CH645727A5

CH645727A5 - PREPARATION FOR DETERMINING HUMAN BETA-2-MICROGLOBULIN, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND ITS USE.

Info

Publication number: CH645727A5
Application number: CH776879A
Authority: CH
Inventors: Tetsuo Tomiyama; Takashi Ogura
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1978-08-28
Filing date: 1979-08-27
Publication date: 1984-10-15
Also published as: DE2934756A1; SE446130B; FR2435039A1; FR2435039B1; JPS5530652A; GB2030294A; SE7907118L; GB2030294B; DE2934756C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Präparat zur Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin, einem Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung. Das Präparat ist geeignet für eine qualitative und quantitative Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin, hat eine verbesserte Lagerfähigkeit und ergibt schnelle zuverlässige Ergebnisse, die gut reproduzierbar sind und eine hohe Genauigkeit aufweisen, ohne dass sie durch andere Proteine, die in der Probe enthalten sind, beeinträchtigt werden, und wobei ein einfaches Messverfahren und ein einfaches Messinstrument verwendet wird. The invention relates to a preparation for the determination of human β2-microglobulin, a method for its production and its use. The preparation is suitable for a qualitative and quantitative determination of human β2-microglobulin, has an improved shelf life and gives rapid, reliable results which are easily reproducible and have a high accuracy without being affected by other proteins which are contained in the sample. impaired, and using a simple measuring method and a simple measuring instrument.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Präparat zur Bestimmung von menschlichem ßi-Mikroglobulin aus Partikeln von synthetischem polymerem Latex mit einem Überzug von menschlichem ß2-MikrogIobulinantikörper. Vorzugsweise bestehen die Partikel aus einem Latex eines synthetischen Polymeren vom Styroltyp ausgewählt aus der Gruppe Styrolpolymer, Styrolcopolymer und carboxylierte oder Aminogruppen enthaltende carboxylierte Derivate derselben. The invention relates in particular to a preparation for the determination of human β-microglobulin from particles of synthetic polymer latex with a coating of human β2-microglobulin antibody. The particles preferably consist of a latex of a synthetic polymer of the styrene type selected from the group of styrene polymer, styrene copolymer and carboxylated or amino-containing carboxylated derivatives thereof.

Menschliches ßi-Mikroglobulin ist ein Protein, das ein relativ niedriges Molekulargewicht von etwa 12000 hat und das sich im Serum, Urin, cerebrospinalen Flüssigkeiten, Human β-microglobulin is a protein that has a relatively low molecular weight of about 12,000 and that is found in serum, urine, cerebrospinal fluids,

Saliva, Milch usw. des Menschen findet. Die In-vivo-Funk-tion von ß2-Mikroglobulin ist noch nicht völlig aufgeklärt worden. Kürzlich wurde jedoch festgestellt, dass bei bestimmten Erkrankungen, wie Entzündungen, Krebs und renalen Erkrankungen, sich der ß2-Mikroglobulingehalt in den Flüssigkeiten des menschlichen Körpers erhöht. Beispielsweise werden renale .Erkrankungen klassifiziert in solche, die verursacht werden durch glomerulare Unstimmigkeiten und solche durch Erkrankungen der renalen Tubuli. Bei dem letztgenannten Fall erhöht sich der ß2-Mikroglobulingehalt zuerst im Blut, d.h. im Serum und dann im Urin. Saliva, milk, etc. of humans. The in vivo function of ß2-microglobulin has not yet been fully elucidated. However, it has recently been found that in certain diseases, such as inflammation, cancer and renal diseases, the ß2-microglobulin content in the fluids of the human body increases. For example, renal diseases are classified into those caused by glomerular inconsistencies and those caused by diseases of the renal tubules. In the latter case, the β2-microglobulin content first increases in the blood, i.e. in the serum and then in the urine.

Das ß2-Mikroglobulin ist ein Protein, das die glomerulare Membrane durchdringt und dann readsorbiert wird von den renalen Tubuli. Wenn jedoch eine Erkrankung der renalen Tubuli vorliegt, geht das Protein in den Urin über, ohne readsorbiert zu werden. Daher ist der Gehalt an ß2-Mikroglobuiin im Urin eine der besten Parameter für die Funktion der renalen Tubuli. Daher kann eine Unstimmigkeit der renalen Tubuli diagnostifiziert werden durch Bestimmung des Gehalts an ß2-Mikroglobulin in Serum und Urin. The ß2-microglobulin is a protein that penetrates the glomerular membrane and is then readsorbed by the renal tubules. However, if there is renal tubule disease, the protein passes into the urine without being readsorbed. Therefore, the level of ß2-microglobuiin in the urine is one of the best parameters for the function of the renal tubules. Therefore, a discrepancy in the renal tubules can be diagnosed by determining the level of β2-microglobulin in serum and urine.

Bis heute ist kein geeignetes Verfahren bekannt zur Beurteilung von Unstimmigkeiten bei den renalen Tubuli. Es ist jedoch eine leichte Diagnose möglich durch Messen des ß2-Mikroglobulingehalts im Serum und im Urin, wodurch ein geeigneter Weg zur Behandlung der Erkrankung geschaffen wird. Dieser ist sehr wichtig und geeignet für klinische Anwendung. To date, no suitable method is known for assessing discrepancies in the renal tubules. However, easy diagnosis is possible by measuring the ß2-microglobulin content in the serum and in the urine, thereby creating a suitable way of treating the disease. This is very important and suitable for clinical use.

Ein Verfahren zur Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin im Serum oder Urin mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit entspricht einem dringenden Bedürfnis. Jedoch ist keines der konventionellen Verfahren zur Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin befriedigend. A method for the determination of human β2-microglobulin in serum or urine with high accuracy and reliability corresponds to an urgent need. However, none of the conventional methods for the determination of human β2-microglobulin is satisfactory.

Eines der bekannten Verfahren ist ein «Einzelradialimmu-nodiffusion»-Verfahren bei dem auf einer Agarplatte, die menschlichen ß2-Mikroglobulinantilcörper enthält, Vertiefungen vorgesehen sind, in die die Probe eingebracht wird und wobei das menschliche ß2-Mikroglobulin bestimmt wird durch eine Aüsfällungsbande, die durch Diffusion des ß2-Mikroglobulins entsteht. Da dieses Verfahren eine niedrige Empfindlichkeit hat, kann es nur verwendet werden zur Bestimmung von ß2-Mikroglobulin in Proben innerhalb einer gewissen Konzentrationsgrenze. One of the known methods is a “single radial immunodiffusion” method in which wells are provided on an agar plate which contains human β2-microglobulin antibody bodies, into which the sample is introduced and the human β2-microglobulin is determined by a precipitation band, the by diffusion of the ß2-microglobulin. Since this method has a low sensitivity, it can only be used to determine β2-microglobulin in samples within a certain concentration limit.

Es ist ferner eine Radioimmunoassayverfahren bekannt, bei dem ß2-Mikroglobulin bestimmt wird durch Verwendung eines menschlichen ß2-Mikrog!obulinantikörpers, der mit einem Radioisotop markiert ist. Dieses Verfahren ist gefährlich und beschwerlich, da mit radioaktiven Substanzen gearbeitet werden muss. Daher kann es nur durchgeführt werden mit ausreichenden Kontrollen und einer Einrichtung zur Verwendung von radioaktiven Substanzen. A radioimmunoassay method is also known in which β2-microglobulin is determined by using a human β2-microglobulin antibody which is labeled with a radioisotope. This procedure is dangerous and burdensome since radioactive substances have to be used. Therefore it can only be carried out with sufficient controls and a facility for the use of radioactive substances.

Bei einem weiteren Verfah'ren wird eine umgekehrte passive Hemagglutinationsreaktion (RPHA) verwendet zur Bestimmung von ß2-Mikroglobulin, die hinsichtlich der Empfindlichkeit gleich ist dem Radioimmunoassayverfahren. Da bei diesem Verfahren rote Blutzellen von Tieren als Träger verwendet werden, hat sie den Nachteil, dass bei der Herstellung von Antikörper sensibilisierten roten Blutzellen eine Vorbehandlung der roten Blutzellen wie Fixierung der roten Blutzellen und Behandlung der roten Blutzellen mit Bindemitteln wie Glutaraldehyd oder Tanninsäure notwendig sind. Da bei den tatsächlichen Messungen bei den als Antikörper für die roten Blutzellen verwendeten Träger nicht spezifische Reaktionen auftreten, ist es notwendig, eine Absorptionsbehandlung mit den roten Blutzellen durchzuführen sowie ein Kontrollverfahren unter Verwendung von Zellen, die mit Tanninsäure behandelt sind. Another method uses an inverted passive hemagglutination reaction (RPHA) to determine β2-microglobulin, which is similar in sensitivity to the radioimmunoassay method. Since this method uses red blood cells from animals as carriers, it has the disadvantage that in the production of antibody-sensitized red blood cells, pretreatment of the red blood cells such as fixation of the red blood cells and treatment of the red blood cells with binders such as glutaraldehyde or tannic acid are necessary . Since non-specific reactions occur in the actual measurements on the carriers used as antibodies for the red blood cells, it is necessary to perform absorption treatment with the red blood cells and a control method using cells treated with tannic acid.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden und ein Verfahren zur The object of the present invention is to avoid the disadvantages mentioned above and a method for

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Bestimmung von menschlichen ß2-Mikroglobulin unter Verwendung einer einfachen Vorrichtung und einer einfachen Messoperation, bei der zuverlässige Ergebnisse mit hoher Genauigkeit erhalten werden, zur Verfügung zu stellen. To provide determination of human β2-microglobulin using a simple device and a simple measurement operation in which reliable results are obtained with high accuracy.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind das im Anspruch 1 definierte Präparat, das im Anspruch 8 beschriebene Verfahren zur Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin und das im Anspruch 10 beschriebene Verfahren zur Herstellung des Präparates. The present invention relates to the preparation defined in claim 1, the method for determining human β2-microglobulin described in claim 8 and the method for producing the preparation described in claim 10.

Das genannte erfindungsgemässe Präparat hat ferner eine überlegene Lagerbeständigkeit und die Messung wird nicht beeinträchtigt durch andere Proteine, die in der Probe enthalten sein können. Wie ferner gefunden wurde, kann das genannte Präparat einfach hergestellt werden und nicht nur in Form eines Latex, sondern auch als Trockenprodukt gelagert werden. Said preparation according to the invention also has a superior shelf life and the measurement is not impaired by other proteins that may be contained in the sample. As was also found, the preparation mentioned can be easily produced and stored not only in the form of a latex, but also as a dry product.

Menschliches ß2-Mikroglobulin ist vorhanden in verschiedenen menschlichen Körperflüssigkeiten wie Urin, Milch, Serum usw. und kann verwendet werden als Ausgangsprodukt zur Herstellung des erfindungsgemässen Präparats. Vorteilhafterweise wird das Ausgangsprodukt hergestellt aus dem Urin des Patienten, der von den oben erwähnten Erkrankungen befallen ist. Die Abtrennung des menschlichen ß2-Mikroglobulins kann unter Verwendung von verschiedenen an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispiele für derartige Verfahren sind die elektrophoretische Zonenmethode, das Verfahren von Berggârd und Mitarb. (I. Berggârd und Mitarb., J. Biol. Chem. 243,4095,1968) durch Ionenaus-tauschchromatographie, Gelfiltration und das Verfahren von Ohsawa und Mitarb. (M. Ohsawa und Mitarb., Experientia 29, 1179, 1973). Human β2-microglobulin is present in various human body fluids such as urine, milk, serum etc. and can be used as a starting product for the preparation of the preparation according to the invention. The starting product is advantageously produced from the urine of the patient who is affected by the diseases mentioned above. The separation of the human β2-microglobulin can be carried out using various methods known per se. Examples of such methods are the electrophoretic zone method, the method by Berggârd and Mitarb. (I. Berggârd and co-workers, J. Biol. Chem. 243, 4095, 1968) by ion exchange chromatography, gel filtration and the method of Ohsawa and co-workers. (M. Ohsawa and co-workers, Experientia 29, 1179, 1973).

Das als Ausgangsprodukt verwendete menschliche ß2-Mikroglobulin ist vorzugsweise ein einziges Protein, da der Einschluss von Verunreinigungen die nachfolgende Operation kompliziert. The human β2-microglobulin used as the starting product is preferably a single protein because the inclusion of contaminants complicates the subsequent operation.

Antikörper, die unter Verwendung des menschlichen ß2-Mikroglobulins unter Anwendung der vorgenannten bekannten Verfahren erhalten werden können, können hergestellt werden durch Verabreichung des ß2-Mikroglobulins als Antigen an Tiere, die eine hohe Antikörperproduktion aufweisen, wie Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen, wobei in üblicherweise eine Immunisierung erfolgt, das Blut des immunisierten Tiers abgenommen wird und der menschlichen ß2-Mikroglobulinantikörper aus dem erhaltenen Blut abgetrennt wird. Antibodies that can be obtained using the human β2-microglobulin using the aforementioned known methods can be raised by administering the β2-microglobulin as an antigen to animals that have high antibody production, such as guinea pigs, rabbits or goats, usually in immunization takes place, the blood of the immunized animal is drawn and the human β2-microglobulin antibody is separated from the blood obtained.

Bei diesem Verfahren kann ein beliebiges Tier verwendet werden, das die Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern besitzt. Um jedoch eine grosse Menge an Antikörper zu erhalten, ist die Verwendung von grossen Tieren bevorzugt. Im allgemeinen werden Kaninchen oder Ziegen bevorzugt, das Verfahren ist jedoch hierauf nicht beschränkt. Die Abtrennung des menschlichen ß2-Mikroglobulinantikörpers aus dem Anti-serum kann durchgeführt werden mittels bekannter Verfahren, zum Beispiel wird das Antiserum ausgesalzen und eine Adsorption-Eluierung unter Verwendung eines unlösliche Antigens wird wiederholt durchgeführt. Any animal that has the ability to produce antibodies can be used in this method. However, in order to obtain a large amount of antibody, the use of large animals is preferred. Rabbits or goats are generally preferred, but the method is not so limited. The separation of the human β2-microglobulin antibody from the anti-serum can be carried out by known methods, for example, the antiserum is salted out and an adsorption elution using an insoluble antigen is carried out repeatedly.

Für das erfindungsgemässe Präparat können verschiedene synthetische Latexpartikel verwendet werden, z.B. Polymere oder Copolymere, die einen solchen Latex bilden, z.B. Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, Aminogruppen enthaltendes carboxyliertes Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol-Butadien-copolymer, carboxyliertes Styrol-Butadiencopolymer, Styrol-Divinylbenzolcopolymer, Vinyltoluol-tert-Butylstyrolcopoly-mer, Polyester, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Pclyacry-lonitril, Acrylnitril-Butadien-Styrolcopolymer, Polyvinylacetat-acrylat, Polyvinylpyrrolidon und Vinylchlorid-acrylatcopolymer. Various synthetic latex particles can be used for the preparation according to the invention, e.g. Polymers or copolymers that form such a latex, e.g. Polystyrene, carboxylated polystyrene, amino-containing carboxylated polystyrene, polyvinyltoluene, styrene-butadiene copolymer, carboxylated styrene-butadiene copolymer, styrene-divinylbenzene copolymer, vinyltoluene-tert-butylstyrene copolymer, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, plyacrylic-nitrile , Polyvinyl acetate acrylate, polyvinyl pyrrolidone and vinyl chloride acrylate copolymer.

Bevorzugt werden Partikel aus einem Latex eines Polymeren vom Styroltypus, ausgewählt aus der Gruppe von Styrol-polymer, Styrolcopolymer, wie ein Copolymeres von Styrol mit beispielsweise Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Viny-lidenchlorid, und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Derivaten derselben. Diese Partikel aus synthetischem polymerem Latex können verwendet werden nach einer Vorbehandlung der Oberfläche mit einem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel. Vorzugsweise wird ein nichtionogenes oberflächenaktives Mittel vom Typus Äthylenoxid auf der Oberfläche dieser Partikel adsorbiert nach dem Verfahren, das beschrieben ist in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 9716/76 (26. Januar 1976). Beispiele von geeigneten nichtionogenen oberflächenaktiven Mitteln vom Äthylenoxidtyp sind Blockcopolymere von Äthylenoxid und Polyoxypropylenglykol, Polyoxyäthylen-alkyläther und Polyoxyäthylenalkylaryläther. Preference is given to particles of a latex of a styrene-type polymer selected from the group of styrene polymer, styrene copolymer, such as a copolymer of styrene with, for example, chlorostyrene, methyl methacrylate and vinylidene chloride, and carboxylated or amino-containing carboxylated derivatives thereof. These synthetic polymer latex particles can be used after pretreating the surface with a non-ionic surfactant. Preferably, a nonionic ethylene oxide surfactant is adsorbed on the surface of these particles by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 9716/76 (January 26, 1976). Examples of suitable nonionic surfactants of the ethylene oxide type are block copolymers of ethylene oxide and polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene alkyl aryl ether.

Die erfindungsgemässen Latexpartikel haben vorzugsweise einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 0,01-10, insbesondere 0,1-1 jim. Um die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zu erhöhen, wird es bevorzugt Partikel zu verwenden, die hinsichtlich ihrer Teiichengrösse in einem relativ engen Bereiche liegen. Das spezifische Gewicht der Latexpartikel beträgt vorzugsweise 0,9-1,4, insbesondere 1,1-13 p.m. Bei einer Messung unter Verwendung einer Agglutinationsreaktion auf einer gleitenden Glasplatte können Latexpartikel verwendet werden, deren spezifisches Gewicht in einem weiten Bereich liegt. Bei Anwendung der Mikrotiter-methode werden vorzugsweise Latexpartikel verwendet, die ein spezifisches Gewicht von mindestens 1,1 haben. The latex particles according to the invention preferably have an average particle diameter of 0.01-10, in particular 0.1-1 jim. In order to increase the reproducibility of the measurement results, it is preferred to use particles whose particle size is in a relatively narrow range. The specific weight of the latex particles is preferably 0.9-1.4, in particular 1.1-13 p.m. When measuring using an agglutination reaction on a sliding glass plate, latex particles whose specific weight is in a wide range can be used. When using the microtiter method, latex particles with a specific weight of at least 1.1 are preferably used.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Bestimmung des menschlichen ß2-Mikroglobuiins kann in einfacher Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäss wird ein synthetischer polymerer Latex in einer Konzentration von 0,05-5% mit menschlichen ß2-Mikroglobulinantikörper in einer Konzentration von 0,0001-1% in einem Puffer in einem pH-Bereich von 5-10, insbesondere 6,5-8 ^m bei einer Temperatur von 4-40 °C zusammen gebracht werden. Die Vereinigung der Komponenten kann beispielsweise durchgeführt werden durch mässiges Rühren während 30 min bis etwa 24 h. The preparation according to the invention for determining the human β2-microglobuiin can be produced in a simple manner. According to the invention, a synthetic polymer latex in a concentration of 0.05-5% with human β2-microglobulin antibodies in a concentration of 0.0001-1% in a buffer in a pH range of 5-10, in particular 6.5-8 ^ m brought together at a temperature of 4-40 ° C. The components can be combined, for example, by moderate stirring for 30 minutes to about 24 hours.

Der Puffer kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung (M/60 Phosphatpuffer pH 7,2) sein, enthaltend 0,15 M NaCl (abgekürzt als PBS) und eine Glycin-gepufferte Salzlösung. Um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern, kann gewünschtenfalls 0,01-0,1% eines Proteins zu einer Antikörperlösung zugefügt werden. Nach dem Überziehen der Partikel werden diese mehrere Male gewaschen durch Zentrifugieren in einer neutralen Salzlösung wie in einer Gly-cin-gepufferten Salzlösung oder PBS. Schliesslich können die mit dem ß2-Mikroglobulinantikörper überzogenen Partikeln in Form einer Suspension in einem Verdünnungsmittel aufbewahrt werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die erhalten wird durch Zugabe von 0,1% BSA zu einer gepufferten Salzlösung oder zu PBS. Bevorzugt wird ferner zu dem Verdünnungsmittel 0,01-0,5% Natriumazid (NaNj) zugegeben. The buffer can be, for example, a phosphate buffered saline solution (M / 60 phosphate buffer pH 7.2) containing 0.15 M NaCl (abbreviated as PBS) and a glycine buffered saline solution. To prevent non-specific agglutination, 0.01-0.1% of a protein can be added to an antibody solution if desired. After coating the particles, they are washed several times by centrifugation in a neutral saline solution, such as in a glycine-buffered saline solution or PBS. Finally, the particles coated with the β2-microglobulin antibody can be stored in the form of a suspension in a diluent. The diluent is preferably a mixture obtained by adding 0.1% BSA to a buffered saline solution or to PBS. Preferably, 0.01-0.5% sodium azide (NaNj) is added to the diluent.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin kann, wie vorstehend beschrieben, in Form eines Latex vorliegen, jedoch auch in Form eines getrockneten Produktes. Das Trockenprodukt kann erhalten werden durch Zugabe eines Stabilisators wie einer Aminosäure (z.B. Glycin oder Natriumglutamat) oder Dextran zu dem oben genannten Verdünnungsmittel, Suspendieren des mit menschlichem ß2-Mikroglobulinantikörper überzogenen Latex in dem Verdünnungsmittel und Lyophili-sieren der Suspension. Die anzufindenden Mengen der Aminosäure und des Dextrans liegen bei etwa 1,2-4 Gewichtsteilen bzw. 1,6-6 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Latexpartikel. As described above, the preparation according to the invention for the determination of human β2-microglobulin can be in the form of a latex, but also in the form of a dried product. The dry product can be obtained by adding a stabilizer such as an amino acid (e.g. glycine or sodium glutamate) or dextran to the diluent mentioned above, suspending the latex coated with human β2-microglobulin antibody in the diluent and lyophilizing the suspension. The amounts of amino acid and dextran to be found are approximately 1.2-4 parts by weight and 1.6-6 parts by weight per part by weight of the latex particles.

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Das erfindungsgemässe Präparat zur Bestimmung des menschlichen ß2-Mikroglobuiins hat sowohl in Form eines Latex als auch als Trockenprodukt eine gute Stabilität. Das Trockenprodukt kann über längere Zeit räumegelagert werden, beispielsweise mehrere Jahre. The preparation according to the invention for determining the human β2-microglobuiin has good stability both in the form of a latex and as a dry product. The dry product can be stored over a long period of time, for example several years.

Gemäss der Erfindung wird ferner ein Verfahren vorgeschlagen zur Bestimmung von menschlichem ßa-Mikroglobulin, wobei dieses qualitativ oder quantitativ bestimmt wird im menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung des vorgenannten erfindungsgemässen Präparats. According to the invention, a method is also proposed for the determination of human β-microglobulin, this being determined qualitatively or quantitatively in human urine or serum using the aforementioned preparation according to the invention.

Für die Bestimmung können an sich bekannte Verfahren angewandt werden, beispielsweise die Bestimmung von ß2-M.ikroglobulin im Serum oder Urin nach dem Mikrotiter-verfahren. Gemäss diesem Verfahren wird eine bestimmte Menge eines Verdünnungsmittels wie dies vorstehend erwähnt wurde, portionsweise auf eine Mikroplatte gegeben und dann eine bestimmte Menge der zu untersuchenden Probe wie Serum oder Urin in die Vertiefung der Platte gegeben, und aufeinander folgend mit einem Verdünnungsmittel behandelt. Andererseits kann eine Verdünnungsserie in derselben Weise hergestellt werden unter Verwendung eines Standardantigens. Dann wird eine bestimmte Menge eines mit menschlichem ß2-Mikroglobulinantikörper sensitiviertes Latex zugefügt und gemischt. Nachdem eine gewisse Zeit bei Zimmertemperatur stehengelassen wurde, wird der Endpunkt der Agglutination festgestellt und die absolute Menge des ß2-Mikroglobulins kann bestimmt werden durch Vergleich mit der Reihe des Standardantigens. Methods known per se can be used for the determination, for example the determination of β2-M. microglobulin in serum or urine by the microtiter method. According to this method, a certain amount of a diluent as mentioned above is put in portions on a microplate and then a certain amount of the sample to be examined such as serum or urine is put in the well of the plate, and successively treated with a diluent. On the other hand, a series of dilutions can be made in the same manner using a standard antigen. Then a certain amount of a latex sensitized with human β2-microglobulin antibody is added and mixed. After standing at room temperature for a period of time, the end point of agglutination is determined and the absolute amount of the β2-microglobulin can be determined by comparison with the series of standard antigen.

Bei dem bekannten «Einzelradialimmunodiffusions»-Verfahren zur Bestimmung von ß2-Mikroglobulin kann die Menge des ß2-Mikroglobulins nur bestimmt werden, wenn sie mindestens 5 ug pro ml in der Probe beträgt, wenn die Probe Serum oder Urin ist. Da bei einem ß2-Mikroglobulingehalt von etwa 5-10 (ig Irrtümer nicht auszuschliessen sind, ist eine etwas höhere Konzentration zu bevorzugen. Im Gegensatz hierzu kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von ß2-Mikroglobulin unter Verwendung des erfindungsgemässen Präparats durchgeführt werden, wenn die Menge des ß2-Mikroglobulins mehr als 1 ^g pro ml beträgt. Das Verfahren besitzt daher eine hohe Empfindlichkeit, die gleich oder höher ist als diejenige des Radioimmuno-assayverfahrens, die bei üblichen Analysen als diejenige mit der höchsten Empfindlichkeit angesehen wird. In the known “single radial immunodiffusion” method for determining β2-microglobulin, the amount of β2-microglobulin can only be determined if it is at least 5 µg per ml in the sample if the sample is serum or urine. Since errors can not be ruled out at a β2-microglobulin content of about 5-10 (ig), a somewhat higher concentration is to be preferred. In contrast, the method according to the invention for the determination of β2-microglobulin can be carried out using the preparation according to the invention if the The amount of β2-microglobulin is more than 1 ^ g per ml, and the method therefore has a high sensitivity which is equal to or higher than that of the radioimmunoassay method, which is considered to be the most sensitive in conventional analyzes.

Nach einer anderen Ausführungsform der Messung gemäss der Erfindung wird eine gewisse Menge einer Probe auf eine gleitende Glasplatte getropft und ungetrennt eine bestimmte Menge einer Lösung eines menschlichen ß2-Mikroglobulins bekannter Konzentration tropfenweise zugefügt. Eine bestimmte Menge des mit menschlichem ß2-Mikroglobulinantikörper sensitivierten Latex wird zu allen Proben zugegeben und anschliessend einer mässigen Oszillation unterworfen. Durch Auswerten des erhaltenen Agglutinationsverhaltens kann die Konzentration des menschlichen ßz-Mikroglobulins in der Probe qualitativ innerhalb weniger Minuten bestimmt werden. Es kann auch eine halbquantitative Bestimmung durchgeführt werden, wenn die Probe in einem Testrohr verdünnt wird und die Reaktionszeit bei jeder Verdünnung beobachtet wird. According to another embodiment of the measurement according to the invention, a certain amount of a sample is dropped onto a sliding glass plate and, without separation, a certain amount of a solution of a human β2-microglobulin of known concentration is added dropwise. A certain amount of the latex sensitized with human ß2-microglobulin antibody is added to all samples and then subjected to a moderate oscillation. By evaluating the agglutination behavior obtained, the concentration of the human β-microglobulin in the sample can be determined qualitatively within a few minutes. A semi-quantitative determination can also be made if the sample is diluted in a test tube and the reaction time is observed at each dilution.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Messung des menschlichen ß2-Mikroglobulins in Form eines Latex oder eines Trockenproduktes ist überlegen gegenüber Präparaten, die erhalten werden durch Aufbringen von menschlichem ß2-Mikroglobulin auf rote Blutzellen oder einen anderen Träger, insofern als andere nichtspezifische Reaktionen als die gewünschte Antigenantikörperreaktion nicht stattfindet, da der Träger selbst keine Antigenizität aufweist. Ferner weil ein menschlicher ßi-Mikroglobulinantikörper direkt auf einen Latex in einfacher Weise durch einfaches Eintauchen einer The preparation according to the invention for measuring human β2-microglobulin in the form of a latex or a dry product is superior to preparations which are obtained by applying human β2-microglobulin to red blood cells or another carrier, insofar as non-specific reactions other than the desired antigen antibody reaction are not takes place because the carrier itself has no antigenicity. Furthermore, because a human beta microglobulin antibody is directly on a latex in a simple manner by simply immersing one

Antikörperlösung in den Latex ohne Verwendung eines Bindemittels aufgebracht werden kann und da eine gute Lagerbeständigkeit gegeben ist. Antibody solution in the latex can be applied without the use of a binder and because it has good shelf life.

Das erfindungsgemässe neue Präparat zur Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin reagiert überhaupt nicht mit anderen Proteinen als menschlichem ß2-Mikroglobulin und der Träger reagiert nicht mit ßj-Mikroglobulin. Daher kann gesagt werden, dass der menschliche ß2-Mikroglobulin-antikörper an die Partikel des Latexträgers gebunden ist. The new preparation according to the invention for the determination of human β2-microglobulin does not react at all with proteins other than human β2-microglobulin and the carrier does not react with βj-microglobulin. It can therefore be said that the human β2-microglobulin antibody is bound to the particles of the latex carrier.

Die Erfindung gehört im folgenden durch die Beispiele näher beschrieben. The invention is described in more detail below by the examples.

Beispiel A Example A

Herstellung von menschlichem ß2-Mikroglobulin Production of human β2-microglobulin

1 kg Ammoniumsulfat wird zugeführt zu ungefähr 2 Liter Urin eines Patienten, der von Nephritis befallen ist und die Lösung wird bei 4°C über Nacht stehengelassen. Die gebildete Ausfällung wird abgetrennt und in Wasser gelöst. Der unlösliche Anteil wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die Ausfällung in Salzlösung gelöst und in eine Sephadex G100 (Produkt von Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) Kolonne (5 x 100 cm) gegeben, die gepuffert war mit einem 0,02 M Tris-Puffer (pH 8,0) enthaltend 1 M Natriumchlorid. Zur Durchführung der Gelfiltration wird der Puffer mit einer Durchflussrate von 40 ml pro h zugegeben. Es werden 400 ml eluierter Fraktionen abgetrennt, entsalzt und auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Dann wurde das Produkt in eine DEAE-Cellulosekolonne (Produkt von Brown Company, USA) (2,5 x 40 cm) gegeben, die gepuffert wurde mit einem 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,5) und eluiert unter linearem Erhöhen der Konzentration des Natriumchlorids in den Puffer auf 0,2 M. Es wurden an erster Stelle 70 ml einer Proteinfraktion eluiert, die abgetrennt, entsalzt und auf 10 ml eingeengt wurden. Die Flüssigkeit wurde in eine SP-Sepha-dex C 50 (Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) Kolonne (2 x 35 cm) gegeben, die gepuffert wurde mit einem 0,04 M Phosphatpuffer (pH 5,9) und die Eluierung wurde durchgeführt mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 25 ml/h unter linearer Erhöhung der Konzentration des Puffers auf 0,2 M. 100 ml der Fraktionen von 75-175 ml der Eluate wurden abgetrennt, entsalzt, eingeengt und lyophilisiert, wobei 60 mg eines weissen Pulvers erhalten wurden. 1 kg of ammonium sulfate is added to approximately 2 liters of urine from a patient suffering from nephritis and the solution is left at 4 ° C overnight. The precipitate formed is separated off and dissolved in water. The insoluble portion is separated by centrifugation and the precipitate is dissolved in saline and placed in a Sephadex G100 (product of Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Sweden) column (5 x 100 cm) which was buffered with a 0.02 M Tris buffer (pH 8.0) containing 1 M sodium chloride. To carry out the gel filtration, the buffer is added at a flow rate of 40 ml per hour. 400 ml of eluted fractions are separated, desalted and concentrated to a volume of 10 ml. The product was then placed in a DEAE cellulose column (product from Brown Company, USA) (2.5 x 40 cm) which was buffered with a 0.01M phosphate buffer (pH 7.5) and eluted with a linear increase in the concentration of the Sodium chloride in the buffer to 0.2 M. 70 ml of a protein fraction were eluted in the first place, which were separated, desalted and concentrated to 10 ml. The liquid was placed in an SP-Sepha-dex C 50 (Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Sweden) column (2 x 35 cm), which was buffered with a 0.04 M phosphate buffer (pH 5.9) and the elution was carried out at a flow rate of 25 ml / h with a linear increase in the concentration of the buffer to 0.2 M. 100 ml of the fractions of 75-175 ml of the eluates were separated, desalted, concentrated and lyophilized, 60 mg of a white one Powder were obtained.

Das Produkt zeigte auf der Elektrophoresescheibe eine einfache Bande. The product showed a simple band on the electrophoresis disk.

Beispiel B Example B

Herstellung von menschlichem ß2-Mikroglobulinantikörper Production of human β2-microglobulin antibody

Das gemäss Beispiel A erhaltene menschliche ß2-Mikroglobulin wurde in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 4 mg/ml gelöst. Die Lösung wurde gemischt mit einer gleichen Menge von vollständigem «Freund's Adjuvans». Die Mischung wurde injiziert in einer Menge von 0,1 ml in die Fusspfoten von vier gesunden Kaninchen mit einem Gewicht von 2,3-2,5 kg, dreimal pro Woche. Eine Woche später wurde ein ml einer 0,l%igen Salzlösung von menschlichem ß2-Mikroglobulin injiziert. 3 Wochen nach der ersten Injektion wurde das gesamte Blut aus der Karotidenarterie des Kaninchens entnommen. Das Blut wurde in üblicher Weise zentrifugiert und das erhaltene Serum 30 min bei 56 °C gehalten, wobei sich etwa 200 ml Antiserum bildeten. The human β2-microglobulin obtained according to Example A was dissolved in physiological saline in a concentration of 4 mg / ml. The solution was mixed with an equal amount of complete Freund's adjuvant. The mixture was injected in an amount of 0.1 ml into the foot paws of four healthy rabbits weighing 2.3-2.5 kg, three times a week. One week later, one ml of a 0.1% saline solution of human β2-microglobulin was injected. 3 weeks after the first injection, all of the blood was drawn from the rabbit's carotid artery. The blood was centrifuged in a conventional manner and the serum obtained was kept at 56 ° C. for 30 minutes, about 200 ml of antiserum being formed.

Da das erhaltene Antiserum eine einzige Ausfällungsbande mit einem Antigen bildete nach dem Ouchtalony-Verfahren und dem Immunoelektrophoresis-Verfahren, wurde festgestellt, dass es sich um einen einzelnen Antikörper handelt. Since the antiserum obtained formed a single precipitation band with an antigen by the ouchtalony method and the immunoelectrophoresis method, it was found that it was a single antibody.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

ö5 Ö5

5 5

645 727 645 727

Beispiel C Example C

Herstellung von unlöslichem menschlichem ß2-Mikroglobulin Production of Insoluble Human ß2 Microglobulin

5 mg menschliches ß2-Mikroglobulin wurden gelöst in 5 ml eines 0,2 M Essigsäurepuffers (pH 5,0) und dann wurden etwa 0,5 ml einer Lösung eines 5%igen Ochsenserumalbumins 5 zugefügt. Dann wurden 5% Glutaraldehyd tropfenweise zuge-gegeben, bis sich eine Ausfällung bildete. Die Ausfällung wurde abgetrennt, homogenisiert und dann gewaschen mit PBS, mit einem Glycinsalzsäurepuffer (pH 2,8) und wieder mit PBS, und sodann unterhalb von -20° C aufbewahrt. 10 5 mg of human β2-microglobulin was dissolved in 5 ml of a 0.2 M acetic acid buffer (pH 5.0) and then about 0.5 ml of a solution of a 5% ox serum albumin 5 was added. Then 5% glutaraldehyde was added dropwise until a precipitate formed. The precipitate was separated, homogenized and then washed with PBS, with a glycine hydrochloric acid buffer (pH 2.8) and again with PBS, and then kept below -20 ° C. 10th

Beispiel D Example D

Reinigung von menschlichem ß2-Mikroglobulinantikörper Purification of human ß2 microglobulin antibody

Zu Antiserum wurde eine gleiche Menge einer gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat zugefügt und eine vollständige 15 Mischung hergestellt. Die Mischung wurde 30 min bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die gebildete Ausfällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, gewaschen mit einer 0,5%igen gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat und dann gegenüber PBS dialysiert. Dann wurde zu dem Dialysat die 20 Lösung von unlöslichem menschlichem ß2-Mikroglobulin, hergestellt gemäss Beispiel C zugefügt und die Mischung bei Zimmertemperatur 30 min stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert, wobei sie sich auftrennt in eine überstehende Flüssigkeit und ein Sediment. Zu der überstehenden 25 Flüssigkeit wurde wieder unlösliches menschliches ß2-Mikroglobulin zugefügt und die Mischung in ähnlicher Weise behandelt. Die zwei Ausfällungen wurden kombiniert und gewaschen mit PBS. Dann wurde ein Glycinsalzsäurepuffer (pH 2,8) zugefügt und die Mischung 5 min geschüttelt, 30 An equal amount of a saturated solution of ammonium sulfate was added to antiserum and a complete mixture was prepared. The mixture was left to stand at room temperature for 30 minutes. The precipitate formed was separated by centrifugation, washed with a 0.5% saturated solution of ammonium sulfate and then dialyzed against PBS. Then the solution of insoluble human β2-microglobulin, prepared according to Example C, was added to the dialysate and the mixture was left to stand at room temperature for 30 minutes. The mixture was centrifuged, separating into a supernatant liquid and sediment. Insoluble human β2-microglobulin was again added to the supernatant and the mixture treated in a similar manner. The two precipitates were combined and washed with PBS. Then a glycine hydrochloric acid buffer (pH 2.8) was added and the mixture was shaken for 5 min, 30

anschliessend zentrifugiert. Die Ausfällung wurde in ähnlicher Weise behandelt mit einem Glycinsalzsäurepuffer und kombiniert mit der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit. Die Mischung wurde dialysiert gegenüber PBS, wobei sich ein gereinigter menschlicher ß2-Mikroglobulinantikörper bildete. 35 then centrifuged. The precipitate was treated in a similar manner with a glycine hydrochloric acid buffer and combined with the supernatant liquid obtained. The mixture was dialyzed against PBS to form a purified human β2-microglobulin antibody. 35

Ausführungsbeispiel 1 Embodiment 1

Latex, sensibilisiert mit menschlichem ß2-Mikroglobulin-antikörper Latex sensitized with human ß2-microglobulin antibody

Ein Polystyrollatex (Produkt von Takeda Chemical Indu- 40 stry, Co., Ltd., SDL 59, spezifisches Gewicht 1,14, Partikeldurchmesser 0,9 Mikron) wurde verdünnt mit PBS, so dass die Konzentration der Partikel 0,25% betrug und dann eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers, 60fach verdünnt mit PBS zugefügt. Die Mischung wurde 2 h bei 37 °C gehalten und dann zentrifugiert. Die Latexpartikel wurden abgetrennt und gewaschen mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel. Die Latexpartikel wurden dann in einer Konzentration von 0,25% unter Verwendung eines Verdünnungsmittels suspendiert, wobei sich ein Latex, sensibilisiert mit einem menschlichen ß2-Mikroglobulinantikörper bildet. A polystyrene latex (product of Takeda Chemical Industry, Co., Ltd., SDL 59, specific gravity 1.14, particle diameter 0.9 micron) was diluted with PBS so that the concentration of the particles was 0.25% and then an equal amount of a purified antibody, diluted 60 times with PBS, is added. The mixture was kept at 37 ° C for 2 hours and then centrifuged. The latex particles were separated and washed with PBS and then with a diluent. The latex particles were then suspended at a concentration of 0.25% using a diluent to form a latex sensitized with a human ß2 microglobulin antibody.

Durch Zugabe einer Lösung eines menschlichen ß2-Mikroglobulins zu dem sensibilisierten Latex erfolgt Agglutination. Keine Agglutination erfolgte, wenn Albumin, IgG-, IgM- oder IgA-Lösungen zugegeben werden. Agglutination is carried out by adding a solution of a human β2-microglobulin to the sensitized latex. No agglutination occurred when albumin, IgG, IgM or IgA solutions were added.

Das verwendete Verdünnungsmittel enthielt 0,08% BSA und 0,1% Natriumazid. The diluent used contained 0.08% BSA and 0.1% sodium azide.

Ausführungsbeispiel 2 Embodiment 2

Bestimmung von menschlichem ß2-Mikroglobulin Determination of human β2-microglobulin

Ein Verdünnungsmittel in einer Menge von 0,025 ml wurde in die Vertiefungen einer Mikroplatte vom V-Typ gegeben und 0,025 ml Serum oder Urin verdünnt mit einem geeigneten Verdünnungsmittel zu der ersten Probe zugegeben und sodann fortlaufend verdünnt mit einem Verdünnungsmittel nach der zweifachen Verdünnungsmethode. Andererseits wurden 0,025 ml einer Standardlösung, enthaltend 0,01 (ig von menschlichem ß2-Mikroglobulin pro ml, zugefügt zu der ersten Probe einer anderen Reihe und in derselben Weise verdünnt. Dann wurden 0,025 ml des Latex, sensibilisiert mit dem menschlichen ß2-Mikroglobulinantikörper in jede der Vertiefungen gegeben und nach ausreichendem Mischen mehr als 10 h bei Zimmertemperatur stehengelassen, wobei der Endpunkt der Agglutination beobachtet wurde. Wenn eine Antigenantikörperreaktion stattfand, wurden die Latexpartikel auf der gesamten Oberfläche der Probelöcher disper-giert. Wenn keine Antigenantikörperreaktion erfolgte, sammelten sich die Latexpartikel im Mittelpunkt der Probelöcher. Auf diese Weise konnte der Endpunkt der Agglutination bestimmt werden. A diluent in an amount of 0.025 ml was added to the wells of a V-type microplate, and 0.025 ml of serum or urine diluted with an appropriate diluent was added to the first sample, and then continuously diluted with a diluent according to the two-fold dilution method. On the other hand, 0.025 ml of a standard solution containing 0.01 (ig of human β2-microglobulin per ml was added to the first sample of another series and diluted in the same manner. Then, 0.025 ml of the latex sensitized with the human β2-microglobulin antibody in each of the wells was given and after sufficient mixing was allowed to stand at room temperature for more than 10 hours observing the end point of agglutination. When an antigen antibody reaction occurred, the latex particles were dispersed over the entire surface of the sample holes. If no antigen antibody reaction occurred, the collected Latex particles in the center of the test holes, which enabled the end point of the agglutination to be determined.

Gemäss dem vorstehenden Verfahren wurde die Menge ß2-Mikroglobulin bestimmt in sieben Beispielen eines Serums, lOOfach verdünnt und sieben Beispielen eines Urins, 50fach verdünnt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. According to the above method, the amount of β2-microglobulin was determined in seven examples of a serum, 100-fold diluted and seven examples of a urine, 50-fold diluted. The results are shown in Table 1.

Tabelle 1 Table 1

Bestimmung der Latexagglutination Determination of latex agglutination

Probe 1 2 3 4 5 6 7 8 Konzentration in Sample 1 2 3 4 5 6 7 8 concentration in

Konzentration des Standard-ß2-Mikroglobulins(,ug/ml) 5 2,5 1,25 0,625 0,312 0,156 0,078 0,039 der Probe Concentration of standard β2 microglobulin (.ug / ml) 5 2.5 1.25 0.625 0.312 0.156 0.078 0.039 of the sample

Agglutination '+ + + + — — — — (jig/ml) Agglutination '+ + + + - - - - (jig / ml)

Serum serum

Gesunder Erwachsener 32 Jahre männlich + + + + — — — — 1 Healthy adult 32 years male + + + + - - - - 1

Gesunder Erwachsener 43 Jahre männlich + + + •— — — — — 0,5 Gesunder Erwachsener 22 Jahre männlich '+ + + + — — — — 1 Healthy adult 43 years male + + + • - - - - - 0.5 Healthy adult 22 years male '+ + + + - - - - 1

Leukämiepatient 9 Jahre männlich + + + + + + + — 8 Patient mit Magenkrebs 53 Jahre männlich Leukemia patient 9 years male + + + + + + + - 8 patients with gastric cancer 53 years male

Patient 62 Jahre männlich, renaler Verfall + + + + + + + + 16 Patient 32 Jahre weiblich, unter SLE leidend Patient 62 years male, renal decay + + + + + + + + 16 patient 32 years female, suffering from SLE

Urin urine

Gesunder Erwachsener 32 Jahre männlich + + + — — — — — 0,25 Healthy adult 32 years male + + + - - - - - 0.25

Gesunder Erwachsener 43 Jahre männlich + + 0,13 Healthy adult 43 years male + + 0.13

Gesunder Erwachsener 22 Jahre männlich + + + — — — — — 0,25 Healthy adult 22 years male + + + - - - - - 0.25

Patient 57 Jahre männlich mit Myeloma + + + + + + + - 4 Patient 57 years male with myeloma + + + + + + + - 4

Patient 9 Jahre männlich mit Leukämie + + + + + + + — 4 Patient 62 Jahre mit renalem Verfall Patient 32 Jahre weiblich mit SLE Patient 9 years male with leukemia + + + + + + + - 4 patient 62 years with renal decay Patient 32 years female with SLE

+ +

— -

+ +

• - • -

- -

+ +

- -

+ +

- + - +

+ +

+ - + -

+ +

_ _

+ +

- -

+ +

- -

+ +

+ : positiv; — : negativ +: positive; -: negative

645 727 645 727

Ausführungsbeispiel 3 Embodiment 3

Bestimmung von menschlichem ßi-Mikroglobulin nach dem «Gleitaggregations»-Verfahren Determination of human ßi microglobulin using the "sliding aggregation" method

Polystyrollatex (Produkt von Dow Chemicals, Partikeldurchmesser 0,22 ± 0,006 Mikron, spezifisches Gewicht 1,05) wurde verdünnt auf 1% mit einem Glycinnatriumchloridpuf-fer (pH 8,4) und eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers zugefügt. Die Mischung wurde bei 4°C über Nacht stehengelassen und dann zur Abtrennung des Latex zentrifugiert. Der Latex wurde einmal mit einem Glycinnatriumchlo-ridpuffer gewaschen und suspendiert in einer Konzentration von 1% in einem Glycinnatriumchloridpuffer, enthaltend 1% BSA, wobei sich der sensibilisierte Latex bildet. Polystyrene latex (product of Dow Chemicals, particle diameter 0.22 ± 0.006 micron, specific gravity 1.05) was diluted to 1% with a glycine sodium chloride buffer (pH 8.4) and an equal amount of a purified antibody was added. The mixture was left at 4 ° C overnight and then centrifuged to separate the latex. The latex was washed once with a glycine sodium chloride buffer and suspended at a concentration of 1% in a glycine sodium chloride buffer containing 1% BSA to form the sensitized latex.

50 ul einer Lösung von menschlichem ßi-Mikroglobulin in Konzentrationen von 400, 200,100, 50 oder 25 (xg/ml wurden tropfenweise getrennt zugegeben auf ein Gleitglas. Dann wurden 50 _ul des erhaltenen sensibilisierten Latex tropfenweise oben zugegeben und die Reaktion unter massigem Rühren während weniger Minuten beobachtet. Eine Agglutination trat ein bei den Konzentrationen von 400, 200 und 100 iig/ml, jedoch erfolgte keine Agglutination bei einer Konzentration von 50 und 25 ug/ml. 50 µl of a solution of human ßi-microglobulin in concentrations of 400, 200, 100, 50 or 25 (xg / ml was added dropwise separately on a slide glass. Then 50 µul of the sensitized latex obtained was added dropwise above and the reaction was carried out with gentle stirring for less Minutes observed, agglutination occurred at concentrations of 400, 200 and 100 µg / ml, but no agglutination occurred at concentrations of 50 and 25 µg / ml.

Nach dem vorstehenden Verfahren wurde aufgrund von sechs Proben des Serums und 6 Proben des Urins der Gehalt von menschlichem ß2-Mikroglobulin ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tablelle 2 angegeben. According to the above method, the content of human β2-microglobulin was determined based on six samples of the serum and 6 samples of the urine. The results are shown in Table 2.

Tabelle 2 Latexagglutination Table 2 Latex agglutination

Probe Aggluti- Konzentration nation in der Probe Sample agglutin concentration nation in the sample

Patient 62 Jahre männlich, Patient 62 years male,

renaler Verfall + dito renal decay + same

Patient 32 Jahre weiblich unter SLE leidend + dito Patient 32 years female suffering from SLE + same

10 10th

Kontrolle Konzentration des Standard-ß2-Mikroglobulins Control concentration of the standard ß2 microglobulin

(Hg/ml) 400 200 100 50 25 (Hg / ml) 400 200 100 50 25

15 Agglutination + + + + ± - 15 agglutination + + + + ± -

Ausführungsbeispiel 4 Embodiment 4

Durch Behandlung wie in Beispiel 1 beschrieben wird ein Latex sensibilisiert, gewaschen und in einem Verdünnungs-20 mittel enthaltend 0,5% Glycin und 0,7% Dextran T-10 (Produkt von Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) suspendiert, so dass die Konzentration der Latexpartikel 1,25% beträgt. Die Suspension wurde dann in üblicher Weise lyophilisiert, wobei ein Präparat von Latexpartikeln, sensibili-25 siert mit menschlichem ß2-Mikroglobulinantikörper erhalten wird. By treatment as described in Example 1, a latex is sensitized, washed and suspended in a diluent containing 0.5% glycine and 0.7% dextran T-10 (product of Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Sweden) , so that the concentration of the latex particles is 1.25%. The suspension was then lyophilized in the usual manner, a preparation of latex particles sensitized with human β2-microglobulin antibody being obtained.

Tabelle 2 Latexagglutination Table 2 Latex agglutination

Probe sample

Aggluti- Konzentration nation in der Probe Aggluti- nation nation in the sample

Serum (verdünnt 50fach) Gesunder Erwachsener 32 Jahre männlich Serum (diluted 50-fold) Healthy adult 32 years male

Gesunder Erwachsener 42 Jahre männlich Gesunder Erwachsener 22 Jahre männlich Leukämiepatient 9 Jahre männlich Healthy adult 42 years male Healthy adult 22 years male Leukemia patient 9 years male

Patient 62 Jahre männlich, renaler Verfall Patient 32 Jahre weiblich unter SLE leidend Patient 62 years male, renal decay Patient 32 years female suffering from SLE

Urin (verdünnt lOfach) Gesunder Erwachsener 32 Jahre männlich Urine (diluted tenfold) Healthy adult 32 years male

Gesunder Erwachsener 43 Jähre männlich Gesunder Erwachsener 22 Jahre männlich Leukämiepatient 9 Jahre männlich Healthy adult 43 years male Healthy adult 22 years male Leukemia patient 9 years male

+ + + +

weniger als 2,5 g/ml dito dito mindestens 5 g/ml dito dito weniger als 0,5 g/ml dito dito mindestens 1 g/ml less than 2.5 g / ml ditto ditto at least 5 g / ml ditto ditto less than 0.5 g / ml ditto ditto at least 1 g / ml

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

Ausführungsbeispiel 5 Embodiment 5

Zu den Latexpartikeln erhalten gemäss dem vorstehenden Beispiel 4 wird ein Verdünnungsmittel zugefügt, dann in derselben Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, die Menge des ß2-Mikroglobulins im Serum und Urin bestimmt. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. A diluent is added to the latex particles obtained according to Example 4 above, then the amount of β2-microglobulin in the serum and urine is determined in the same manner as described in Example 2. Similar results have been obtained.

Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, ist die Menge von ß2-Mikroglobulin im Serum und Urin von Patienten, die von verschiedenen Erkrankungen befallen sind, höher als diejenige bei gesunden Erwachsenen. Daher stellt die Bestimmung der Menge des ß2-Mikroglobulins im Blut oder Urin eine sehr wertvolle Diagnose dieser Erkrankungen dar. As is apparent from the above results, the amount of β2-microglobulin in the serum and urine of patients suffering from various diseases is higher than that in healthy adults. Therefore, determining the amount of β2-microglobulin in the blood or urine is a very valuable diagnosis of these diseases.

In derselben Weise, wie im vorstehenden Beispiel D beschrieben, wurde die Menge von ß2-Mikroglobulin im Serum und Urin von Patienten gemessen unter Verwendung eines Latex, sensibilisiert mit menschlichem ß2-Mikro-globulinantikörper und zwar aus dem Antiserum der Ziege. Die Ergebnisse waren im wesentlichen dieselben, wie in den vorstehenden Tabellen angegeben. In the same manner as described in Example D above, the amount of β2-microglobulin in the serum and urine of patients was measured using a latex sensitized with human β2-microglobulin antibody from goat antiserum. The results were essentially the same as indicated in the tables above.

Mit dem sensibilisierten Latexgemisch der Erfindung kann die Menge von ß2-Mikroglobulin in kürzerer Zeit gemessen werden, wenn eine Probe verwendet wird (menschliches Serum oder Urin), die nur in einer sehr kleinen Menge von weniger als 0,03 ml vorliegt. Die Empfindlichkeit ist sehr hoch und 1 ng ß2-Mikroglobulin pro ml der Probe kann bestimmt werden. Daher ergibt das erfindungsgemässe Präparat genaue und wertvolle Informationen für Diagnose von Leukämie, renalen Erkrankungen, Entzündungen usw. und sein Anwendungsbereich ist sehr breit. Da die Probemenge sehr klein ist, ist das Präparat geeignet für Kinder, Neugeborene und Kleinkindern, denen nur eine kleine Menge Blut entnommen werden kann. With the sensitized latex mixture of the invention, the amount of β2-microglobulin can be measured in a shorter time when using a sample (human serum or urine) that is present in a very small amount of less than 0.03 ml. The sensitivity is very high and 1 ng ß2-microglobulin per ml of the sample can be determined. Therefore, the preparation according to the invention provides precise and valuable information for the diagnosis of leukemia, renal diseases, inflammation, etc., and its area of application is very broad. Since the sample amount is very small, the preparation is suitable for children, newborns and toddlers, from whom only a small amount of blood can be drawn.

G G

Claims

645 727

1. Preparation for the determination of human [h-microglobulin from particles of synthetic polymer latex with a coating of human β-microglobulin antibody.

2. Preparation according to claim 1, characterized in that the particles have an average diameter of 0.01-10 (im.

2nd

PATENT CLAIMS

3. Preparation according to claim 1, characterized in that the latex particles have a specific weight of 0.9-1.4.

4. Preparation according to claim 1, characterized in that they also contain an amino acid or dextran as a stabilizer.

5. Preparation according to claim 1, characterized in that the latex particles are those of the styrene type selected from the group of styrene polymers, styrene copolymers and carboxylated or amino-containing carboxylated derivatives thereof.

6. Preparation according to one of claims 1-5, characterized in that it is in the form of a latex.

7. Preparation according to one of claims 1-6, characterized in that it is in the form of a dried latex.

8. A method for the determination of human ß2-microglobulin, characterized in that a qualitative or quantitative determination is made in human urine or serum using a preparation of particles of polymeric synthetic latex with a coating of ß2-microglobulin antibody.

9. The method according to claim 8, characterized in that the determination is carried out according to the microtiter method.

10. A method for producing a preparation for the determination of human ß2-microglobulin from particles of synthetic polymer latex with a coating of human ß2-microglobulin antibody, characterized in that a polymeric synthetic latex is brought into contact in a concentration of 0.05-5% is with a human ß2-microglobulin antibody in a concentration of 0.0001-1% in a buffer at a pH of 5-10 and at a temperature of 4-40 ° C.