AT330358B - Diagnostisches mittel zum nachweis und zur uberwachung einer schwangerschaft - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur überwachung einer Schwangerschaft. 



   Während der Schwangerschaft wird bei einer Reihe von Plasmaproteinen die Konzentration im Blut signifikant verändert ; andere Proteine, die normalerweise nicht vorkommen, erscheinen im mütterlichen Blut neu. 



  Zu diesen als Schwangerschaftsproteine bezeichneten Substanzen gehören alle in der Plazenta gebildeten Enzyme, Inhibitoren und Hormone, die Eiweissnatur besitzen und in das mütterliche Blut abgegeben werden. Beispiele dafür sind die Oxytocinase, die hitzestabile alkalische Phosphatase, die Histaminase, die Urocinaseinhibitoren sowie das humane Plazentalactogen und das humane Choriongonadotropin (HCG). In der menschlichen Plazenta wurde nun ein ssl-Glykoprotein nachgewiesen, das sich in seinen chemischen und physikalischen Eigenschaften von den bisher beschriebenen Plazentarsubstanzen unterscheidet. Es wurde gefunden, dass dieses neue ssl-Glykoprotein als wesentlicher Bestandteil von diagnostischen Mitteln zum Nachweis und/oder zur überwachung einer Schwangerschaft geeignet ist.

   Das neue   ss1-Glykoprotein   ist durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der   ssi-Globuline,   eine Sedimentationskonstante von   4,   6 S   0, 5   S, ein Molekulargewicht von etwa 100000   : ! : 15000,   
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 einen Kohlehydratgehalt von 26, 5 bis 29, 6%, davon
10, 0 bis 11, 0% Hexosen,
9, 5 bis 10, 5% Hexosamin,   0, 5   bis 0, 6% Fucose und
6, 5 bis   7, 5% Neuraminsäure   gekennzeichnet. 



   Gegenstand der Erfindung ist daher ein diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur überwachung einer
Schwangerschaft, das als wesentlichen Bestandteil dieses neue ssl-Glykoprotein enthält. Das in den erfindungsgemässen diagnostischen Mitteln als wesentlicher Bestandteil enthaltene neue   ssl -Glykoprotein   wird, da es schwangerschaftsspezifisch ist,   schwangerschaftsspezifisches-ssi-Glykoprotein-abgekürzt-SP i-genannt.   



   Das erfindungsgemässe diagnostische Mittel kann bei der Bestimmung des   ss1-Glykoproteins   zum qualitativen oder quantitativen Nachweis desselben eingesetzt werden. Da die quantitative Beziehung häufig nur mit Hilfe eines standardisierten Antigenpräparates herzustellen ist, ist hiefür ein erfindungsgemässes diagnostisches
Mittel erforderlich, mit dessen Hilfe eine Bezugskurve aufgestellt werden kann. Damit können die Antigenkonzentrationen in den zu untersuchenden Proben ermittelt werden. 



   Ein weiteres Beispiel, in dem sowohl der spezifische Antikörper als auch das erfindungsgemässe diagnostische Mittel erforderlich sind, ist der Radioimmunoassay. Für dieses quantitative Bestimmungsverfahren von Antigenen ist   SPl   radioaktiv markiert und der spezifische Antikörper einzusetzen. Daneben wird ein erfindungsgemässes diagnostisches Mittel zur Erstellung einer Bezugskurve benötigt. Der Nachweis kann mit Serum oder Urin der Schwangeren geführt werden. Eine quantitative Bestimmung von   ss1 -Glykoprotein, z. B.   mit der radialen Immundiffusion, kann für eine überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung werden. 



   Das in den erfindungsgemässen diagnostischen Mitteln als wesentlicher Bestandteil enthaltene schwangerschaftsspezifische ssl-Glykoprotein kann dadurch erhalten werden, dass man aus einem mit Hilfe einer Salzlösung aus Plazenten gewonnenen Extrakt oder aus Blut oder Urin von Schwangeren die mit   Diaminoäthoxyacridin-lactat   fällbaren Proteine abtrennt, sodann das im überstand verbleibende schwangerschaftsspezifische   ss1-Glykoprotein   zusammen mit y-globulin, insbesondere mittels Ammoniumsulfat, ausfällt und von diesem durch Chromatographie und/oder Elektrophorese abtrennt. 



   Zweckmässigerweise werden für die Herstellung des schwangerschaftsspezifischen   ssl-Glykoproteins   zerkleinerte Plazenten mit einer schwachen Salzlösung extrahiert und die mit   Diaminoäthoxyacridin-lactat   fällbaren Proteine bei einem   pH-Wert   von etwa 8, 0 abgetrennt. Das im überstand verbleibende   ssi-Glykoprotein   wird zusammen mit'y-Globulin mit Ammoniumsulfat ausfällt. Zur Trennung des ss1-Glykoproteins von der Hauptmenge des   y-Globulins   wird die in reinem Wasser wieder aufgelöste Fällung, zweckmässig nach einer Vorbehandlung, durch Dialyse gegen eine Pufferlösung, an Diäthylaminoäthyl   (DEAE)-Cellulose   adsorbiert und von dieser wieder eluiert.

   Als Eluierungsmittel hat sich eine 0, 02-molare Tris-oxymethylaminomethyl/Salzsäure-Pufferlösung vom   pervert 6,5   besonders bewährt, die noch etwa   0, 85% Natriumchlorid   und eine kleine Menge, z. B. 0, 05% Natriumazid enthalten kann. Ausfällen des Eluats mit Ammoniumsulfat liefert das   l-glykoprotein   in angereichterter Form, das durch Gelfiltration, beispielsweise mittels mit Epichlorhydrin dreidimensional versetztem Dextran in Perlform mit einer Ausschlussgrenze für Proteine von grösserem Molekulargewicht als 150000, im Handel als Sephadex G-150 der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, weiter gereinigt werden kann. 



   Zur weiteren Reinigung eignet sich die präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid als Träger in einer geeigneten Pufferlösung, z. B. 0, 075% Ammoniumhydrogencarbonat. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die   ss1 -Glykoprotein-haltige   ss-Zone des Trägers herausgeschnitten, mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und lyophilisiert. Weitere geeignete Feinreinigungsverfahren sind eine Chromatographierung an 

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 dem basischen Ionenaustauscher auf der Basis von mit Epichlorhydrin dreidimensional vernetztem Dextran in Perlform mit eingebautem Diäthylaminoäthylgruppen, im Handel als DEAE-Sephadex der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, mit nachfolgender Eluierung mit einem Natriumchlorid-Gradienten, und eine Fraktionierung mit Alkohol, vorzugsweise mit Äthanol.

   Das schwangerschaftsspezifische ssl-Glykoprotein wird in ähnlicher Weise aus Blut oder Urin von Schwangeren isoliert. 



   Gewinnung des erfindungsgemäss verwendbaren, neuen   ssl-Glykoproteins :  
A) Aus Plazenten. 



   150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 1501 einer   0, 5%igen   wässerigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natriumhydroxyd auf PH 8 eingestellt und mit 501 einer 3%igen wässerigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-lactat versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 h wird der Überstand, der das   ssl-Glykoprotein   zusammen mit y-Globulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtriert und mit 26, 5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 h wird der Niederschlag abfiltriert. 



   500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine   0, 01-molare Tris- (0xymethyl)-aminomethan   (im folgenden   mit"Tris"abgekürzt)-Salzsäure-Puffer-   
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    0,ss1-glykoproteinhaltigen   Fraktionen gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30% festem Ammonsulfat ausgefällt. 



   Eine weitere Reinigung erzielt man durch präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid als Träger. 



  Als Puffer wird eine 0,075-molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung (PH 8,0) verwendet. Man schneidet nach der elektrophoretischen Auftrennung die   ss1 -glykoproteinhaltige   ss-Zone heraus, eluiert mit dem 
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 enthält, gelöst, an einer   Diäthylaminoäthyl-Sephadex-Säule   (5 X 20 cm) chromatographiert und mit einem linearen Gradienten von 0, 2 bis 2, 0% Natriumchlorid in 0, 01-molarem Tris/Salzsäurepuffer, PH 7, 0, eluiert. Es folgt eine Fällung mit 40% Äthanol bei-5 C. Nach Abzentrifugieren des Niederschlages wird der Überstand gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert und lyophilisiert. Reinheit : 90 bis 95%. Dieses Präparat kann zur Herstellung von Antiseren Verwendung finden. 



   B) Aus Blut. 



     51   Schwangerenserum werden mit destilliertem Wasser im Verhältnis   l : l   verdünnt und daraus die Hauptmenge der Plasmaproteine durch 2, 51 einer   3% eigen   wässerigen Lösung von   Diaminoäthoxyacridin-lactat   bei PH 8, 0 gefällt. Der durch Zentrifugieren erhaltene Überstand wird zur Entfernung des   Diaminoäthoxyacridin-lac-   tats mit 5% Natriumchlorid versetzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert, der Überstand vom Sediment getrennt und mit 30% festem Ammonsulfat versetzt. Im Niederschlag sind das'y-Globulin und das schwangerschaftsspezifische   ss1-Glykoprotein   enthalten.

   Der Niederschlag wird in 0, 01-molarem Tris/Salzsäurepuffer, PH 7, 0, gelöst, gegen 0,01-molaren Tris/Salzsäurepufer, PH 7,0, dialysiert und anschliessend mit Diäthylaminoäthylcellulose gereinigt. Die Diäthylaminoäthylcellulose-Behandlung wird in   0, 01-molarem   Tris/Salzsäurepuffer, PH 8, 0, ausgeführt. 
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 gemäss Abschnitt A) ausgeführt. 



     Bei s pie 1 :   Zusammensetzung eines diagnostischen Mittels. 



   Eine Testanordnung für die immunologische Bestimmung des schwangerschaftsspezifischen ss1-Glykoproteins besteht aus anti-schwangerschaftsspezifischem ss1-Glykoprotein-Serum von Kaninchen und einem Referenzstandard für das schwangerschaftsspezifische   ssi-Glykoprotein.   Den Referenzstandard erhält man durch Auflösen einer abgewogenen Menge des gereinigten Proteins in Humanserum, einer Serumkonserve aus Humanserum oder einer Plasmaersatzlösung als stabilisierendes Lösungsmittel. Die Konzentration wird zweckmässig so gewählt, dass sie etwa 25 bis 36 mg schwangerschaftsspezifisches   ssi-Glykoprotein/lOOm !   entspricht. 

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   Beispiel für die quantitative Bestimmung des schwangerschaftsspezifischen   ssi-Glykoproteins.   



   1 g Agarose wird mit 50 ml Diäthylbarbiturat-Acetat Pufferlösung vom   pro-vert   8, 6 und der Ionenstärke 0, 04 M, 50 ml destilliertem Wasser und 10 mg des Konservierungsmittels Thiocid vermischt und auf etwa   100 C   erhitzt, bis sich eine klare Lösung gebildet hat. 15 ml der Lösung werden mit einer vorgewärmten Messpipette auf eine vollkommen waagrecht liegende Glasplatte von 10 X 10 cm ausgegossen. Nach kurzem Stehen bei Raumtemperatur erstarrt die Lösung zu einem transparenten Gel von gleichmässiger Schichtdicke. In einer Entfernung von 2 cm vom Rand der Glasplatte werden in regelmässigen Abständen Löcher von 4 mm Durchmesser gestanzt.

   Die Löcher dienen zur Aufnahme der zu untersuchenden Seren von Frauen bzw. den als Bezugsstandard dienenden Lösungen, die 4,8, 16 und 32 mg   SPi/100 ml   enthalten.   15jol   der zu untersuchenden Lösungen werden in die Löcher eingefüllt und 3 h in einer feuchten Kammer belassen. Danach wird ausgehend von den Löchern in einem Abstand von 0, 5 cm die Agaroseschicht durchtrennt und von der Glasplatte entfernt. 



  Der freie Teil der Glasplatte wird nun mit 15 ml einer Agaroselösung beschichtet, die wie oben beschrieben hergestellt und der beim Abkühlen auf etwa 500C bis zu einer Konzentration von   1, 5% Anti-SPI-Serum   zugemischt wurde. Anschliessend an die Überschichtung erfolgt eine elektrophoretische Auftrennung der in den Löchern aufgetragenen Proben während 15 h bei 2 V/cm in das angrenzende antiserum-haltige Gel. Danach werden die Gele wie bei Agarelektrophoresen üblich gewaschen und getrocknet und die Immunpräzipitatlinien, die sich während der Elektrophorese ausgebildet haben, zur besseren Sichtbarmachung mit Amidoschwarz angefärbt. Die Höhe der Präzipitatspitzen ist ein Mass für die Konzentration des   SP1   in den untersuchten Proben.

   Sie wird zu den   Präzipitadängen,   die durch die Standardlösungen ausgebildet wurden, in Beziehung gesetzt. Im vorliegenden Versuch ergab sich bei einem Serum einer nicht schwangeren Frau keine Präzipitatbildung, bei einer Frau in der 8. Schwangerschaftswoche ein Gehalt von   1 mg SPi/l00 ml   Serum, bei einer Frau in der 20. Schwangerschaftswoche 5 mg   SP,/100   ml Serum und bei einer Frau in der 32. Schwangerschaftswoche 20 mg   SPi/100   ml Serum.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur überwachung einer Schwangerschaft, enthaltend schwangerschaftsspezifisches-ssl-Glykoprotein, das durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der ssI-Globuline, eine Sedimentationskonstante von 4, 6 S 0, 5 S, ein Molekulargewicht von EMI3.1 EPH H 0), einen Kohlehydratgehalt von 26, 5 bis 29, 6%, davon 10, 0 bis 11, 0% Hexosen, 9, 5 bis 10, 5% Hexosamin, 0, 5 bis 0, 6% Fucose und 6, 5 bis 7, 5% Neuraminsäure gekennzeichnet ist, als wesentlicher Bestandteil.