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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Nachweis von menschlichem carcinoembryonalen Antigenen im Blut durch a) Zusatz einer bestimmten Menge von Anti-carcinoem bryonalem Antigen-Antiserum zu einer Probe von mit Per chlorsäure extrahiertem Blutserum, b) Inkubieren des Gemisches, c) Zusatz einer bestimmten Menge von radioaktiv markiertem menschlichem carcinoembryonalem Antigen zu dem Gemisch, d) Inkubieren des Gemisches, e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zu dem inkubierten Gemisch, wobei alle menschlichen carcinoembryonalen Antigen-Anti-carcinoembryonalen Antigen-Komplexe copräzipitiert werden, f) Bestimmung der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes und g) Vergleiche mit einer Standardinhibitionskurve, dadurch gekennzeichnet,
dass das radioaktiv markierte menschliche carcinoembryonale Antigen eine Radioaktivität von mindestens 5-10 Ci/g aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe a) das Anti-carcinoembryonale Antigen-Antiserum mit normalem Blutserum, das mit einem Borat-Puffer vom pH 8,4 auf eine Verdünnung von 1:100 gebracht wurde, verdünnt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe c) das menschliche carcinoembryonale Antigen mit l25Jod markiert ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe e) das nicht umgesetzte menschliche carcinoembryonale Antigen in Lösung verbleibt und das Proteinfällungsmittel wässrige gesättigte Ammoniumsulfatlösung ist.
5. Reagenziengarnitur zur Bestimmung von menschlichem carcinoembryonalem Antigen, enthaltend a) menschliches carcinoembryonales Antigen-J'25 mit einer Radioaktivität von mindestens 5-10 Ci/g oder b) carcinoembryonales Antigen-Antiserum, wie es erhältlich ist, wenn man ein warmblütiges Tier mit menschlichem carcinoembryonalem Antigen, welches ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, eine einzige Präzipitationslinie mit einem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum bei Geldiffusionstests bildet, bei der Blockelektrophorese in einem Boratpuffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 bei 400 V und einer Stromstärke von etwa 20 mA 10-14 cm in anodischer Richtung wandert,
wenn gleichzeitig Ferritin als Standard 18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert und an welches in der Jodierung mit der Chloramin-T-Methode 20-50% des eingesetzten Jods gebunden werden kann, immunisiert und die vom Tier gebildeten Antikörper isoliert, oder c) als Standard menschliches carcinoembryonales Antigen, welches ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweist, eine einzige Präzipitationslinie mit einem spezifischen Antikörper in nicht absorbiertem Antiserum bei Geldiffusionstests bildet, bei der Blockelektrophorese in einem Boratpuffer vom pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 bei 400 V und einer Stromstärke von etwa 20 mA 10-14 cm in anodischer Richtung wandert,
wenn gleichzeitig Ferritin als Standard 18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert und an welches in der Jodierung mit der Chloramin-T-Methode 2050% des eingesetzten Jods gebunden werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an carcinoembryonischem Antigen (CEA) in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, von Personen mit Krebs oder Krebsverdacht sowie eine Reagenziengarnitur zur Durchführung dieses Verfahrens. Insbesondere wurde gemäss vorliegender Erfindung eine Radioimmunoassay-Technik entwickelt, die sehr spezifisch, einfach durchzuführen und von hoher Reproduzierbarkeit ist.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von carcinoembryonalen Antigenen im Blut durch a) Zusatz einer bestimmten Menge von Anti-CEA-Antiserum zu einer Probe von mit Perchlorsäure extrahiertem Blutserum, b) Inkubieren des Gemisches, c) Zusatz einer bestimmten Menge von radioaktiv markiertem CEA zu dem inkubierten Gemisch, d) Inkubieren des Gemisches, e) Zusatz eines Proteinfällungsmittels zu dem inkubierten Gemisch, wobei alle CEA-Anti-CEA-Komplexe copräzipitiert werden, f) Bestimmung der Radioaktivität des Copräzipitates oder des Überstandes und g) Vergleiche mit einer Standardinhibitionskurve, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktiv markierte CEA eine Radioaktivität von mindestens 5-10 Ci/g aufweist.
Beim erfindungsgemässen Radioimmunoassay ist es wichtig, dass das radioaktive Atom mit dem zu kennzeichnenden Molekül hinreichend reagiert, um eine entsprechende Intensität der Radioaktivität für die Bestimmung zu schaffen, und dass das radioaktive Atom eine ausreichende Zerfallsgeschwindigkeit besitzt, um eine hinreichend grosse Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung zu gewährleisten. Weiterhin darf im Falle des Radioimmunoassays von Antigenen die Antigenwirksamkeit durch die Verbindung des radioaktiven Atoms mit dem Antigen nicht beeinträchtigt werden.
Mittels vorliegender Erfindung ist es möglich, etwa 1,0 ng CEA pro ml Serum zu bestimmen. Die Empfindlichkeit der Prüfung wird nur durch die spezifische Aktivität des radioaktiven Atoms begrenzt. Diese Begrenzung kann jedoch weitgehend überwunden werden, da praktisch das gesamte, in einem Teilvolumen des Serums vorhandene CEA durch das nachstehend erwähnte Extraktionsverfahren extrahiert werden kann, wodurch es möglich wird, die spezifische Aktivität des radioaktiven Atoms zu erhöhen. Weiterhin kann die Hemmung der Copräzipitation des markierten CEA vergrössert werden, um die Empfindlichkeit der Methode zu erhöhen.
CEA kann durch verschiedene radioaktive Atome markiert werden. Es wurde gefunden, dass 125Jod besonders geeignet ist.
Die Markierung erfolgt mittels bekannter Verfahren mit geringen Modifikationen bezüglich der Konzentration und Volumina. Die Chloramin T-Methode von Hunter und Greenwood [Biochem. J. 91, 46 (1964)] bei der 125Jod benutzt wird, ist besonders vorteilhaft; die Jodierung erfolgt hier mit 20-50%-ige Ausbeute.
Es werden zweckmässig etwa 0,25-0,4 mg gereinigtes CEA mit 125Jod in Form von KJ oder NaJ in Gegenwart von Chloramin T, d.i. Na[WCH3-C6H4-SO2NCl], jodiert. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur in etwa einer Minute und wird vorteilhaft durch Zugabe von Natrium- oder Kaliummetabisulfit unterbrochen. Die Funktion des Chloramin T ist, das Jodid zum Jod zu oxidieren, während das Metabisulfit nicht umgesetztes 125Jod zum Jodid reduziert. Man kann auch andere Oxydationsund Reduktionsmittel verwenden, doch darf durch sie das CEA nicht geschädigt werden. Das Produkt kann durch Chromatographie an einer Säule mit einem vernetzten Dextrangel, zum Beispiel Sephadex G-100 > , gereinigt werden.
Dieses Gel hat eine Ausschlussgrenze von etwa 100 000, ein Wasserretentions
vermögen von 10,0 + 1,0 g H2O/g Trockensubstanz, eine Teilchengrösse von 40-120 u und ein Bettvolumen von 15-20 ml/g Trockensubstanz. Das Produkt hat die folgenden Eigenschaften:
Es ist mit einem spezifischen Antikörper reaktionsfähig, zeigt das CEA-Elektrophoresebild, hat ein Molekulargewicht von etwa 200 000 und eine spezifische Aktivität von etwa 1 000-25 000, vorzugsweise von etwa 10 000-20 000 Impulsen pro Minute und Nanogramm, d.h. etwa 5-10 Ci/g CEA.
Gemäss vorliegender Erfindung wird unter Verwendung von radiojodiertem CEA die Anwesenheit von CEA im menschlichen Serum nach einem Verfahren festgestellt, das eine Modifikation der von Farr beschriebenen Technif der Hemmung der Copräzipitation [J. Infect. Dis. 103, 239 (1958)] darstellt.
Bei der genannten Methode muss das gesamte im Blut vorhandene CEA nach Abtrennung von störenden Materialien in dem schliesslich verwendeten Serum vorliegen. Dies kann durch Behandeln des Blutserums mit einem Glycoprotein Lösungsmittel, das also ein CEA lösendes Mittel ist und ggf.
vorhandene CEA-Antikörper-CEA-Komplexe zerstört und durch Klären der erhaltenen Lösung erreicht werden.
Das für dieses Verfahren geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel ist Perchlorsäure, vorzugsweise 0,2 m Perchlorsäure. Die erhaltene, das gegebenenfalls vorhandene CEA enthaltende Lösung wird dann, vorzugsweise durch Zentrifugieren, geklärt, 24-48 Stunden gegen Wasser/dialysiert und gefriergetrocknet.
Bei Anwendung dieses Verfahrens wird ein gereinigter Serumextrakt erhalten, der mehr als etwa 95 % des ursprünglich vorhandenen CEA enthält. Anfangs vorhandene CEA-Anti CEA-Komplexe werden gespalten und deren CEA miterfasst.
Für die Durchführung des Radioimmunoassays ist es ferner erforderlich, dass CEA-spezifische Antikörper vorhanden sind.
Die wird z.B. durch Immunisierung von Tieren mit gereinigtem CEA in üblicher Weise erreicht.
Dem in einer Salzlösung befindlichen CEA fügt man zweckmässig ein Emulgiermittel zu, zum Beispiel komplettes Freund 'sches Adjuvans. Die Emulsion kann bei Tieren intramuskulär in den Fussballen und/oder subkutan injiziert werden. Geeignete Tiere sind z.B. Geflügel, Kaninchen, Pferde, Ziegen oder Schafe. Bei Kaninchen werden zum Beispiel wöchentlich zwei bis fünf Injektionen vorgenommen. Nach der letzten Injektion wird dem Tier Blut entnommen. Das Serum aus diesem Blut ist nichtabsorbiertes Anti-CEA-Antiserum.
Bei einem bevorzugten Verfahren werden 400 ug CEA in 1 ml 0,9%-iger Salzlösung verwendet. Der in dem Antiserum vorhandene Antikörper ist nach Absorption an normalen Gewebebestandteilen spezifisch gegen CEA.
Die Ergebnisse des auf die gepulverten Perchlorsäureextrakte angewandten Radioimmunoassays nach der Methode der Copräzipitationshemmung, die Angaben über den CEA-Gehalt des Blutes enthalten, gestatten damit eine Aussage zu machen, ob beim untersuchten Patienten Krebstumoren des Verdauungssystems vorliegen oder nicht.
Das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete CEA kann wie folgt hergestellt werden: a) Homogenisieren von CEA enthaltendem Gewebe, das entweder embryonales Gewebe aus Verdauungsorganen von Föten aus dem ersten und zweiten Trimester oder Adenokarzinomgewebe von Tumoren des Verdauungssystemepithels ist, b) Behandlung des Homogenates mit einem Glycoprotein Lösungsmittel, c) Abtrennung des Niederschlages und Klären der erhaltenen Lösung, d) Dialys.E der geklärten Lösung, e) Konzentrieren des Dialysats, f) Klären der erhaltenen Lösung, g) Trocknen der geklärten Lösung, h) Chromatographie des erhaltenen Materials an zwei verschiedenen Gelsäulen, von denen die erste ein Agarosegel mit etwa 4 Gew.-% Agarose und einer Teilchengrösse von 40-190 u und die zweite ein hydrophiles wasserunlösliches quervernetztes Dextrangel darstellt,
i) Sammeln und Konzentrieren der Fraktionen des Eluats mit einem Absorptionsmaximum bei 280 nm und einem Molekulargewicht von etwa 200 000, j) präparative Elektrophorese der gesammelten Eluate und k) Sammeln derjenigen Fraktionen, die bei der Elektrophorese von der Startzone etwa 10-14 cm in anodischer Richtung gewandert sind, wenn gleichzeitig Ferritin vom Kathodenende 18 cm in anodischer Richtung wandert.
Das CEA enthaltende Gewebe wird zweckmässig mit einer für die Solubilisierung des gesamten vorhandenen CEA ausreichenden Menge Wasser homogenisiert. Im allgemeinen ist eine grössere Menge als etwa 2 Liter Wasser Pro Kilogramm Gewebe nicht erforderlich.
Das Homogenat wird mit einem Glycoprotein-Lösungsmittel und damit CEA-lösenden Mittel, behandelt. Dies ist erforderlich, damit präzipitierbare normale Proteine und störende antigenische Materialien vom CEA-Material abgetrennt werden können. Hierfür geeignete Glycoprotein-Lösungsmittel sind zum Beispiel Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure und dergleichen, wobei Perchlorsäure bevorzugt wird.
Jede Temperatur von Raumtemperatur und darunter ist für die Zugabe des Glycoprotein-Lösungsmittels zum Gewebehomogenat geeignet. Vorzugsweise arbeitet man bei Raumtemperatur, d.h. bei 20-25" C. Die Temperatur des Glycoprotein Lösungsmittels, das dem Gewebehomogenat zugefügt wird, kann ebenfalls variieren; auch hier wird Raumtemperatur bevorzugt. Im allgemeinen wird eine konzentrierte 0,5-2 N, insbesondere 2 N Säure bevorzugt. Dem Homogenat wird zweckmässig innerhalb von 10-30 Minuten etwa die gleiche Volumenmenge Lösungsmittel zugefügt. Ein langsamerer Zusatz kann zum Verlust der Antigenwirksamkeit führen.
Man erhält ein Präzipitat, das vom Überstand, der das gelöste CEA enthält, nach einem der üblichen Verfahren wie z.B. Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden kann.
Zur Abtrennung wird Zentrifugieren bevorzugt, i.a. bei etwa 3 000-8 000 U/min. Es wird vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen, etwa 4-10 C, zentrifugiert.
Zur weiteren Reinigung, d.h. zur Entfernung niedermolekularer Substanzen, wie Perchlorsäure oder Salzen, wie Natriumchlorid hat sich die Dialyse gegen Wasser als am geeignetsten erwiesen. Die Dialyse ist ein kritischer Teil des Verfahrens, da durch sie alle diffusionsfähigen löslichen Substanzen mit Ausnahme der Substanzen von höherem Molekulargewicht, wozu auch die CEA-Fraktion gehört, entfernt werden. Sie kann zuerst mit Leitungswasser während etwa 24-48 Stunden und dann mit kaltem destilliertem Wasser bei Temperaturen von etwa 4-10 C durchgeführt werden. Jedoch ist es auch möglich, nur destilliertes Wasser zu verwenden. Das Dialyseverfahren nimmt insgesamt etwa 48-96 Stunden in Anspruch.
Die trübe Lösung, die nach der Dialyse zurückbleibt, wird konzentriert. Die Methode der Wahl ist die Gefriertrocknung, obgleich auch andere Verfahren in Frage kommen wie z.B.
Sprühtrocknung. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, dass das Material zuerst in Schalen gefroren und dann lyophylisiert wird, was insgesamt etwa 32-36 Stunden in Anspruch nimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird jedoch, um Zeit zu sparen, die Lyophylisierung nach etwa 24-30 Stunden abgebrochen, so dass das Produkt noch nicht vollständig trocken ist.
Das nicht ganz bis zur Trockene lyophylisierte Material kann dann bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, wie etwa 37 C, aufgetaut werden. Es kann auch durch Verdünnen mit einer sehr geringen Menge Wasser aufgetaut werden.
Danach können die zurückbleibenden Teilchen entfernt werden. Wird das Volumen auf einem Minimum gehalten, dann kann die Klärung durch Filtration und/oder Zentrifugieren erreicht werden. Alle Teilchen, die ein 0,22 Filter nicht passieren können (d.h. bis zur Grösse der kleinsten Bakterien), werden so aus der Lösung entfernt.
Das bevorzugte Verfahren ist das des 15-45 minütigen Zentrifugierens mit hoher Geschwindigkeit, d.h. mit etwa
14 000 bis 30 000, vorzugsweise mit etwa 14 000 u/min, bei Temperaturen bis zu etwa 10 C, vorzugsweise von 4-10" C.
Höhere Temperaturen sind anwendbar, jedoch nicht zweckmässig, da sie die Sedimentation verzögern. Nach dem Zentrifugieren ist es erforderlich, die überstehende Lösung weiter zu klären und zu sterilisieren. Dies kann man durch Filtrieren durch Filter erreichen, deren Porengrösse zwischen 1,2 und 0,20 u variiert.
Bevorzugt verwendet man Filter mit einer Porengrösse von
1,2 Cm, 0,45 ,0,22 u in der angegebenen Reihenfolge.
Das Filtrat wird getrocknet, vorzugsweise gefriergetrocknet.
Die Abtrennung des CEA von anderen Substanzen des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers kann durch subsequente Chromatographie an zwei verschiedenen Gelsäulen und anschliessende Elektrophorese erreicht werden.
Es wurde gefunden, dass die eluierten Fraktionen der Säu lenchromatographie, die ein Molekulargewicht von etwa
200 000 und ein definiertes Absorptionsmaximum bei 280 nm besitzen, das CEA enthalten. Es wurde weiter gefunden, dass, wenn die das CEA enthaltenden Fraktionen bei pH 8,6 in einem
Boratpuffer mit einer Ionenstärke von 0,05 einer Elektropho rese unterworfen werden, man ein charakteristisches Wande rungsbild erhält. Die Länge des zurückgelegten Weges hängt von der Stromstärke, der Spannung, vom Puffer, von dessen pH-Wert und dessen Ionenstärke ab. Bei einer Spannung von
400 V und einer Stromstärke von 20 mA wandert das CEA etwa 10-14 cm in anodischer Richtung während Ferritin (ein gefärbtes Protein) als Vergleichssubstanz in der gleichen Zeit
18 cm vom Kathodenende in anodischer Richtung wandert.
Die anschliessende Säulenchromatographie kann in der
Weise durchgeführt werden, dass man das gelöste lyophylisierte
Material an zwei verschiedenen Gelsäulen in beliebiger Reihenfolge chromatographiert. Zweckmässigerweise verwendet man eine Gelsäule aus Agarose-Gel, dem neutralen Anteil von Agar.
Es wurde Gelmaterial der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), das unter dem Warenzeichen Sepharose im
Handel erhältlich ist, verwendet. Die Gele sind als wässrige
Suspensionen in 0,02 %igem Natriumazid als Schutzmittel erhältlich. Die Konzentration der Agarose im Gel bestimmt seinen Fraktionierungsbereich. Die zweckmässigsten Gele besitzen eine Teilchengrösse von etwa 40-190u und enthalten 4 Gew.-% Agarose. Dieses als Sepharose 4B bezeichnete
Material hat einen Fraktionierungsbereich von 3 X 105-3 X 106.
Mit Sepharose 4B gelingt eine Anreicherung von CEA, da andere Verbindungen mit höherem oder niedrigerem Moleku largewicht wie auch kolloidale Teilchen abgetrennt werden.
Die andere Säule enthält zweckmässig ein hydrophiles, was serunlösliches vernetztes Dextrangel. Ein solches Material wird von der Firma AB Pharmacia, Uppsala (Schweden), unter dem
Namen Sephadex in den Handel gebracht. Die Fähigkeit des
Gelmaterials, Wasser aufzunehmen, ist dem Vernetzungsgrad der Dextransubstanzen im Gelmaterial umgekehrt proportional.
Das Gelmaterial ist in einer Vielzahl von Graden erhältlich, die sich im Hinblick auf den Porositätsgrad unterscheiden. Das bovorzugte Gel hat eine annähernde Ausschlussgrenze von
200 000, ein Wasserretentionsvermögen von 20 j2,0 g H2O/g
Trockensubstanz, eine Teilchengrösse von 40-120 u und ein
Bettvolumen von 30-40 ml/g Trockensubstanz. Dieses Gel trägt die Bezeichnung Sephadex G-200 .
Sephadex G-200 > wird zweckmässig zur weiteren Reinigung der das CEA enthaltenden Fraktion verwendet. Die Sephadex G-200-Säule hat ein grösseres Auftrennungsvermögen für den Molekulargewichtsbereich von 150 000 bis 250 000 als die erstgenannte und sollte nur verwendet werden, nachdem die kolloidalen Teilchen durch die erste Säule entfernt worden sind, da diese Teilchen die Sephadex-Säule sonst verstopfen und sie unwirksam machen würden.
Die Säulenchromatographie wird beispielsweise folgendermassen durchgeführt: das lyophylisierte Material wird in einem wässrigen Puffer beim pH-Wert des isoelektrischen Punktes des CEA, d.h. bei pH 4,5, gelöst. Die Lösung wird auf die erste Säule aufgegeben. Die gesammelten aktiven Fraktionen des Eluats werden wie oben beschrieben, dialysiert, lyophylisert, wiederum in einem wässrigen Puffer vom pH 4,5 gelöst und auf die zweite Säule gegeben. Die aktiven Fraktionen (Absorptionsmaximum bei 280 nm) werden nochmals dialysiert und lyophylisiert. Obwohl alle üblichen wässrigen Puffer geeignet sind, wird die Verwendung eines 0,9%gen Phosphatpuffers bevorzugt. Der Vorteil der Anwendung niedriger Temperaturen, d.h.
von etwa 4-10" C, liegt darin, dass man ein verbessertes Auflösevermögen erreicht. Die aus der zweiten Säule gesammelten Fraktionen haben ein Molekulargewicht von 200 000 und ein Absorptionsmaximum bei 280 nm.
Die aktiven, konzentrierten Fraktionen des Eluats der zweiten Säule werden schliesslich einer Elektrophorese beispielsweise in einem Puffer vom pH etwa 8,2-9,2 und einer Ionenstärke von etwa 0,0125-0,10, vorzugsweise in einem Boratpuffer vom pH etwa 8,6 und einer Ionenstärke von etwa 0,05 unterworfen.
Die Blockelektrophorese ist die bevorzugte Elektrophoresemethode, jedoch kann man andere Typen der Elektrophorese ebenfalls anwenden. Zweckmässig arbeitet man bei etwa 300-500 V, vorzugsweise bei 400 V mit etwa 20 mA. Bei dem bevorzugten Elektrophoreseverfahren wird geeigneterweise ein vernetztes Dextrangel, zum Beispiel Sephadex G-25, fein verwendet, mit einer Ausschlussgrenze von etwa 5 000, einem Wasserretentionsvermögen von 2,5 + 0,2 g H2O/g Trockensubstanz, einer Teilchengrösse von 20-80 p und einem Bettvolumen von 5 ml/g Trockensubstanz. Das Gel wird in dem Puffer angequollen und auf einem nichtleitfähigen Block, zum Beispiel Lucite , angeordnet. Als geeigneter Standard kann zum Beispiel Ferritin verwendet werden, das am Kathodenende des Blocks aufgebracht wird.
Nach etwa 24-stündiger Elektrophorese wird der die CEA-Aktivität enthaltende Bereich entfernt.
Unter den genannten speziellen Betriebsbedingungen ist das die Zone, die in anodischer Richtung 10-14 cm vom Start entfernt ist. Das Ferritin ist in diesem Fall 18 cm in anodischer Richtung gewandert. Die CEA-Aktivität wird eluiert und das Material vorzugsweise durch Dialyse gegen destilliertes Wasser gereinigt.
Man erhält ein Material, das im wesentlichen reines CEA ist.
Dies wird entweder durch die Hemmung der Präzipitation oder unmittelbar durch die Ouchterlony Prüfung gegen nicht-absorbiertes Tumor-Antiserum gezeigt. Eine einzige Präzipitationslinie zeigt reines CEA an.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Umsetzung von CEA mit 125Jod.
500 u1 eines Gemisches, das 100 ug Chloramin T, 250 ug CEA und 4 mit25 Jod in Form von KJ enthält, werden nach 1 Minute bei Raumtemperatur mit 240 ug Natriummetabisulfit versetzt. Das erhaltene Produkt, 125J-CEA, wird von nichtumgesetztem 125 Jod durch Chromatographie an einer Sephadex G-100-Säule abgetrennt. Das Produkt hat eine spezifische Aktivität von etwa 5 Ci/g.
Das als Ausgangsmaterial verwendete CEA wird wie folgt hergestellt: a) Isolierung der CEA-Fraktion.
Es wird Tumorgewebe vom Adenokarzinom des Colons herausgeschnitten und möglichst viel normales Gewebe entfernt. Das restliche Tumorgewebe wird durch einen Fleischwolf gedreht und in 1 000 g-Mengen bei -20" C gelagert. 1 000 g des zerkleinerten Gewebes werden mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4 000 ml suspendiert und eine Stunde in einem wassergekühlten Homogenisator bei 15 000 U/min zerkleinert. Unter ständigem Rühren fügt man bei 4" C langsam ein gleiches Volumen 2N Perchlorsäure zu, rührt das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugiert dann 30 Minuten bei 4" C mit 6 000 U/min in einer gekühlten Zentrifuge. Das Überstehende wird entfernt und in einen flachen, etwa 7,6 cm weiten Dialysierschlauch gegeben, der zuvor 1 Stunde in destilliertes Wasser getaucht wurde, um ihn geschmeidiger zu machen.
Es wird 48 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und weitere 48 Stunden gegen destilliertes Wasser bei 4" C dialysiert. Der dialysierte Rückstand wird nicht ganz bis zur Trockene lyophylisiert, aufgetaut und die erhaltene Lösung in einer gekühlten Zentrifuge bei 4" C 30 Minuten mit 14 000 U/min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und nacheinander durch Membranfilter von 1,2 ,0,45 u und 0,22 u Porengrösse filtriert. Die geklärte Lösung wird in Schalen gefroren und zur Trockene lyophylisiert.
1,5 g des getrockneten rohen Extraktes löst man in 50 ml eines 0,05 m NaH2PO4-Puffers (pH 4,5) in normaler Salzlösung. Der Phosphat-Salz-Puffer vom pH 4,5 dient bei allen nachfolgenden Säulenchromatographien als Elutionsmittel. Die Probe wird dann über eine Säule (Pharmacia K 100/100 (100 cm X 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm) mit Sepharose 4B gegeben. Die Temperatur wird auf 4-5" C gehalten. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 150 ml/Stunde. Man sammelt 25 ml-Fraktionen, deren Absorption bei 280 nm gemessen wird. Die aktiven Fraktionen erscheinen nach 4 750 ml im Eluat. Die aktiven Fraktionen (750 ml) werden vereinigt, 48 Stunden bei 4" C gegen destilliertes Wasser dialysiert, in Schalen gefroren und lyophylisiert.
200 mg des erhaltenen getrockneten Materials werden dann in 10 ml des Standard-Puffers gelöst und an Sephadex G-200 chromatographiert. (Säule Pharmacia K 50/100 (100 cm X 10 cm) mit einer Bettlänge von 90 cm). Die Temperatur wird auf 4" C gehalten. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 40 ml/Stunde werden 10 ml-Fraktionen gesammelt und bei 280 nm in einem Spektrophotometer gemessen. Die aktiven Fraktionen (190 ml) erscheinen nach 820 ml im Eluat, werden vereinigt, 48 Stunden bei 4" C gegen destilliertes Wasser dialysiert, in Schalen gefroren und lyophylisiert.
b) Reinigung des isolierten CEA durch Blockelektrophorese.
Das Blockelektrophoresematerial Sephadex G-25, fein, wird zwei Stunden bei 80" C in Wasser gequollen, mit Borat Puffer (pH 8,6; Ionenstärke 0,05) gewaschen und dann durch eine gesinterte Glasplatte unter Anwendung von Unterdruck filtriert.
Man verteilt eine Gelaufschlämmung gleichmässig auf einem Lucite Blockträger (Masse 61 7,5 X 1 cm) und behandelt die Oberfläche mit einem Wattebausch, bis sie fest aber nicht vollständig trocken ist. Der Block wird dann mit Chromatographiepapierkontakten (3 mm), die alle in Fliessrichtung des Papiers ausgerichtet sind, versehen und eine Stunde unter den Betriebsbedingungen (400 V und etwa 20 mA) bei 4" C äquilibriert. Dann entfernt man von der Mitte des Blocks einen Streifen von 1 cm, vermengt das Material gut mit 60 mg trockenem CEA aus Beispiel 1, das zuvor in einer möglichst geringen Menge (etwa 0,5 ml) von 0,05 m Boratlösung gelöst wurde. Der erhaltene Brei wird in den Mittelstreifen zurückgegossen.
Dann tupft man 1-2 Tropfen einer Ferritinlösung (6::umkristallisiert; Konzentration 100 mg/ml) auf das Kathodenende des Blocks und beginnt die Elektrophorese.
Nach 24 Stunden hat sich der Ferritin-Standard etwa 18 cm, in anodische Richtung bewegt. Nach beendeter Elektrophorese werden aus dem Block Streifen von 2 cm zwischen der Startzone und dem Anodenende geschnitten. Die Hauptaktivität wird in einer Entfernung von 10-14 cm von der Startzone in anodischer Richtung lokalisiert; eine schwächere Aktivität lässt sich in einer Entfernung von 8-10 cm nachweisen.
Jeder aktive Streifen wird mit 2 m NaC1-Lösung, die vorher eine 0,20 u Membran passieren musste, eluiert und das Eluat 48 Stunden bei 4" C mit destilliertem Wasser dialysiert. Das Dialysat wird in Schalen eingefroren und gefriergetrocknet. Das getrocknete, gereinigte CFA wird unter vermindertem Druck über Calciumchlorid bei 4" C gelagert.
Das Produkt hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften:
Es bildet eine einzige Präzipitationslinie mit nichtabsorbiertem Antiserum bei Geldiffusionsprüfungen; ist in Perchlorsäure löslich; wandert bei der Blockelektrophorese anodisch
10-14 cm, wobei gleichzeitig ein Ferritin Standard anodisch
18 cm wandert (Borat-Puffer von pH 8,6 und einer lonenstärke von 0,05, Spannung 400 V, Stromstärke 20 mA); Molekulargewicht 200 000; Absorptionsmaximum bei 280 nm.
Beispiel 2
Herstellung von Blutproben für den Radioimmunoassay.
Man fügt 5 ml einer 2,0 m Perchlorsäure zu je 5 ml Serum, das von Blutproben von 200 Menschen stammt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 9 000 X g während
10 Minuten bei 4" C entfernt. Das erhaltene Sediment wird verworfen und das Überstehende 24 Stunden gegen kaltes Leitungswasser und dann zusätzliche 24 Stunden gegen destilliertes Wasser bei 4" C dialysiert. Der dialysierte Rückstand wird dann zu einem trocknen Pulver lyophylisiert.
Beispiel 3
Herstellung des Anti-CEA-Antiserums.
12 ausgewachsene, männliche, weisse Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von je 2,0 kg wurden in 3 Gruppen zu je 4 Tieren eingeteilt. Die verschiedenen Gruppen wurden mit den folgenden Materialien immunisiert: normaler Colongewebeextrakt, Tumorgewebeextrakt des gleichen Individuums, von dem der normale Gewebeextrakt stammt und menschliches Plasma. Der Tumorgewebeextrakt stammte von Tumorproben, die als Adenokarzinome des Colons diagnostiziert und bestätigt worden waren. Die normalen Gewebeextrakte und die Tumorgewebeextrakte wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gebildet. Das menschliche Plasma stammte von 30 normalen Spendern aller Hauptblutgruppen.
Die Injektionen, die 4 Wochen lang zweimal wöchentlich gegeben wurden, enthielten 3 mg Protein in 0,6 ml Gewebeextrakt oder Plasma und dem gleichen Volumen kompletten Freund'schen Adjuvans'. Es wurden 0,1-0,2 ml in den Fussballen und der Rest intramuskulär in die Flankengegend injiziert.
12 Tage nach den letzten Injektionen wurde den Tieren Blut aus ihren marginalen Ohrvenen entnommen, und die von jeder Gruppe erhaltenen Seren wurden gesondert gesammelt.
Die Seren jeder Gruppe wurden an normalem Gewebe absorbiert und das erhaltene Präzipitat wurde abgetrennt. Die überstehenden Lösungen wurden dann nach der Ouchterlony Technik einer zweidimensionalen Diffusion in Agargel unterworfen. Diese wurde in einer 1 %gen Lösung von Agar in Salzlösung mit Merthiolat durchgeführt, das als Schutzstoff verwendet wurde und in einer Konzentration von 1:10 000 verlag.
Die Vertiefungen wurden so in die Gelplatten geschnitten, dass die zentralen und peripheren 1 cm von einander entfernt waren.
Jede Vertiefung wurde mit 0,15 ml des zu untersuchenden Materials gefüllt. Die Antigenkonzentration betrug 10 mg pro ml. Die Anfangsinkubation der Platten betrug 24 Stunden in feuchter Umgebung bei 37" C. Dann wurde 7 Tage in der gleichen feuchten Atmosphäre bei 25" C entwickelt. Die Flekken aus den Seren von den Tieren, die mit dem Tumorgewebeextrakt immunisiert worden waren, bildeten eine einzige Linie.
die anzeigte, dass das Serum für den Tumor spezifische Antikörper enthielt. Die Ergebnisse aus den Seren der Tiere, die mit normalem Gewebe oder mit normalem menschlichen Plasma immunisiert worden waren, waren negativ.
Beispiel 4
Radioimmunoassay von CEA.
Normales menschliches Serum wird mit Borat-Puffer (Tonenstärke 0,1 pH 8,4) auf 1:100 verdünnt und als Verdünnungsmittel für das Anti-CEA-Antiserum, das aus Ziegen nach dem Verfahren des Beispiels 3 gewonnen wurde, und für das '25J-CEA verwendet, das nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt wurde.
a) Herstellung einer Standardinhibitionskurve.
Man fügt 5 ml Standard-CEA einer Reihe von Röhrchen zu, von denen jedes den gepulverten Extrakt von 5 ml normalem menschlichen Serum enthält und der nach dem Verfahren des Beispiels 2 hergestellt wurde. Dann gibt man in jedes Röhrchen 50() u1 verdünntes Anti-CEA-Antiserum. Es wird 18 Stunden bei 4" C inkubiert und danach jedes Rörchen mit 500 u1 Jod CEA versetzt. Die Inkubation wird weitere 2 Stunden bei 37" C fortgesetzt. Dann fügt man jedem Röhrchen 1 ml einer auf 4" C gekühlten gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung hinzu.
Bei der vorliegenden Ammoniumsulfatkonzentration (50 %-ige Sättigung) erleidet das an den Antikörper gebundene CEA eine Copräzipitation, während das freie CEA in Lösung bleibt. Nach Waschen mit 3,0 ml einer zu 50% gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung bei 4" C wird der 25Jod-CEA-Gehalt des Präzipitats in einem Zweikanal-Szintillationszähler bestimmt.
Auf diese Weise erhält man eine Standardinhibitionskurve.
b) Radioimmunoassay von Serum.
Das zu untersuchende Serum wird in gleicher Weise behandelt, mit dem Unterschied, dass zu keiner der Proben Standard CEA zugefügt wurde. Der Gehalt an CEA wird durch Vergleich mit der Standardinihibitionskurve bestimmt.