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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-schwangerschaftsspezifischen ssi-Glykoprotein-Serums.
Während der Schwangerschaft wird bei einer Reihe von Plasmaproteinen die Konzentration im Blut
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Zu diesen als Schwangerschaftsproteine bezeichneten Substanzen gehören alle in der Plazenta gebildeten Enzyme, Inhibitoren und Hormone, die Eiweissnatur besitzen und in das mütterliche Blut abgegeben werden. Beispiele dafür sind die Oxytocinase, die hitzestabile alkalische Phosphate, die Histaminase, die Urocinaseinhibitoren sowie das humane Plazentalactogen und das humane Choriongonadotropin (HCG).
In der menschlichen Plazenta wurde nun ein ss1-Glykoprotein nachgewiesen, das sich in seinen chemischen und physikalischen Eigenschaften von den
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neue ssl-Glykoprotein ist durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der ss1 -Globuline ; eine Sedimentationskonstante von 4, 6 S 0, 5 S ; ein Mol.-Gew. von etwa 100000 15000 ;
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11, 0 0, 510, 0 bis 11, 0% Hexosen, 9, 5 bis 10, 5% Hexosamin, 0, 5 bis 0, 6% Fucose und
6,5 bis 7,5% Neuraminsäure gekennzeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-schwangerschaftsspezifischen ss1-Glykoprotein-Serums, welches in seinem Wesen darin besteht, dass man Tiere nach bekannten Methoden mit diesem neuen schwangerschaftsspezifischen ssl-Glykoprotein immunisiert und aus dem Blut der Tiere das Antiserum gewinnt. Das erfindungsgemäss verwendete neue ss1 -Glykoprotein wird, da es schwangerschaftsspezifisch ist, schwangerschaftsspezifisches ssi-Glykoprotein-abgekürzt SP i-genannt.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, nach an sich bekannten Methoden der Immunisierung von Tieren die neuen Antiseren zu gewinnen, mit deren Hilfe man durch immunologische Methoden (Haemagglutinations-Hemmungs-Test, Komplement-Bindungs-Reaktion, Radio-Immunassay, Latex-Agglutination) eine Schwangerschaft nachweisen kann. Der Nachweis kann mit Serum oder Urin der Schwangeren geführt werden. Eine quantitative Bestimmung von ssi-Glykoprotein, z. B. mit der radialen Immundiffusion, kann für eine Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung werden.
Das erfindungsgemäss zur Herstellung der Anti-schwangerschaftsspezifischen ssi-Glykoprotein-Seren verwendete neue schwangerschaftsspezifische ssI-Glykoprotein kann dadurch erhalten werden, dass man aus einem mit Hilfe einer Salzlösung aus Plazenten gewonnenen Extrakt oder aus Blut oder Urin von Schwangeren die mit Diaminoäthoxyacridin-lactat fällbaren Proteine abtrennt, sodann das im überstand verbleibende schwangerschaftsspezifische ssl-Glykoprotein zusammen mit Gammaglobulin, insbesondere mittels Ammoniumsulfat, ausfällt und von diesem durch Chromatographie und/oder Elektrophorese abtrennt.
Zweckmässigerweise werden für die Herstellung des schwangerschaftsspezifischen ss1 -Glykoproteins
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der Hauptmenge des Gammaglobulins wird die in reinem Wasser wieder aufgelöste Fällung, zweckmässig nach einer Vorbehandlung, durch Dialyse gegen eine Pufferlösung, an Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Cellulose adsorbiert und von dieser wieder eluiert. Als Eluierungsmittel hat sich eine 0, 02-molare Tris-oxymethylaminomethyl/Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 6, 5 besonders bewährt, die noch etwa 0, 85% Natriumchlorid und eine kleine Menge, z. B. 0, 05% Natriumazid enthalten kann.
Ausfällen des Eluats mit Ammoniumsulfat liefert das si-glykoprotein in angereicherter Form, das durch Gelfiltration, beispielsweise mittels mit Epichlorhydrin dreidimensional vernetztem Dextran in Perlform mit einer Ausschlussgrenze für Proteine von grösserem Mol.-Gew. als 150000, im Handel als Sephadex G-150 der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, weiter gereinigt werden kann.
Zur weiteren Reinigung eignet sich die präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid als Träger in einer geeigneten Pufferlösung, z. B. 0, 075% Ammoniumhydrogencarbonat. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die ssi-Glykoprotein-haltige ss-Zone des Trägers herausgeschnitten, mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und lyophilisiert. Weitere geeignete Feinreinigungsverfahren sind eine Chromatographierung an dem basischen Ionenaustauscher auf der Basis von mit Epichlorhydrin dreidimensional vernetztem Dextran in Perlform mit eingebauten Diäthylaminoäthylgruppen, im Handel als DEAE-Sephadex der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, mit nachfolgender Eluierung mit einem Natriumchlorid-Gradienten, und eine Fraktionierung mit Alkohol, vorzugsweise mit Äthanol.
Das schwangerschaftsspezifische ss1-Glykoprotein wird in ähnlicher Weise aus Blut oder Urin von Schwangeren isoliert.
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Gewinnung des erfindungsgemäss verwendbaren, neuen -Glykoproteins :
A) Aus Plazenten.
150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 1501 einer 0,5%igen wässerigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natriumhydroxyd auf PH 8 eingestellt und mit 501 einer 3%igen wässerigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-lactat versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 h wird der überstand, der das ssl-Glykoprotein zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtriert und mit 26, 5% bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 h wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0, 01-molare Tris (oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit"Tris"abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7, 0 die 0, 05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000ml aufgefüllt, mit 0,1n-Natriumhydroxydlösung auf
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Gelfiltration mittels Sephadex G-150 unter Verwendung von 0, 1-molarem Tris/Salzsäurepuffer vom PH 8, 0, der 1, 0 Mol Natriumchlorid pro Liter enthält, unterzogen (100 : 20 cm-Säule).
Anschliessend werden die Eluate mit spezifischem ss1-Glykoprotein-Antiserum getestet, die ssi-glykoproteinhaltigen Fraktionen gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30% festem Ammonsulfat ausgefällt.
Eine weitere Reinigung erzielt man durch präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid als Träger.
Als Puffer wird eine 0, 075-molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung (PH 8, 0) verwendet. Man schneidet nach der elektrophoretischen Auftrennung die ss1-glykoproteinhaltige ss-Zone heraus, eluiert mit dem Ammoniumhydrogencarbonatpuffer und lyophilisiert die Eluate.
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gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert und lyophilisiert. Reinheit : 90 bis 95% Dieses Präparat kann zur Herstellung von Antiseren Verwendung finden.
B) Aus Blut.
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: 1 verdünntPH 8, 0 gefällt. Der durch Zentrifugieren erhaltene Überstand wird zur Entfernung des Diaminoäthoxyacridin-lac- tats mit 5% Natriumchlorid versetzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert, der Überstand vom Sediment getrennt und mit 30% festem Ammonsulfat versetzt. Im Niederschlag sind das Gammaglobulin und das schwangerschaftsspezifische ssi-Glykoprotein enthalten. Der Niederschlag wird in 0, 01-molarem
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mit Diäthylaminoäthylcellulose gereinigt. Die Diäthylaminoäthylcellulose-Behandlung wird in 0, 01-molarem Tris/Salzsäurepuffer, PH 8, 0, ausgeführt.
Die Eluierung von Diäthylaminoäthylcellulose, die Gelfiltration mit Sephadex, die präparative Zonenelektrophorese, die Reinigung an Diäthylaminoäthyl-Sephadex sowie die Fällung mit Alkohol werden gemäss Abschnitt A ausgeführt.
B e i s p i e l : Herstellung eines Antiserums.
Zur Herstellung eines spezifischen Antiserums werden Kaninchen mit dem gereinigten
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einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert.
Das schwangerschaftsspezifische ss1-Glykoprotein wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0, 06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxyd zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg Protein in 3 ml Suspension pro Tier i. v. injiziert. Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.