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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des ssl-AP-Glykoproteins, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man zu der zu prüfenden Lösung ein Antiserum gibt, das nach bekannten
Methoden durch Immunisierung von Tieren mit dem ssi-AP-Glykoprotein erhalten worden ist, und die immunologische Reaktion beobachtet, registriert und gegebenenfalls quantitativ auswertet.
Es ist bereits ein Verfahren zur Isolierung eines schwangerschaftsspezifischen ssi-Glykoproteins vorgeschlagen worden (AT-PS Nr. 322097). Es war in diesem Vorschlag jedoch nicht erwähnt, dass während der Schwangerschaft zwei weitere Glykoproteine auftreten, die aber nicht schwangerschaftsspezifisch sind, da sie auch im Serum von Patienten mit entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen verschiedener
Genese auftreten. Wegen dieses Auftretens sowohl in der Schwangerschaft als auch bei Erkrankungen werden sie AP-Glykoproteine genannt (AP : Akute Phase).
Es wurde gefunden, dass man diese beiden AP-Glykoproteine aus Plazenten oder aus dem Blut von
Schwangeren isolieren kann.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Verfahren zum Nachweis eines der beiden Glykoproteine, nämlich des ssi-AP-Glykoproteins.
Das ssi-AP-Glykoprotein ist gekennzeichnet durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der ssi-Globuline und einem Molgewicht von etwa 100000 ( 10%) und das 012-AP-Glykoprotein ist gekennzeichnet durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im
Agargel im Bereich der s-Glykoproteine und einem Molgewicht von etwa 300000 (i 10%).
Dass die AP-Glykoproteine einen höheren Gehalt an Kohlenhydraten aufweisen, ergibt sich aus der
Zunahme ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit bei der Behandlung mit Neuraminidase. Das ssi-AP-Glyko- protein zeigt nach Abspaltung der Neuraminsäure die Beweglichkeit eines Gammaglobulins, das 012-AP-Glykoprotein die Beweglichkeit eines ssi-Globulins.
Eine solch starke Verschiebung zeigen im allgemeinen nur Plasmaproteine, die mindestens 2 bis 6% Neuraminsäure bzw. 10 bis 30% Kohlenhydrate enthalten.
Die Wanderungsgeschwindigkeit in einem Polyacrylamid-Gel [mit 5, 5% Acrylamid bei PH 8, 5 in Tris-Zitrat-Borat-Puffer, Z. clin. Chem. 4, 58 (1966)] beträgt für das ss1-AP-Glykoprotein 62, für das α2-AP-Glykoprotein 32, wenn man die Wanderungsgeschwindigkeit von Human-Albumin mit 100 festsetzt.
Zur Gewinnung des beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Antiserums werden Tiere mit dem ssi-AP-Glykoprotein immunisiert. Das für die Immunisierung benötigte ss1-AP-Glykoprotein kann isoliert werden, indem man Plazenten oder Blut von Schwangeren nach bekannten Methoden fraktioniert.
Für die Isolierung des ss1-AP-Glykoproteins können zerkleinerte Plazenten mit einer physiologisch verträglichen schwachen Salzlösung, z. B. Natriumchloridlösung, extrahiert werden. Aus dem Extrakt kann mit Diaminoäthoxyakridinlaktat bei schwach saurem PH-Wert eine inaktive Vorfällung abgetrennt und anschliessend im alkalischen PH-Bereich wieder durch Fällung mit Diaminoäthoxyakridinlaktat die beiden Glykoproteine ausgefällt werden. Für die Abtrennung der Vorfällung wird das Diaminoäthoxyakridinlaktat vorzugsweise als wässerige Lösung in einer Menge von 5 bis 10 Gew.-%, berechnet auf den Eiweissgehalt des Extrakts, empfohlen.
Für die Hauptfällung, die zweckmässig in einem PH-Bereich zwischen 7, 5 und 9, 0 stattfindet, wird eine Diaminoäthoxyakridinlaktat-Menge von 10 bis 30%, berechnet auf den Eiweissgehalt des Extrakts, empfohlen. Zur weiteren Reinigung eignet sich die Gel-Filtration mit vernetztem Dextran, z. B. Sephadex G-150 und/oder die präparative Zonenelektrophorese.
Die Gel-Filtration wird nach Dialyse gegen eine schwache, z. B. 0, 01 molare Tris-SalzsäurePufferlösung von PH 7, 5 bis 8, 5, vorzugsweise PH 8, 0, an vernetztem Dextran, wie Sephadex G-150, ausgeführt. Zur Elution kann beispielsweise 0, 1 molarer Tris-Salzsäure-Puffer pH 8, 0 dienen, der noch 1 Mol/1 Natriumchlorid enthält. Bei diesem Elutionsverfahren wird zuerst das 012-AP-Glykoprotein eluiert, während das ss1-AP-Glykoprotein erst später von der Säule kommt.
Das ssi-AP-Glykoprotein wird unmittelbar nach dem 7 S-Gammaglobulin eluiert.
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des Niederschlags in destilliertem Wasser wird die Lösung gegen eine Pufferlösung, wie Ammoniumhydrogencarbonat [PH 8, 0 bis 8, 5] dialysiert und zweckmässig mit dem gleichen Puffer in der präparativen Zonenelektrophorese weiter aufgetrennt. Die entsprechenden Zonen im ss1-Bereich werden mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und gefriergetrocknet.
Zur Isolierung des ssl-AP-Glykoproteins aus Serum werden die N-und ssi-Glykoproteine im alkalischen pH-Bereich [PH 8 bis 9] mit Diaminoäthoxyakridinlaktat aus Retroplacentarserum ausgefällt.
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Der Akridin-Komplex wird mit Natriumchloridlösung, beispielsweise einer 4 bis 6% eigen, vorzugsweise 5%igen, Lösung versetzt, der entstehende Niederschlag abgetrennt und verworfen und der Überstand mit festem Ammonsulfat (2 bis 2, 5 Mol/l) gefällt.
Zur Trennung der beiden AP-Glykoproteine kann auch hier die oben erwähnte Gelfiltration mit
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erfindungsgemässen Verfahrens durch immunologische Methoden (Gel-Diffusionstest, Überwanderungs- elektrophorese, radioimmunologische Bestimmung) den Zustand einer Krankheit festzustellen und den Verlauf von Krankheiten zu verfolgen.
Der immunologische Nachweis des ssl-AP-Glykoproteins ist für die Differentialdiagnostik von Bedeutung, da bei verschiedenen Krankheiten qualitative und quantitative Unterschiede im Vorkommen dieses Proteins bestehen. Seine immunologische Bestimmung kann ausserdem zur Überwachung der Therapie verwendet werden. Der Nachweis wird mit Serum des Patienten durchgeführt.
Die Gewinnung von Antiseren ist ein in der Praxis allgemein bekanntes Verfahren. Hiezu wird das AP-Glykoprotein einem Versuchstier injiziert und nach einiger Zeit wird dem Versuchstier Blut entnommen, welches das entsprechende Antiserum enthält. Dieses Antiserum wird in an sich bekannter Weise in Versuchsanordnungen zur Durchführung immunologischer Tests als Diagnostikum verwendet.
Vorschrift l :
Isolierung aus Retroplacentarserum :
500 ml Retroplacentarserum (s. dazu"Reallexikon der Medizin, Seite R 100 unter"Retroplacentar- blut") werden mit 500 ml destilliertem Wasser verdünnt und bei PH 8, 5 (0, 1 N Natriumchloridlösung mit 350 ml einer 3%igen Diaminoäthoxyakridinlaktatlösung gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und mit 500 ml 5% iger Natriumchloridlösung versetzt, wobei das Akridinderivat ausfällt. Das ausgeschiedene Akridinderivat wird abzentrifugiert, der Überstand durch Zugabe von 30 g pro 100 ml festem Ammonsulfat gefällt. Der erhaltene Niederschlag enthält die beiden AP-Glykoproteine.
Diese werden nach Lösen in Wasser durch Gelfiltration an Sephadex G-150 in Fraktionen von je 20 ml aufgetrennt (Säule 10 x 100 cm).
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1Ochterony).
Die entsprechenden Fraktionen, in denen ssi-AP-Glykoprotein nachgewiesen wurde, werden jeweils vereinigt, mit 30 g Ammonsulfat pro 100 ml Lösung gefällt, gegen 0, 075 molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung dialysiert und zur weiteren Reinigung durch präparative Elektrophorese aufgetrennt. Man bedient sich dazu des Polyvinylchlorids als Träger und einer 0, 075% igen Ammoniumhydrogencarbonatlösung als Puffer. Das ssi-AP-Glykoprotein wird aus den entsprechenden Zonen, nämlich dem ssl-Bereich der Globuline mit dem gleichen Puffer eluiert und die Eluate anschliessend lyophilisiert. Bei der präparativen Elektrophorese findet sich das ssl-AP-Glykoprotein in der ssl-Fraktion.
Vorschrift 2 :
Isolierung aus Plazenten :
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5% igen Natriumchlorid-LSsungäthoxyakridin-Laktat-Lösung versetzt. Die inaktive Vorfällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird mit 2 normaler Natriumhydroxydlösung auf PH 8, 5 eingestellt und mit 3 Liter der 3% igen Akridinsalzlosung gefällt. Der Niederschlag, der die AP-Glykoproteine enthält, wird mit 6 Liter einer 5% igen Natriumchlorid-Losung entsprechend Beispiel 1 zerlegt. Nach Zentrifugation wird dem Überstand 30% festes Ammonsulfat zugefügt. Der Niederschlag, der durch Filtration gewonnen wird, wird in Wasser gelöst und gegen eine 0, 01 molare Tris-Salzsäure-Lösung (PH 6, 0) dialysiert.
Zur Entfernung von Gammaglobulin und Hämoproteinen wird die Lösung mit 150 g feuchter Carboxymethylcellulose verrührt und anschliessend filtriert. Aus dem Filtrat werden die AP-Glykoproteine durch Ammonsulfatfällung (30% w/v) isoliert. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und gemäss Vorschrift 1 durch Gelfiltration und präparative Zonenelektrophorese aufgetrennt und gereinigt. Die Ausbeute beträgt 15 mg des ssi-AP-Glyko- proteins.
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