunisierung mit den aus den Reagin-Ig-Molekülen abgespalteten Fragmenten, die die bestimmenden Gruppen enthalten, vornimmt oder indem man die spezifischen Antikörper aus einer Mischung von Antikörpern isoliert, die durch Immunisieren mit nativem Reagin-Ig gewonnen worden sind.Specific antibodies, that is, antibodies against the class-specific determining groups of the Reagin-Ig can be obtained by immunizing with the from the Reagin-Ig molecules split-off fragments that contain the determining groups or by the specific antibodies are isolated from a mixture of antibodies that are immunized with native reagin-Ig have been obtained.

Spezifische Antikörper die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, können gegebenenfalls aus dem Antiserum auch durch übliche immunosorbierende Techniken isoliert werden; beispielsweise kann Reagin-Ig mit Bromacetylcellulose gekuppelt werden, worauf die Antikörper, die an das gekuppelte Reagin-Ig gebunden sind, durch Erniedrigung des pH-Wertes freigesetzt werden.Specific antibodies directed against Reagin-Ig can optionally also be obtained from the antiserum by customary immunosorbing techniques to be isolated; for example, Reagin-Ig can be coupled with bromoacetyl cellulose, whereupon the Antibodies bound to the coupled Reagin-Ig are released by lowering the pH will.

Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, spezifische Antikörper gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen in dem Reagin-Ig zu verwenden, damit eine besonders hohe Sicherheit und Genauigkeit während der Versuche erreicht werden.In some cases it is beneficial to use specific antibodies to use against the class-specific determining groups in the Reagin-Ig so that a particularly high security and accuracy can be achieved during the tests.

Die Markierung von Reagin-Ig und Antikörpern gegen Rcagin-lg mit radioaktiven Isotopen kann in üblicher Weise vorgenommen werden, wobei ein für diese Zwecke geeignetes Isotop z. B. aus ¹²M besteht (Methode nach Munter und Greenwood). Auch die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z, B. mit einem Fluorcszeinderivat, wie Fluoreszeinisothiocyanat. The labeling of Reagin-Ig and antibodies against Rcagin-Ig with radioactive isotopes can be carried out in the usual way, with an isotope suitable for this purpose, for. B. consists of ¹² sts (Munter and Greenwood method). Labeling with a fluorescent group can also be carried out in a customary manner, for example with a fluorocin derivative such as fluorescein isothiocyanate.

ίο Allergenhaltige Extrakte, z. B. von Hunde- oder Pferdeepithel, Timothy-Gras- oder Birkenpollen, sind im Handel erhältlich.ίο extracts containing allergens, e.g. B. of dogs or Horse epithelium, timothy grass or birch pollen, are commercially available.

Die Bestimmung der Radioaktivität kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von Leuchtdetektoren. Auch die Fluoreszens kann in üblicher Weise gemessen werden.The determination of the radioactivity can be carried out in the usual way, e.g. B. with the help of Light detectors. The fluorescence can also be measured in the usual way.

Die Menge an Polymer, an welches Allergen gebunden ist, wird unter anderem im Hinblick auf die Empfindlichkeit, die während des Tests erforderlich ist, ausgewählt. Die Menge an Antikörpern gegen das Reagin-lg, das der Reaktion zugesetzt wird, wird beispielsweise so ausgewählt, daß ein Überschuß im Hinblick auf die Zahl der Haftstellen für diese Antikörper an den an die Polymeren gebundenen Substanzen vorhanden ist, nachdem die Allergene vollständig mit Reagin-Ig gesättigt worden sind. In entsprechender Weise wird die Menge an markierten Antikörpern mit markiertem Reagin-lg so ausgewählt, daß ein Überschuß mit Bezug auf die maximale Zahl der Haftstellen an den an das Polymer gebundenen Substanzen vorhanden ist.The amount of polymer to which allergen is bound is, among other things, with regard to the Sensitivity required during the test is selected. The amount of antibodies against that Reagin-Ig, which is added to the reaction, is selected, for example, so that an excess in With regard to the number of points of attachment for these antibodies on the substances bound to the polymers is present after the allergens are fully saturated with Reagin-Ig. In corresponding The amount of labeled antibodies with labeled Reagin-Ig is selected in such a way that that an excess with respect to the maximum number of traps on those bound to the polymer Substances is present.

Erfindungsgemäß kann das Testallergen ein einzelnes Allergen oder eine Mischung aus zwei oder mehr Allergenen sein. Im letzteren Fall bringt das Verfahren den Vorteil mit sich, daß während der Untersuchung ein schnelles »ja« oder »nein« auf die Frage möglich ist, ob eine Überempfindlichkeil gegen ein oder mehrere Allergene in einer großen Gruppe von Allergenen existiert. Ist die Antwort »ja», so müssen weitere Bestimmungen durchgeführt werden. um festzustellen, gegen welche Allergcnc die Überempfindlichkeit des Patienten in der großen Gruppe gerichtet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur quantitativen Bestimmung von Reagin-lg dienen. Für diesen Zweck wird eine serielle Verdünnung des Testserums analysiert: das Ergebnis ergibt sich durch Vergleich mit der Wirkung einer Standardlösung, die in analoger Weise analysiert worden ist.According to the invention, the test allergen can be a single allergen or a mixture of two or more allergens. In the latter case, the method has the advantage that during the examination a quick "yes" or "no" is possible in response to the question of whether a hypersensitivity wedge to one or more allergens in a large group of allergens exists. If the answer is "yes", further determinations must be carried out. to determine which allergy the patient is hypersensitive to in the large group.
The method according to the invention can also be used for the quantitative determination of Reagin-Ig. For this purpose, a serial dilution of the test serum is analyzed: the result is obtained by comparison with the effect of a standard solution which has been analyzed in an analogous manner.

Zum Gegenstand der Erfindung gehören auch die Mittel zur Bestimmung von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Testproben. Diese Hilfsmittel umfassen ein erstes Reagenz, welches aus einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein Testallergen gebunden ist, besteht, ein zweites Reagenz, welches aus Antikörpern gegen Reagin-Ig: besteht und gegebenenfalls ein drittes Reagenz, welches aus Reagin-Ig besteht, wobei — \venn das dritte Reagenz nicht anwesend ist — die Antikörper gegen das Reagin-Ig durch Markierung zur Aussendung einer Strahlung befähigt sind 'der das Reagin-Ig des dritten Reagenzes durch Markierung zur Aussendung einer Strahlung befähigt ist. wobei weiterhin das erste Reagenz dazu dient, in vitro aus einer Reagin-Ig enthaltenden wäßrigen Testprobe das Reagin-Ig an das an das unlöbliche Polymer gebundene Testallergen zu binden und das zweite Reagenz, gegebenenfalls zusammen mit dem dritten Reagenz,The subject matter of the invention also includes the means for determining against certain allergens directed reagin immunoglobulins (Reagin-Ig) in aqueous test samples. These tools include a first reagent, which consists of a water-insoluble polymer to which a test allergen is bound, consists, a second reagent, which consists of antibodies against Reagin-Ig: and possibly a third Reagent, which consists of Reagin-Ig, where - \ venn the third reagent is not present - the antibodies against the Reagin-Ig by marking Emission of radiation are capable of the Reagin-Ig of the third reagent by marking is capable of emitting radiation. wherein furthermore the first reagent is used in vitro of an aqueous test sample containing reagin-Ig, the reagin-Ig to that bound to the unrecognizable polymer To bind test allergen and the second reagent, optionally together with the third reagent,

609 640/342609 640/342

1717th

,.ta,, so dall ^S, .ta ,, so dall ^ S

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oder frisch gcsammc.tcmor fresh gcsammc.tcm

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DiC Zur Durchführung des «r.ndunpgemäBen ,₅ pH - 7 5 gclfc.. Das Mortal würfe noch emrnajw« h,_i hen«i_&e„ Hilfsn*«, .on ^ϊΧϊ¹ΤΑώί^η5Τ:'^<ΪΪΑ DiC To carry out the "r.ndunpgemäBen, ₅ pH - 7 5 gclfc .. Mortal would throw emrnajw" h, _i hen "i _& e" auxiliary * ", .on ^ ϊΧϊ ¹ ΤΑώί ^η 5Τ: '^< ΪΪΑ

läuterung der Erfindung.purification of the invention.

example 1

Bestimmung von Reagin-lg, welches gegen ein Tieralicrgcii (llundccpithel) gerichtet istDetermination of reagin-Ig which is directed against an animal alicrgcii (llundccpithelium)

A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundenem AllergenA. Manufacture of particles with chemically bound allergen

Feine Teilchen eines Mischpolymeren aus Dextran und Epichlorhydrin wurden als Ausgangsmalerial benutzt: das Dextran war mit Glvcerin-Ätherbrücken vernetzt (Teilchengröße 1 bis H) Mikron). Dieses Mischpolymerisat ist in Wasser unlöslich, aber qucllbar; die Substanz absorbiert etwa 2.5 g Wasser pro Gramm trockner Substanz. Das Ausgangsmaterial wurde zunächst mit Cyanogenbromid in alkalischer Lösung aktiviert, worauf die Teilchen des aktivierten Mischpolymerisate!) gewaschen wurden. Ein handelsüblicher Allergenextrakt von Hundeepithel wurde zu der wäßrigen Suspension der Teilchen gegeben, so daß der Extrakt 0,2 mg pro Milliliter im Verhältnis von 1 ml Allergenextrakt auf 100 mg aktiviertes Polymer enthielt. Das Allergen wurde dann chemisch an das aktivierte Mischpolymerisat gebunden. Im Anschluß an die Umsetzung wurden die Mischpolymerleilchen mit dem daran gebundenen Allergen abzentri-. und zweimal mit 0,5 m NaHCC)₃, 0,1 m Acetat-0.1 m Trispuffer mit 1 "„ Schweineserum-Die Teilchen wurden homogeni-Trispuffer mit 1 Schweineserumalbumin suspendiert.Fine particles of a mixed polymer of dextran and epichlorohydrin were used as the starting material: the dextran was cross-linked with glycerol-ether bridges (particle size 1 to H) microns). This copolymer is insoluble in water, but swellable; the substance absorbs about 2.5 g of water per gram of dry substance. The starting material was first activated with cyanogen bromide in an alkaline solution, after which the particles of the activated copolymer!) Were washed. A commercially available allergen extract from dog epithelium was added to the aqueous suspension of the particles so that the extract contained 0.2 mg per milliliter in the ratio of 1 ml of allergen extract to 100 mg of activated polymer. The allergen was then chemically bound to the activated copolymer. Following the implementation, the mixed polymer particles with the allergen bound to them were centrifuged off. and twice with 0.5 M NaHCC) ₃ , 0.1 M acetate-0.1 M Tris buffer with 1 "" Pig serum - The particles were suspended homogeni-Tris buffer with 1 pig serum albumin.

B. Herstellung von Reagin-lgB. Manufacture of Reagin-Ig

Reagin-lg wurde aus dem Serum gewonnen, welches einem"Mveloma-Patienten entnommen worden war.Reagin-Ig was obtained from the serum taken from a "Mveloma patient".

i-,< R₁-IPiIi leTvo'rzuöswe'ise) in cetrockneler, und mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gef IMjfophS K? F enS, sow ic gegebenen- bracht. Das Eluieren des Materials wurde mit Tr,-falfs cmEr Ampulle, welche markiertes Reagin-lg, HCI, dessen Stärke allmählich von 0.1 auf Im ^ in eetrockneter ζ B. lyophilisierter ₂₅ nahm, bei konstantem pH-Wert von 8,0 bei -U L \.nthält bestehen für den Fall, daß die letzt- durchgeführt. Die Fraktionen, die das Reagm-Ig i -, < R ₁ -IPiIi leTvo'rzuöswe'ise) in cetrockneler, and equilibrated with the same buffer IMjfophS K? F enS, as well as given. The elution of the material was carried out with Tr, -falfs cmEr ampoule, which labeled Reagin-Ig, HCl, the strength of which gradually took from 0.1 to Im ^ in dried ζ B. lyophilized ₂₅ , at a constant pH of 8.0 at -UL \ .contains exist in the event that the latter is carried out. The fractions containing the Reagm-Ig

' sind die enthielten, wurden aufgefangen,'are they contained, were caught,

eine Kolonne (Größe 3,2 ·; 95 ....,a column (size 3.2; 95 ....,

weiteren Er- Glycerin-Ätherbrücken quervernetztem Dextran mit 30 einem Perldurchmesser von 40 bis 120 μ und einer Wasseraufnahme von etwa 15 ml Wasser pro Gramm trockener Substanz aufeebracht, die mit 0,1 m Tns-HCl — 0,2 m NaCl — 0,002 m EDTA Na₂ — pH 7.7 — ins Gleichgewicht gebracht worden war 35 und 0.02",, Natriumazid" enthielt. Man ließ das Material die Kolonne dreimal passieren (Rücklaufchromatographiertechnik). Fraktionen, welche das Reaginlg enthielten, wurden aufgefangen und durch UH raliltration bei 4'C konzentriert (Visking-Rohre 8 32 ). 40 Das auf diese Weise hergestellte Reagin-lg war mit weniger als 0,1 "/„ an Gesamtprotein von anderen Immunoglobulinen (IgA, IgD, IgG und IgM) verunreinigt. Das gereinigte Reagin-lg gab bei der Elektrophorese bei pH 8,6 einen einzelnen Peak, 45 1 - 0.05, welcher im /3-y-Bereich wanderte. Untersuchungen bei der Ultrazentrifugation zeigten das Vorliegen einer einzigen Grenzschicht; die Sedimentationskonstante, Si',, „■ wurde mit 8,20 S berechnet. Das Molekulargewicht des Reagin-lg wurde 50 mit 200 000 ± 5000 berechnet, wobei man ein partielles spezifisches Volumen von 0,713 cm³/g benutzte, das auf der Basis der Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung des Reagin-lg bestimmt worden war. Die Diffusionskonstante, £>ä,. «· wurde mit 55 3,71 .· 10-⁷cm-²/Sek. berechnet.further Er-glycerin-ether bridges cross-linked dextran with a pearl diameter of 40 to 120 μ and a water absorption of about 15 ml of water per gram of dry substance, which with 0.1 M Tns-HCl - 0.2 M NaCl - 0.002 M EDTA Na ₂ - pH 7.7 - had been equilibrated to 35 and contained 0.02 "" Sodium Azide ". The material was passed through the column three times (reflux chromatography technique). Fractions which contained the reagent were collected and concentrated by UH raliltration at 4'C (Visking tubes 8-32). The reagin-Ig produced in this way was contaminated with less than 0.1 "/" of total protein from other immunoglobulins (IgA, IgD, IgG and IgM). The purified reagin-Ig gave on electrophoresis at pH 8.6 single peak, 45 1 - 0.05, which migrated in the / 3-y region. Investigations during ultracentrifugation showed the presence of a single boundary layer; the sedimentation constant, Si ',, "■ was calculated to be 8.20 S. The molecular weight of the reagin -Ig 50 was calculated to be 200,000 ± 5000 using a partial specific volume of 0.713 cm ³ / g, which was determined on the basis of the amino acid and carbohydrate composition of the reagin-Ig. "· was charged 55 3.71. · 10 ^-7 cm ² / sec..

Reduktionsversuche zeigten, daß das Reagin-lg aus zwei Arten von Polypeptidketten besteht, so dall es anderen Serum-Immunoglobulinen entspricht. Die Anwesenheit von zwei leichten Polypeptidketten mit einem Molekulargewicht von 22 600 konnte in dem Reaein-lg erwiesen werden. Das Molekulargewicht der ~schweren Polypeptidketten. einschließlich der prosthetischen Kohlehydratgruppe(n) wurde mit etwa 77 400 berechnet, wobei ein Molverhältnis von 1:1 für die schweren und leichten Polypeptidketten in nativem Reagin-lg angenommen wurde. Die Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung ist in der Tabelle aneeeehen. Reduction experiments showed that the Reagin-Ig consists of two types of polypeptide chains, so that it corresponds to other serum immunoglobulins. the Presence of two polypeptide light chains with a molecular weight of 22,600 could be found in the Reaein-lg be proven. The molecular weight of the ~ heavy polypeptide chains. including the Prosthetic carbohydrate group (s) was calculated to be approximately 77,400, with a 1: 1 molar ratio was assumed for the heavy and light polypeptide chains in native Reagin-Ig. The amino acid and carbohydrate composition is shown in the table.

_hi,_hi,_{n {}; _hi , _hi , _{n {} ;

1111th

Aminosäure- und Kohlchydrutzusammcnsctzung von Reagin-IgAmino Acid and Carbohydrate Composition of Reagin-Ig

Aminosäureamino acid

Aminosäurcrcsl, Gramm pm 100 g ProteinAmino Acid Crcsl, grams pm 100 g protein

TryptophanTryptophan

LysinLysine

HistidinHistidine

Amid-NAmide-N

ArgininArginine

AsparaginsäureAspartic acid

ThreoninThreonine

GlutaminsäureGlutamic acid

ProlinProline

GlycinGlycine

AlaninAlanine

Halb-cystinHalf-cystine

ValinValine

MethioninMethionine

IsoleucinIsoleucine

LeucinLeucine

TyrosinTyrosine

PhenylalaninPhenylalanine

3,67 4,20 2,16 1,34 5,63 6,73 9,01 8,52 8,93 5,24 3,13 3,92 2,15 5,59 1,17 2,29 6,08 4,63 3,91 88,293.67 4.20 2.16 1.34 5.63 6.73 9.01 8.52 8.93 5.24 3.13 3.92 2.15 5.59 1.17 2.29 6.08 4.63 3.91 88.29

KohlehydratCarbohydrate

Kohlehydratrcst, Gramm pro 100 g ProteinCarbohydrate residue, grams per 100 g protein

N-Acetyl-glucosamin 4,60N-acetyl-glucosamine 4.60

Hexose (Galaktose -f Mannose) 5,34 L-Fucose 0,51 Hexose (galactose -f mannose) 5.34 L-fucose 0.51

N-Acetyl-neuraminsäure 1,26N-acetyl neuraminic acid 1.26

11,7111.71

C. Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-IgC. Production of antibodies to Reagin-Ig

Kaninchen wurden intramuskulär mit einer Mischung aus 0,5 mg Reagin-Ig in 0,2 ml 0,15 m Natriumchloridlösung und 0,8 ml vollständiger Freundscher Zusatzlösung injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und dann jede Woche 3 Wochen lang wiederholt. Nachdem weitere 10Tage vergangen waren, wurde den Kaninchen Blut entnommen, aus welchem das Antiserum durch Koagulieren und Entfernung des Koagulates gewonnen wurde. Rabbits were injected intramuscularly with a mixture of 0.5 mg Reagin-Ig in 0.2 ml 0.15 M sodium chloride solution and 0.8 ml complete Freund's additive solution. The immunization was repeated after 14 days and then every week for 3 weeks. After a further 10 days had passed, blood was taken from the rabbits, from which the antiserum was obtained by coagulating and removing the coagulate.

Das Antiserum wurde durch Adsorption während einer Stunde bei 37°C und 16 Stunden bei 4 C spezifisch gemacht. Nach dem Abzentrifugiercn wurde die Spezifität des Antiserums durch Immunoelektrophorese gegen normales Menschenserum u.id durch Ochterlony-Geldiffusionsanalyse gegen reine Immunoglobuline A, G und M, sogenannte leichte PoIypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteine getestet; dabei konnte die Spezifität gegen Reagin-Ig festgestellt werden. Das Antiserum wurde als Antikörpermaterial für das Bestimmungsverfahren verwendet.The antiserum was made specific by adsorption for one hour at 37 ° C and 16 hours at 4 ° C. After centrifugation, the Specificity of the antiserum by immunoelectrophoresis against normal human serum and id Ochterlony gel diffusion analysis against pure immunoglobulins A, G and M, so-called light polypeptide chains from normal immunoglobulin G and Bence Jones proteins tested; the specificity against Reagin-Ig could be determined. The antiserum was used as an antibody material for the determination procedure.

D. Herstellung von markiertem Rcagin-lg D. Preparation of Labeled Rcagin-Ig

Reagin-Ig wurde mit ¹²⁵J nach der Methode von H u η t e r und G r e e η w ο ο d, »Nature« 144 (1962), S. 495, markiert.Reagin-Ig was ^{labeled with 125} I according to the method of H u η ter and G ree η wοο d, "Nature" 144 (1962), p. 495.

Ii. BestimmungsverfahrenIi. Determination procedure

Die Analysen wurden in Glas- oder Plastikreagenzgläscrn mit einer Größe von 50 - 10 mm durchgeführt. The analyzes were carried out in glass or plastic test tubes with a size of 50-10 mm.

1. 0,5 ml einer Suspension aus Teilchen mit chemisch gebundenem Allergen, die gemäß A (vgl. weiter vorn) erhalten worden waren, wurden in jeweils zwei Reagenzgläser eingefüllt; die Suspension1. 0.5 ml of a suspension of particles with chemically bound allergen, which had been obtained according to A (see above), were filled into two test tubes each; the suspension

enthielt 1 mg Partikeln pro Milliliter. contained 1 mg of particles per milliliter.

2. 0,05 ml des zu untersuchenden Serums eines Patienten wurde in eines der beiden Reagenzgläser gegeben2. 0.05 ml of a patient's serum to be examined was placed in one of the two test tubes

3. 0,05 ml Kontrollscrum aus einer nicht allergischen Herkunftsstelle wurden in das zweite Reagenzglas eingefüllt.3. 0.05 ml control scrum from a non-allergic site of origin was added to the second Test tube filled.

4. Der Inhalt dieser Reagenzgläser wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser langsam in senkrechter Ebene rotiert4. The contents of these test tubes were 20 hours incubated at room temperature, the test tubes slowly rotating in a vertical plane

wurden.became.

5. Die Teilchen wurden dann bei 3000 UpM 1 Minute lang abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.5. The particles were then spun down at 3000 rpm for 1 minute after which the supernatant was removed.

Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Trispuffer (pH 7,4), welches 1 Gewichtsprozent Schweinesr-rumalbumin enthielt, gewaschen, worauf die Suspension wiederum abzentrifugiert wurde und die überstehende Flüssigkeit nach jedem Waschvorgang abgesaugt wurde. Bei dem Absaugen wurde jeweils sichergestellt, daß feste Teilchen nicht mitgerissen wurden.
0,1 ml des Antiserums, das gemäß C (vgi. weiter vorn) erhalten worden war, wurde in jedes Reagenzglas gegeben.The particles were washed three times with 0.1 M Tris buffer (pH 7.4) containing 1 percent by weight of porcine rum albumin, whereupon the suspension was centrifuged off again and the supernatant liquid was suctioned off after each washing process. During the suction process , it was ensured in each case that solid particles were not entrained.
0.1 ml of the antiserum which had been obtained according to C (see above) was added to each test tube.

Der Inhalt der Reagenzgläser wurde wie bei Stufe 4 inkubiert.The contents of the test tubes were incubated as in step 4.

Die Teilchen wurden wie bei Stufe 5 abzentrifugiert. The particles were centrifuged off as in step 5.

Die Teilchen wurden wie bei Stufe 6 gewaschen. 0.1 ml einer Lösung, welche ^l:5J-Reagine gemäß D (vgl. weiter vorn) enthielt, wurde in die Reagenzgläser gegeben.The particles were washed as in step 6. 0.1 ml of a solution which contained ^{1: 5} J-Reagine according to D (see above) was placed in the test tubes.

Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden wie bei Stufe 4 inkubiert. The test tubes with the contents were incubated as in step 4.

Die Teilchen wurden wie bei Stufe 5 abzentrifugiert.The particles were centrifuged off as in step 5.

Die Teilchen wurden wie bei Stufe 6 gewaschen. Die Reagenzgläser wurden vor einen Schirmbilddetektor gesetzt, damit die Gammastrahlung gemessen werden konnte.The particles were washed as in step 6. The test tubes were placed in front of a screen detector, so that the gamma radiation could be measured.

Zur Auswertung wurde die Intensität der Strahlung des einen Reagenzglases mit der Intensität der Strahlung des anderen Reagenzglases, welches das Kontroll-For the evaluation, the intensity of the radiation from one test tube was compared with the intensity of the radiation from the other test tube, which is the control serum eines nicht allergischen Patienten enthielt, verglichen. Es ist auch möglich, im Anschluß an das Zentrifugieren gemäß Stufe 13 eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen zu überführen, worauf die Gammastrahlungserum from a non-allergic patient. It is also possible, following the Centrifugation according to step 13 to transfer a certain volume of the supernatant liquid into counting tubes, whereupon the gamma radiation des ¹²⁵J-Reagins frei in der Lösung bestimmt werden kann.of the ¹²⁵ I-reagent can be determined freely in the solution.

Zur quantitativen Bestimmung können 0,05 ml Testserum in verschiedenen Stadien der VerdünnungFor quantitative determination, 0.05 ml test serum can be used in various stages of dilution

8.
9.8th.
9.

10.
11.10.
11th

12.
13.12th
13th

14. 15.14th 15th

1717th

in Stufe 2 jedem einer Reihe von Reagenzgläsern zugesetzt weiden. Eine Reihe von Reagenzgläsern wurde in derselben Weise mit unterschiedlichen Verdünnungen eines Standardserums versetzt. Die Aktivität kann dann im Vergleich zu der des Standardserums ausgedrückt werden.in stage 2 added to each of a number of test tubes. Different dilutions of a standard serum were added to a number of test tubes in the same way. The activity can then be expressed in comparison to that of the standard serum.

Example 2

Bestimmung von Rcagin-Ig, welches gegen ein
Pfliinzcnallcrgcn (Birkenpullcn) gerichtet istDetermination of Rcagin-Ig, which against a
Pfliinzcnallcrgcn (Birkenpullcn) is directed

Keine Teilchen eines mit Glycerin-Älhcrbrücken vernetzten Dextrans, welches nach der Methode von R. A χ e η und J. Porath, Acta Chem. Scand., IS (1964), S. 2193, mit Isothiocyanatophcnoxyhydroxypropylgruppcn substituiert war, wurden als Ausgangsrnalerial verwendet. Zu einer Suspension von 100 mg dieser Teilchen in einer wäßrigen Natriumbicarbonatlösung gab man 100 ml eines handelsüblichen Allcrgcnextraktes, der etwa dieselbe Konzentration aufwies wie die Allcrgenlösung im Beispiel 1. Die Mischung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur inkubiert und dabei langsam in vertikaler Ebene rotiert. Die Teilchen wurden dann zentrifugiert und zweimal mit je 0,5 m NaHCO₃, 0,1 m AcetatpufTer, 0,1 m Trispuffcr mit 1 "„ Sehweineserumalbumin gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in 0,1 m Trispuffer mit 1",, Sehweineserumalbumin suspendiert.No particles of a dextran crosslinked with glycerol-ether bridges, which was substituted with isothiocyanatophynoxyhydroxypropyl groups according to the method of R. A e η and J. Porath, Acta Chem. Scand., IS (1964), p. 2193, were used as the starting point . To a suspension of 100 mg of these particles in an aqueous sodium bicarbonate solution was added 100 ml of a commercial universal extract, which had about the same concentration as the allergen solution in Example 1. The mixture was incubated for 3 days at room temperature and slowly rotated in a vertical plane. The particles were then centrifuged and washed twice each with 0.5 M NaHCO ₃ , 0.1 M acetate buffer, 0.1 M Tris buffer with 1 "" wine serum albumin. The particles were homogenized and placed in 0.1 M Tris buffer with 1 "" Wine serum albumin suspended.

B. Isolierung von Fragmenten des Reagin-lg, welche klassenspezifische bestimmende Gruppen enthaltenB. Isolation of fragments of Reagin-Ig which contain class-specific determining groups

(sogenannte Fc-Fragmcnte)(so-called Fc fragments)

100 mg Reagin-lg, welches gemäß Beispiel 1 B hergestellt worden war, in 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7.0) mit 0,1 rn Cystein wurden bei 37° C 4 Stunden mit 1 mg Papain inkubiert, worauf die Reaktion durch Zugabe von Jodacetamidlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,05 m unterbrochen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltration fraktioniert, wobei ein Mischpolymerisat aus Dextran und Epichlorhydrin verwendet wurde; die Wasserrückgewinnung lag bei 15 g pro Gramm feste Substanz, und die Eluierung des Gelbettes wurde mit 0.1 m Tris-HCl, 0,2 m NaCl-Puffer (pH 7,7) durchgeführt. Die Fraktionen, welche das Fc-Fragment enthielten, wurden für Immunisierungszwecke aufgefangen. 100 mg Reagin-Ig, which had been prepared according to Example 1B, in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) with 0.1 m cysteine were at 37 ° C for 4 hours incubated with 1 mg papain, followed by the reaction by adding iodoacetamide solution up to a Final concentration of 0.05 m was interrupted. The reaction mixture was filtered through gel fractionated using a copolymer of dextran and epichlorohydrin; the water recovery was 15 g per gram of solid substance, and the elution of the gel bed was with 0.1 M Tris-HCl, 0.2 M NaCl buffer (pH 7.7) carried out. The fractions containing the Fc fragment were collected for immunization purposes.

C. Herstellung von Antikörpern gegen das Fc-Fragment des Reagin-lg C. Production of antibodies against the Fc fragment of Reagin-Ig

Antiserum gegen das wie vorstehend angegeben gemäß B gewonnene Fc-Fragment des Reagin-lg wurde in einer der Gewinnung von Antiserum gegen Reagin-lg gemäß Beispiel 1 C entsprechenden Weise gewonnen. Antikörper gegen das Fc-Fragment wurden aus diesem Antiserum isoliert, welches in einer der Arbeitsweise von Beispiel 1 C entsprechenden Weise wie folgt absorbiert worden war: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-lg wurden mit 34 ml einer Lösung vermischt, die etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt, die aus dem Antiserum durch Ionenaustauscherchromatographie isoliert worden war. Die gewonnene Suspension wurde bei pH 7 und 4° C 2 Stunden aktiviert und anschließend mit 20 000 χ g 20 Minuten bei 10⁰C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit 0,15 m NaCI — 8m Harnstoff (pH 6 bis 7) gewaschen, anschließend wurde wieder zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde so lange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit frei von Protein war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9 ml 0,1 m Glycin-HCI-Puffer (pH 3,1) gegeben und unter Rühren bei 37^UC 40 Minuten inkubiert. Die ganze Lösung wurde dann zentrifugiert; die überstehende FlüssigkeitAntiserum against the Fc fragment of reagin-Ig obtained as indicated above according to B was obtained in a manner corresponding to the preparation of antiserum against reagin-Ig according to example 1C. Antibodies against the Fc fragment were isolated from this antiserum, which had been absorbed in a manner corresponding to the procedure of Example 1C as follows: 2 g of a complex of bromoacetyl cellulose and Reagin-Ig were mixed with 34 ml of a solution containing about 95% mg of immunoglobulin isolated from the antiserum by ion exchange chromatography. The suspension obtained was activated 7 and 4 ° C for 2 hours at pH, and then with 20,000 χ g for 20 minutes at 10 ⁰ C centrifuged. The supernatant liquid was removed, the cellulose was washed with 0.15 M NaCl-8 M urea (pH 6 to 7), then centrifugation was carried out again, whereupon the supernatant liquid was removed. This washing procedure was repeated until the supernatant was free of protein. The cellulose-protein complex was added to 9 ml of 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.1) and ^{incubated with stirring at 37 °} C. for 40 minutes. The whole solution was then centrifuged; the supernatant liquid

ίο wurde gegen 1200 ml 0,01 m Tris-HCl. 0,1 m NaCl (pH 7,1) bei 4¹C 48 Stunden dialysiert. Diese Lösung enthielt Antikörper in einer Menge von ungefähr mg pro Milliliter, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-lg und damit also auch für das gesamte Reagin-lg spezifisch sind. Dieses Antikörpermaterial reicht zur Durchführung von mehr als 10 Millionen Bestimmungen aus.ίο was against 1200 ml of 0.01 M Tris-HCl. 0.1 m 48 hours dialyzed NaCl (pH 7.1) at 4 C ^1. This solution contained antibodies in an amount of approximately mg per milliliter which are specific against the Fc fragment of Reagin-Ig and thus also for the entire Reagin-Ig. This antibody material is sufficient to carry out more than 10 million determinations.

D. Markierung von Antikörpern, die gegen das
Fe-Fragment des Reagin-ig spezifisch sindD. Labeling of antibodies raised against the
Fe fragment of the reagin-ig are specific

Die Markierung wurde in entsprechender Weise durchgeführt, wie dies im Beispiel 1 für das Reagin-lg beschrieben ist.The labeling was carried out in the same way as in Example 1 for the Reagin-Ig is described.

E. BestimmungsverfahrenE. Determination procedure

1. 0,5 ml einer Suspension gab man in jedes von zwei Reagenzgläsern. Die Suspension enthielt Teilchen mit chemisch gebundenen Pflanzenallergenen und war wie vorstehend unter A beschrieben hergestellt worden; die Suspension enthielt 1 mg Teilchen pro Milliliter.1. 0.5 ml of a suspension was added to each of two test tubes. The suspension contained Particles with chemically bound plant allergens and were as described under A above been made; the suspension contained 1 mg of particles per milliliter.

2. 0,05 ml des zu untersuchenden Serums eines Patienten wurde in eines der Reagenzgläser gegeben.2. 0.05 ml of a patient's serum to be tested was poured into one of the test tubes given.

3. 0,05 ml eines Kontrollserums, welches von einem nicht allergischen Patienten genommen worden war, wurde in das andere Reagenzglas eingeführt.3. 0.05 ml of a control serum taken from a non-allergic patient was inserted into the other test tube.

4. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurden 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser langsam in senkrechter Ebene rotiert wurden.4. The test tubes with the contents were incubated for 5 hours at room temperature, with the Test tubes were rotated slowly in a vertical plane.

5. Die Teilchen wurden 1 Minute bei 3000 UpM abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde.5. The particles were centrifuged for 1 minute at 3000 rpm, followed by the supernatant was removed.

6. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Tri>Puffer (pH 7,4) mit 1 % Sehweineserumalbumin gewaschen. Die überstehende Flüssigkeit wurde6. The particles were washed three times with 0.1 M tri> buffer (pH 7.4) washed with 1% wine serum albumin. The supernatant liquid was

nach jedem Zentrifugieren abgesaugt. Dabei wurde sichergestellt, daß beim Entfernen dei überstehenden Flüssigkeit keine festen Teilchen mitgerissen wurden. aspirated after each centrifugation. It was ensured that no solid particles were entrained when the supernatant liquid was removed.

7. 0,1 ml der wie vorstehend unter C erhaltener Lösung mit Antikörpern gegen das Fc-Fragmenl 7. 0.1 ml of the solution obtained as above under C with antibodies against the Fc fragment

des Reagin-lg, die mit ¹²⁵J markiert worden war wurde in alle Reagenzgläser gegeben.des Reagin-Ig, which ^{had been labeled with 125} J, was added to all test tubes.

8. Die Teilchen wurden 1 Minute bei 3000 UpW abzentrifugiert, worauf die überstehende Flüssig keit entfernt wurde. 8. The particles were centrifuged for 1 minute at 3000 rpm , after which the supernatant liquid was removed.

9. Die Reagenzgläser mit dem Inhalt wurdei 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wöbe die Reagenzgläser in senkrechter Ebene langsan rotiert wurden.9. The test tubes with their contents were incubated for 15 hours at room temperature, wöbe the test tubes were rotated slowly in a vertical plane.

10. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Tris Puffer (pH 7,4) mit 1 Gewichtsprozent Schweine serumalbumin gewaschen, wobei nach jeden Waschvorgang zentrifugiert und die überstehend10. The particles were washed three times with 0.1 M Tris buffer (pH 7.4) with 1 percent by weight pigs Serum albumin washed, centrifuged after each washing process and the supernatant

Flüssigkeit abgesaugt wurde. Es wurde sichergestellt, daß während der Entfernung der überstehenden Flüssigkeit keine festen Teilchen mitgerissen wurden.Liquid has been aspirated. It was ensured that no solid particles are entrained during the removal of the supernatant liquid became.

11. Die Reagenzgläser wurden vor einen Leuchtschirmdetektor gesetzt, so daß die Gammastrahlung gemessen werden konnte.11. The test tubes were placed in front of a fluorescent screen detector so that the gamma radiation could be measured.

Zur Abschätzung der Intensität der Strahlung des ersten Reagenzglases wurde mit der Strahlungsintensität des zweiten Reagenzglases, welches Kontrollserum von einem nicht allergischen Patienten enthielt, verglichen.To estimate the intensity of the radiation from the The first test tube was matched with the radiation intensity of the second test tube, which is the control serum contained in a non-allergic patient.

Es ist auch möglich, nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe 8 eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen zu überführen, worauf die Gammastrahlung der markierten Antikörper gegen das Fc-Fragment frei in der Lösung gemessen werden kann.It is also possible after centrifugation according to Step 8 to transfer a certain volume of the supernatant liquid into counting tubes, whereupon the gamma radiation of the labeled antibodies against the Fc fragment was measured free in the solution can be.

Zur quantitativen Bestimmung können jeweils 0,05 ml Testserum in verschiedenen Verdünnungen in Stufe 2 zugesetzt werden. Eine Anzahl von Reagenzgläsern wurde in derselben Weise mit verschiedenen Verdünnungen eines Standardserums versehen. Die Aktivität kann im Verhältnis zur Aktivität des Standardserums ausgedrückt werden.For quantitative determination, 0.05 ml of test serum can be used in various dilutions can be added in stage 2. A number of test tubes were made in the same manner with different Provide dilutions of a standard serum. The activity can be in relation to the activity of the Standard serums are expressed.

609 640/342609 640/342

Claims

Patent claims:

1. Procedure for determining the presence of reagin immunoglobulins which are active against certain allergens (Reagin-fg) in aqueous test samples, characterized in that one the sample, e.g. B. a body fluid, such as blood serum or blood plasma, in vitro with a water-insoluble polymer to which a Tcslailergen has been bound, brings together, so that a reaction between the test allergen takes place on the polymer and the counteracting reagin-Ig and the reagin on the the insoluble polymer is bound testailergen, whereupon the polymer with the Test allergen and the Reagin- / g either with antibodies specifically directed against Reagin-Ig and with an atom or group capable of emitting radiation have been labeled, or with antibodies that are specifically directed against Reagin-Ig, and Reagin-Ig, which contains an atom or group capable of emitting radiation has been marked, then brings together the insoluble polymer with those attached to it Substances separates from the liquid and finally the radiation from the insoluble Polymer with the substances on it is emitted, or the radiation emitted by the separated liquid is emitted, measures or investigates the effect of the same.

2. The method according to claim 1, characterized in that the polymer is in particulate form.

3. The method of claim 1 or 2, characterized in that the reagin-Ig or antibodies against the reagin-lg with a radioactive isotope, especially iodine ^{^1-5,} are marked.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Reagin-Ig or the antibodies against the Reagin-Ig are marked with a fluorescent group.

5. The method according to claims 1 to 4, characterized in that the test allergen from consists of a mixture of 2 or more allergens.

ft. Method according to claims 1 to 5, characterized in that the determination of the The presence of Heagin-Ig takes place quantitatively.

7. The method according to claims 1 to ft. Characterized in that the bond between the test allergen and the polymer has a covalent character.

8. Aid for the determination of Rcanin immunoglobulins directed against certain allergens (Reagin-Ig) in aqueous test samples according to the method according to claims 1 to 7, characterized by a first reagent which consists of a water-insoluble polymer to which one testyl gene is bound, sees a second Reagent, which consists of antibodies which are specifically directed against Reagin-Ig, and if necessary a third reagent, which consists of reagent, whereby if the third reagent does not is present - the antibodies of the second reagent, in the other case the reagent of the third Reagent are capable of emitting radiation by marking.

9. Aid according to claim 8, characterized in that the insoluble polymer in Partial form is present.

10. Aid according to claim 8 or 9, characterized in that the Reagin-Ig or the antibodies against the Reagin-Ig are marked ^{with a radioactive isotope, in particular 125 iodine.}

11. Aid according to claim 8 or 9, characterized in that the Reagin-Ig or the anti

body against the Reagin-Ig with a fluorescent Group are marked.

12. Aid according to claims 8 to H, 'characterized in that the test allergen is a

Is mixture of two or more allergens.

13. Aid according to claims 8 to 12,

characterized in that the bond between the test allergen and the polymer is covalent Has character.

14. Aid according to claims 8 to 13, characterized in that it is in the form of a Test pack available.

15. Aid according to claims 8 to 14, characterized in that a reagent or several reagents are each present in one ampoule, preferably in a dried, z. B. in lyophilized form.