DE2934756A1 - COMPOSITION FOR DETERMINING BETA 2 -HUMANMICROGLOBULIN AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF - Google Patents
COMPOSITION FOR DETERMINING BETA 2 -HUMANMICROGLOBULIN AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOFInfo
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Description
Zusammensetzung zur Bestimmung von ß2-Humanmikroglcbulin und Verfahren zu de ren Herstellung und de ren VerwendungComposition for the determination of ß2-human microglcbulin and methods for their manufacture and use
Die Erfindung "bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ß^-Humanmikroglobulin, auf ein Verfahren zu deren Herstellung und auf deren Verwendung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin (sowohl qualitativ als auch quantitativ), die eine überlegene Lagerstabilität besitzt und mit guter Reproduzierbarkeit und einem hohen Grad an Genauigkeit rasch zuverlässige Ergebnisse liefert, ohne Störung durch andere Proteine, welche in einer Versuchs- oder Testprobe enthalten sein können, wobei eine einfache Bestimmungsarbeitsweise und ein einfaches Bestimmungsinstrument zur Anwendung gelangen. The invention "relates to a composition for Determination of ß ^ -human microglobulin, on a method for their production and their use. In particular, the invention relates to a composition for the determination of ßo-human microglobulin (both qualitative as well as quantitative), which has a superior storage stability and good reproducibility and quickly provides reliable results with a high degree of accuracy, without interference from other proteins, which can be contained in an experimental or test sample, with a simple determination procedure and a simple identification tool can be used.
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Insbesondere bezieht sich, die Erfindung auf eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ßp-Humaniaikroglobulin, welche aus Teilchen eines synthetischen polymeren Latex,vorzugsweise aus Teilchen eines synthetischen polymeren Latex vom Styroltyp, ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und den carboxylierten oder aminohaltigen, carboxyl!erten Produkten hiervon besteht; ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzung und auf die Verwendung dieser Zusammensetzung. In particular, the invention relates to a composition for the determination of ßp-human microglobulin, which from particles of a synthetic polymer latex, preferably from particles of a synthetic polymer latex of the styrene type selected from the group of styrene polymers, Styrene copolymers and the carboxylated or amino-containing, it consists of carboxylated products; also relates the invention relates to a process for the preparation of this composition and to the use of this composition.
Bp-Humanmikroglobulin ist ein Protein nit einem relativ niedrigen Molekulargewicht von etwa 12 000 und es wird im Serum, im Urin, Cerebrospinalflussigkeit, Speichel, Milch oder dergleichen von Menschen gefunden- Die Wirkung in vivo von ßo-MikroglobulJn ist bis jetzt noch nicht vollständig geklärt. Es wurde jedoch vor kurzem gefunden, daß bei bestimmten Krankheiten, wie Entzündungen, Karzinomerkrankungen und Kierenerkrankungen der Gehalt an ßo-Mikroglobulin in den Korperflussxgkeiten des Patienten ansteigt. Beispielsweise sind Nierenerkranklingen in solche, welche durch glomerulare Störung hervorgerufen werden und in solche, welche durch Störungen in Harnkanälchen verursacht werden, unterteilt. Im letzteren Fall nimmt die Menge an ßp-Mikroglobulin zuerst im Blut, genauer im Serum und dann im Urin zu.Bp human microglobulin is a protein with a relative low molecular weight of about 12,000 and it is found in serum, urine, cerebrospinal fluid, saliva, Milk or the like found from humans. The in vivo effect of β-microglobules is not yet known completely resolved. However, it has recently been found that in certain diseases such as inflammation, carcinoma diseases and kidney diseases, the ßo-microglobulin content increases in the patient's body fluids. For example, kidney disease are in those who caused by glomerular disorder and in those which are caused by disorders in the urinary tubules. In the latter case, the amount of ßp-microglobulin increases first in the blood, more precisely in the serum and then in the urine.
Das ß2-Mikroglobulin ist ein Protein, welches die glomerulare Basalmembran durchdringt und dann von den Nierenkanälchen oder Harnkanälchen absorbiert wird. Wenn jedoch eine Störung der Harnkanälchen auftritt, sickert dieses Protein in den Urin, ohne erneut absorbiert zu werden. Demgemäß ist der ßo-Mikroglobulinspiegel im Urin einer der besten Parameter für die Wirkung der Harnkanälchen. Auf diese Weise kann eine Störung der Hieren- oder HarnkanälchenThe ß 2 -microglobulin is a protein that penetrates the glomerular basement membrane and is then absorbed by the kidney tubules or urinary tubules. However, when there is a disturbance of the tubules, this protein seeps into the urine without being reabsorbed. Accordingly, the ßo-microglobulin level in the urine is one of the best parameters for the functioning of the tubules. In this way, a disorder of the hernial or urinary tubules can occur
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durch die Bestimmung des Spiegels von ßp-Mikroglobulin im Serum und Urin diagnostiziert werden.by determining the level of βp-microglobulin can be diagnosed in serum and urine.
Bisner war kein geeignetes Mittel zur Beurteilung einer Erkrankung der liieren- oder Harnkanälchen verfügbar. Sie kann jedoch nun mühelos durch, die Bestimmung des ßp-Mikroglobulinspiegels im Serum und Urin diagnostiziert werden, wodurch ein Weg für eine geeignete Behandlung der Erkrankung eröffnet wird. Dies ist für die klinische Anwendung äußerst wichtig und wertvoll.Bisner did not have a suitable means of assessing disease of the tubal or urinary tubules. However, you can now easily go through the determination of the ßp-microglobulin levels in serum and urine were diagnosed thereby opening the way for appropriate treatment of the disease. This is for clinical Application extremely important and valuable.
Es bestand ein Interesse für die Entwicklung eines Verfahrens, durch welches ßp-Humanmikroglobulin im Serum oder im Urin mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit bestimmt werden kann. Jedoch erwies sich keines der gebräuchlichen Kittel für die Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin als zufriedenstellend. Eine bekannte Maßnahme ist ein Verfahren einer einseinen Eadialimmunodiffusion, bei welchem in einer Agarplatte, welche einen β.-,-HumanmikiOglobulin-Antikörper enthält, Bohrungen geschaffen werden, in diese Bohrungen eine Versuchsprobe eingefüllt wird und aus einem Ausfällungsband, welches bei der Diffusion von ßo-Mikroglobulin auftritt, das ßp-Humanmikroglobulin bestimmt wird. Da dieses Verfahren eine niedrige Empfindlichkeit besitzt, kann damit das ßp-Mikroglobulin in der Versuchsprobe lediglich in einer Konzentration oberhalb einer bestimmten Grenze bestimmt werden.There was an interest in developing a process by which ßp-human microglobulin in serum or urine can be determined with a high degree of accuracy and reliability. However, none of the common ones turned out to be Gown for the determination of ßo-human microglobulin as satisfactory. One known measure is a method of single radial immunodiffusion in which in an agar plate which contains a β -, - HumanmikiOglobulin antibody contains, bores are created, a test sample is filled into these bores and from a Precipitation band, which occurs during the diffusion of ßo-microglobulin occurs, which determines ßp-human microglobulin will. Since this method has a low sensitivity, the ßp-microglobulin in the test sample can only be used in a concentration above a certain Limit to be determined.
Die Radioimmunoassay-Kethoäe ist ebenfalls eine gebräuchliche Methode,nach welcher ßp-Mikroglobulin unter Verwendung eines mit einem Radioisotopen indizierten ßp-Eumanmikroglobulin-Antikörper gemessen wird. Dieses Verfahren ist jedoch gefährlich und mühsam, daThe radioimmunoassay method is also a common one Method according to which ßp-microglobulin using a ßp-human microglobulin antibody indicated with a radioisotope was measured will. However, this procedure is dangerous and troublesome since
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es die Verwendung einer radioaktiven Substanz umfaßt. Es kann daher nicht durchgeführt werden, wenn nicht eine ausreichende Kontrolle und Einrichtungen zur Anwendung der radioaktiven Substanz zur Verfugung stehen. it involves the use of a radioactive substance. It cannot therefore be carried out if there are insufficient controls and facilities for the use of the radioactive substance available.
Ein weiteres Beispiel ist ein Verfahren unter Anwendung einer passiven Umkehr-Hämagglutinationsreaktion (RPHA), nach welchem ß2-Mikroglobulin mit einer äquivalenten Empfindlichkeit, wie bei der Radioimmunoassay-Methode mühelos bestimmt werden kann. Da als Träger die roten Blutzellen von einem Tier verwendet werden, hat dieses Verfahren den Nachteil, daß bei der Herstellung von antikörpersensibilisierten roten Blutzellen,, Vorbehandlungen der roten Blutzellen, z.B. die Fixierung der roten Blutzellen und Behandlung der roten Blutzellen mit Bindereagenzien, wie Glutaraldehyd oder Gerbsäure erforderlich sind. Da außerdem eine nicht spezifische Reaktion, welche einem Antikörper für die als Träger verwendeten roten Blutzellen zugeschrieben wird, bei der praktischen Bestimmung häufig auftritt, ist es notwendig, eine Absorptionsbehandlung mit den roten Blutzellen und einen Kontrollversuch unter Verwendung von gebräunten Zellen durchzuführen.Another example is a method using a passive reverse hemagglutination reaction (RPHA), according to which β 2 -microglobulin can easily be determined with an equivalent sensitivity as in the radioimmunoassay method. Since the red blood cells of an animal are used as a carrier, this method has the disadvantage that in the production of antibody-sensitized red blood cells, pretreatments of the red blood cells, for example the fixation of the red blood cells and treatment of the red blood cells with binding agents such as glutaraldehyde or Tannic acid are required. In addition, since a non-specific reaction ascribed to an antibody for the red blood cells used as a carrier frequently occurs in the practical determination, it is necessary to conduct an absorption treatment with the red blood cells and a control experiment using browned cells.
Es wurden nunmehr Untersuchungen ausgeführt, um eine Mittel oder eine Methode zur Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin zu schaffen, die frei von den Nachteilen und Mangeln der gebräuchlichen, vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen ist, und die zuverlässige Ergebnisse mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit unter Verv/endung eines einfachen Gerätes und unter Anwendung einer einfachen Bestimmungsarbeitsweise liefern kann. Diese Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, daß eine Zusammensetzung, welche Teilchen eines synthetischen polymeren Latices, vorzugsweise Teilchen eines synthetischen polymeren Latices vom Styroltyp und einen ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper als Überzug auf der Oberfläche der Teil-Studies have now been carried out to find a means or a method for determining βp-human microglobulin to create that is free from the disadvantages and deficiencies of the customary working methods described above, and the reliable results with a high degree of accuracy using a simple device and using a simple determination procedure. These investigations led to the result, that a composition which particles of a synthetic polymeric latex, preferably particles of a synthetic polymeric styrene type latices and a βp-human microglobulin antibody as a coating on the surface of the partial
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chen enthält, eine überlegene La gerbe ständigkeit besitzt und bei der raschen Bestimmung der Konzentration von ßp-Humanmikroglobulin in einer Versuchsprobe mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit und einer guten Reproduzierbarkeit sehr brauchbar ist, wobei ein einfaches Meßinstrument und eine mühelose Bestimmungsarbeitsweise zur Anwendung gelangen, und wobei keine Störung durch andere Proteine, welche in der Versuchsprobe enthalten sein können, auftritt. Es wurde auch gefunden, daß die vorstehend genannte Zusammensetzung in einfacher Weise hergestellt und nicht nur als Latex sondern auch als getrocknetes Produkt gelagert werden kann.contains, has a superior storage life and in the rapid determination of the concentration of ßp-human microglobulin in a test sample with a high levels of accuracy and reliability and good reproducibility is very useful, with a simple measuring instrument and an effortless determination procedure are used, and none Interference by other proteins, which may be contained in the test sample, occurs. It was also found that the above-mentioned composition is easily prepared and not only as a latex but also can be stored as a dried product.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer neuartigen und ausgezeichneten Zusammensetzung zur Bestimmung von ß2-Humanraikroglobulin, eines Verfahrens zur Herstellung derselben und die Verwendung der vorstehend genannten Zusammensetzung.The object of the invention is therefore to provide a novel and excellent composition for determination of ß2-human raicroglobulin, a method of manufacture the same and the use of the above-mentioned composition.
ßp-Humanmikroglobulin ist in verschiedenen menschlichen Körperflüssigkeiten vorhanden. So können Urin, Milch, Serum und dergleichen als Ausgangs-ßo-Humanmikroglobulin für die Herstellung des ßp-Humanmikroglobulin-Antikörpersßp-human microglobulin is found in various human Body fluids present. Thus, urine, milk, serum and the like can be used as the starting ßo-human microglobulin for the production of the ßp-human microglobulin antibody
in der Zusammensetzung gemäß der Erfindung verwendetused in the composition according to the invention
werden. Am zweckmäßigsten wird das Ausgangsmaterial aus dem Urin eines Patienten, der an einer der vorstehendwill. Most conveniently, the starting material will be obtained from the urine of a patient who has been exposed to any of the foregoing
beschriebenen Krankheiten erkrankt ist, hergestellt.diseases described is made.
Die Abtrennung des ß2-Humanmikroglobulins kann unterThe separation of the ß 2 -humanmikroglobulin can under
Anwendung von verschiedenen, an sich bekannten Arbeitsweisen ausgeführt werden. Beispiele für derartige ArbeitsweisenApplication of different, per se known working methods can be carried out. Examples of such working methods
umfassen ein Zonenelektrophoretisch.es Verfahren, dascomprise a zone electrophoretically.es method that
Verfahren von Berggird u.a. (I. Berggird et al : J. Biol. Chem., 24-5, 4095, 1968) durch lonenaustausch-Chromatographie,Method of Berggird et al. (I. Berggird et al: J. Biol. Chem., 24-5 , 4095, 1968) by ion exchange chromatography,
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Gelfiltration und das Verfahren von Ohsawa u.a. (M. Ohsawa et al : Experientia, _29, 1179, 1973).Gel filtration and the Ohsawa et al. (M. Ohsawa et al: Experientia, 29, 1179, 1973).
Das Ausgangs-ßp-Humanmikroglobulin ist zweckmäßig eine Probe eines einzigen !Proteins, da der Einschluß von Verunreinigungen den nachfolgenden Arbeitsgang erschwert.The starting βp-human microglobulin is conveniently one Sample of a single protein, as the inclusion of impurities makes the subsequent operation more difficult.
Ein Antikörper des ßp-Humanmikroglobulins, welches unter Anwendung der vorstehend genannten bekannten Arbeitsweisen erhalten werden kann, kann durch Verabreichung des ßp-Mikroglobulins a]s ein Antigen an ein Tier mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines Antikörpers, z.B. Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen, in üblicher V/eise zur Immunisierung desselben, Abnahme von Blut aus dem immunisierten Tier und Abtrennung des ßp-Humanmikroglobulin-Antikörpers aus dem so erhaltenen Blut hergestellt werden.An antibody of ßp-human microglobulin, which under Applying the above known procedures can be obtained by administering the βp-microglobulin a] s an antigen to an animal capable of generating an antibody, e.g. guinea pigs, rabbits or goats, in a conventional manner for immunizing the same, drawing blood from the immunized animal and separating it the ßp-human microglobulin antibody from the thus obtained Blood are made.
Das bei diesem Verfahren verwendete Tier kann irgendein Tier sein, das die Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern besitzt. Um jedoch eine große Menge an Antikörper zu erhalten, wird die Verwendung eines großen Tieres bevorzugt. Gewöhnlich sind Kaninchen oder Ziegen geeignet, wobei jedoch das zu verwendende Tier nicht auf diese beschränkt ist. Die Abtrennung eines ßp-Humanmikroglobulin-Antikörpers aus dem diesen enthaltenden Antiserum kann unter Anwendung von bekannten Maßnahmen ausgeführt v/erden. Beispielsweise wird das Antiserum ausgesalzen und eine Absorption-Eluierung unter Verwendung eines unlöslichen Antigens wird wiederholt.The animal used in this method can be any animal that has the ability to raise antibodies owns. However, in order to obtain a large amount of antibody, it is preferred to use a large animal. Usually rabbits or goats are suitable, but the animal to be used is not limited to these. The separation of a ßp-human microglobulin antibody from the antiserum containing this can be carried out using known measures. For example the antiserum is salted out and an absorption-elution using an insoluble antigen is repeated.
Verschiedene synthetische Latexteilchen können für die Herstellung der Zusammensetzung für die Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele für Polymere oder Copolymere, welche diesen Latex bilden, umfassen Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol,Various synthetic latex particles can be used for manufacture the composition for the determination of ßp-human microglobulin can be used according to the invention. Examples of polymers or copolymers that make up this latex form include polystyrene, carboxylated polystyrene,
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aminohaltiges.carboxyliertes Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol/Butadien-Copolymeres, carboxyliertes Styrol/Butadien-Copolymeres, Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres, Vinyltoluol/ tert.-Butylstyrol-Copolymeres, Polyester, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylnitril, Acrylnitril/Butadien/ Styrol-Copolymeres, Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyrrolidon und Vinylchlorid/Acrylat-Copolymeres.amino-containing carboxylated polystyrene, polyvinyltoluene, Styrene / butadiene copolymer, carboxylated styrene / butadiene copolymer, Styrene / divinylbenzene copolymer, vinyltoluene / tert-butylstyrene copolymer, polyester, polyacrylic acid, Polymethacrylic acid, polyacrylonitrile, acrylonitrile / butadiene / Styrene copolymer, polyvinyl acetate acrylate, polyvinyl pyrrolidone and vinyl chloride / acrylate copolymer.
Bevorzugte Teilchen von synthetischen polymeren Latices sind Teilchen von synthetischen Polymerlatices vom Styroltyp aus der Gruppe von Styrolpolyaeren, Styrolcopolymeren^ z.B. einem Copolymeren von Styrol mit einem Monomeren aus der Gruppe von Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Vinylidenchlorid, und carboxylierte oder aminohaltige carboxylierte Produkte hiervon. Diese synthetischen Polymerlatexteilchen können nach Vorbehandlung ihrer Oberflächen mit einem nicht ionischen oberflächenaktiven Mittel verwendet werden. Beispielsweise werden diese Teilchen bevorzugt verwendet, nachdem ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthylenoxydtyp einem Verfahren zum Anhaften daran gebracht wurde, das in der JP-Offenlegungsschrift Nr. 9716/76, offengelegt am 26. Januar 1976, beschrieben ist. Beispiele für geeignete nicht ionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxydtyp sind ein Blockcopolymeres von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol, Polyoxyäthylenalkyläther und PoIyoxyäthylenaIky1aryläther.Preferred particles are synthetic polymeric latexes Particles of synthetic polymer latices of the styrene type from the group of styrene polymers, styrene copolymers, e.g. a copolymer of styrene with a monomer from the group of chlorostyrene, methyl methacrylate and vinylidene chloride, and carboxylated or amino-containing carboxylated products thereof. These synthetic polymer latex particles can be used after their surfaces have been pretreated with a nonionic surfactant. For example, these particles are preferably used after a nonionic surfactant has been used Ethylene oxide type was made to adhere thereto by a method disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 9716/76, laid open January 26, 1976. Examples of suitable non-ionic surfactants from Ethylene oxide are a block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene alkyl ethers and polyoxyethylene allyl aryl ethers.
Gemäß der Erfindung besitzen die synthetischen Polymerlatexteilchen vorzugsweise einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 /um, insbesondere 0,1 bis 1 /um. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse werden vorzugsweise Teilchen mit einem relativ engen Bereich der Größenverteilung verwendet. Das spezifische Gewicht der Latexteilchen beträgt vorzugsweise etwa 0,9 bis 1,4- und insbesondere 1,1 bis 1,3. Im Falle einer Bestimmung unterAccording to the invention, the synthetic polymer latex particles have preferably an average particle diameter of 0.01 to 10 μm, in particular 0.1 to 1 μm. To the Increase in the reproducibility of the measurement results preferably particles with a relatively narrow range of size distribution are used. The specific weight of the The latex particles are preferably about 0.9 to 1.4, and more preferably 1.1 to 1.3. In the event of a provision under
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Anwendung einer Aggjufcinationsreaktion auf einer Obgektträgerglasplatte können Latexteilchen mit einem "breiten Bereich des spezifischen Gewichts verwendet werden. Im Falle einer Mikrotitermethode werden Latexteilchen mit einem spezifischen Gewicht von wenigstens 1,1 bevorzugt verwendet. Die Zusammensetzung zur Bestimmung von ßp-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung kann in einfacher Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann sie dadurch hergestellt werden, daß man einen synthetischen polymeren Latex vorzugsweise mit einer Konzentration von 0,05 bis 5 °/° mit einem ß2-Humanmikroglobulin-Antikö"rper mit einer Konzentration von 0,0001 bis 1 % in einem Puffer bei einem pH-Bereich von vorzugsweise etwa 5 his etwa 10, insbesondere etwa 6,5 his etwa 8 bei einer Temperatur von vorzugsweiseApplying an agglomination reaction on a slide glass plate, latex particles having a "wide range of specific gravity" can be used. In the case of a microtiter method, latex particles having a specific gravity of at least 1.1 are preferably used. The composition for determining βp-human microglobulin according to the invention can be described in For example, it can be prepared by mixing a synthetic polymer latex, preferably at a concentration of 0.05 to 5 ° / °, with a ß2-human microglobulin antibody at a concentration of 0.0001 to 1%. in a buffer at a pH range of preferably about 5 to about 10, in particular about 6.5 to about 8 at a temperature of preferably
etwa 4 bis etwa 40 C in Berührung bringt. Das Inberührungkann do <=> brings about 4 to about 40 C in contact. The touch can do <=>
bringen/unter schwachem Rühren während etwa 30 min bis etwa 24 h ausgeführt werden.bring / with gentle stirring for about 30 min to run for about 24 hours.
Der zur Anwendung gelangende Puffer kann z.B. eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung ^fT/60 Phosphatpuffer (pH 7,2) mit einem Gehalt von 0,15 M HaCl, abgekürzt PBÖ7 und eine glycingepufferte Salzlösung sein. Erwünschtenfalls kann 0,01 bis 0,1 % eines Proteins z.B. Rinderserum-The buffer used can, for example, be a phosphate-buffered saline solution ^ fT / 60 phosphate buffer (pH 7.2) with a content of 0.15 M HaCl, abbreviated to PBÖ7 and a glycine-buffered saline solution. If desired can contain 0.01 to 0.1% of a protein e.g. bovine serum
vo-TZUgswexse albumin (abgekürzt BSA) zu einer Antikörperlösung / zugesetzt werden, um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern. Nach der Beschichtungs- oder Überzugsreaktion wird die Reaktionsmischung mehrmals durch Zentrifugierung in einer neutralen Salzlösung z.B. einer glycingepufferten Salzlösung oder in PBS gewaschen. Schließlich können die Latexteilchen mit dem darauf aufgebrachten Überzug von dem ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper in Form einer Suspension in einem Verdünnungsmittel gelagert werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die durch Zugabe vonvo-TZUgswexse albumin (abbreviated BSA) added to an antibody solution / to prevent non-specific agglutination. After the coating or coating reaction the reaction mixture is repeatedly centrifuged in a neutral saline solution, e.g. a glycine-buffered one Saline or washed in PBS. Finally, the latex particles with the coating of the ßp-human microglobulin antibody in the form of a suspension be stored in a diluent. The diluent is preferably a mixture obtained by adding
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etwa 0,1 % BSA zu einer glycingepufferten Salzlösung oder zu PBS erhalten vrurde. Es wird ferner "bevorzugt, dem Verdünnungsmittel 0,01 "bis 0,5 % von Natriumazid (NaN,) zuzusetzen.about 0.1 % BSA to glycine buffered saline or PBS was obtained. It is also "preferred to add 0.01" to 0.5% sodium azide (NaN,) to the diluent.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von ß^-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung kann in Form eines Latices, wie vorstehend "beschrieben, und auch in Form eines getrockneten Produktes vorliegen. Die Zusammensetzung in Form eines getrockneten Produktes kann erhalten werden, indem man einen Stabilisator, z.B. eine Aminosäure (z.B. Glycin oder Natriumglutamat) oder Dextran zu dem vorstehend "beschriebenen Verdünnungsmittel zusetzt, die Latexmasse mit dem darauf befindlichen Überzug des ßo-Humanmikroglobulin-Antikörpers in dem Verdünnungsmittel suspendiert und die Suspension gefriertrocknet. Die Mengen von Aminosäuren und Dextran sind etwa 1,2 bis etwa 4 Gew.Teile, beziehungsweise etwa 1,6 bis etwa 6 Gew.Teile je 1 Gew.Teil Latexteilchen.The composition for the determination of ß ^ -human microglobulin according to the invention can be in the form of a latex, as described above, and also in the form of a dried Product. The composition in the form of a dried product can be obtained by a stabilizer such as an amino acid (e.g. glycine or sodium glutamate) or dextran to that described above Adding diluent, the latex mass with the coating of the ßo-human microglobulin antibody on it suspended in the diluent and the suspension freeze-dried. The amounts of amino acids and dextran are about 1.2 to about 4 parts by weight, or about 1.6 to about 6 parts by weight per 1 part by weight of latex particles.
Die Zusammensetzung zur Bestimmung von ß2-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung besitzt eine gute Stabilität sowohl in Form eines Latices als auch in Form eines getrockneten Produktes. Das getrocknete Produkt kann während einer längeren Zeitdauer beispielsweise während mehrerer Jahre stabil gelagert werden.The composition for the determination of ß2-human microglobulin according to the invention has good stability both in the form of a latex and in the form of a dried one Product. The dried product can be stored stably for a longer period of time, for example for several years will.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung von ß2-Humanmikroglobulin geschaffen, nach welchem ßp-Humanmikroglobulin in menschlichem Urin oder Serum unter Verwendung der Zusammensetzung, die synthetische Polymerlatexbeilchen und als Überzug auf den Oberflächenlatexteilchen einen ß^-Humanmikroglobulin-Antikörper umfaßt, qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.According to the invention there is provided a method for determining β2-human microglobulin, according to which βp-human microglobulin in human urine or serum using the composition containing synthetic polymer latex particles and comprising as a coating on the surface latex particles a β ^ human microglobulin antibody, qualitative or is quantified.
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Zur Bestimmung können an sich bekannte Maßnahmen zur Anwendung gelangen; beispielsweise kann die Konzentration von ßg-Mikroglobulin in Serum oder "Urin nach einem Mikrotiterverfahren mühelos bestimmt werden. Gemäß dieser Arbeitsweise wird eine bestimmte Menge eines Verdünnungsmittels der vorstehend erläuterten Art anteilsweise auf eine Mikroplatte gegossen und dann wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe, z.B. von Serum oder Urin in die erste Bohrung oder den ersten Boden eingeführt und allmählich mit einem Verdünner verdünnt. Ebenfalls wird eine Verdünnungsreihe in der gleichen Weise unter Verwendung eines Standardantigens hergestellt. Eine bestimmte Menge eines mit ß2-Humanmikroglobulin-Antikörpers sensibilisierten Latices zu jeder Verdünnungsreihe zugegeben und damit gemischt. Bach Stehenlassen während einer bestimmten Zeitdauer bei Eaumtemperatur wird der Endpunkt der Agglutination beobachtet und die absolute Menge von ßg-Mikroglobulin kann durch Vergleich mit der Standardantigenreihe bestimmt werden.Measures known per se can be used for the determination reach; for example, the concentration of βg-microglobulin in serum or urine can be determined by a microtiter method can be easily determined. According to this procedure, a certain amount of a diluent of the type described above is partially poured onto a microplate and then a certain amount of Test sample, e.g. of serum or urine, introduced into the first hole or the first floor and gradually with a Thinner diluted. A serial dilution is also carried out in the same way using a standard antigen manufactured. A certain amount of a ß2-human microglobulin antibody sensitized latices were added to and mixed with each dilution series. Let the brook stand the end point of agglutination is observed and the absolute amount of ßg-microglobulin can be determined by comparison can be determined with the standard antigen series.
Bei dem gebräuchlichen Verfahren der Einzelradialimmunodiffusion zur Bestimmung von ßp-Mikroglobulin kann das ß2~Mikroglobulin nicht bestimmt werden, wenn nicht dessen Menge wenigstens 5 /U-g je ml einerVersuchsprobe beträgt, falls die Versuchsprobe Serum oder Urin ist. Da die Neigung zum Auftreten von Fehlern bei einem ß2-Mikroglobulingehalt von etwa 5 bis 10 /Ug besteht, wird eine etwas höhere Konzentration bevorzugt. Im Gegensatz dazu ist es bei dem Verfahren zur Bestimmung von ßg-Mikroglobulin gemäß der Erfindung unter Verwendung des mit dem ß2-Eiimanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices möglich, eine Bestimmung auszuführen, wenn die Menge von ß2-Mikroglobulin mehr als 1 ng je ml beträgt. Somit zeigt das Verfahren gemäß der Erfindung eine sehr hohe Empfindlichkeit, und die Empfindlich-With the customary method of single radial immunodiffusion for the determination of ßp-microglobulin, ß2 ~ microglobulin cannot be determined unless its amount is at least 5 / Ug per ml of a test sample, if the test sample is serum or urine. Since there is a tendency for errors to occur with a β 2 -microglobulin content of about 5 to 10 / Ug, a somewhat higher concentration is preferred. In contrast, in the method for determining βg-microglobulin according to the invention using the latex sensitized with β2-egg-microglobulin antibody, it is possible to make a determination when the amount of β2-microglobulin is more than 1 ng per ml. Thus, the method according to the invention shows a very high sensitivity, and the sensitivity
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keit ist derjenigen äquivalentspeed is equivalent to that
oder höher als diese der Radioimmunoassay-Methode, die als eine Methode mit der höchsten Empfindlichkeit bei gebräuchlichen Analysen angesehen wird.or higher than that of the radioimmunoassay method, which is considered to be one of the most sensitive methods in common analysis.
Bei einer anderen Ausführungsform der Bestimmung gemäß der Erfindung wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe auf eine Objektträgerglasplatte getropft, und getrennt davon wird eine festgelegte Menge einer ßo-Humaninikroglobulinlösung von einer bekannten Konzentration tropfenweise zugegeben. Eine bestimmte Menge des mit dem ßp-Huaanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices wird zu jeder der Lösungen zugegeben, worauf eine schwache Schwingbewegung erteilt wird. Bei Bewertung des sich ergebenden Agglutinationsmusters kann die Konzentration von dem ßp-Humanmikroglobulin in der Versuchsprobe innerhalb weniger Minuten qualitativ bestimmt werden. Eine halbquantitative Bestimmung kann ebenfalls ausgeführt werden, wenn die Versuchsprobe in einem Probeglas verdünnt wird und die Reaktion mit Bezug auf die jeweilige Verdünnung beobachtet wird.In another embodiment, the determination according to According to the invention, a certain amount of a test sample is dropped onto a slide glass plate and separated a fixed amount of a ßo-human microglobulin solution is of this added dropwise of a known concentration. A certain amount of the with the βp-huaan microglobulin antibodies sensitized latices is added to each of the solutions, whereupon a weak oscillating motion is given. When evaluating the resulting The agglutination pattern can show the concentration of the ßp-human microglobulin in the test sample within a few minutes can be qualitatively determined. A semi-quantitative determination can also be carried out if the test sample is diluted in a test glass and the reaction with reference to the respective dilution is observed.
Die Zusammensetzung für die Bestimmung von ß^-Humanmikroglobulin in Form eines Latices oder in Form eines getrockneten Produktes ist den Zusammensetzungen überlegen, die durch Überziehen von roten Blutkörperchen oder anderen iCrägermaterialien mit ßp-Humanmikroglobulin erhalten wurden, da aufgrund des Fehlens eine Antigenizität des Trägers selbst nicht—spezifische Reaktionen außer der gewünschten Antigen-Antikörperreaktion nicht stattfinden, und weil ein ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper direkt auf einen Latex mühelos durch einfaches Eintauchen einer Antikörperlösung in den Latex ohne Verwendung eines Binders als Überzug aufgebracht werden kann, und weil sie eine guteThe composition for the determination of ß ^ -human microglobulin in the form of a latex or in the form of a dried product is superior to the compositions which obtained by coating red blood cells or other carrier materials with ßp-human microglobulin, since, due to the lack of antigenicity of the carrier itself, non-specific reactions other than the desired ones Antigen-antibody reaction does not take place, and because a ßp-human microglobulin antibody directly targets one Latex effortlessly by simply dipping an antibody solution into the latex without using a binder as Coating can be applied and because they are good
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Lagerstabilität besitzt.Has storage stability.
Die neuartige Zusammensetzung gemäß der Erfindung, welche Latexteilchen und einen darauf als Überzug aufgebrachten ß^-Humanaikroglobulin-Antikörper umfaßt, reagiert überhaupt nicht mit anderen Proteinen als dem ßg-Humanmikroglobulin und der träger reagiert ebenfalls nicht mit ßo-Mikroglobulin. Aufgrund dieser Tatsache kann gesagt werden, daß der ßo-Humanmikroglobulin-Antikörper an die Trägerlatexteilchen gebunden ist.The novel composition according to the invention which Comprises latex particles and a β ^ -humanicroglobulin antibody coated thereon, reacts at all not with proteins other than ßg-human microglobulin and the carrier also does not react with β-microglobulin. From this fact, it can be said that the βo-human microglobulin antibody is bound to the carrier latex particles is bound.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Herstellungsbeispielen und Arbeitsbeispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with reference to production examples and working examples.
Herstellung von ßo-Humanmikroglobulin:Production of ßo-human microglobulin:
C.C.
Ein Kilogramm Ammonium sulfat wurde zu etwa 2 1 Urin eines an Nierenentzündung erkrankten Patienten gegeben und die Lösung wurde über Nacht bei 4 0C stehengelassen. Die gebildete Ausfällung wurde gesammelt und in Wasser gelöst. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugierung abgetrennt und die Ausfällung wurde in Salzlösung aufgelöst und auf eine Sephadex G100-Säule (ein Produkt von Pharmacia Pine Chemicals Co., Ltd., Schweden) (5 χ 100 cm), gepuffert mit einer 0,02M Erispufferlösung (pH 8,0) mit einem Gehalt von 1M Natriumchlorid aufgebracht. Der Puffer wurde bei einem Strömungsausmaß von 40 ml/h fließen gelassen, um eine Gelfiltration auszuführen. 400 ml eluierter Fraktionen wurden gesammelt, entsalzen und auf ein Volumen von 10 ml konzentriert. Dann wurde das Produkt auf eine DEAE-Cellulose-Säule (ein Produkt von Brown Company, USA) (2,5 x 40 cm) gepuffert mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,5) aufge-One kilogram of ammonium sulfate was added to about 2 liters of urine from a patient suffering from kidney inflammation and the solution was left to stand at 4 ° C. overnight. The precipitate formed was collected and dissolved in water. The insoluble matter was separated by centrifugation, and the precipitate was dissolved in saline and applied to a Sephadex G100 column (a product of Pharmacia Pine Chemicals Co., Ltd., Sweden) (5 × 100 cm) buffered with a 0.02M Eris buffer solution (pH 8.0) with a content of 1M sodium chloride is applied. The buffer was allowed to flow at a flow rate of 40 ml / h to carry out gel filtration. 400 ml of eluted fractions were collected, desalted and concentrated to a volume of 10 ml. The product was then applied to a DEAE cellulose column (a product of Brown Company, USA) (2.5 x 40 cm) buffered with a 0.01 M phosphate buffer (pH 7.5).
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bracht und die Eluierung wurde ausgeführt, während die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer linear auf 0,2 Mol zunahm. 70 ml einer Proteinfraktion, die an erster Stelle eluiert wurde, wurde gesammelt, entsalzen und auf 10 ml konzentriert. Die Flüssigkeit wurde auf eine SP-Sephadex C 50-Säule (Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) (2 χ 35 cm), gepuffert mit einem 0,OA-M Phosphatpuffer (pH 5S9) aufgebracht und die Eluierung wurde bei einem Strömungsausmaß von 25 ml je h ausgeführt, wobei die Konzentration des Puffers linear auf 0,02 Mol erhöht wurde. 100 ml von Fraktionen von 73 ml bis 175 ml Eluat wurden gesammelt, entsalzen, konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 60 ml eines weißen Pulvers erhalten wurden.and the elution was carried out while the concentration of sodium chloride in the buffer increased linearly to 0.2 mol. 70 ml of a protein fraction eluted in the first place was collected, desalted and concentrated to 10 ml. The liquid was applied to an SP-Sephadex C 50 column (Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Sweden) (2 × 35 cm), buffered with a 0.0A-M phosphate buffer (pH 5 S 9), and the elution was carried out at a flow rate of 25 ml per hour with the concentration of the buffer increasing linearly to 0.02 mol. 100 ml of fractions from 73 ml to 175 ml of eluate were collected, desalted, concentrated and freeze-dried to give 60 ml of a white powder.
Das Produkt zeigte ein einzigesBand bei der Scheibenelektrophorese. The product showed a single band on disk electrophoresis.
Herstellung von ß^-Humanraikroglobulin-Antikörper:Production of ß ^ human microglobulin antibodies:
Das im Herstellungsbeispiel 1 erhaltene ßp-Humanmikroglobulin wurde in einer physiologischen Salzlösung in einer Konzentration von 4 mg/ml der letzteren aufgelöst. Die Lösung wurde mit einer gleichen Menge eines vollständigen Freund1sehen Hilfsmittels vermischt. Die Mischung wurde in einer Menge von 0,1 ml in jedes Faßpolster von 4- gesunden Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 2,3 bis2,5 kg dreimal in der Woche eingespritzt. Eine Voche später wurde 1 ml einer 0,1 %igen ßp-Humanmikroglobulinlösung indiziert. Drei Wochen nach der letzten Injektion wurde das Gesamtblut aus der Halsschlagader der Kaninchen entnommen. Das Blut wurde in üblicherweise zentrifugiert und das sich ergebende Serum wurde bei 56 0C während 30 min gehalten, wobei etwa 200 ml AntiserumThe βp-human microglobulin obtained in Preparation Example 1 was dissolved in a physiological saline solution at a concentration of 4 mg / ml of the latter. The solution was mixed with an equal amount of a complete Freund 1 see adjuvant. The mixture was injected in an amount of 0.1 ml into each barrel pad of 4 healthy rabbits weighing about 2.3 to 2.5 kg three times a week. One week later, 1 ml of a 0.1% ßp-human microglobulin solution was indicated. Whole blood was drawn from the rabbits' carotid artery three weeks after the last injection. The blood was centrifuged in the usual way and the resulting serum was kept at 56 0 C for 30 min, with about 200 ml of antiserum
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gebildet wurden.were formed.
Aus der Tatsache,daß ein einziges Ausfällungsband mit einem Antigen nach einem Ouchtalony-Terfahren und nach der Immunoelektrophorese gebildet wurde, wurde festgestellt, daß das sich ergebende Antiserum ein einziger Antikörper war.From the fact that a single band of precipitation with a Antigen after an Ouchtalony method and after immunoelectrophoresis was formed, it was found that the resulting antiserum was a single antibody.
Herstellung von unlöslichem ß^-Humanmikroglobulin:Production of insoluble ß ^ -human microglobulin:
5 mg von ßp-Humanmikroglobulin wurden in 5 ml einer 0,2M Essigsäur epufferlösung (pH 5»0) gelöst und etwa 0,5 ml einer 5 %igen Rinaerserumalbuminlösung wurden zugegeben. Dann wurde 5 %iger Glutaraldehyd tropfenweise zugegeben, bis eine Ausfällung gebildet wurde. Die Ausfällung wurde gesammelt, homogenisiert und mit EBS und dann mit einem Glycin-Salzsäure-Euffer (pH 2,8) und ferner mit EBS gewaschen und bei unter -20 0C gelagert.5 mg of βp-human microglobulin was dissolved in 5 ml of a 0.2M acetic acid buffer solution (pH 5 »0) and about 0.5 ml of a 5% pure serum albumin solution was added. Then 5% glutaraldehyde was added dropwise until a precipitate was formed. The precipitate was collected, homogenised and stored with EBS and then with a glycine-hydrochloric acid Euffer (pH 2.8) and further washed with EBS and below -20 0 C.
Eeinigung von ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper:Agreement on ßp-human microglobulin antibodies:
Zu dem Antiserum wurde eine gleiche Menge einer gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat ,gegeben, worauf vollständig gemischt wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 min stehengelassen. Die sich dabei bildende Ausfällung wurde durch Zentrifugalabscheidung gesammelt, mit 0,5 gesättigter Lösung von Ammoniumsulfat gewaschen und dann gegen EBS dialysiert. Dann wurde das im Herstellungsbeispiel 3 hergestellte unlösliche ßp-Humanmikroglobulin zu dem Dialysat zugegeben und die Mischung wurde anschließend bei SaumtemperaturAn equal amount of a saturated solution of ammonium sulfate was added to the antiserum and mixed completely became. The mixture was left to stand at room temperature for 30 minutes. The precipitate that forms in the process was collected by centrifugal separation, washed with 0.5 saturated solution of ammonium sulfate, and then dialyzed against EBS. Then, the insoluble βp-human microglobulin prepared in Preparation Example 3 became the dialysate added and the mixture was then at seam temperature
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30 min stehen-gelassen. Die Mischung wurde zur Trennung in eine überstehende Flüssigkeit und in eine Abscheidung zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde erneut unlösliches ßo-Humanmikroglobulin zugegeben und die Mischung wurde in gleicher Weise behandelt. Die zwei Ausfällungen wurden vereinigt und mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Glycin-Salzsäure-Puffer (pH 2,8) zugegeben und die Mischung wurde 5 min lang geschüttelt, worauf zentrifugiert wurde. Die Ausfällung wurde in ähnlicher Weise mit einem Glycin-Salzsäure-Puffer behandelt und die sich ergebenden überstehenden Flüssigkeiten vereinigt. Die Mischung wurde gegen PBS dialysiert, wobei ein gereinigter ßg-Humanmikroglobulin-Antikörper gebildet wurde.Left to stand for 30 min. The mixture became a separation centrifuged into a supernatant liquid and into a deposit. To the supernatant liquid became insoluble ßo-human microglobulin was again added and the Mixture was treated in the same way. The two precipitates were combined and washed with PBS. Then became a glycine-hydrochloric acid buffer (pH 2.8) was added and the Mixture was shaken for 5 minutes and then centrifuged became. The precipitate was similarly treated with a glycine-hydrochloric acid buffer and the resulting combined supernatant liquids. The mixture was dialyzed against PBS using a purified βg-human microglobulin antibody was formed.
Mit ßo-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierter Latex:Latex sensitized with ßo-human microglobulin antibodies:
Polystyrollatex (ein Produkt von Takeda Chemical Industry Co., Ltd; SDL 59; spezifisches Gewicht 1,14; Teilchendurchmesser 0,9 /tun) wurde mit PBS so verdünnt, daß die Konzentration der Teilchen 0,25 % erreichte, worauf eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers, der bis auf das 60-fache mit PBS verdünnt wurde, zugegeben wurde. Die Mischung wurde bei 37 0C während zwei Stunden gehalten, worauf . zentrifugiert wurde. Die Latexteilchen wurden gesammelt und mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel gewäsehen. Danach wurden die Latexteilchen bis auf eine Konzentration von 0,25 % unter Verwendung eines Verdünnungsmittels suspendiert, wobei ein mit ß2-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierter Latex gebildet wurde.Polystyrene latex (a product of Takeda Chemical Industry Co., Ltd; SDL 59; specific gravity 1.14; particle diameter 0.9 / tun) was diluted with PBS so that the concentration of the particles reached 0.25 % , followed by an equal amount a purified antibody diluted 60-fold with PBS was added. The mixture was kept at 37 ° C. for two hours, whereupon. was centrifuged. The latex particles were collected and washed with PBS and then with a diluent. Thereafter, the latex particles were suspended to a concentration of 0.25% using a diluent, whereby a latex sensitized with β2-human microglobulin antibody was formed.
Wenn eine ß2-Humanmikroglobulinlösung zu diesem sensibilisierten Latex zugegeben wurde, trat eine Agglutination ein. Es fand jedoch keine Agglutination statt, wenn Albumin-,When a β2 human microglobulin solution was added to this sensitized latex, agglutination occurred. However, no agglutination took place when albumin,
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IgG-, IgM- und IgA-Lösungen jeweils hierzu zugegeben wurden.IgG, IgM and IgA solutions were each added thereto.
Das verwendete Verdünnungsmittel war PBS mit einem Gehalt an 0,08 % BSA und 0,1 % Natriumazid.The diluent used was PBS containing 0.08 % BSA and 0.1 % sodium azide.
.Arbeitsbeispiel 2Working example 2
Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin:Determination of ßo-human microglobulin:
Ein Verdünnungsmittel in einer Menge von 0,025 ml wurde jeweils in eine Bohrung einer Mikroplatte vom V-Ί^ρ gegossen und 0,025 ml Serum oder eines mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnten SeruEB wurden der ersten Bohrung zugegeben und mit einem Verdünner nach einem Reihendoppelverdünnungsverfahren allmählich verdünnt. Ferner wurden 0,025 ml einer Standardlösung mit einem Gehalt von 0,01 >ug ßp-Humanmikroglobulin je ml der ersten Bohrung einer weiteren Reihe zugegeben und in gleicher Weise verdünnt. Dann wurden 0,025 ml des mit ß2-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices in jede der Bohrungen gegossen und nach ausreichendem Vermischen bei Raumtemperatur während mehr als 10 h stehengelassen, um den Endpunkt der Agglutination zu beobachten. Wenn eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfand, wurden die Latexteilchen auf der gesamten Oberfläche des Bodens einer Bohrung dispergiert. Wenn keine Antigen-Antikörper-Reaktion stattfand, sammelten sich die Latexteilchen in der Mitte von jeder Bohrung. Auf diese Weise kann der Endpunkt der Agglutination bewertet werden. Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren wurde die Menge von ßo-Mikroglobulin mit Bezug auf sieben Proben von Serum, das auf das 100-fache verdünnt war, und sieben Proben von Urin, der auf das 50-fache verdünnt war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.A diluent in an amount of 0.025 ml was poured into each hole of a microplate of V-Ί ^ ρ and 0.025 ml Serum or one diluted with a suitable diluent SeruEB were added to the first well and diluted with a serial double dilution method gradually thinned. In addition, 0.025 ml of a standard solution containing 0.01> µg of βp-human microglobulin added to each ml of the first hole in a further row and diluted in the same way. Then 0.025 ml of the ß2-human microglobulin antibodies sensitized latices are poured into each of the wells and after sufficient mixing left at room temperature for more than 10 hours to observe the end point of agglutination. if an antigen-antibody reaction occurred, the latex particles became dispersed over the entire surface of the bottom of a well. If there was no antigen-antibody reaction, the latex particles collected in the center of each hole. This can be the end point of agglutination be rated. According to the above procedure, the amount of β-microglobulin was referred to on seven samples of serum diluted 100-fold and seven samples of urine diluted 50-fold was determined. The results are shown in Table I below.
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Probesample
Konzentration von
Standard-ßo-MikroglobulinConcentration of
Standard ßo-microglobulin
AgglutationsmusterAgglutation pattern
(ng/ml)(ng / ml)
2,5 1,25 0,625 0,312 0,156 0,078 0,03S2.5 1.25 0.625 0.312 0.156 0.078 0.03 S.
Konz entration in der Probe (ng/ml)Concentration in the sample (ng / ml)
Gesunder Erwachsener (32 JahreHealthy adult (32 years
alter Mann)old man)
Gesunder Erwachsener (43 JahreHealthy adult (43 years
alter Mann)old man)
Gesunder Erwachsener (22 JahreHealthy adult (22 years
alter Mann)old man)
Leukämie-Patient (9 Jahre alt,Leukemia patient (9 years old,
männlich)masculine)
53 Jahre alter Mann, erkrankt an Magenkrebs53 year old man, suffering from stomach cancer
62 Jahre alter Mann, erkrankt an Nierenversagen62 year old man with kidney failure
32 Jahre alte Frau, erkrankt an SLE32 year old woman with SLE
0,5 10.5 1
8 88 8
über 8over 8
Gesunder Erwachsener (32 JahreHealthy adult (32 years
alter Mann) Gesunder Erwachsener (43 Jahreold man) Healthy adult (43 years
alter Mann) Gesunder Erwachsener (22 Jahreold man) Healthy adult (22 years
alter Mann)old man)
57 Jahre alter Mann mit Knochenmarkerkrankung (Myeloma) 57 year old man with bone marrow disease (myeloma)
9 Jahre alt, männlich, erkrankt an Leukämie9 years old, male, developed leukemia
62 Jahre alter Mann, erkrankt an Nierenversagen62 year old man with kidney failure
32 Jahre alte Frau, erkrankt an SLE 0,25 0,13 0,2532 year old female with SLE 0.25 0.13 0.25
über 8 Ot <over 8 Ot <
Anmerkungannotation
+: positiv; -: negotiv+: positive; -: negotiv
Bestimmung von ßo-Humanmikroglobulin durch Objektglas-Aggregation (Slide Aggregation):Determination of β-human microglobulin by slide aggregation (Slide aggregation):
Polystyrollatex (ein Produkt von Dow Chemical; Teilchendurchmesser 0,22 + 0,006 /um; spezifisches Gewicht 1,05) wurde mit einem Glycin-Natriuachlorid-Puffer (pH 8,4) auf 1 % verdünnt und eine gleiche Menge des gereinigten Antikörpers wurde zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 0C stehengelassen und dann zentrifugiert, wobei der Latex abgetrennt wurde. Der Latex wurde einmal mit einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer gewaschenund auf eine Konzentration von 1 % in einem Glycin-Natriumchlorid-Puffer mit einem Gehalt von 1 % BSAsuspendiert, wobei ein sensibilisierter Latex gebildet wurde.Polystyrene latex (a product of Dow Chemical; particle diameter 0.22 + 0.006 / µm; specific gravity 1.05) was diluted to 1% with a glycine-sodium chloride buffer (pH 8.4) and an equal amount of the purified antibody was added . The mixture was left to stand at 4 ° C. overnight and then centrifuged, the latex being separated off. The latex was washed once with a glycine-sodium chloride buffer and suspended to a concentration of 1% in a glycine-sodium chloride buffer containing 1 % BSA to form a sensitized latex.
50 yul einer ßp-Humanmikroglobulin-Lösung mit einer Konzentration von 400 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml oder 25 ng/ml wurden getrennt tropfenweise auf ein Objektglas aufgebracht. Dann wurden 50 /Ul des erhaltenen sensibilisierten Latices tropfenweise auf die Oberseite jeweils zugegeben und unter sanftem Rühren während einiger Minuten wurde die Reaktion beobachtet. Ein Agglutinationsmuster erschien, wenn die Konzentration der ßo-Humanmikroglobulinlösung 400 ng/ml, 200 ng/ml und 100 ng/ml betrug. Es trat jedoch kein Agglutinationsmuster in Erscheinung bei einer Konzentration von 50 ng/ml und 25 ng/ml.50 yul of a ßp-human microglobulin solution with a concentration of 400 ng / ml, 200 ng / ml, 100 ng / ml, 50 ng / ml or 25 ng / ml were separately applied dropwise to a slide glass. Then, 50 / µl of the sensitized latex obtained Added dropwise on top of each time and with gentle stirring for a few minutes, the reaction was stopped observed. An agglutination pattern appeared when the concentration of the ßo-human microglobulin solution was 400 ng / ml, 200 ng / ml and 100 ng / ml. However, no agglutination pattern appeared at a concentration of 50 ng / ml and 25 ng / ml.
Nach der vorstehend angegebenen Arbeitsweise wurde der Gehalt an ß2-Humanmikroglobulin bei sechs Beispielen von Seren undAccording to the procedure given above, the content of ß2-human microglobulin in six examples of sera and
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sechs Beispielen von Urin bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt.six samples of urine determined. The results are in summarized in Table II below.
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Tabelle II: LatexagglutinationswertTable II: Latex agglutination value
musterAgglutination
template
50-fache)Serum (diluted to the
50 times)
der ProbeConcentration in
the sample
+ +100 50 25
+ +
alter Mann)Healthy adult (32 years
old man)
alter Mann)Healthy adult (43 years
old man)
2,5 g/nlless than
2.5 g / nl
alter Mann)Healthy adult (22 years
old man)
alt, männlich)Leukemia patient (9 years
old, male)
krankt an Hierenversagen62 year old man, he
suffers from hernia failure
5 g/mlat least
5 g / ml
an SLEJ2 year old woman, ill
to SLE
10-fache)Urine (diluted to the
10 times)
alter Mann)Healthy adult (32 years
old man)
alter Mann)Healthy adult (43 years
old man)
++
+
0,5 g/mlless than
0.5 g / ml
alter Mann)Healthy adult (22 years
old man)
alt, männlich
62 Jahre alter Mann, erkrankt
an NierenversagenLeukemia patient (9 years
old, male
62 year old man, ill
from kidney failure
an SLE32 year old Prau, ill
to SLE
++ +400 200
++ +
1 g/ml
11at least
1 g / ml
11
ß2-Mikroglobulinlösung (ng/ml)
AgglutinationsmusterConcentration of standard
ß 2 -microglobulin solution (ng / ml)
Agglutination pattern
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-23- 2334756-23- 2334756
Durch Ausführung einer Behandlung in gleicher Weise wie in Arbeitsbeispiel 1 wurde ein Latex sensibilisiert, gewaschen und in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt von 0,5 % Glycin und 0,7 % Dextran T-10 (ein Produkt von Pharmacia Pine Chemicals Co., Ltd., Schweden) so suspendiert, daß die Konzentration der Latexteilchen 1,25 % erreichte. Die Suspension wurde dann in üblicher Weise gefriergetrocknet, wobei eine Zusammensetzung von Latexteilchen mit einer Empfindlichkeit gegenüber einem ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper erhalten wurde.By carrying out treatment in the same manner as in Working Example 1, a latex was sensitized, washed and dissolved in a diluent containing 0.5 % glycine and 0.7 % dextran T-10 (a product of Pharmacia Pine Chemicals Co., Ltd ., Sweden) so that the concentration of the latex particles reached 1.25 % . The suspension was then freeze-dried in the usual manner to obtain a composition of latex particles sensitive to a βp-human microglobulin antibody.
Ein Verdünnungsmittel wurde zu der in Arbeitsbeispiel 4 erhaltenen Latexteilchenzusammensetzung mit einer Empfindlichkeit gegenüber ίϊρ-Humanmikroglobulin-Antikörper zugegeben. Bei Ausführung der gleichen Arbeitsweise wie in Arbeitsbeispiel 2 wurde dann die Menge von 3p-Mikrogibbulin in Serum und Urin bestimmt. Es wurden dabei ähnliche Ergebnisse erhalten.A diluent was added to the latex particle composition obtained in Working Example 4 with sensitivity against ίϊρ-human microglobulin antibodies added. Then, carrying out the same procedure as in Working Example 2, the amount of 3p-microgibbulin became determined in serum and urine. Similar results were obtained.
Aus den in den vorstehenden Beispielen erhaltenen Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß die Menge von ßp-Mikrοglobulin in Serum und Urin von Patienten, die an verschiedenen Krankheiten erkrankt sind, einen offensichtlich höheren Wert als derjenige in den Seren und Urinflüssigkeiten von gesunden Erwachsenen zeigten. Demgemäß ist die Bestimmung der Menge von ßp^-Mikroglobulin in Blut und Urin äußerst wertvoll für die Diagnose von diesen Erkrankungen.It is clear from the results obtained in the above examples that the amount of βp-microglobulin in Serum and urine of patients suffering from various diseases are obviously higher than that in the sera and urinary fluids of healthy adults. Accordingly, the determination is the amount of βp ^ -microglobulin in blood and urine is extremely high valuable for the diagnosis of these diseases.
Getrennt wurde die Menge von ß2-Mikroglobulin in dem SerumThe amount of β 2 -microglobulin in the serum was separated
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und in Urin von Menschen gemessen, wobei ein mit ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierter Latex, hergestellt aus dom Antiserum einer Ziege unter Anwendung der gleichen Arbeitsweise wie in Herstellungsbeispiel 4 und in den nachfolgenden Arbeitsbeispielen, verwendet wurden. Die Ergebnisse waren völlig die gleichen wie in den vorstehend aufgeführten Tabellen.and measured in human urine, one with ßp-human microglobulin antibody sensitized latex prepared from goat antiserum using the same Procedures as in Preparation Example 4 and in the following working examples were used. The results were completely the same as in the tables listed above.
Unter Verwendung des mit ßp-Humanmikroglobulin-Antikörper sensibilisierten Latices oder der den sensibilisierten Latex gemäß der Erfindung enthaltenden Zusammensetzung kann die Menge von ßo-Mikroglobulin innerhalb einer kürzeren Zeitdauer gemessen werden, wenn eine Probe (menschliches Serum oder menschlicher Urin) in einer sehr geringen Menge von weniger als 0,03 el vorhanden ist. Die Empfindlichkeit ist äußerst hoch und ein ng von ß^-Mikroglobulin je 1 ml der Versuchsprobe kann bestimmt werden. Demgemäß gewährt die Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine wichtige und brauchbare Information für die Diagnose von Leukämie, Nierenerkrankungen, Entzündungen oder dergleichen, und ihr Anwendungsbereich ist sehr breit. Da ferner die Menge der Versuchsprobe sehr gering sein kann, ist die Zusammensetzung gemäß der Erfindung besonders geeignet für Kinder, insbesondere für Neugeborene und Säuglinge, von welchen lediglich eine kleine Blutmenge ent -nommen werden kann.Using the βp-human microglobulin antibody sensitized latices or the sensitized latex according to the composition containing the invention, the amount of β-microglobulin can be increased within a shorter period of time measured when a sample (human serum or human urine) is in a very small amount of less than 0.03 el is present. The sensitivity is extremely high and a ng of ß ^ -microglobulin per 1 ml of the Test sample can be determined. Accordingly, the composition according to the invention provides an important and useful one Information for the diagnosis of leukemia, kidney disease, inflammation or the like, and their scope is very wide. Furthermore, since the amount of the test sample can be very small, the composition is according to the invention particularly suitable for children, in particular for newborns and infants, of which only a small one Amount of blood can be drawn.
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