AT358744B - Verfahren zum nachweis des alpha2-ap- -glykoproteins - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis   desa-AP-Glykoproteins,   welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man zu der zu prüfenden Lösung ein Antiserum gibt, das nach bekannten Methoden durch Immunisierung von Tieren mit dem a 2-AP-Glykoprotein erhalten worden ist, und die immunologische Reaktion beobachtet, registriert und gegebenenfalls quantitativ auswertet. 



   Es ist bereits ein Verfahren zur Isolierung eines schwangerschaftsspezifischen   ssl-Glykoproteins   vorgeschlagen worden (AT-PS Nr. 322097). Es war in diesem Vorschlag jedoch nicht erwähnt, dass während der Schwangerschaft zwei weitere Glykoproteine aufttreten, die aber nicht schwangerschaftsspezifisch sind, da sie auch im Serum von Patienten mit entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen verschiedener Genese auftreten. Wegen dieses Auftretens sowohl in der Schwangerschaft als auch bei Erkrankungen werden sie AP-Glykoproteine genannt (AP : Akute Phase). 



   Es wurde gefunden, dass man diese beiden AP-Glykoproteine aus Plazenten oder aus dem Blut von Schwangeren isolieren kann. 



   Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Verfahren zum Nachweis eines der beiden Glykoproteine, nämlich des   o-AP-Glykoproteins.   



   Das   ss l-AP-Glykoprotein   ist gekennzeichnet durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der ssi-Globuline und ein Molgewicht von etwa 100000   (     10%)   und das   a 2 -AP-Glykoprotein   ist gekennzeichnet durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der   a-Glykoproteine   und ein Molgewicht von etwa 300000   (   10%). 



   Dass die AP-Glykoproteine einen höheren Gehalt an Kohlenhydraten aufweisen, ergibt sich aus der Zunahme ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit bei der Behandlung mit Neuraminidase. 
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 in Tris-Zitrat-Borat-Puffer, Z. clin. Chem. 4, 58   (1966)]   beträgt für   das 61-AP-Glykoprotein   62, für das    2-AP-Glykoprotein   32, wenn man die Wanderungsgeschwindigkeit von Human-Albumin mit 100 festsetzt. 



   Zur Gewinnung des beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Antiserums werden Tiere mit dem   a   -AP-Glykoprotein immunisiert. Das für die Immunisierung benötigte a 2-AP-Glykoprotein kann isoliert werden, indem man Plazenten oder Blut von Schwangeren nach bekannten Methoden fraktioniert. 
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 Extrakt kann mit Diaminoäthoxyakridinlaktat bei schwach saurem PH-Wert eine inaktive Vorfällung abgetrennt und anschliessend im alkalischen pH-Bereich wieder durch Fällung mit Diaminoäthoxyakridinlaktat bei beiden Glykoproteine ausgefällt werden. Für die Abtrennung der Vorfällung wird das Diaminoäthoxyakridinlaktat vorzugsweise als wässerige Lösung in einer Menge von 5 bis 
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   Das   a. -AP-Glykoprotein   wird durch Ammonsulfat (etwa 2 bis 2, 5 Mol/l) ausgefällt. Nach dem Auflösen des Niederschlages in destilliertem Wasser wird die Lösung gegen eine Pufferlösung, wie Ammoniumhydrogencarbonat (PH 8, 0 bis 8, 5) dialysiert und zweckmässig mit dem gleichen Puffer in der präparativen Zonenelektrophorese weiter aufgetrennt. Die entsprechenden Zonen im    2-Bereich   werden mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und gefriergetrocknet. 

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   Zur Isolierung des   o-AP-Glykoproteins   aus Serum werden die   c-und ssi-Glykoproteine   im alkalischen PH -Bereich (PH 8 bis 9) mit Diaminoäthoxyakridinlaktat aus Retroplacentarserum ausgefällt. Der Akridin-Komplex wird mit Natriumchloridlösung, beispielsweise einer 4 bis 6%igen, vorzugsweise 5%igen, Lösung versetzt, der entstehende Niederschlag abgetrennt und verworfen und der Überstand mit festem Ammonsulfat (2 bis   2, 5 Mol/l)   gefällt. 



   Zur Trennung der beiden AP-Glykoproteine kann auch hier die oben erwähnte Gelfiltration mit anschliessender präparativer Zonenelektrophorese angewendet werden. 



   Die mittels des   a-AP-Glykoproteins   gewonnenen Antiseren ermöglichen es, im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens durch immunologische Methoden (Gel-Diffusionstest, Überwanderungselektrophorese, radioimmunologische Bestimmung) den Zustand einer Krankheit festzustellen und den Verlauf von Krankheiten zu verfolgen. 



   Der immunologische Nachweis des   a-AP-Glykoproteins   ist für die Differentialdiagnostik von Bedeutung, da bei verschiedenen Krankheiten qualitative und quantitative Unterschiede im Vorkommen dieses Proteins bestehen. Seine immunologische Bestimmung kann ausserdem zur Überwachung der Therapie verwendet werden. Der Nachweis wird mit Serum des Patienten durchgeführt. 



   Die Gewinnung von Antiseren ist ein in der Praxis allgemein bekanntes Verfahren. Hiezu wird das  2-AP-Glykoprotein einem Versuchstier injiziert und nach einiger Zeit wird dem Versuchstier Blut entnommen, welches das entsprechende Antiserum enthält. Dieses Antiserum wird in an sich bekannter Weise in Versuchsanordnungen zur Durchführung immunologischer Tests als Diagnostikum verwendet. 



   Vorschrift 1 : Isolierung aus   Retroplacentarserum :  
500 ml Retroplacentarserum (siehe   dazu"Reallexikon   der Medizin, Seite R 100 unter "Retroplacentarblut") werden mit 500 ml destilliertem Wasser verdünnt und bei PH 8,   (0, 1   N Natriumchloridlösung) mit 350 ml einer 3%igen Diaminoäthoxyakridinlaktatlösung gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und mit 500 ml 5%iger Natriumchloridlösung versetzt, wobei das Akridinderivat ausfällt. Das ausgeschiedene Akridinderivat wird abzentrifugiert, der Überstand durch Zugabe von 30 g pro 100 ml festem Ammonsulfat gefällt. Der erhaltene Niederschlag enthält die beiden AP-Glykoproteine. Diese werden nach Lösen in Wasser durch Gelfiltration an Sephadex G-150 in Fraktionen von je 20 ml aufgetrennt (Säule 10 x 100 cm).

   Zur Elution dient   0,1molarer   Tris-Salzsäure-Puffer PH   8,   0, der noch 1,0 Mol/l Natriumchlorid enthält. Die Fraktionen werden mit spezifischen Antiseren von Kaninchen getestet (Gel-Diffusionstest nach Ochterony). 



   Die entsprechenden Fraktionen, in denen    2-AP-Glykoprotein   nachgewiesen wurde, werden jeweils vereinigt, mit 30 g Ammonsulfat pro 100 ml Lösung gefällt, gegen 0, 075molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung dialysiert und zur weiteren Reinigung durch präparative Elektrophorese aufgetrennt. Man bedient sich dazu des Polyvinylchlorids als Träger und einer 0,075%gen Ammoniumhydrogencarbonatlösung als Puffer. Das  2-AP-Glykoprotein wird aus den entsprechenden 
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 in der   a 2-Fraktion.   



   Vorschrift 2 : Isolierung aus Plazenten :
10 kg menschliche Plazenten werden in tiefgefrorenem Zustand zerkleinert und mit 10 1 einer   0,5%gen   Natriumchloridlösung extrahiert   (1   h bei 5 bis   10 C).   10 1 der Extraktionslösung werden mit 20%iger Essigsäure auf PH 6, 0 eingestellt und zunächst mit 1500 ml einer 3%igen Diaminoäthoxyakridin-Laktat-Lösung versetzt. Die inaktive Vorfällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird mit 2 normaler Natriumhydroxydlösung auf PH 8,5 eingestellt und mit 3 1 der 3%igen Akridinsalzlösung gefällt. Der Niederschlag, der die AP-Glykoproteine enthält, wird mit 6 1 einer 5%igen Natriumchlorid-Lösung entsprechend Beispiel 1 zerlegt. Nach Zentrifugation wird dem Überstand 30% festes Ammonsulfat zugefügt.

   Der Niederschlag, der durch Filtration gewonnen wird, wird in Wasser gelöst und gegen eine   0,01mare   Tris-Salzsäure-Lösung (PH 6, 0) dialysiert. Zur Entfernung von Gammaglobulin und Hämoproteinen wird die Lösung mit 150 g feuchter Carboxymethylcellulose verrührt und anschliessend filtriert. Aus dem Filtrat werden dei AP-Glykoproteine durch Ammonsulfatfällung (30% w/v) isoliert. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und gemäss Vorschrift 1 durch Gelfiltration und präparative Zonenelektrophorese aufgetrennt und gereinigt. Die Ausbeute beträgt 5 mg des   o-AP-Glykoproteins.   

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   Vorschrift 3 : Herstellung eines Antiserums :
Zur Herstellung eines   spezififschen   Antiserums werden Kaninchen mit dem gereinigten   a. -AP-   Glykoprotein unter Verwendung von Aluminiumhydroxyd als Adjuvans über einen Zeitraum von 
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 Kaninchen erhalten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0,06 mg Protein in 3 ml Suspension pro Tier   i. v.   injiziert. Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen. 



   Beispiel : a) Zusammensetzung eines diagnostischen Mittels. 



   Eine Testanordnung für die immunologische Bestimmung des   a-AP-Glykoproteins   besteht aus Antiserum vom Kaninchen und einem Referenzstandard für das  2-AP-Glykoprotein. Den Referenzstandard erhält man durch Auflösen einer abgewogenen Menge des gereinigten Proteins in Humanserum, einer Serumkonserve aus Humanserum oder einer Plasmaersatzlösung als stabilisierendes Lösungsmittel.

   Die Konzentration wird zweckmässig so gewählt, dass sie etwa 25 bis 36 mg    2-AP-   Glykoprotein pro 100 ml entspricht. b) Quantitative Bestimmung des   a-AP-Glykoproteins  
1 g Agarose wird mit 50 ml Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung vom PH -Wert 8,6 und der Ionenstärke 0,04 M, 50 ml destilliertem Wasser und 10 mg des Konservierungsmittels Thiocid vermischt und auf etwa 100 C erhitzt, bis sich eine klare Lösung gebildet hat. 15 ml der Lösung werden mit einer vorgewärmten Messpipette auf eine vollkommen waagrecht liegende Glasplatte von 10 x 10 cm ausgegossen. Nach kurzem Stehen bei Raumtemperatur erstarrt die Lösung zu einem transparenten Gel von gleichmässiger Schichtdicke. In einer Entfernung von 2 cm vom Rand der Glasplatte werden in regelmässigen Abständen Löcher von 4 mm Durchmesser gestanzt.

   Die Löcher dienen zur Aufnahme der zu untersuchenden Seren von Probanden bzw. den als Bezugsstandard dienenden Lösungen, die 4,8, 16 und 32   mga2-AP-Glykoprotein/l00   ml enthalten. 15   pl   der zu untersuchenden Lösung werden in die Löcher eingefüllt und 3 h in einer feuchten Kammer belassen. Danach wird ausgehend von den Löchern in einem Abstand von 0,5 cm die Agaroseschicht durchtrennt und von der Glasplatte entfernt. Der freie Teil der Glasplatte wird nun mit 15 ml einer Agaroselösung be- 
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 schichtung erfolgt eine elektrophoretische Auftrennung der in den Löchern aufgetragenen Proben während 15 h bei 2 V/cm in das angrenzende antiserumhaltige Gele.

   Danach werden die Gele, wie bei Agarelektrophoresen üblich, gewaschen und getrocknet und die Immunpräzipitatlinien, die sich während der Elektrophorese ausgebildet haben, zur besseren Sichtbarmachung mit Amidoschwarz angefärbt. Die Höhe der Präzipitatspitzen ist ein Mass für die Konzentration   des a -AP-Glykoproteins   in den untersuchten Proben. Sie wird zu den Präzipitatlängen, die durch die Standardlösungen ausgebildet wurden, in Beziehung gesetzt.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zum Nachweis des a-AP-Glykoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass man zu der zu prüfenden Lösung ein Antiserum gibt, das nach bekannten Methoden durch Immunisierung von Tieren mit dem 2-AP-Glykoprotein erhalten worden ist, und die immunologische Reaktion beobachtet, registriert und gegebenenfalls quantitativ auswertet.