DE2157610C3 - Schwangerschaftsspezifisches ß , -Glykoprotein, Verfahren zu seiner Isolierung und seine Verwendung für die Herstellung von Antiseren - Google Patents
Schwangerschaftsspezifisches ß , -Glykoprotein, Verfahren zu seiner Isolierung und seine Verwendung für die Herstellung von AntiserenInfo
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Description
aufweist und das herstellbar ist dadurch, daß man aus einem mit Hilfe einer Salzlösung aus menschlichen
Plazenten gewonnenen Extrakt die mit Diaminoäthoxyacridin-Lactat fällbaren Proteine abtrennt so dann das
im Überstand verbleibende SPi zusammen mit Gamma-Globulin mittels Ammonsulfid ausfällt und von diesem
das Gamma-Globulin durch Adsorption an DEAE abtrennt aus dem Eluat das SPi mit Ammonsulfat
ausfällt und das so erhaltene Produkt durch Chromatographie und/oder Elektrophorese reinigt.
Das erfindungsgemäß hergestellte schwangerschaftsspezifische ßi-Glykoprotein dient zur Gewinnung von
Antiseren. Mit diesen wiederum kann durch immunologische Methoden (Haemagglutinations-Hemmungs-Test
Komplement-Bindungs-Reaktion, Radio-Immunassay, Latex-Agglutination) eine Schwangerschaft
nachgewiesen werden. Der Nachweis kann mit Serum oder Urin der Schwangeren geführt werden. Eine
quantitative Bestimmung von SPi, z. B. mit der radialen
Immundiffusion, kann für eine Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung werden.
Für eine bevorzugte Methode der Herstellung des schwangerschaftsspezifischen ßi-Glykoproteins werden
zerkleinerte Plazenten mit einer schwachen Salzlösung extrahiert und die mit Diaminoäthoxyacridin-lactat
fällbaren Proteine bei einem pH-Wert von etwa 8,0 abgetrennt Das im Überstand verbleibende SPi wird
zusammen mit Gammaglobulin mit Ammoniumsulfat ausgefällt Zur Trennung des SPi von der Hauptmenge
des Gammaglobulins wird die in reinem Wasser wieder aufgelöste Fällung, zweckmäßig nach einer Vorbehandlung
durch Dialyse gegen eine Pufferlösung, an Diäthylaminoäthyl (DEAE) — Cellulose adsorbiert und
von dieser wiederum eluiert. Als Elutionsmittel hat sich eine 0,02molare Tris-oxymethylaminomethyl-Salzsäure-Pufferlösung
vom pH-Wert 6,5 besonders bewährt, die noch etwa 0,85% Natriumchlorid und eine kleine
Menge, z. B. 0,05% Natriumazid enthalten kann. Ausfällen des Eluats mit Ammoniumsulfat liefert das SPi
in angereicherter Form, das durch Gelfiltration beispielsweise mittels SephadexW G-150 weiter gereinigt
werden kann.
Zur weiteren Reinigung eignet sich auch die präparative Zonenelektrophorese mit PVC als Träger in
einer geeigneten Pufferlösung, z. B. 0,075% Ammoniumhydrogencarbonat.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die SPi-haltige jS-Zone des Trägers
herausgeschnitten, mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und lyophilisiert. Weiter geeignete Feinreinigungsverfahren
sind eine Chromatographierung an DEAE-Sephaclex mit nachfolgender Elution mit einem
10
20
Natriumchlorid-Gradienten und eine Fraktionierung mit Alkohol, vorzugsweise mit Äthanol.
Das schwangerschaftsspezifische 0t-Glykoprotein
kann in ähnlicher Weise aus Blut oder Urin von Schwangeren isoliert werden.
Beispiel 1
Isolierung aus Plazenten
Isolierung aus Plazenten
150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5%igen wäßrigen Natriumchlorid-Lösung
extrahiert Der Extrakt wird mit 2normalem Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt und
mit 150 Liter einer 3%igen wäßrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat (Rivanol®) versetzt Nach
einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Oberstand, der
das SPi zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert,
mit 5% festem Natriumchlorid (11kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Rivanols
versetzt, filtriert und mit 26,5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt
und gut durchgerührt Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen
eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit »Tris« abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung
vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und
der Oberstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung
auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt.
Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter
0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02molarem
Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert. Den
vereinigten Eluaten wird 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze
verrührt. Der Niederschlag, der das SPi enthält, wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und der Gelfiltration
mittels Sephadex G-150 unter Verwendung von 0,1 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0, der 1,0MoI
Natriumchlorid pro Liter enthält, unterzogen (100:20cm-Säule).
Anschließend werden die Eluate mit spezifischem SPi-Antiserum getestet die SPi-haltigen Fraktionen
gesammelt und daraus die Proteine nochmals wie oben beschrieben mit 30% festem Ammonsulfat ausgefällt.
Eine weitere Reinigung erzielt man durch präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid (PVC) als
Träger. Als Puffer wird eine 0,075molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung
(pH 8,0) verwendet. Man schneidet nach der elektrophoretischen Auftrennung die SPi-haltige J3-Zone heraus, eluiert mit dem Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer
und lyophilisiert die Eluate.
Die Trockensubstanz wird in 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 7,0, der 0,2% Natriumchlorid enthält,
gelöst, an DEAE-Sephadex (Säule 5 χ 20 cm) chromatigraphiert und mit einem linearen Gradienten von 0,2 bis
2,0% Natriumchlorid in 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 7,0 eluiert. Es folgt eine Fällung mit 40%
Äthanol bei —5°C. Nach Abzentrifugation des Niederschlages wird der Überstand gegen destilliertes Wasser
salzfrei dialysiert und lyophilisiert. Reinheit 90-95%.
40
4>
W) Dieses Präparat kann zur Herstellung von Antiseren Verwendung finden.
Beispiel 2
Isolierung aus Blut
Isolierung aus Blut
5 Liter Schwangerenserum werden mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 :1 verdünnt und daraus die
Hauptmenge der Plasmaproteine durch 2,5 Liter 3%igen Rivanols bei pH 8,0 gefällt Der durch
Zentrifugation erhaltene Oberstand wird zur Entfernung
des Rivanols mit 5% Natriumchlorid versetzt Der dabei entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert
der Überstand vom Sediment getrennt und mit 30% festem Ammonsulfat versetzt Im Niederschlag sind das
Gammaglobulin und das schwangerschaftsspezifische /?i-Glykoprotein enthalten. Der Niederschlag wird in
0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 7,0 gelöst gegen 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 7,0 dialysiert und
anschließend mit DEAE-Cellulose gereinigt Die DEAE-Cellulose-Behandlung
wird in 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0 ausgeführt
Die Elution von DEAE-Cellulose, die Gel-Filtration mit Sephadex, die präparative Zonenelektrophorese, die
Reinigung am DEAE-Sephadex sowie die Fällung mit Alkohol werden gemäß Beispiel 1 ausgeführt
Beispiel 3
Herstellung eines Antiserums
Herstellung eines Antiserums
Zur Herstellung eines spezifischen Antiserums werden Kaninchen mit dem gereinigten schwangerschaftsspezifischen
ßi-Glykoprotein unter Verwendung von Aluminiumhydroxid als Adjuvans über einen
Zeitraum von 6 Wochen immunisiert
Das schwangerschaftsspezifische j9i-Glykoprotein
wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0,06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxid
zu einer Suspension verrührt Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0,06 mg
des Glykoproteins in 3 ml Suspension pro Tier i. v. injiziert. Anschließend läßt man die Tiere 9 Tage ruhen.
Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge
Antigen, läßt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schließlich nochmals an 5 aufeinanderfolgenden Tagen
je 0,06 mg des Antigens. Nach einer erneuter. Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem
Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.
Beispiel 4
Diagnostisches Mittel
Diagnostisches Mittel
Eine Testanordnung für die immunologische Bestimmung des schwangerschaftsspezifischen ß\ -Glykoproteins
besteht aus anti-schwangerschaftsspezifischen ]3i-Glykoprotein-Serum vom Kaninchen und einem
Referenzstandard für das schwangerschaftsspezifische 01-Glykoprotein. Den Referenzstandard erhält man
durch Auflösen einer abgewogenen Menge des gereinigten Proteins in Humanserum, einer Serumkonserve
aus Humanserum oder einer Plasmaersatzlösung als stabilisierendes Lösungsmittel. Die Konzentration
wird zweckmäßig so gewählt, daß sie etwa 25 bis 36 mg schwangerschaftsspezifisches /?i-Glykoprotein pro
100 ml entspricht.
Quantitative Bestimmung des schwangerschaftsspezifischtn ß\ -Glykoprcteins
1 g Agarose wird mit 50 ml Diäthylbarbiturat-Acetat-Puffer-lösung vom pH-Wert 8,5 und der Ionenstärke
0,04 M, 50 ml destilliertem Wasser und 10 mg des Konservierungsmittels Thiocid vermischt und auf etwa
1000C erhitzt, bis sich eine klare Lösung gebildet hat
15 ml der Lösung werden mit einer vorgewärmten Meßpipette auf eine vollkommen waagerecht liegende
Glasplatte von 10 χ 10 cm ausgegossen. Nach kurzem Stehen bei Raumtemperatur erstarrt die Lösung zu
einem transparenten Gel von gleichmäßiger Schichtdikke. In einer Entfernung von 2 cm vom Rand der
Glasplatte werden in regelmäßigen Abständen Löcher von 4 mm Durchmesser gestanzt Die Löcher dienen zur
Aufnahme der zu untersuchenden Seren von Frauen bzw. den als Bezugsstandard dienenden Lösungen, die 4,
8, 16 und 32 mg SPi/lOOml enthalten. 15 μΐ der zu
untersuchenden Lösungen werden in die Löcher eingefüllt und 3 Stunden in einer feuchten Kammer
belassen. Danach wird ausgehend von den Löchern in einem Abstand von 0,5 cm die Agaroseschicht durchtrennt und von der Glasplatte entfernt Der freie Teil
der Glasplatte wird nun mit 15 nil einer Agaroselösung
beschichtet die wie oben beschrieben hergestellt und der beim Abkühlen auf etwa 500C bis zu einer
Konzentration von 1,5% AnU-SP1-Serum zugemischt
wurde. Anschließend an die Überschichtung erfolgt eine elektrophoretische Auftrennung der in den Löchern
aufgetragenen Proben während 25 Stunden bei 2 V/cm in das angrenzende Antiserum-hcltige Gel. Danach
ίο werden die Gele wie bei Agarelektrophoresen üblich
gewaschen und getrocknet und die Immunpräzipitatlinien, die sich während der Elektrophorese ausgebildet
haben, zur besseren Sichtbarmachung mit Amidoschwarz angefärbt Die Höhe der Präzipitatspitzen ist
!5 ein Maß für die Konzentration des SPj in den
untersuchten Proben. Sie wird zu den Präzipitatlängen, die durch die Standardlösungen ausgebildet wurden, in
Beziehung gesetzt Im vorliegenden Versuch ergab sich bei einem Serum einer nicht schwangeren Frau keine
v) Präzipitatbildung, bei einer Frau in der 8. Schwangerschaftswoche ein Gehalt von 1 mg SPi pro 100 ml
Serum, bei einer Frau in der 20. Schwangerschaftswoche 5 mg SPi pro 100 ml Serum und bei einer Frau in der 32.
Schwangerschaftswoche 20 mg SPi pro 100 ml Serum.
Claims (5)
1. Schwangerschaftsspezifisches ßi-GIykoprotein
(SP1), das
eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der /Ji -Globuline,
einen ExtinktionskoeffizientenE \*m = 11,0
(278 πιμ; 1/15 molarer Phosphatpuffer,
pH 7,0)
(278 πιμ; 1/15 molarer Phosphatpuffer,
pH 7,0)
einen Kohlenhydratgehalt von 26,5-29,6%, davon
10,0-11,0% Hexosen, 9,5-10,5% Hexosamin, 0,5-04% Fucose und 6,5-7,5% Neuraminsäure
aufweist herstellbar dadurch, daß man aus einem mit Hilfe einer Salzlösung aus menschlichen Plazenten
gewonnenen Extrakt die mit Diaminoäthoxyacridinlactat fällbaren Proteine abtrennt, sodann das im
Überstand verbleibende SPi zusammen mit Gamma-Globulin mittels Ammonsulfid ausfällt und von
diesem das Gamma-Globulin durch Adsorption an DEAE abtrennt, aus dem Eluat das SPi mit
Ammonsulfat ausfällt und das so erhaltene Produkt durch Chromatographie und/oder Elektrophorese
reinigt
2. Verfahren zum Herstellen von SPi nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß es durch
Extraktion von menschlichen Plazenten hergestellt wird, indem man
a) aus Plazentaextrakt mit Diaminoäthoxyacridinlactat
(I) die damit fällbaren Proteine bei einem pH-Wert von etwa 8 abtrennt,
b) das im Überstand verbleibende, von (1) befreite 01-Glykoprotein zusammen mit den Gamma-Globulinen
mit Ammonsulfat ausfällt,
c) die in Wasser wiederaufgelöste Fällung — gegebenenfalls nach Dialyse — an Diäthylaminoäthyl
(DEAE)-Cellulose adsorbiert und von dieser mit Trisoxymethylaminoäthyl (TRIS)- <tu
HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 6,5 eluiert,
d) das Eluat mit Ammonsulfat fällt und reinigt indem man es
dl) einer Gelfiltration mit epichlorhydrinvernetztem Dextran unterwirft
d2) mittels Präparativer Zonenelektrophorese mit PVC als Träger in geeigneter Pufferlösung
weiter auftrennt und
d3) das /?i-Glykoprotein daraus eluiert und
lyophilisiert,
d4) worauf das ßi-Glykoprotein zur weiteren
Feinreinigung nochmals an DEAE-modifiziertem Dextran Chromatographien und
das daraus resultierende Eluat einer Alkoholfraktionierung unterworfen werden
kann.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß anstelle von Plazenta-Extrakt Blut
oder Urin von schwangeren Frauen verwendet wird.
4. Verwendung des schwangerschaftsspezifischen e>o
01-Glykoproteins nach den Ansprüchen 1 und 3 zum
Herstellen von Antiseren.
5. Verwendung des Antiserums nach Anspruch 4 zum Nachweis und zur Überwachung der
Schwangerschaft. f«
Es ist bisher nicht bekannt daß in der Plazenta und im
Urin von Schwangeren ein schwangerschaftsspezifisches /?i-Glykoprotein vorkommt Es ist zwar immunologisch
schon ein Protein im /J-Bereich von Schwangerenserum
nachgewiesen worden, ein Verfahren zu seiner Isolierung jedoch noch nie beschrieben worden.
Gegenstand der Erfindung ist das schwangerschaftsspezifische /Ji-Glykoprotein (abgekürzt SPi), das
eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der ß\ -Globuline,
einen Extinktionskoeffizienten E |*m =11,0
(278 ηιμ; 1/15 molarer Phosphatpuffer
pH 7,0) und
(278 ηιμ; 1/15 molarer Phosphatpuffer
pH 7,0) und
einen Kohlenhydratgehalt von 26,5—29,6%, davon
10,0-11,0% Hexosen, 9,5-105 Hexosamin, 0,5—0,6% Fucose und 6,5 — 7,5% Neuraminsäure
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