DE2126128A1

DE2126128A1 - Medical test procedure, reagent and additive to perform the procedure

Info

Publication number: DE2126128A1
Application number: DE19712126128
Authority: DE
Inventors: Hans H Johansson Stig Gunnar Olof Lundkvist Ulf Gustav Uppsala Benruch (Schweden)
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1970-05-27
Filing date: 1971-05-26
Publication date: 1971-12-09
Also published as: FR2093840A5; GB1356346A; NL7107245A; CH538692A; AU2919171A

Description

Pharmacia AB
Upsala / SchwedenPharmacia AB
Upsala / Sweden

ivleaizinisches Q?e st verfahren, Reagens und Additiv zur Durchführung des Verfahrensivleaical quality process, reagent and additive for carrying out the process

Die vorliegende JBrfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Tests mit Proben nienschlisehen Ursprungs, bei welchem ein Antigen und ein gegen das Antigen gerichteter Antikörper in einer immunologischen Reaktion in vitro miteinander reagieren. Die Erfindung betrifft ferner ein Reagens und ein Additiv zur Durchführung des Verfahrens.The present invention relates to a method of implementation of tests with specimens of inconsistent origin which an antigen and an antibody directed against the antigen in an immunological reaction in vitro with one another react. The invention also relates to a reagent and an additive for carrying out the method.

'Ilests der obigen Art sind allgemein bekannt und werden praktisch durcngeführt. Die Durchführung erfolgt beispielsweise anhand von Proben, die aus menschlichem Gewebe, Blut, Blutplasma oder Blutserum stammen. Beispiele für auf derartigen immunolo-'Ilests of the above kind are well known and come in handy carried out. It is carried out, for example, on the basis of samples obtained from human tissue, blood, blood plasma or blood serum. Examples of such immunological

1 O 9 η ■ (J / 1 2 4 81 O 9 η ■ (J / 1 2 4 8

gischen Reaktionen basierende Tests sind beispielsweise Tests zum Nachweis von Antikörpern im menschlichen Blut, welche Antikörper gegen bestimmte Allergene gerichtet sind, in Verbindung mit der Diagnose allergischer Zustände, der Nachweis von Gonadotropin beim Schwangerschaftstest und der Machweis •oder die Bestimmung anderer Proteine (unter die Bezeichnung "Proteine" fallen gemäß vorliegender Beschreibung auch Polypeptide) in menschlichen Körperflüssigkeiten, z.B. Serum oder Plasma. Dem Fachmann sind verschiedene Varianten dieser Tests bekannt. _tEs liegt auf der Hand, daß die oben erwähnten Tests in der Praxis von außerordentlicher Bedeutung sind, da sie zum nachweis und/oder zur Bestimmung von Substanzen verwendet werden können, die Antigene oder Antikörper sind, Solche Tests werden daher in der Medizin in großem Umfang durchgeführt. Bs wurde jedoch festgestellt, daß bei Durchfürirung von Tests der oben beschriebenen Art in zahlreichen Fällen Fehlanzeigen auftreten, und zwar sowohl negativer wie positiver Art. Beispielsweise wurden bei Agglutinations-Tests mit Serum von nicht-schwangeren Frauen in zahlreichen Fällen positive Ergebnisse ermittelt. Sogar männliche Serumproben ergaben gelegentlich bei diesen Schwangerschaftsstests ein positives Ergebnis.Tests based on gical reactions are, for example, tests for the detection of antibodies in human blood, which antibodies are directed against certain allergens, in connection with the diagnosis of allergic conditions, the detection of gonadotropin in the pregnancy test and the detection of • or the determination of other proteins (under the name According to the present description, “proteins” also include polypeptides) in human body fluids, for example serum or plasma. Various variants of these tests are known to the person skilled in the art. _t It is obvious that the above-mentioned tests are in practice extremely important, since they can be used for the detection and / or determination of substances which are antigens or antibodies, Such assays are therefore in medicine large- Scope carried out. However, it has been found that when tests of the type described above are carried out, false indications occur in numerous cases, both negative and positive. For example, positive results were obtained in numerous cases in agglutination tests with serum from non-pregnant women. Even male serum samples occasionally gave positive results on these pregnancy tests.

Bei der Suche nach der Ursache dieser Fehlanzeigen wurde nun beobachtet, daß zahlreiche Personen einen bestimmten Typus von Antikörpern besitzen (die in der weiteren Beschreibung als "heterophile Antikörper" bezeichnet werden), welche gegenIn the search for the cause of these false indications it has now been observed that numerous people are of a certain type of antibodies (which will be referred to in the further description as "heterophile antibodies"), which against

T-Globulin tierischen Ursprungs gerichtet sind, und daß diese heterophilen Antikörper, falls bei einem der obigen Tests vorliegend, mit dem T'-Globulin tierischen Ursprungs im Testsystem reagieren können, wobei diese Reaktion zu den Fehlanzeigen führt. Es wurde nun gefunden, daö diese, die Fehlanzeigen verursachende Reaktion unterdrückt werden kann, indem man die immunologische Testreaktion in Gegenwart vonT-globulin of animal origin and that these heterophilic antibodies, if present in one of the above tests, with the T'-globulin of animal origin im Test system can react, this reaction leading to the false indications. It has now been found that these The reaction causing false indications can be suppressed by keeping the immunological test reaction in the presence of

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^- Globulin tierischen Ursprungs durchführt, gegen welches menschliche heterophile Antikörper (die natürlicherweise in der Probe vorliegen) gerichtet sind, so daß diese hetero— philen Antikörper blockiert werden.^ - Globulin of animal origin performs against which human heterophile antibodies (which are naturally present in the sample) are directed so that they are hetero- phile antibodies are blocked.

Beispiele für tierische ' tf'-Globuline sind ^-Globulin von Pferden, Schafen und Hindvieh wie z.B. Kühen.Examples of animal 'tf' globulins are ^ -globulin of Horses, sheep and cattle such as cows.

Die vorliegende Erfindung besteht somit im wesentlichen darin, daß man zur Vermeidung von Fehlanzeigen als Ergebnis der Anwesenheit menschlicher heterophiler Antikörper während der Reaktion diese in Gegenwart von ^Globulin nicht-menschlichen Ursprungs, gegen welches die menschlichen heterophilen Antikörper, die für den Test selbst unerheblich sind, gerichtet sind, durchführt.The present invention thus essentially consists in that in order to avoid false displays as a result of the Presence of human heterophile antibodies during the reaction these in the presence of ^ globulin non-human Origin against which the human heterophile antibodies, which are irrelevant for the test itself, are directed are carried out.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist somit ein Verfahren zur Durchführung von Tests an Proben menschlichen Ursprungs, bei welchem ein Antigen (I) und ein gegen das Antigen gerichteter Antikörper (II) in einer immunologischen Reaktion in vitro miteinander umgesetzt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Vermeidung von Fehlanzeigen als Ergebnis der Anwesenheit menschlicher heterophiler Antikörper (III) während der Reaktion diese in Gegenwart von ^-Globulin nichtmenschlichen Ursprungs, gegen welches die für den Test unerheblichen heterophilen Antikörper (III) gerichtet sind, durchführt.The present invention therefore relates to a method for carrying out tests on samples of human origin, in which an antigen (I) and an antibody (II) directed against the antigen in an immunological reaction in be reacted in vitro with each other, which is characterized in that to avoid false indications as a result of the Presence of human heterophile antibodies (III) during the reaction, these in the presence of ^ -globulin of non-human origin, against which those are insignificant for the test heterophile antibodies (III) are directed.

Die Menge an tierischem ^T-GIobulin, die eingesetzt werden muli, um die Möglichkeit einer Fehlanzeige auszuschließen, läßt sich vom Fachmann leicht experimentell ermitteln.The amount of animal ^ T-GIobulin that is used muli, in order to rule out the possibility of a false indication, can easily be determined experimentally by a person skilled in the art.

Beispiele von Proben, die unter Anwendung des erfindungsgernäßen Verfahrens untersucht werden können, sind menschlichesExamples of samples using the inventive Procedures that can be studied are human

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Gewebe, Blut, Blutplasma oder Blutserum. In den meisten Fällen enthalten die Proben Wasser, und die immunologische Reaktion wird vorzugsweise in vs/ässrigem Medium durchgeführt.Tissue, blood, blood plasma or blood serum. In most cases the samples contain water and the immunological reaction is preferably carried out in an aqueous medium.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann entweder das Antigen oder der gegen das Antigen gerichtete Antikörper unlöslich gemacht werden. Dies kann erfolgen, indem man das Antigen oder den Antikörper durch Adsorption oder mittels kovalenter Bindungen mit Hilfe eines Vernetzungsmittels an einen festen Träger bindet. Als feste Träger eignen sich z.B. Polymere mit Hydroxyl- und/oder Aminogruppen, beispielsweise Mischpolymere aus Dextran und üpichlorhydrin oder Cellulose, die die Form eines runden Papierblättchens aufweisen können. Der Träger kann auch die Form sines Gehäuses Behälters aufweisen, und beispielsweise ein aus dem bindungsfähigen Material, z.B. einem Kunststoff, hergestelltes Rohr sein. Methoden zur derartigen Bindung von Antigenen oder Antikörpern sind in der britischen Patentschrift 1 223 281 und in der französischen Patentschrift 1 595 332 beschrieben.According to one embodiment of the invention, either the antigen or the antibody directed against the antigen can be insoluble be made. This can be done by the antigen or the antibody by adsorption or by means of binds covalent bonds to a solid support with the aid of a crosslinking agent. Suitable solid supports are e.g. Polymers with hydroxyl and / or amino groups, for example mixed polymers of dextran and upichlorohydrin or cellulose, which can have the shape of a round sheet of paper. The carrier can also have the shape of its housing container, and, for example, a tube made of the bondable material such as a plastic. Methods for such binding of antigens or antibodies is described in British Patent 1,223,281 and in French U.S. Patent 1,595,332.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform können entweder das Antigen oder der gegen das Antigen gerichtete Antikörper mit einem nachweisbaren Atom oder einer nachweisbaren Gruppe markiert sein. Durch die Markierung kann häufig die Empfindlichkeit des Tests gesteigert werden, ferner ergibt sich die Möglichkeit zur Bestimmung sehr geringer Mengen an Antigen oder Antikörpern. Beispiele für nachweisbare Atome oder Gruppen sind radioaktive Isotope, z.B. radioaktives Jod, sowie Gruppen mit einem radioaktiven Isotop. Die Markierung kann ferner durch farbbildende oder fluor4sa.erende Gruppen, z.B. durch €t*e eine Fluorescein enthaltende Gruppe_/ erfolgen.According to a further embodiment, either the antigen or the antibody directed against the antigen can be labeled with a detectable atom or a detectable group. The marking can often increase the sensitivity of the test, and it is also possible to determine very small amounts of antigen or antibodies. Examples of detectable atoms or groups are radioactive isotopes, eg radioactive iodine, as well as groups with a radioactive isotope. The label may further by color-forming or fluor4sa.erende groups, for example by € t * e a fluorescein-containing group _/ take place.

Gemäß einer wichtigen Ausführungsform der Erfindung kann die "According to an important embodiment of the invention, the "

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immunologische Reaktion in Verbindung mit einem Radio-immunolo gischen Test durchgeführt werden.immunological reaction in conjunction with a radio-immunolo cal test can be carried out.

Sine weitere wertvolle Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Durchführung der immunologischen Reaktion' in Verbindung mit einem Agglutinationstest.Another valuable application of the method according to the invention consists in carrying out the immunological reaction in conjunction with an agglutination test.

Sine weitere nützliche Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Durchführung der immunologischen Reaktion in Verbindung mit Tests auf Antikörper gegen Allergene. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren dann eingesetzt werden, wenn die immunologische Reaktion zur Bestimmung von Proteinen oder Peptiden in S Proben menschlichen Ursprungs dient.Another useful application of the method of the invention is in performing the immunological reaction in conjunction with tests for antibodies to allergens. Further the method according to the invention can then be used when the immunological reaction for the determination of proteins or peptides in S samples of human origin.

bereits erwähnt, ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die immunologische Reaktion zur Schwangerschaftsbestimmung von besonderer Bedeutung. Die immunologische Reaktion kann in Verbindung mit Agglutinationstests durchgeführt werden, wobei die Tests auf der Immun-Reaktion zwischen Gonadotropin in der flüssigen Probe und Antikörpern gegen Gonadotropin beruht, wobei letztere an sehr kleine Teilchen gebunden sind.already mentioned, the application of the method according to the invention to the immunological reaction for determining pregnancy is of particular importance. The immunological response Can be done in conjunction with agglutination tests, the tests on the immune response between gonadotropin based in the liquid sample and antibodies against gonadotropin, the latter being bound to very small particles are.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ferner ein Reagens zur Verwendung im vorstehend beschriebenen Verfahren. Das Reagens enthält ein Antigen (I) tierischen Ursprungs, welches entweder aus tierischem ^Globulin besteht oder solches enthalt, wobei das Reagens dazu bestimmt ist, mit der zu untersuchenden Probe vereinigt zu werden und ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß es JT-Globulin nicht-menschlichem Ursprungs enthält, gegen welches die heterophilen menschlichen Antikörper, (III), weiche in der Probe vorliegen, gerichtet sind.The present invention also provides a reagent for use in the method described above. The reagent contains an antigen (I) of animal origin, which either consists of animal ^ globulin or contains such, wherein the reagent is intended to be combined with the sample to be examined and is further characterized by that it contains JT globulin of non-human origin against which is the heterophile human antibody, (III), which are present in the sample, are directed.

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Bine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Reagens zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens, welches Antikörper (II) tierischen Ursprungs enthält, das zur Vereinigung mit der zu untersuchenden Probe bestimmt ist und dadurch gekennzeichnet ist, daß es ferner ίΓ-Globulin nicht-menschlichen Ursprungs enthält, gegen welches die in der Probe vorliegenden menschlichen heterophilen Antikörper (HIj gerichtet sind. Der im Reagens enthaltene Antikörper (II) kann gemäß einer Ausführungsform auch besonders gereinigt oder an einen festen Träger gebunden sein.A further embodiment of the invention relates to a reagent for carrying out the above method, which Contains antibody (II) of animal origin, which is intended for association with the sample to be examined and thereby is characterized in that it is also ίΓ-globulin non-human Of origin against which the human heterophile antibodies present in the sample (HIj are. According to one embodiment, the antibody (II) contained in the reagent can also be specially purified or transferred to a be bound to a solid support.

Gegenstand der .!Erfindung ist ferner ein zur Verwendung in vorstehendem Verfahren brauchbares Additiv. Dieses ist im "wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß es nicht-menschliches If-Globulin enthält, gegen welches, heterophile Antikörper (III) menschlichen Ursprungs, die in der Probe vorhanden sind, gerichtet sind. Das Additiv kann aus einer Lösung bestehen, die das nicht-menschliche ίΓ-Globulin enthält.The invention also relates to an additive which can be used in the above process. This is "essentially characterized in that it contains non-human If globulin against which heterophilic antibodies (III) of human origin present in the sample are directed. The additive can consist of a solution which is not -Contains human ίΓ-globulin.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auf einen direkten Agglutinationstest zum Schwangerschaftsnachweis angewendet werden. Der Test kann als üblicher Schwangerschaftstest, basierend auf dem direkten Agglutinationsprinzip, durchgeführt werden, unter Verwendung von Polymerteilchen (z.B. Latexteilchen) welche mit Antikörpern (tierischen Ursprungs) überzogen sind, die gegen menschliches Chorion-Gonadotropin gerichtet sind. Für diesen Zweck werden die Teilchen in einer Reagenslösung suspendiert. i5in Tropfen der Suspension wird mit einem Tropfen menschlichen Serums oder Urins innerhalb eines vorgegebenen Bereichs auf einem festen Substrat, z.B. einer Glasplatte, in Berührung gebracht. Die Reagenslösung und Testflüssigkeit werden dann durch vorsichtiges Schütteln der Glasplatte während 2 bis 3 Minuten vermischt.The method according to the invention can, for example, be based on a direct agglutination test for the detection of pregnancy be applied. The test can be carried out as a normal pregnancy test based on the direct agglutination principle using polymer particles (e.g. latex particles) with antibodies (of animal origin) are coated against human chorionic gonadotropin are directed. For this purpose the particles are suspended in a reagent solution. i5in drops of the suspension will be with a drop of human serum or urine within a given area on a solid substrate, e.g. a glass plate, brought into contact. The reagent solution and test liquid are then mixed by gently shaking the Glass plate mixed for 2 to 3 minutes.

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Bei Durchführung des Tests mit menschlichem Serum erweisen sich etwa Λ0..0 der positiven Ergebnisse als falsch. Diese falschen Ergebnisse können nun gemäß vorliegender Erfindung vollständig eliminiert werden, indem man der Reagenslösung o,1 lag x^ro ml Rinder- & -Globulin oder r-'inderserum in solaher Menge'zugibt, daß das Serum in der Reagenslösung auf das 5°~ fache verdünnt wird.When performing the test with human serum, approximately Λ0..0 of the positive results are found to be false. These false results can now be completely eliminated in accordance with the present invention by adding 0.1 ml of bovine & globulin or r-'inderserum 'to the reagent solution in such an amount that the serum in the reagent solution falls to 5 ° ~ is diluted times.

example 1

Jnterdrückung falscher positiver Ergebnisse· bei der Bestimmung von gagen tierigches Allergen QCah-Epithel) gerichtetem Re a-Suppression of false positive results in determination from gagen animal allergen QCah epithelium) directed Re a-

A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundenem Allergen.A. Manufacture of particles with chemically bound allergen.

Als ü-isgangsmaterial wurden feine Teilchen eines Mischpolymeren aus Dextran und üpichlorhydrin verwendet, wobei das Dextran dvirch Glycerin-Ätherbrücken vernetzt war ("Sephadex", Teilchengröße 1 bis 1o Mikron). Das Mischpolymer ist in Wasser unlöslich, jedoch quellbar, wobei die Substanz etwa 2,5 g Wasser pro Gramm. Trockengewicht absorbiert. Das Ausgangsmaterial wurde zunächst mit Bromcyan aktiviert (siehe Axen et al., Nature, Bd. 214 (1967) S. 15o2), wobei 2oo ml einer wässrigen, 5 g Bromcyan enthaltenden Lösung zu 5 g des Polymeren zugesetzt und der pH-Wert 2 Minuten lang unter Zutropfen von 1n-Natriumhydroxyd bei 1o,5 gehalten wurde. Dann wurden die Teilchen des aktivierten Mischpolymeren gewaschen. Ein handelsüblicher Allergen-iSxtrakt aus Rinder-Epithel wurde zu einer wässrigen Suspension der Teilchen zugegeben, wobei dieser Extrakt o,2 mg Allergen pro ml enthielt. Das Mischungsverhältnis betrug 1 ml Allergen-Extrakt pro I00 mg aktiviertes Polymer. Das AllergenFine particles of a copolymer were used as the starting material made of dextran and hypichlorohydrin, the dextran being cross-linked by glycerine-ether bridges ("Sephadex", particle size 1 to 10 microns). The copolymer is insoluble in water, but swellable, the substance about 2.5 g of water per Grams, dry weight absorbed. The starting material was first activated with cyanogen bromide (see Axen et al., Nature, Vol. 214 (1967) p. 1502), 200 ml of an aqueous solution containing 5 g of cyanogen bromide being added to 5 g of the polymer and the pH for 2 minutes with the dropwise addition of 1N sodium hydroxide was held at 1o.5. Then the activated copolymer particles were washed. A commercially available one Allergen extract from bovine epithelium turned into an aqueous one Suspension of the particles added, this extract containing 0.2 mg of allergen per ml. The mixing ratio was 1 ml Allergen extract per 100 mg activated polymer. The allergen

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reagierte sodann mit dem durch. Bromcyan aktivierten Mischpolymer, wobei man eine kovalente Bindung zwischen Allergen und Polymer erhie.lt. Anschließend wurden die Allergen-haltigenthen reacted with the through. Cyanogen bromide activated copolymer, whereby there is a covalent bond between allergen and Polymer obtained. Subsequently, the allergen-containing

Mischpolymerteilchen zentrifugiert und 2 χ mit 1o ml o,5-molarer Natriumbic arbonatlosung (pH etwa 8,2), 0,1-molarem Natriumacetat-Sssigsäure-Puffer(pH etwa 4), ο,Ι-molarem Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäure-Puffer (Tris-HCl) mit 1% Rinder serum-Albumin (pH etwa 7,2) gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in ο,Ι-molarem Tris-Puffer mit 1% Rinderserum-Albumin suspendiert.Mixed polymer particles centrifuged and 2 χ with 1o ml of 0.5 molar Sodium bicarbonate solution (pH about 8.2), 0.1 molar sodium acetate-acetic acid buffer (pH about 4), ο, Ι molar trishydroxymethylaminomethane hydrochloric acid buffer (Tris-HCl) washed with 1% bovine serum albumin (pH about 7.2). The particles were homogenized and in ο, Ι molar Tris buffer with 1% bovine serum albumin suspended.

B. Herstellung von Reagin-IgB. Preparation of Reagin-Ig

Von den Immunoglobulinen IgA, IgD, IgG- und igM im wesentliche^ freies Reagin—Ig wurde aus dem Serum eines iVlyeloma-Patienten mit hohem Gehalt an Reagin-Ig im Blut gewonnen. Das Reagin-Ig wurde aus dem Serum durch Salzfällung, Gelfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie wie folgt isoliert: Proben von aufgetautem oder frisch gewonnenem Plasma eines Patienten mit jyjyelomatose wurden mit o,15-molarer Natriumchloridlösung auf einen Gehalt von etwa 15 mg pro ml bzgl. der M-Komponente (Reagin-Ig) verdünnt. Die Ausfällung mit wasserfreiem Natriumsulfat (18 g pro 1oo ml) erfolgte bei 25°C. Nach 1 Std. wurde der Niederschlag durch Zentrifagieren gesammelt (1o ooo χ g, 2o Minuten, 25°C). Das Sediment wurde gesammelt und mit Natriumsulfatlösung (18 g pro 1oo ml) gewaschen und dann in o,8 Volumenteilen o,1-molarem Natriumphosphatpuffer vom pH 7»5 gelöst. Dann wurde nochmals wie oben beschrieben ausgefällt. Nach der letzten Ausfällung wurde das Sediment in o,1-molarem Tris-HOl-Puffer von pH 8,ο (2o°G) gelöst und auf eine mit DJiiAB-Sephadex^^R^A-5o gefüllte Säule (3,2 χ 3o cm), welche mit dem gleichen Puffer getränkt war, aufgebracht. Die iJluierung erfolgte mit kontinuierlich von o,1-m nach 1-m ansteigendem Tris-HGl bei konstantem pH-v/ert von 8,ο bei 2o°C. Die Heagin-Reagin-Ig, essentially free of the immunoglobulins IgA, IgD, IgG- and igM, was obtained from the serum of an iVlyeloma patient with a high content of reagin-Ig in the blood. The reagin-Ig was isolated from the serum by salt precipitation, gel filtration and ion exchange chromatography as follows: Samples of thawed or freshly obtained plasma from a patient with jyjyelomatosis were treated with 0.15 molar sodium chloride solution to a content of about 15 mg per ml or the M component (Reagin-Ig) diluted. Precipitation with anhydrous sodium sulfate (18 g per 100 ml) took place at 25 ° C. After 1 hour the precipitate was collected by centrifugation (10,000 g, 20 minutes, 25 ° C.). The sediment was collected and washed with sodium sulfate solution (18 g per 100 ml) and then dissolved in 0.8 parts by volume of 0.1 molar sodium phosphate buffer of pH 7-5. Then it was precipitated again as described above. After the last precipitation, the sediment was dissolved in 0.1 molar Tris-HOl buffer of pH 8.0 (2o ° G) and transferred to a ^{column filled with DJiiAB-Sephadex ^ R} ^ A-5o (3.2 χ 3o cm), which was soaked with the same buffer, applied. The iJluation was carried out with Tris-HGL increasing continuously from 0.1 m to 1 m at a constant pH value of 8.0 at 20 ° C. The Heagin

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Ig enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert und auf eine mit Sephadex ^ G 15o gefüllte Säule (3 »2 χ 95 cm) aufgebracht, welche mit o,1-m Tris-HCl - o,2 m NaGl — o,oo2 m JJi¹DiDAlTa₂ (pH 7,7)_y enthaltend o,o2% Natriumazid, equilibriert war. Das Material wurde 3 x- durch die Säule geleitet (Kreis- ' lauf-Chr'omatographie). Die Reagin-Ig enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und durch Jltrafiltration (Visking-Rohr 8/81,3 cm) bei 4° C konzentriert.Ig-containing fractions were combined and concentrated and applied to a column (3 »2 × 95 cm) filled with Sephadex ^ G 15o, which was filled with 0.1 m Tris-HCl - 0.2 m NaGl - 0.02 m JJi ¹ DiDAlTa ₂ (pH 7.7) _y containing 0.02% sodium azide, was equilibrated. The material was passed 3 times through the column (circular chromatography). The fractions containing reagin-Ig were collected and concentrated by ultrafiltration (Visking tube 8/81.3 cm) at 4 ° C.

Das so hergestellte Reagin-Ig war mit weniger als o,1% Protein oder anderen Immunoglobulinen (IgA, IgD, IgG und IgM) insgesamt verunreinigt. Dieses gereinigte Reagin-Ig ergab einen einzigen Peak bei der Elektrophorese bei pH 8,6 I » o,o5» der in die 3 - /*-Region wanderte. Untersuchungen mit der ultrazentrifuge ergaben eine einzige Grenzlinie_/und die Sedimentationskonstante S on w^{1 0ΘΓΘ0Ληθ}*^θ sich zu 8,2o S. Das Molekulargewicht von Reagin—Ig berechnete sich auf 2oo ooo + 5 ooo, ausgehend von einem spezifischen Volumen von o,713 cnr/g, bestimmt auf der Grundlage der Aminosäure- und Kohlehydratmensetzung. Die DiffusionskThe reagin-Ig produced in this way was contaminated with less than 0.1% protein or other immunoglobulins (IgA, IgD, IgG and IgM) in total. This purified reagin-Ig gave a single peak on electrophoresis at pH 8.6 10.0.5 ”which migrated into the 3 - / * region. Investigations with the ultracentrifuge showed a single boundary line _/ and the sedimentation ^{constant S on w 10 0ΘΓΘ0Ληθ} * ^θ was 8.2o S. The molecular weight of Reagin-Ig was calculated to be 2oo,000 + 5,000, based on a specific volume of 0.713 cnr / g, determined on the basis of amino acid and carbohydrate composition. The diffusion c

x 1o ' cm /sek. berechnet.x 10 'cm / sec. calculated.

zusammensetzung. Die Diffusionskonstante Do_n _m, wurde mitcomposition. The diffusion constant Do _n _m was with

O p £IU,WO p £ IU, W

Reduktionsreaktionen ergaben, daß Reagin—Ig aus zwei Arten von Polypeptidketten besteht, und damit anderen Serum—Immunoglobulinen ähnlich ist. Das Vorliegen von zwei leichten Polypeptidketten vom Molekulargewicht 22 6oo konnte sichergestellt werden. Das Molekulargewicht der schweren Polypeptidketten, der sogenannten J3-Ketten, einschließlich deren prosthetisehen Kohlehydratgruppen, wurde zu etwa 77 4oo berechnet, unter der Annahme eines molaren Verhältnisses von 1:1 zwischen schweren und leichten Polypeptidketten im ursprünglichen Reagin-Ig. Die Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung ist aus Tabelle 1 ersichtlich:Reduction reactions indicated that Reagin-Ig consists of two types of polypeptide chains and is thus similar to other serum immunoglobulins. The presence of two light polypeptide chains with a molecular weight of 22,6oo could be ascertained. The molecular weight of the heavy polypeptide chains, the so-called J3 chains, including their prosthetisehen carbohydrate groups was calculated to be about 77 4oo, assuming a molar ratio of 1: 1 between the heavy and light polypeptide chains in the original reagin-Ig. The amino acid and carbohydrate composition is apparent from Table 1:

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Table 1

Aminosäuren- und Kohlehydratzusammensetzung von Eeagin-IgAmino acid and carbohydrate composition of Eeagin-Ig

Aminosäure AminosaurerestAmino acid amino acid residue

• g/1 oo g Protein• g / 100 g protein

Tryptophan 3»67Tryptophan 3 »67

Lysin 4,2oLysine 4.2o

Histidin , 2,16Histidine, 2.16

Amid-N 1,34Amide-N 1.34

Arginin 5,63Arginine 5.63

Asparaginsäure 6,73Aspartic acid 6.73

Threonin 9,o1Threonine 9, o1

Serin 8,52Serine 8.52

Glut aminsäure 8,93Glutamic acid 8.93

Prolin 5,24Proline 5.24

Glycin 3,13Glycine 3.13

Alanin 3,92Alanine 3.92

Cystein 2,15Cysteine 2.15

Valin 5,59Valine 5.59

Methionin 1,17Methionine 1.17

Isoleucin 2,29Isoleucine 2.29

Leucin 6,o8Leucine 6, o8

Tyrosin 4,63Tyrosine 4.63

Phenylalanin 3,91Phenylalanine 3.91

88,2988.29

Carbohydrate Carbohydrate residue, g / 100 g protein

N-Acetyl-glucosamin 4,6oN-acetyl-glucosamine 4,6o

Hexose (Galactose + Mannose) 5»34Hexose (galactose + mannose) 5 »34

L-Fucose o,51L-fucose o, 51

N-Acetyl-neuraminsäure 1,26N-acetyl neuraminic acid 1.26

11,71 109850/1248 11.71 109850/1248

G. Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-IgG. Preparation of Antibodies to Reagin-Ig

Ein Gemisch, aus 2 mg B-Ketten in o,5 ml o,15-molarer Natriumciiloridlösung und o,5 ml Freund¹ s-Hilfsmittel (Freund-Hilfsmittel^ wurde zur Intensivierung der Antikörperbildung verwendet·, siehe z.B. Cabat und Mayers: Experimental Immunochemistry 1961) wurde Schafen intramuskulär injiziert. Die Immunisierung wurde in Abständen von 3 Wochen wiederholt, wobei insgesamt 5 Injektionen verabreicht wurden. Bekanntlich wird die Bildung von Antikörpern durch wiederholte Injektion der Antigene gesteigert. Nach 14 Tagen wurden die Schafe entblutet und das Antiserum wurde aus dem Blut gewonnen, indem man diesem koagulierte und den geronnenen Anteil entfernte βA mixture of 2 mg of B-chains in 0.5 ml of 0.15 molar sodium chloride solution and 0.5 ml of Freund ¹ s aid (Freund aid ^ was used to intensify antibody formation, see, for example, Cabat and Mayers: Experimental Immunochemistry 1961) sheep were injected intramuscularly. The immunization was repeated at 3 week intervals, giving a total of 5 injections. It is known that the formation of antibodies is increased by repeated injection of the antigens. After 14 days, the sheep were bled and the antiserum was obtained from the blood by coagulating it and removing the coagulated portion

Das Antiserum wurde durch Adsorption während 1 Std. bei 37 G und 16 Stunden bei 4° G spezifisch gemacht, indem 1 Teil normales menschliches Serum zu 1 Teil Antiserum zugesetzt wurde. Nach dem Zentrifugieren wurde das Antiserum durch Immuno-jSlektrophorese gegen normales menschliches Serum und durch Ouchterlony-Geldiffusionsanalyse gegen reines Immunoglobulin A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteinen getestet, wobei es sich als spezifisch gegen Ε-Ketten und Reagin-Ig erwies. Das Antiserom wurde als Antikörper im Bestimmungsverfahren eingesetzt.The antiserum was adsorbed for 1 hour at 37 G and made specific for 16 hours at 4 ° G by adding 1 part normal human serum to 1 part antiserum. After centrifugation, the antiserum was determined by immuno-electrophoresis against normal human serum and by Ouchterlony gel diffusion analysis against pure immunoglobulin A, G and M, so-called light polypeptide chains from normal immunoglobulin G and M, so-called light polypeptide chains from normal immunoglobulin G and Bence Jones proteins tested, it was found to be specific against Ε chains and Reagin-Ig. The antiseroma was used as an antibody in the assay used.

B. Herstellung von markiertem Reagin-IgB. Preparation of Labeled Reagin-Ig

Nach der Methode von Hunter und Greenwood, Nature 194 (1962), S. 495 wurde Reagin-Ig mit ^²^I markiert. Die Markierung kann auch wie folgt vorgenommen werden: Jod-125 ohne Träger wurde verwendet, und zwar in Form von Natriumiodid, in o,1-molarer ^{Reagin-Ig was labeled with ^ 2} ^ I according to the method of Hunter and Greenwood, Nature 194 (1962), p. 495. The labeling can also be done as follows: Iodine-125 without carrier was used, in the form of sodium iodide, in 0.1 molar

109850/1248109850/1248

Natriimhydroxydlösung gelöst, frei von Reduktionsmitteln.Dissolved sodium hydroxide solution, free of reducing agents.

Nach dem Verfahren von J.L. Izzo, W.F. Bale, M.J. Izzo and A. Roncone* J. Biol. Chein. 239 Nr. 11 (1964) 3742 warde Jodmonochlorid hergestellt, and dessen Jodgehalt warde darch Redaktion von sämtlichem Jod mit Arsentrioxyd zam Jodid and anschließende Titration mit o,1-molarer Silbernitratlösang bestimmt. Die Jodmonochlorid-G-randlösang enthielt 2,54 mg Jod pro ml in o,o2-m KGl, 2,o-m NaGl and 1,o-m HGl, sie ist bei Raamtemperatur mindestens 19 Monate lang beständig. Vor der Verwendung wird diese Grundlösung aaf die erforderliche Konzentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wird eine HGl-NaGl-Lösung zubereitet, deren Konzentration für jeden Versach so eingestellt wird, daß sie oberhalb den «liniuialkonzentrationen von Chlorwasserstoff and Natriumchlorid, mit denen Jo dmo no Chlorid beständig ist, liegt (R. V/. Helmkamp, M. A. Gontreras and W.F. Bale: Int. J. Appl. Radiat. Isotopes, 18 (1967) 737). Following the method of JL Izzo, WF Bale, MJ Izzo and A. Roncone * J. Biol. Chein. 239 No. 11 (1964) 3742 iodine monochloride was produced, and its iodine content was determined by editing all iodine with arsenic trioxide and iodide and subsequent titration with 0.1 molar silver nitrate solution. The iodine monochloride G-rand solution contained 2.54 mg iodine per ml in o, o2-m KGl, 2, om NaGl and 1, om HGl, it is stable for at least 19 months at room temperature. Before use, this basic solution is diluted to the required concentration. A HGl-NaGl solution is prepared as a diluent, the concentration of which is adjusted for each test so that it is above the linear concentrations of hydrogen chloride and sodium chloride with which Jodmo No Chloride is resistant (R. V /. Helmkamp, MA Gontreras and WF Bale: Int. J. Appl. Radiat. Isotopes, 18 (1967) 737).

Die Jodierung erfolgt nach der Helmkamp¹sehen Modifizierung des Verfahrens von McFairlane (A.S. McFairlane, Nature, 182 (1958) 53) mit zusätzlichen Modifizierungen (J.L. Izzo, W.F. Bale, M.J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Ghem., 239, Nr. 11 (1964) 3743, W.F. Bale, R.W. Helmkamp, T.P. Davis, M.J. Izzo, R.L. Gooland, M.A. Contreras und J.L. Spar, Proc. Soc. Bxp. Med., 122 (1966) 4o7 und R.Vi. Helmkamp, M.A. Gontreras und W.F. Bale, int. J. Appl. Radiat. Isotopes, 18 (1967) 737)· 1oo/Ug Reagin-Ig wurden mit einem Molverhältnis von Jodmonochlorid zu Reagin-Ig von 2:1 und von Jodmonochlorid zuThe iodination takes place according to the Helmkamp ¹ modification of the McFairlane method (AS McFairlane, Nature, 182 (1958) 53) with additional modifications (JL Izzo, WF Bale, MJ Izzo and A. Roncone, J. Biol. Ghem., 239 , No. 11 (1964) 3743, WF Bale, RW Helmkamp, TP Davis, MJ Izzo, RL Gooland, MA Contreras and JL Spar, Proc. Soc. Bxp. Med., 122 (1966) 407 and R.Vi. Helmkamp , MA Gontreras and WF Bale, int. J. Appl. Radiat. Isotopes, 18 (1967) 737) · 100 / Ug Reagin-Ig were added with a molar ratio of iodine monochloride to reagin-Ig of 2: 1 and of iodine monochloride

-^I von 1:1 markiert. Folgende Lösungen wurden verwendet:- ^ I marked by 1: 1. The following solutions were used:

Lösung I: Reagin-Ig wird in o,2-molarem l'ris-HG 1-Puff er mit einem pH-Wert 8 auf eine Konzentration von 11,17 mg pro ml gelöst. Das Präparat enthielt 3v<> Reagin-Ig-Aggregat und o,5/o IgG.Solution I: Reagin-Ig is dissolved in o, 2-molar l'ris-HG 1 buffer with a pH value of 8 to a concentration of 11.17 mg per ml. The preparation contained 3 % reagin-Ig aggregate and 0.5 / o IgG.

10 9 0 3 0 / 1 2 4 810 9 0 3 0/1 2 4 8

Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die Jodmonochlorid-Grundlösung wurde hergestellt durch Lösen von 2,92 g Natriumchlorid in 12,5 ml 2,o-molarer HGl und 87,5 ml destillierten Wassers.Solution II: The diluent for the basic iodine monochloride solution was prepared by dissolving 2.92 g of sodium chloride in 12.5 ml of 2.0 molar HGl and 87.5 ml of distilled Water.

Lösung III: Die endgültige Jodmonochloridlösung wurde hergestellt durch Verdünnen von 1oo ,\x 3
lösung mit 53?55 Jnl &er Lösung II.Solution III: The final iodine monochloride solution was made by diluting 100 , \ x 3
solution with 53 - 55 Jnl & er solution II.

stellt durch Verdünnen von 1oo ,u 1 der Jodmonochlorid-Grund-by diluting 100 u 1 the iodine monochloride basic

Lösung IV: 17, 9/U 1 des Radiojodids (3,ο mGi) wurden zu 45/U der Lösung III zugegeben und vor Verwendung in einem Eisbad aufbewahrt. Sämtliche Lösungen wurden kalt gehalten und die Jodierungsreaktion erfolgte bei Bistemperatur. Die Reagentien wurden in folgender Reihenfolge eingesetzt: Zu 2oo ,xx 1 Borat-Gar bonat-Puff er (o,4 m, pH 9,1) und 8,95/U 1 Lösung I (1oo,u g Reagin-Ig) in einem kleinen G-lasrährchen wuäen 5°/^a 1 Lösung IV zugegeben und das Gemisch wurde kräftig gerührt. Wach 6o Sekunden wurden 2> ,\x. 1 o,1-m NapSoO^, 5o/U 1 2% KI und 2oo /U 1 *j-/o menschliches Serum-Albumin-Blau (HSA-Blau) zugesetzt. Das HSA-Blau wa? nach der Methode von Melani(l.Melani, K.M. Bartelt, R. Conrads, E.F. Pfeiffer, Z. Klin Chem., 4 Jahrg. 1966, Art. 4).zubereitet worden. Es wurde zugegeben zur Verminderung einer Zersetzung durch Strahlung und Adsorption von Reagin-Ig an den Glaswänden. Mit Jod-125 aocLiertes Reagin-Ig kann unter Verwendung von vernetztem Dextran (Sephadex, eingetragenes Warenzeichen) oder durch Agaros-Gelfiltration (Sepharose, eingetragenes Warenzeichen) oder mit Ionenaustauscher (z.B. Dowex: oder Amberlite, eingetragene Warenzeichen) gereinigt werden. Aus der Säule wurden Fraktionen bei etwa +4⁰C in o,1-m Tris-HCl-Puffer, pH 7,72, mit 5% menschlichem Serum-Albumin, gewonnen· Die markiertes Reagin-Ig enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in eingefrorenem Zustand gelagert. Nach dieser Methode werden 83% der gesamten Jodmenge an dasSolution IV: 17.9 / U 1 of the radioiodide (3, ο mGi) were added to 45 / U of solution III and stored in an ice bath before use. All solutions were kept cold and the iodination reaction took place at bistemperature. The reagents were used in the following order: To 2oo , xx 1 borate-gar bonate buffer (0.4 m, pH 9.1) and 8.95 / U 1 solution I (1oo, ug reagent-Ig) in one small glass tubes 5 ° / ^a 1 solution IV were added and the mixture was stirred vigorously. Awake 60 seconds became 2> , \ x. 1 o, 1-m NapSoO ^, 5o / U 1 2% KI and 2oo / U 1 * j- / o human serum albumin blue (HSA blue) added. The HSA blue huh? according to the method of Melani (I. Melani, KM Bartelt, R. Conrads, EF Pfeiffer, Z. Klin Chem., 4th year 1966, Art. 4). It was added to reduce radiation degradation and adsorption of Reagin-Ig on the glass walls. Iodine-125-added Reagin-Ig can be purified using cross-linked dextran (Sephadex, registered trademark) or agaros gel filtration (Sepharose, registered trademark) or with an ion exchanger (e.g. Dowex: or Amberlite, registered trademark). From the column fractions were at about +4 ⁰ C in o, m-1 Tris-HCl buffer, pH 7.72, with 5% human serum albumin obtained, · The labeled reagin-Ig containing fractions were combined and frozen in Condition stored. According to this method, 83% of the total amount of iodine is added to the

109850/1248109850/1248

Reagin-Ig gebunden. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom Jod-125 und etwa 1 Atom Jod-127 pro Molekül (Molekulargewicht 2oo ooo) und besaß eine spezifische Aktivität von ca. 12 mOi/mgoReagin-Ig bound. The labeled immunoglobulin contained about 1 atom of iodine-125 and about 1 atom of iodine-127 per molecule (molecular weight 2oo ooo) and had a specific activity of approx. 12 mOi / mgo

E. BestimmungsverfahrenE. Determination procedure

Die Analysen wurden in Glas- oder Kunststoffrohren von 5ox1o mm durchgeführt„The analyzes were carried out in glass or plastic tubes of 5ox1o mm carried out"

1. o,5 ml einer'Teilchensuspension mit chemisch gebundenem Allergen (siehe Absatz A) wurden in jeweils 2 Teströhrchen eingeführt. Die Suspension enthielt 1 mg Teilchen pro ml.1. 0.5 ml of a particle suspension with chemically bound Allergen (see paragraph A) were introduced into 2 test tubes each. The suspension contained 1 mg of particles per ml.

2. o,o5 il des zu untersuchenden Serums wurden einem der beiden Röhrchen zugesetzt.2. o, o5 il of the serum to be examined became one of the two Tubes added.

3. o,o5 ml eines Vergleichsserums nicht-allergischer Herkunft wurden in das zweite Röhrchen zugegeben,3. 0.05 ml of a reference serum of non-allergic origin were added to the second tube,

4. Der Inhalt der Röhrchen wurde 2o Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Gefäße langsam auf vertikaler Ebene rotiert wurden.4. The contents of the tubes were left for 20 hours at room temperature incubated, the tubes were slowly rotated in the vertical plane.

5· Die Teilchen wurden bei 3 ooo Umdrehungen pro Minute 1 Minute lang zentrifugiert, dann wurde die überstehende Flüssigkeit .entfernt»5. The particles were rotated at 3,000 revolutions per minute for 1 minute centrifuged long, then the supernatant .removed"

6. Die Teilchen wurden 3 x mit o,1-m Tris-Puffer (pH 7A) mit 1 Gewichtsprozent Rinderserumalbumin gewaschen, die Suspen^ sion wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Waschen abgesaugt. Es wurde sichergestellt, daß beim Absaugen keine Feststoffteilchen mitgerissen wurden.6. The particles were washed 3 times with 0.1-m Tris buffer (pH 7A) washed with 1 percent by weight of bovine serum albumin, the suspen ^ sion was centrifuged and the supernatant liquid was aspirated after washing. It was ensured that the Suction no solid particles were entrained.

109850/1248109850/1248

7. o,1 ml des nach Absatz G hergestellten Antiserums (Verdünnung 1:5oo) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben.7. 0.1 ml of the antiserum prepared in accordance with paragraph G (dilution 1: 500) was added to each tube.

8. Der Inhalt der Röhrchen wurde wie in Stufe 4 inkubiert.8. The contents of the tubes were incubated as in step 4.

9. Dann wurde wie in Stufe 5 zentrifugiert.9. Then centrifugation was carried out as in step 5.

10. Danach wurde wie gemäß Stufe 6 gewaschen.10. This was followed by washing as in step 6.

125125

11. o,1 ml einer Lösung enthaltend ^I-Reagin (Herstellung11. o, 1 ml of a solution containing ^ I-reagin (manufacture

siehe Absatz D) mit einer Radioaktivität von 5o ooo Ausschlägen pro Minute wurden in die Röhrchen eingefüllt.see paragraph D) with a radioactivity of 50,000 beats per minute were filled into the tubes.

12. Dann wurde wie in Stufe 4 inkubiert.12. Incubation was then carried out as in step 4.

13. Danach wurden die Teilchen wie in Stufe 5 zentrifugiert.13. The particles were then centrifuged as in step 5.

14. Danach erfolgte eine Waschstufe gemäße Stufe 6.14. This was followed by a washing stage in accordance with stage 6.

15· In einem Scintillationsde.tektor wurde die e"-Strahlung bestimmt. 15 · The e "radiation was determined in a scintillation detector.

Zur Auswertung wurde die Intensität der Strahlung des ersten Röhrchens verglichen mit der Intensität der Strahlung des zweiten Röhrchens,welche das Vergleichsserum eines nicht-allergischen Patienten enthielt.For the evaluation, the intensity of the radiation from the first tube was compared with the intensity of the radiation from the second tube, which is the comparison serum of a non-allergic Patient contained.

Als Alternative kann auch nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen überführt werden, worauf man die ^-StrahlungAs an alternative, after centrifuging according to step, a certain volume of the supernatant liquid in Counting tubes are transferred, whereupon the ^ radiation

125
von freiem ^I-Reagin in der Losung bestimmen kann.125
of free ^ I-reagin in the solution.

Für quantitative Bestimmungen können o,o5 ml des TestserumsFor quantitative determinations, 0.05 ml of the test serum

1 098 ü O/ 12481 098 ü O / 1248

- 1ÄT - .- 1ÄT -.

in verschiedenen Verdünnungen in Stufe/in die entsprechende Anzahl von Teströhrchen zugegeben werden. Gleichzeitig werden Vergleichspro.ben mit Standard-Serum hergestellt. Die Aktivität kann dann im Verhältnis zu der eines Standard-Serums ausgedrückt werden.in different dilutions in level / in the corresponding Number of test tubes to be added. At the same time, comparison samples are made with standard serum. The activity can then be expressed in relation to that of a standard serum.

Bei Anwesenheit von gegen das an Teilchen gebundene Allergen (Rinder-Epithel-Allergen) gerichtetem Reagin-Ig in der Serumprobe des allergischen Patienten ist die von diesem Röhrchen abgegebene Strahlung hoch, während die Strahlung des das Vergleichsserum der nicht-allergischen Probe enthaltenden Röhrchens sehr niedrig war. Es wurde jedoch beobachtet, daß bei Verwendung eines handelsüblichen Rinder-Epithel-Allergenextrakts mit dem das Vergleichsserum enthaltenden Röhrchen ein hohes Ausmaß an Strahlung erhalten wurde. Wurde das Verfahren unter Zusatz von 0,05 ml Rinderserum, auf 1:5o in o,15-molarer Natriumchloridlösung verdünnt, zu den Röhrchen in Stufe 2 und 3 wiederholt, so wurde bei dem das Serum des allergischen Patienten enthaltenden Röhrchens keine Veränderung der Strahlung beobachtet, jedoch ergab das Röhrchen mit dem Vergleichsserum der nicht-allergischen Person eine sehr niedrige Strahlung. If reagin-Ig directed against the particle-bound allergen (bovine epithelial allergen) is present in the serum sample of the allergic patient, the radiation emitted by this tube is high, while the radiation of the das The comparative serum of the tube containing the non-allergic sample was very low. However, it has been observed that Use of a commercially available bovine epithelial allergen extract with the tube containing the comparison serum a high Level of radiation received. The procedure was carried out with the addition of 0.05 ml of bovine serum, to 1: 5o in 0.15 molar Sodium chloride solution diluted, repeated to the tubes in steps 2 and 3, in which case the serum of the allergic No change in radiation was observed in the tube containing the patient, but the tube with the comparison serum of the non-allergic person gave very low radiation.

Example 2

Unterdrückung falscher positive Ergebnisse bei der Bestimmung von gegen tierisches Allergen (Pferde-Epithel) gerichteteen Reagin-Ig.Suppression of false positives in the determination of those directed against animal allergen (horse epithelium) Reagin Ig.

A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundem Allergen ^einteiliges, durch Glycerin-At herb rücken vemetztes DextranA. Manufacture of particles with chemically bound allergen ^ one-part dextran that is backed up by glycerine atom

1098Γ0/12481098-0 / 1248

(Sephadex G 25, superjün), welches durch Isothiocyanat-phenoxyhydroxypropylgruppen substituiert war (R. Axen und J. Porath, Acta Chem. Scan. 18 (1964-), S. 2193) wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Zu einer Suspension von 1oo mg der leuchen in einer wässrigen Natriumbicarbonatlösung wurde 1 ml der Allergenlö'sung (handelsüblicher All er gen extrakt) mit etwa der· gleichen Konzentration wie in Beispiel 1 zugegeben. Das Gemisch wurde dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei es ständig langsam in vertikaler Ebene rotiert wurde. Die Teilchen wurden dann abzentrifugiert und 2 χ mit «jeweils 0,5-molarer Natriumbicarbonatlösung, o,1-molarem Acetatpuffer und 0,1-molarem Iris-Puffer mit 1% Rinder-Serum-Alumin gewaschen. Die Teilchen wurden darauf homogenisiert und in a,1-molarem Tris—Puffer mit 1% Rinder-Serum-Albumin suspendiert.(Sephadex G 25, super young), which is characterized by isothiocyanate-phenoxyhydroxypropyl groups (R. Axen and J. Porath, Acta Chem. Scan. 18 (1964-), p. 2193) was used as the starting material used. To a suspension of 100 mg of the glow in of an aqueous sodium bicarbonate solution became 1 ml of the allergen solution (commercial allergen extract) was added in approximately the same concentration as in Example 1. The mixture was then incubated for 3 days at room temperature, with it constantly was rotated slowly in the vertical plane. The particles were then centrifuged and 2 χ with «each 0.5 molar sodium bicarbonate solution, 0.1 molar acetate buffer and 0.1 molar Iris buffer washed with 1% bovine serum aluminum. The particles were then homogenized and in a, 1-molar Tris buffer with 1% bovine serum albumin suspended.

B. Isolierung von !Fragmenten Reagin-Ig-haltiger, klassenspezifischer Determinanten (sogenannten Fc-Fragmenten).B. Isolation of fragments of reagin-Ig containing, class-specific Determinants (so-called Fc fragments).

1oo mg Reagin-Ig (Herstellung siehe Beispiel 1B) in o,1-molarem Natriumphosphat-Puffer (pH 7,o) mit 1-m Cystein wurden 4- Std. lang mit 1 mg Pepsin bei 37°0 inkubiert, worauf die.Reaktion durch Zusatz einer Jodacetamidlösung in einer Endkonzentration von o,o5-m abgebrochen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Gelfiltration unter Verwendung eines Mischpolymeren aus Dextran und Epichlorhydrin (Sephadex G 15o) fraktioniert, wobei die Wasserrückgewinnung 15 g pro Gramm Feststoff betrug. Die Miierung der Gelschicht erfolgte mit o,1-m Tris-HOl, o,2-m NaCl-Puffer (pH 7,7)· Die Fc-Fragmente enthaltenden Fraktionen wurden analytisch ermittelt und für Immunisierungszwecke gesammelt. 100 mg Reagin-Ig (preparation see Example 1B) in 0.1 molar sodium phosphate buffer (pH 7.0) with 1 M cysteine were incubated for 4 hours with 1 mg pepsin at 37 ° 0, whereupon the. Reaction was terminated by adding an iodoacetamide solution in a final concentration of 0.05-m. The reaction mixture was then fractionated by gel filtration using a copolymer of dextran and epichlorohydrin (Sephadex G 150), the water recovery being 15 grams per gram of solids. The gel layer was coated with 0.1 m Tris-HCl, 0.2 m NaCl buffer (pH 7.7). The fractions containing Fc fragments were determined analytically and collected for immunization purposes.

0. Herstellung von Antikörpern gegen das Fc-Fragment von Reagin-Ig.0. Production of antibodies against the Fc fragment of Reagin Ig.

109850/1248109850/1248

Die Herstellung des Antiserums erfolgte analog dem Verfahren von Beispiel 10» Gegen das Fc-Fragment gerichtete Antikörper wurden aus diesem Antiserum wie folgt isoliert: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-Ig wurden mit 34- ml einer Lösung vermischt, welche etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt (isoliert aus Antiserum gegen Fc-Sragmente durch Ionenaustausch-chromatographie). Die dabei erhaltene Suspension wurde bei pH 7 und 4°C 2 Stunden lang aktiviert, dann wurde sie zentrifugiert (2o ooo χ g, 2o Minuten, +1o°C). Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit o,15 m NaOl - 8-m Harnstoff, pH 6-7, gewaschen, dann wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. Der Waschvorgang wurde solange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit proteinfrei war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9 ml o,1-m Glycin-HCl-Puffer (pH 3»1) zugegeben, dann wurde unter Rühren 4o Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die gesamte Lösung wurde sodann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 12oo ml o,o1-m Tris-HOl o,1-m NaGl (pH 7»Ό ^o Stunden lang bei 4-⁰C d-ialysiert. Diese Lösung enthielt Antikörper in einer Menge von 1 mg pro ml, die spezifisch sind gegen das Fc-Fragment von Eeagin-Ig, und somit auch gegen das gesamte Reagin-lg. Dieses Material reicht für einige 1o Millionen Bestimmungen aus·The antiserum was prepared analogously to the method of Example 10. Antibodies directed against the Fc fragment were isolated from this antiserum as follows: 2 g of a complex of bromoacetyl cellulose and reagin-Ig were mixed with 34 ml of a solution containing about 95 mg Contained immunoglobulin (isolated from antiserum against Fc fragments by ion exchange chromatography). The suspension obtained was activated at pH 7 and 4 ° C. for 2 hours, then it was centrifuged (20,000 g, 20 minutes, + 10 ° C.). The supernatant liquid was removed, the cellulose was washed with 0.15 M NaOl - 8-M urea, pH 6-7, then centrifuged and the supernatant liquid was removed. The washing process was repeated until the supernatant liquid was free of protein. The cellulose-protein complex was added to 9 ml of 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3 »1), and the mixture was then incubated at 37 ° C. for 40 minutes with stirring. The entire solution was then centrifuged and the supernatant liquid was ialysiert d versus 12oo ml o, o1-m Tris-HOl o, 1-m Nagl (pH 7 "Ό ^ o hours at 4 ⁰ C. This solution contained antibodies in an amount of 1 mg per ml, which are specific against the Fc fragment of Eeagin-Ig, and thus also against the entire Reagin-Ig. This material is sufficient for some 10 million determinations.

D. Markierung der Antikörper.D. Labeling of Antibodies.

Dieses "Verfahren wurde wie in Beispiel 1 für Reagin-Ig oder gemäß Beispiel 5 für Antikörper gegen Reagin-Ig beschrieben durchgeführt.This "procedure was as in Example 1 for Reagin-Ig or as described in Example 5 for antibodies against Reagin-Ig carried out.

E. Bestimmungsverfahren.E. Determination procedure.

1. o,5 ml einer Teilchensuspension mit chemisch gebundenem1. o, 5 ml of a particle suspension with chemically bound

109850/1248109850/1248

.Pferdeepithel-Allergen, Herstellung siehe Absatz A₁ wurden in jeweils 2 Teströhrchen eingefüllt, die Suspension enthielt jeweils 1 mg Teilchen pro ml.Horse epithelial allergen, for preparation see paragraph A ₁ , were filled into 2 test tubes each, the suspension contained 1 mg of particles per ml.

2. o,o5 ml des zu untersuchenden Serums wurden in eines der Röhrchen eingegeben.2. o, o5 ml of the serum to be examined were in one of the Tubes entered.

3. o,o5 ml eines Vergleichsserums nicht-allagischer Herkunft wurden in das andere Röhrchen eingefüllt.3. 0.05 ml of a reference serum of non-Allagan origin were poured into the other tube.

4. Der Inhalt der Röhrchen wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Röhrchen langsam in vertikaler Ebene rotiert wurden.4. The contents of the tubes were left for 5 hours at room temperature incubated, the tubes were slowly rotated in the vertical plane.

5. Dann wurde bei 3 ooo Umdrehungen pro Blinute 1 Minute lang zentrifugiert, danach wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt. 5. Then, at 3,000 revolutions per minute for 1 minute centrifuged, then the supernatant liquid was removed.

6. Die Teilchen wurden 3 χ mit o,1-m Tris-Puffer pH 7,4» 1% Rinderserum-Albumin gewaschen. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach jedem Zentrifugieren abgesaugt. Dabei wurde sichergestellt, daß keine festen Teilchen beim Absaugen mitgerissen wurden» 6. The particles were 3 χ with 0.1 m Tris buffer pH 7.4 » 1% bovine serum albumin washed. The supernatant liquid was aspirated after each centrifugation. It was ensured that no solid particles were entrained during the suction process »

?. o,1 ml der gemäß Absatz C erhaltenen Lösung mit Antikörpern gegen die Pc-Fraktion von Reagin-Ig, mit <Jod-125 markiert, wurden in sämtliche Röhrchen gegeben.?. 0.1 ml of the antibody solution obtained in accordance with paragraph C against the Pc fraction of Reagin-Ig, labeled with <iodine-125, were added to all tubes.

8. Dann wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Röhrchen langsam in vertikaler Ebene rotiert wurden.8. It was then incubated for 15 hours at room temperature, whereby the tubes were rotated slowly in a vertical plane.

9. Dann wurde 1 Minute lang bei 3 ooo Umdrehungen pro Minute9. It was then run for 1 minute at 3,000 revolutions per minute

V .ifugiert, darauf wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt V .ifuged, then the supernatant liquid was removed

1098G0/ 12 4 81098G0 / 12 4 8

- Iß -- Eat -

10 2T2612810 2T26128

Ιο. Die Teilchen wurden 3 x mit o,1-m Tris-Puffer (pH 7 mit 1 Gewichtsprozent Rinderserum-Albumin gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt wurde. Dabei wurde sichergestellt, daß beim Absaugen keine festen Teilchen mitgerissen wurden.Ιο. The particles were washed 3 times with 0.1 m Tris buffer (pH 7 washed with 1 percent by weight bovine serum albumin, with centrifuged after each washing process and the supernatant liquid was sucked off. It was ensured that that no solid particles were entrained during suction.

11. Im Scintillations-Detektor wurde die ^T-Strahlung gemessen. 11. The ^ T radiation was measured in the scintillation detector.

Die endgültige Bestimmung erfolgte dann durch Vergleich der Strahlungsintensität zwischen dem Röhrchen mit der zu untersuchenden Probe und dem Röhrchen mit Vergleichsserum.The final determination was then made by comparing the radiation intensity between the tube and that to be examined Sample and the tube with reference serum.

Gemäß einer Variante kann man nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe 8 ein bestimmtes Volumen der überstehenden !Flüssigkeit in Zählröhrchen überführen, worauf Tdie ^T-Strahlung in der Lösung messen kann.According to a variant, after centrifuging according to step 8, a certain volume of the supernatant liquid can be added Transfer into counting tubes, whereupon the ^ T radiation in the Solution can measure.

Für quantitative Bestimmungen werden o,o5 ml des Testserums in verschiedenen Verdünnungen in Stufe 2 einer Vielzahl von Teströhrchen zugesetzt. Gleichzeitig werden die Vergleichsröhrchen mit Standardserum bereitgestellt. Die Ergebnisse werden durch Aktivitätsvergleich erhalten.For quantitative determinations, 0.05 ml of the test serum are used in various dilutions in stage 2 of a large number of Test tubes added. At the same time, the comparison tubes with standard serum are provided. The results are obtained by activity comparison.

Ist in der Serumprobe des allergischen Patienten gegen das gefundene Allergen gerichtetes Reagin-Ig vorhanden, so erhält man eine starke Strahlung, während das Röhrchen mit Serum nicht-allergischer Herkunft eine sehr schwache Strahlung ergibt Es wurde jedoch gefunden, daß bei Verwendung von handelsüblichem Pferdeepithel-Allergenextrakt auch das Röhrchen mit dem Vergleichsserum eine starke Strahlung liefert. Wiederholt man das Verfahren unter Zusatz von o,o5 ml einer Lösung zu jedem der Röhrchen in Stufe 2 und 3, die o,1 mg pro ml ^-GlobulinIf reagin-Ig directed against the allergen found is present in the serum sample of the allergic patient, then strong radiation, while the tube with serum of non-allergic origin gives very weak radiation However, it has been found that when using commercially available horse epithelial allergen extract, the tube with the Comparative serum provides strong radiation. One repeats the procedure with the addition of 0.05 ml of a solution to each of the tubes in stage 2 and 3, the 0.1 mg per ml ^ -Globulin

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von Schafen oder Pferden in o,15-molarer Natriumchloridlösung enthält, so verändert sich die Strahlung des RöhrGhens mit dem Serum des allergischen Patienten nicht, während andererseits das Röhrchen mit dem Vergleichsserum nur eine sehr geringe Strahlung ergibt.from sheep or horses in 0.15 molar sodium chloride solution contains, the radiation of the RöhrGhens changes with it the serum of the allergic patient, while on the other hand the tube with the comparison serum only a very small one Radiation results.

Example 3

Markierung von Antikörpern gegen Reagin-Ig Antikörper gegen Reagin-Ig Labeling of antibodies against Reagin-Ig Antibodies against Reagin-Ig

Diese wurden hergestellt durch Immunisierung von Schafen mit Reagin-Ig gemäß der Vorschrift von Beispiel 2G.These were prepared by immunizing sheep with Reagin-Ig according to the procedure of Example 2G.

Jod-125 ohne Träger wurde in Form von Natriumiodid in o,1-molarer, von Reduktionsmitteln freier Natriumhydroxydlösung verwendet.Iodine-125 without a carrier was in the form of sodium iodide in 0.1 molar, Sodium hydroxide solution free of reducing agents used.

Jodmonochlorid wurde nach der Methode von J.L. Izzo,- \tf.S¹, Bale, M.J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Chem. 239, Nr. 11 (1964) 374-2 hergestellt, der Jodgehalt wurde durch Reduktion des gesamten Jods zum Jodid mit Arsentrioxyd und anschließende 'J'itration mit o,1-molarer Silbernitratlösung bestimmt. Die Jodmonochlorid-Grundlösung enthielt 2,54- nig Jod pro ml in o,o2-m KCl, 2,o-m WaGl und 1,o-m HGl, sie ist bei Raumtemperatur mindestens 18 Monate lang beständig» Vor der Verwendung wurde die Jodmonochlorid-Grundlösung auf die erforderliche κ.oxizentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde eine Gin Lorwasserstoff-Natriumchloridlösung zubereitet, deren Konzentration von Fall zu Fall wie in Beispiel 1 beschrieben eingesbellt wurde.Iodine monochloride was prepared by the method of JL Izzo, - \ tf.S ¹ , Bale, MJ Izzo and A. Roncone, J. Biol. Chem. 239, No. 11 (1964) 374-2, the iodine content was determined by reducing the determined total iodine to iodide with arsenic trioxide and subsequent nitration with 0.1 molar silver nitrate solution. The iodine monochloride basic solution contained 2.54 nig iodine per ml in o, o2-m KCl, 2, om WaGl and 1, om HGl, it is stable for at least 18 months at room temperature the required κ.oxicentration is diluted. A gin hydrogen chloride-sodium chloride solution was prepared as a diluent, the concentration of which was adjusted as described in Example 1 on a case-by-case basis.

1098 5 0/12 41098 5 0/12 4

1ooyu g Antikörper gegen Reagin-Ig wurden mit einem Molverhältnis von Jodmonochlorid zu Antikörpern von 2:1 und von Jodmonochlorid zu Jod-125 von 1:1 markiert (bezüglich der Vorschriften BeL siehe die in Beispiel 1 angeführte Literatur). Folgende Lösungen wurden verwendet:1ooyu g of antibodies against Reagin-Ig were tested with a molar ratio of iodine monochloride to antibodies of 2: 1 and of Iodine monochloride labeled 1: 1 to iodine-125 (for the BeL regulations, see the literature cited in Example 1). The following solutions were used:

Lösung I: Antikörper gegen Reagin-Ig wurden in o,2-m Tris-HCl-Puffer, pH 8, auf eine Konzentration von 1o,o mg pro ml gelöst.Solution I: Antibodies against Reagin-Ig were in o, 2-m Tris-HCl buffer, pH 8, dissolved to a concentration of 10, o mg per ml.

Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die Jodmonochlorid-Grundlösung wurde durch Lösen von 5 j84a Natriumchlor id in 35 ml 2,o m-Salzsäure und 65 ml destillierten Wassers zubereitet.Solution II: The diluent for the basic iodine monochloride solution was obtained by dissolving 5 j84a of sodium chlorid in 35 ml 2, o m-hydrochloric acid and 65 ml of distilled water.

Lösung III: Die endgültige Jodmonochloridlösung wurde durch Verdünnen von I00/U 1 der Jodmonochlorid-Grundlösuiig mit 2o,2 ml der Lösung II hergestellt»Solution III: The final Jodmonochloridlösung was prepared by diluting I00 / U 1 of iodine monochloride Grundlösuiig with 2o, 2 ml of the solution II prepared "

Lösung IV: 44,29/U 1 des Radiojodids (4,ο mCi) wurden zu 25/U der Lösung III zugegeben und vor Verwendung in einem Eisbad stehen gelassen. Sämtliche Lösungen wurden kalt gehalten und die Jodierungsreaktion erfolgte bei Sistemperatur. Die Reagentien wurden in folgender Reihenfolge eingesetzt: In ein kleines Glasröhrchen wurden 2oo/u 1 Borat-Carbonat-Puffer (o,4 m, pH 9,1) und IO/U 1 der Lösung 1 (I00/U g Antikörper gegen Reagin-Ig) eingefüllt, und dazu wurden 5°/U 1 der Lösung IV zugesetzt, dann wurde das Gemisch sofort kräftig bewegt. Nach 60 Sekunden wurden 2o/u 1 o,1-m Έ^^^®?,* 5o/U 1 2% KI und 2oO/U 1 5%iges menschliches Serum-Albumin-Blau zugesetzt. Das HSA-Blau war nach der Methode von Melani (F.Melani, K,H. Bartelt, R. Conrads, B.F. Pfeiffer, Z. klin. Chem. , 4. Jahrpr. 1966, Art. 4) hergestellt worden. Sein Zusatz erfolgte zur Verminderung von Zerstörung durch Strahlung und Adsorption vonSolution IV: 44.29 / U 1 of the radioiodide (4, ο mCi) were added to 25 / U of solution III and left to stand in an ice bath before use. All solutions were kept cold and the iodination reaction took place at sist temperature. The reagents were used in the following order: 2oo / u 1 borate carbonate buffer (0.4 m, pH 9.1) and 10 / U 1 of solution 1 (100 / U g antibody against reagent Ig), and 5 ° / U 1 of solution IV were added to this, then the mixture was immediately agitated vigorously. After 60 seconds, 2o / u 1 o, 1-m Έ ^^^ ®?, * 5o / U 1 2% KI and 2oO / U 1 5% human serum albumin blue were added. The HSA blue was produced according to the Melani method (F. Melani, K, H. Bartelt, R. Conrads, BF Pfeiffer, Z. klin. Chem., 4th year 1966, Art. 4). Its addition was made to reduce radiation damage and adsorption of

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Antikörpern an den Glaswänden. Das Präparat kann durch Gelfiltration (Agarosegel) an vernetztem Dextran (Sephadex oder Sepharose, eingetragene Warenzeichen) oder mit Ionenaustauschern (Dowex oder Amberlite, eingetragene Warenzeichen) gereinigt werden. Aus der Säule wurden Fraktionen bei etwa 4⁰O in Oji-m.Tris-HCl-Puffer.pH. 7»72, enthaltend 5 % HCA gewonnen. Die markierte Antikörper gegen Reagin-Ig enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in gefrorenem Zustand aufbewahrt.Antibodies on the glass walls. The preparation can be purified by gel filtration (agarose gel) on cross-linked dextran (Sephadex or Sepharose, registered trademarks) or with ion exchangers (Dowex or Amberlite, registered trademarks). From the column fractions were at about 4 ⁰ O in Oji-m.Tris-HCl-Buffer.pH. 7 »72 containing 5 % HCA recovered. The fractions containing labeled antibodies against Reagin-Ig were pooled and stored in the frozen state.

Nach dieser Methode werden 81,3% der gesamten Jodmenge an die Antikörper gebunden. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom Jod-125 und etwa 1 Atom Jod-127 pro Molekül (Molekulargewicht 15o ooo) und wies eine spezifische Aktivität von etwa 16 mCi/mg auf.According to this method, 81.3% of the total amount of iodine is added to the Antibody bound. The labeled immunoglobulin contained about 1 atom of iodine-125 and about 1 atom of iodine-127 per molecule (molecular weight 150,000) and had a specific activity of about 16 mCi / mg.

Example 4

Das "Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Polymer feinkörnige mikrokristalline Cellulose verwendet.The "procedure of Example 1 was repeated except that fine-grained microcrystalline cellulose is used as the polymer.

Example 5

Unterdrückung falscher positiver Ergebnisse bei Schwangerschaftstests. Suppression of false positives in pregnancy tests .

Der verwendete Test basierte auf der Agglutination von Latexteilchen, welche in einem Lösungsmittel suspendiert und mit gegen menschliches Choriongonadotropin (HCG) gerichtetenAntikörper nicht-menschlichen Ursprungs überzogen waren. Die Suspension wurde mit menschlichem Serum auf einer Glasplatte in Berünrung gebracht, und bei hohen HGG-Werten des Serums erhieltThe test used was based on the agglutination of latex particles, which are suspended in a solvent and containing antibodies directed against human chorionic gonadotropin (HCG) of non-human origin. The suspension was mixed with human serum on a glass plate in Brought to mind, and received when the HGG values of the serum were high

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man auf der Platte ein körniges Agglutinat. Diese Form läßt sich leicht von der gleichmäßigen Suspension unterscheiden, die man erhält, wenn keine Agglutinierung erfolgt.a granular agglutinate on the plate. This form leaves differ slightly from the uniform suspension obtained if no agglutination occurs.

Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt: Ein Tropfen Lösungsmittel (o,9 % WaGl, o,o5-m Phosphatpuffer, pH 7,4-, o,o5 % NaN₇,) wurde auf eine Glasplatte getropft, dann wurde ein Tropfen menschliches Serum zugegeben. Serumprobe und Lösungsmittel wurden gut vermischt. Sodann wurde 1 Tropfen einer Suspension von Latexteilchen, an welche HCG-Antikörper von Schafen gebunden waren, im obigen Lösungsmittel zugesetzt, dann wurde gut mit Serum und Lösungsmittel gemischt, die Glasplatte wurde 2 Minuten lang leicht geschüttelt.The experiment was carried out as follows: a drop of solvent (0.9% WaGl, 0.05-m phosphate buffer, pH 7.4, 0.05% NaN ₇ ) was dripped onto a glass plate, then a drop of human serum became admitted. Serum sample and solvent were mixed well. Then, 1 drop of a suspension of latex particles to which sheep HCG antibodies were bound in the above solvent was added, followed by mixing well with serum and solvent, and gently shaking the glass plate for 2 minutes.

Bei Anwesenheit von HOG in höheren Konzentrationen wurden die Latexteilchen agglutiniert.In the presence of HOG in higher concentrations, the Latex particles agglutinate.

Bei der Untersuchung zahlreicher Serumproben von Frauen, die mit Sicherheit nicht schwanger waren, sowie von Serumproben von Männern, ergaben mehrere Proben einen falschen positiven Nachweis. Um diese Fehlergebnisse auszuschalten, wurde folgender Test durchgeführt:When examining numerous serum samples from women who were definitely not pregnant, as well as serum samples from Men, multiple samples gave false positive results. To eliminate these error results, the following was made Test completed:

1 Tropfen Lösungsmittel (siehe oben), welches zusätzlich o,1 mg pro ml Rinder- T-Globulin enthielt, wurde auf eine Glasplatte gegeben, dann wurde 1 Tropfen menschlichen Serums zugesetzt. Serum und Lösungsmittel wurden gemischt. Dann erfolgte Zusatz von 1 Tropfen einer Suspension der Latexteilchen mit gebundenen HCG-Antikörpern von Schafen in o,9% NaCl, o,o5-m Phosphatpuffer, pH 7,4, 0,05% NaN;,, dann wurde gut gemischt. Die Glasplatte wurde 2 Minuten lang mäßig geschüttelt. In allen Fallen, in denen vorher falsche positive Ergebnisse erzielt worden waren, blieb der Nachweis nun negativ. In keinem Fall wurde durch den Zusatz des Rinder- T -Globulins der richtip^erweise positive Nachweis gestört.1 drop of solvent (see above), which additionally contained 0.1 mg per ml of bovine T-globulin, was placed on a glass plate, then 1 drop of human serum was added. Serum and solvent were mixed. Then 1 drop of a suspension of the latex particles with bound HCG antibodies from sheep in 0.9% NaCl, 0.05-m phosphate buffer, pH 7.4, 0.05% NaN, was added; then mixed well. The glass plate was shaken gently for 2 minutes. In all cases in which false positive results had previously been obtained, the evidence now remained negative. In no case was the correct positive detection disturbed by the addition of the bovine T-globulin.

10 9 8 ;.: il / 1 2 U 810 9 8;.: Il / 1 2 U 8

Example 6 Determination of Ιτηττηιηοglobulin E (IgE) in serum

A. Herstellung von Antikörpern gegen Immunoglobulin BA. Production of antibodies against immunoglobulin B

Schafen wurde intramuskulär ein Gemisch aus ο,5 mg IgE (hergestellt aus Serum eines Patienten mit IgB-Myeloma) in o,2 ml o,15m-Natriumchloridlösung und o,8 ml Freund's-Hilfsmittel injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14- Tagen und dann 1 χ wöchentlich 3 Wochen lang wiederholt. Nach Ablauf von 1o Tagen danach wurden die Tiere entblutet und das Antiserum wurde gewonnen, indem man das Blut koagulierte und den Blutkuchen entfernte.Sheep was intramuscularly prepared a mixture of ο.5 mg IgE ( from serum from a patient with IgB myeloma) in 0.2 ml 0.15m sodium chloride solution and 0.8 ml Freund's aids injected. The immunization was repeated after 14 days and then once a week for 3 weeks. After 1o Days thereafter, the animals were bled and the antiserum was recovered by coagulating the blood and the blood cake distant.

Das Antiserum wurde durch Adsorption mit sogenannten leichten Polypeptidketten aus Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteinen währen«
macht.The antiserum was absorbed by so-called light polypeptide chains from immunoglobulin G and Bence Jones proteins.
power.

während 1 Stunde bei 37°O und 16 Stunden bei 4-°0 spezifisch ge-specifically for 1 hour at 37 ° O and 16 hours at 4 ° 0

Die Antikörper-Fraktion wurde aus dem Antiserum durch Behandeln mit einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung ausgefällt, wobei 2,5 ml der Lösung pro 5 ml Serum zugesetzt wurden·The antibody fraction was precipitated from the antiserum by treatment with a saturated aqueous ammonium sulfate solution, adding 2.5 ml of the solution per 5 ml of serum

Der Hiedersahlag wurde abzentrifugiert, dann in Wasser gelöst, worauf die Ausfällung mit Ammoniumsulfatlösung 2 χ wiederholt wurde. Nach der dritten Ausfällung wurde der Niederschlag in 5 ml wässriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, worauf Dialyse gegen o,1 m-Natriumbicarbonatlösung erfolgte.The Hiedersahlag was centrifuged off, then dissolved in water, whereupon the precipitation with ammonium sulfate solution 2 is repeated became. After the third precipitation, the precipitate was dissolved in 5 ml of aqueous sodium bicarbonate solution, followed by dialysis against 0.1 M sodium bicarbonate solution.

B. Herstellung von Teilchen mit kovalent gebundenen Antikörpern. 1o g eines Mischpolymeren, hergestellt durch Umsetzung von Dextra:B. Preparation of particles with covalently bound antibodies. 1o g of a mixed polymer, produced by reacting Dextra:

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mit Epichlorhydrin (Sephadex G-25 superfein) wurden unter Rühren 3 Minuten lang in 2oo ml einer BromEyanlösung gequollen, die 1o g Bromcyan pro 1oo ml Wasser enthielt. Dann wurde eine 5m-Natriumhydroxydlösung unter Rühren bis zur Erreichung eines pH-Werts von 1o,7 zugesetzt» Dieser pH-Wert wurde 8 Minuten lang konstant gehalten, die' Temperatur wurde während des gesamten Verfahrens bei 2o°C gehalten. Das Gemisch wurde dann auf Glasfilter übertragen und sorgfältig mit Wasser neutral gewaschen. Die abgetrennten Teilchen wurden durch Waschen mit Aceton geschrumpft, dann sorgfältig getrocknet, worauf sie gelagert werden konnten, beispielsweise bei -2o°C. 5 g der derart mit Bromcyan aktivierten Teilchen wurden in 3o ml wässriger o,1~m-Natriumbicarbonatlösung gequollen. Unter Bewegung des Gemische wurden dann 5 ml der dialysierten Antikörperlösung gemäß Absatz A zugetropft. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 2o°C gerührt, dann filtriert, der Filterrückstand wurde mit o,5 m-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen. Das Produkt kann dann vorsichtig getrocknet werden, z.B. durch Lyophilisierung.with epichlorohydrin (Sephadex G-25 superfine) were under Stirring for 3 minutes, swollen in 2oo ml of a bromine solution containing 10 g of cyanogen bromide per 100 ml of water. Then became a 5m sodium hydroxide solution was added with stirring until a pH of 10.7 was reached. This pH was 8 minutes kept constant for a long time, the temperature was kept at 20 ° C. throughout the process. The mixture was then transferred to glass filters and carefully washed neutral with water. The separated particles were through Washed with acetone shrunk, then carefully dried, whereupon they could be stored, for example at -2o ° C. 5 g of the particles activated in this way with cyanogen bromide were swollen in 30 ml of aqueous 0.1 μm sodium bicarbonate solution. Under Agitation of the mixture then added 5 ml of the dialyzed antibody solution added dropwise according to paragraph A. The mixture was stirred at 20 ° C. for 24 hours, then filtered, the filter residue was washed with 0.5 M sodium bicarbonate solution to remove unbound material. The product can then carefully dried, e.g. by lyophilization.

0. Herstellung von markiertem Immunoglobulin E.0. Production of Labeled Immunoglobulin E.

Immunoglobulin E wurde mit Jod-125 wie folgt markiert:Immunoglobulin E has been labeled with iodine-125 as follows:

125
2 mC I in Form von Natriumiodid wurde mit Chloramin T in Gegenwart von 2o ,u g IgE nach der Methode von Hunter und Greenwood (s. Nature/London, Bd. 194 (1962*), S. 495) oxydiert. Nach der Markierung wurde Natriumdithionit zugesetzt, um die restliche Jodmenge in lösliches Jodid zu überführen. Das mit Jod 125 markierte IgE wurde von niedermolekularen Produkten durch Gelfiltration an einem Mischpolymer aus Dextran und Epichlorhydrin (Sephadex G 15o) abgetrennt. Es wies eine spezifische Aktivität von 2o bis 3o mO pro mg auf. Ein Milliliter der markierten'Proteinfraktion wurde in ein kleines Gefäß überführt,125
2 mC I in the form of sodium iodide was oxidized with chloramine T in the presence of 20 μg IgE by the method of Hunter and Greenwood (see Nature / London, Vol. 194 (1962 *), p. 495). After labeling, sodium dithionite was added to convert the remaining amount of iodine into soluble iodide. The IgE labeled with iodine 125 was separated from low molecular weight products by gel filtration on a mixed polymer of dextran and epichlorohydrin (Sephadex G 150). It had a specific activity of 2o to 3o MO per mg. One milliliter of the labeled protein fraction was transferred to a small vessel,

109850/1248109850/1248

Α.?Α.?

welches 1/2 ml einer Lösung von Rinder-Plasma-Albumin (5o mg pro ml) enthielt. Das markierte IgB wurde in der Kälte aufbewahrt und vor Verwendung verdünnt.which 1/2 ml of a solution of bovine plasma albumin (50 mg per ml). The labeled IgB was stored in the cold and diluted before use.

D. BestimmungD. Determination

Die Analysen werden zweckmäßig in Glas- oder Kunststoffröhrchen von 5o x 1o mm ausgeführt.The analyzes are expediently carried out in glass or plastic tubes measuring 50 x 10 mm.

1. 1 ml einer Suspension von Polymerteilchen (z.B. 1 mg pro ml), an welche Antikörper gebunden sind, wird in jedes der Röhrehen eingefüllt.1. 1 ml of a suspension of polymer particles (e.g. 1 mg per ml), to which antibodies are bound is filled into each of the tubes.

2. o,25 ml der Serumprobe in verschiedenen Verdünnungen werden in die einzelnen Röhrchen eingefüllt.2. 0.25 ml of the serum sample in various dilutions are poured into the individual tubes.

5. o,25 ml einer Standard-Lösung mit verschiedenen Konzentrationen an IgE₁ z.B. I000, 5oo, 25o, I00, 5o, 15» 12,5 und 6,1 ng/ml und O ng/ml werden in die einzelnen Röhrchen zugegeben.5. 0.25 ml of a standard solution with various concentrations of IgE _1, for example 1000, 500, 25o, 100, 50, 15 »12.5 and 6.1 ng / ml and 0 ng / ml are added to the individual tubes .

4. Die Inkubation erfolgt während 2o Stunden bei Raumtemperatur, wobei die Röhrchen langsam rotiert werden.4. Incubation takes place for 20 hours at room temperature, the tubes being slowly rotated.

125125

5. o,1 ml der "X-IgE (ca. 15 Nanogramm pr. ml) enthaltenden5. 0.1 ml of the "X-IgE" (approx. 15 nanograms per ml) containing

Lösung werden in die einzelnen Röhrchen eingefüllt.Solution are poured into the individual tubes.

6. Dann wird wie gemäß 4, jedoch nur 4 Stunden lang, inkubiert.6. Incubation is then carried out as in FIG. 4, but only for 4 hours.

7. Es wird mit 3000 Umdrehungen pro Minute 5 Minuten lang ζ entrifugiert.7. It is centrifuged at 3000 revolutions per minute for 5 minutes.

8. Dann werden die Teilchen 2 χ mit einer o,9%igen wässrigen Nat^-ruinchloridlösung gewaschen. Wach der letzten Entfernung8. Then the particles 2 χ with a 0.9% aqueous Nat ^ ruin chloride solution washed. Wake up to the last distance

1 O 9 Q Γ» ΰ / m 81 O 9 Q Γ »ΰ / m 8

der überstehenden Flüssigkeit durch Absaugen werden die Röhrchen in Zählrohre zur Bestimmung der iT-Strahlung überführt.the supernatant liquid by aspiration becomes the tube transferred to counting tubes to determine the iT radiation.

9« Die Zählrate von standardisierten Röhrchen während einer bestimmten Zeit wird auf linear-logaritmisches Papier gegen die Dosis aufgetragen, wobei man-aus dem Diagramm die Menge an IgB in unbekannten Proben berechnen kann.9 «The counting rate of standardized tubes during a certain time is compared on linear-logaritmic paper the dose is plotted, the amount being taken from the diagram of IgB in unknown samples.

Als Alternative kann nach dem Zentrifugieren gemäß ötufe 7 ein Milliliter der überstehenden Flüssigkeit in ein Zählröhrchen überführt werden, worauf die ^-Strahlung des markierten IgB bestimmt werden kann. Die Zählwerte dieser Standardröhrchen können ebenso wie oben beschrieben zur Herstellung einer vSS'wendet werden.As an alternative, after centrifuging according to ötufe 7 one milliliter of the supernatant liquid is transferred to a counting tube, whereupon the ^ radiation of the marked IgB can be determined. The counts of these standard tubes can also be used to prepare a vSS 'must be used.

10 0 8 r; j /1 ? u 810 0 8 r; j / 1 ? u 8

Claims

Patent claims

1 · Procedure for performing tests on samples human Origin in which one antigen (I) and one against the Antigen-directed antibody (II) is converted in an immunological reaction in vitro, characterized in that that to avoid false indications as a result of the presence of human heterophilic antibodies (III) during the reaction is non-human in the presence of an ff-grlobulin Of origin against which the heterophile antibodies (III), which are insignificant for the test, are directed.

2. The method according to claim 1, characterized in that the The sample to be examined comes from human tissue, blood, blood plasma or blood serum *

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that that the antigen (I) or the antibody directed against the antigen (II) has been made insoluble.

4, method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that antigen (I) or antibody (II) by a ^ detectable atom or group is marked are.

5. The method according to claim 4, characterized in that the detectable atom or group a radioactive isotope or is a group containing a radioactive isotope,

6. The method according to claim 4, characterized in that the detectable atom or group is dye-forming or fluorescent. '~ ''■"*

109*60/1248109 * 60/1248

- 3ο -

7. Method according to one of Claims 1 to 6, characterized in that that the immunological reaction is carried out in conjunction with a radioimmunological test.

8. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that that the immunological reaction is carried out in conjunction with an agglutination test.

9. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that that the immunological reaction is carried out in conjunction with tests for antibodies directed against JSSfi ^ ßLlergene will"

10. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in, that the immunological reaction is carried out in tests for the determination of proteins or eptides.

11. Method according to one of Claims 1 to 6, characterized in that that the immunological reaction is carried out in pregnancy tests

12. The method according to claim 11, characterized in that the immunological response associated with pregnancy tests performed on the Iamunoreaction between Gonadotropin in the oil and antibodies to be examined against gonadotropin, which are bound to small particles, based *

«En»

13 · Real ** · »for use in the method according to one of the claims · 1 to 12, containing an antigen (I) of animal origin » which consists of animal IT globulin or this contains, characterized in that it also does not contain fr-globulin of animal origin, against which in the to be examined Sample of human heterophile antibodies present (III) the court.

109850/1248109850/1248

- at -

14. Reagent for performing the method according to one of the
Claims 1 "to 12, containing antibodies (II) of animal origin, characterized in that it also contains T-globulin
of non-human origin, against which human heterophilic antibodies (III) present in the sample to be examined are directed.

15 · reagent according to claim 14, characterized in that the Antibody specifically purified or bound to a solid support are.

16. Additive for use in the method according to any one of the claims 1 to 12, characterized in that it contains 2 ^ -globulin of non-human origin, against which in the to be examined The sample contained heterophile antibodies (III) of human origin are directed.

17. Additive according to claim 16, characterized in that it
consists of a solution containing the V -globulin of non-human origin.

For Pharmacia AB

Uppsala / Sweden

(Lawyer)

109850/1248109850/1248