DE60035267T2

DE60035267T2 - Verfahren zur analyse der menge an intraabdominalem fettgewebe

Info

Publication number: DE60035267T2
Application number: DE60035267T
Authority: DE
Inventors: Yuji Takarazuka-shi MATSUZAWA; Hiroko Ashiya-shi MURAKAMI; Masako Takarazuka-shi NISHIZAWA
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2020-04-07
Also published as: EP1169647B1; US6844163B1; EP1169647A1; AU3670400A; ATE365326T1; WO2000062073A1; CA2366523C; DE60035267D1; CA2366523A1; AU773675B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Proteins für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung und ein in vitro-Analyseverfahren für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe.
2. Beschreibung des Fachgebiets
Vor kurzem wurde bekannt, dass die Zunahme an Fettgewebe in der Bauchhöhle, insbesondere die Zunahme an Fettgewebe durch die Ansammlung von Fett in Fettgewebe, das um die Gefäße herum vorliegt, welche in die Pfortader münden, wie z. B. mesenterisches Fettgewebe oder omentales Fettgewebe, eng mit dem Ausbruch von Erkrankungen in Beziehung steht, einschließlich Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes, Hyperlipämie und Arteriosklerose sowie Herzgefäß-Erkrankungen wie z. B. Koronararterien-Erkrankungen, Angina und Myokardinfarkt („Naizo Shibogata Himan (Visceral Fatty-Type Obesity)", 1995, veröffentlicht durch lyaku Journal Ltd.) Um das Risiko für den Ausbruch solcher Erkrankungen vorhersagen zu können, besteht ein Bedarf für die Entwicklung eines analytischen Verfahrens, mit dem leicht und rasch die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe kontrolliert werden kann.
Die europäische Patentanmeldung EP 0 601 360 beschreibt einen Vorläufer-B-Zellen-stimulierenden Faktor, der die Bildung von Prä-B-Zellen fördert, sowie DNA-Sequenzen, die denselben codieren, und Verfahren für die Herstellung und Reinigung des Faktors. Die Anmeldung offenbart weiterhin, dass der Faktor für die Behandlung von hämatopoietischen Erkrankungen und bei der Knochenmarks-Transplantation verwendet werden kann.
Als Verfahren für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe wurde Ober ein Verfahren für die Abschätzung des Taille/Hüfte-Umfang-Verhältnisses (W/H ratio) als Indikator berichtet (J. Clin. Endocrinol. Metab. Bd. 54, S. 254, 1982), aber das W/H-Verhältnis liefert eine grobe Abschätzung für die Menge an Fett im gesamten Abdomenbereich und kann daher nicht eindeutig zwischen der Menge an subcutanem Fettgewebe und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe unterscheiden. Dementsprechend ist das Verfahren zur Abschätzung der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe unter Verwendung des W/H-Verhältnisses als Indikator nicht ausreichend exakt und ist als Verfahren für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe ungeeignet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Somit besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines analytischen Verfahrens mit dem leicht und rasch und mit zufriedenstellender Genauigkeit die Menge an intraabdominalem Fettgewebe kontrolliert werden kann.
Als Ergebnis von Untersuchungen unter diesen Begleitumständen und somit zu der vorliegenden Erfindung gelangend, haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass zwischen der Konzentration eines bestimmten Proteins im Blut und der Fläche an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Querschnitt des Abdomens eine direkte Beziehung bzw. eine positive Korrelation besteht. Daher kann die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe auf Grundlage der Konzentration dieses Proteins bestimmt werden.
Dies bedeutet, dass die vorliegende Erfindung folgendes bereitstellt:

1. Die Verwendung eines Proteins, welches die in SEQ ID NO:1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die in SEQ ID NO:1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe.
2. Die Verwendung nach vorstehendem Punkt 1, wobei die Menge an intraabdominalem Fettgewebe eine Menge von intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier darstellt, welche aus der Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle dieses Testtiers bestimmt wird, basierend auf der positiven Beziehung zwischen der Menge des intra-abdominalen Fettgewebes in einem Tier und der Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle dieses Tiers oder in einer zubereiteten Kontrolllösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Tiers.
3. Die Verwendung nach vorstehenden Punkten 1 und 2, wobei die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe eine Fläche (Bereich) des intraabdominalen Fettgewebes in einem Querschnitt (Abschnitt) des Abdomens ist.
4. Die Verwendung nach vorstehendem Punkt 2, wobei die positive Beziehung eine Beziehung ist, die sich als lineare Funktion einer korrelierenden Funktion ausdrückt.
5. Die Verwendung nach vorstehendem Punkt 2, wobei die Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Tiers oder in einer zubereiteten Kontrolllösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Tiers eine Konzentration ist, welche durch eine immunchemische Analyse bestimmt wird.
6. Die Verwendung nach vorstehendem Punkt 2, wobei die Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers eine Konzentration ist, welche durch immunchemische Analyse bestimmt wird.
7. Die Verwendung nach vorstehendem Punkt 2, wobei das Testtier ein Säuger ist.
8. Die Verwendung nach einem der vorstehenden Punkte 2 bis 6, wobei das Protein in der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers das Protein im Blut ist.
9. Die Verwendung nach einem der vorstehenden Punkte 1 bis 8, wobei das Risiko für den Ausbruch einer Krankheit, welche in enger Beziehung zu der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe steht, vorausgesagt wird, oder die Genesung von dieser Krankheit in einem Individuum beurteilt wird, basierend auf der Untersuchung der Erhöhung oder der Abnahme der Menge an intraabdominalem Fettgewebe des Individuums in einem vorher bestimmten Zeitabschnitt durch die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe.
10. Die Verwendung nach einem der vorstehenden Punkte 2 bis 9, wobei die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier eine Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier ist, die mit der Menge an intraabdominalem Fettgewebe in einem gesunden Tier derselben Spezies des Testtiers verglichen wird.
11. Einen Kit, umfassend als Standard für die Analyse der Menge an intraabdominalem Fettgewebe in einem Tier ein Protein, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, und ein Antikörper, der das Protein erkennt, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
12. Ein in vitro-Analyseverfahren zur Bestimmung der Menge an intraabdominalem Fettgewebe, umfassend die Bestimmung der Konzentration eines Proteins, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers, basierend auf der positiven Beziehung zwischen der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Tier und der Konzentration des Proteins in einer zubereiteten Kontrolllösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers.

Der weitere Schutzbereich der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der detaillierten Beschreibung deutlich werden, die hierin nachstehend bereitgestellt wird.
Überall in dieser Beschreibung und in den nachfolgenden Ansprüchen sollen das Wort „umfassen" und Variationen wie z. B. „umfasst" oder „umfassend" so verstanden werden, dass sie den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten aber nicht den Ausschluss einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten bedeuten, sofern der Zusammenhang dies nicht anders erfordert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Struktur des Expressionsplasmids pET11a085 für die Expression eines Proteins in E. coli, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die an der Position 27 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz beginnt. Der schattierte Bereich in der Zeichnung zeigt die Insertion, die das zu exprimierende Protein codiert.
2 zeigt die Ergebnisse des Nachweises eines Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut durch Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyseverfahren. In der Abbildung gibt der obere Pfeil den Startpunkt der Elektrophorese an und der untere Pfeil gibt das Ende der Elektrophorese an. Das Signal des immunpräzipitierten Proteins wurde mit einem Densitometer quantifiziert. Bahn 1, 0 ng antigenes Protein; Bahn 2, 0,2 ng antigenes Protein; Bahn 3, 0,5 ng antigenes Protein; Bahn 4, 1,0 ng antigenes Protein; Bahn 5, 2,0 ng antigenes Protein; Bahn 6, Blut aus dem untersuchten Individuum 1 und Bahn 7, Blut aus dem untersuchten Individuum 2.
3 ist eine Abbildung, die die Korrelation zwischen der Konzentration (ng/200 μl) des Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut (x) und der Fläche (cm²) des intra-abdominalen Fettgewebes (y) zeigt. Jeder Punkt (Messwert) stammt von einem anderen Individuum.
4 zeigt die Veränderung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut von 5 untersuchten Individuen, wie sie durch Enzym-Immun-Testansätze vor und nach einem vorher bestimmten Zeitabschnitt bestimmt wurde, sowie die Veränderung der Fläche an intra-abdominalem Fettgewebe. Die Balken Nr. 1 und 2 geben die Ergebnisse für das untersuchte Individuum 1 vor, beziehungsweise nach einem vorbestimmten Zeitraum von 28 Tagen an; die Balken Nr. 3 und 4 die Ergebnisse für das untersuchte Individuum 2 vor, beziehungsweise nach einem vorbestimmten Zeitraum von 49 Tagen; die Balken Nr. 5 und 6 die Ergebnisse für das untersuchte Individuum 3 vor, beziehungsweise nach einem vorbestimmten Zeitraum von 56 Tagen; die Balken Nr. 7 und 8 die Ergebnisse für das untersuchte Individuum 4 vor, beziehungsweise nach einem vorbestimmten Zeitraum von 63 Tagen und die Balken Nr. 9 und 10 die Ergebnisse für das untersuchte Individuum 5 vor, beziehungsweise nach einem vorbestimmten Zeitraum von 17 Tagen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hierin nachstehend wird die Erfindung in Einzelheiten beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich „die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe" auf die Menge an Fettgewebe in dem geraden Bauchmuskel, den äußeren und inneren schrägen Bauchmuskeln, dem transversalen Bauchmuskel, dem quadratischen Lendenmuskel, dem Lendenmuskel (Psoas major) und den inneren Teilen des Pyramidenmuskels. Als solches kann die Menge an intraabdominalem Fettgewebe die Gesamtmenge (z. B. Volumen oder Gewicht) an intraabdominalem Fettgewebe oder die Fläche an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Querschnitt des Abdomens umfassen, von der bekannt ist, dass sie zu der Gesamtmenge an intra-abdominalem Fettgewebe proportional ist (Int. J. Obesity, Bd. 17, S. 187, 1993). Die „Fläche an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Querschnitt des Abdomens" bezieht sich auf die Fläche, die das Fettgewebe im Abdomen einnimmt, das heißt in dem geraden Bauchmuskel, den äußeren und inneren schrägen Bauchmuskeln, dem transversalen Bauchmuskel, dem quadratischen Lendenmuskel, dem Lendenmuskel (Psoas major) und dem Pyramidenmuskel und die in einem aufgenommenen Bild eines Querschnitts des Abdomens erkannt werden kann, welches durch Verfahren erhalten werden kann, die in „Image Analysis Viewed from Symptoms" (zusammengestellt von der Japan Medical Association) beschrieben werden, wie z. B. der Computer-Tomographie (hierin nachstehend als CT-Scanning bezeichnet) (Visceral Fatty-Type Obesity, 1995, veröffentlicht von lyaku Journal Ltd.), der Ultraschall-Untersuchung und der Bildgebung durch magnetische Resonanz. Die Begriffe „Abdomen" oder „abdominal" beziehen sich auf einen Bereich, der üblicherweise für die Messung der Fläche des intra-abdominalen Fettgewebes untersucht wird, und grob gesprochen befindet sich dieser Bereich typischerweise über der Leiste und unter dem Zwerchfell, das die Grenze zur Brust bildet.
Das Protein, das bei dem in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in der Regel ein Protein, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, oder ein Protein, das durch einen Antikörper erkannt wird, der gegen dieses Protein gerichtet ist (nachstehend wird auf solche Proteine hierin allgemein als „das Protein der vorliegenden Erfindung" Bezug genommen). Spezifischere Beispiele für das Protein der vorliegenden Erfindung umfassen ein Protein, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, sowie Proteine, die durch einen Antikörper gegen ein Protein erkannt werden, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Bei diesen letzteren Proteinen kann es sich zum Beispiel um Proteine handeln, die die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen, in denen aber eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, ausgetauscht oder hinzugefügt wurden. Die Aminosäuresequenzen, in denen „Aminosäuren deletiert, ausgetauscht oder hinzugefügt wurden", umfassen typischerweise natürlich vorkommende Varianten des Proteins, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, wie z. B. solche, die durch intrazelluläre Prozessierung entstehen oder die durch einen Unterschied in der Art (Species) oder einen Unterschied zwischen Individuen oder Geweben, aus denen das Protein erhalten wurde.
Um die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier gemäß der vorliegenden Erfindung zu analysieren, basierend auf der Beziehung zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Tieres, bevorzugt eines Tieres, das zur gleichen Art (Species) wie das Testtier gehört, oder in einer zubereiteten Lösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines solchen Tiers – und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem solchen Tier, wird die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier üblicherweise aus der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers bestimmt. Die Körperflüssigkeiten aus einem Tier umfassen z. B. Blut, Urin, Speichel usw.; die Gewebe des Tieres umfassen z. B. intra-abdominales Fettgewebe wie z. B. mesenterisches Fettgewebe und omentales Fettgewebe; und die Zellen des Tieres umfassen z. B. Fettzellen, die in intra-abdominalem Fettgewebe vorhanden sind, wie z. B. in mesenterischem Fettgewebe und in omentalem Fettgewebe. Unter den vorstehend beschriebenen Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen eines Tieres kann Blut als das bevorzugte Beispiel erwähnt werden. Wenn gewünscht, kann darüber hinaus eine Kontrolllösung oder eine Testlösung hergestellt werden, indem die Körperflüssigkeiten, Gewebe und Zellen aus einem Tier einer Nachbehandlung unterworfen werden wie z. B. zerstörenden/aufbrechenden Behandlungen, die ein Gerät zum Zerstoßen wie z. B. einen Teflon-Homogenisator verwenden, oder einer Behandlung, bei der Feststoffe entfernt werden, welche eine Zentrifuge verwenden, wenn gewünscht.
Die Beziehung zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen eines Tieres oder in zubereiteten Lösungen aus den Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen eines solchen Tiers – und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in diesem Tier kann zum Beispiel wie folgt bestimmt werden: Die Konzentration(en) des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Kontrolllösung aus einem Kontrolltier, vorzugsweise in Kontrolllösungen aus mehreren Individuen von Kontrolltieren einer einzigen Art, wird z. B. durch eine immunchemische Analyse bestimmt, die nachstehend beschrieben wird. Nachdem die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Kontrolllösung bestimmt wurde, kann die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in jedem der Tiere z. B. als die Fläche an intraabdominalem Fettgewebe in einem Querschnitt des Abdomens bestimmt werden. Für die Quantifizierung einer solchen Fläche werden in der Regel Verfahren wie z. B.
CT-Scanning, Ultraschall-Untersuchung und Bildgebung durch Magnetresonanz verwendet. Noch spezifischer kann die Photographie eines Querschnitts des Abdomens durch CT-Scanning gemäß einem Verfahren durchgeführt werden, das in „Visceral Fatty-Type Obesity", veröffentlicht 1995 von lyaku Journal Ltd., beschrieben wird. Die Fläche, die der Photographie eines Querschnitts des Abdomens unterworfen wird, ist eine Fläche, die üblicherweise bei der Untersuchung der Menge des intra-abdominalen Fettgewebes gemessen wird, und kann eine genaue Bestimmung der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe liefern, bevorzugt handelt es sich um den Bereich des Nabels. Wenn die Konzentrationen des Proteins der vorliegenden Erfindung in Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen von Kontrolltieren oder in zubereiteten Lösungen aus den Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen der Kontrolltiere auf der x-Achse aufgetragen werden, und die Mengen an intra-abdominalem Fettgewebe, z. B. die Fläche an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Querschnitt des Abdomens, auf der y-Achse aufgetragen werden, ergibt sich eine direkte Beziehung oder eine positive Korrelation zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in den Kontrolllösungen und den Mengen an intra-abdominalem Fettgewebe. Die Vielzahl der so erhaltenen Punkte wird statistisch weiterverarbeitet, wobei die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Kontrolllösung und die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe als Variable ausgedrückt werden, die sich voreinander unterscheiden. In dieser Hinsicht kann für die Korrelation zwischen ihnen zum Beispiel eine lineare Funktion verwendet werden wie z. B. die Korrelation y = ax + b. Die Verlässlichkeit (d. h. der Koeffizient der Korrelation) dieser Korrelation verbessert sich mit der Zahl der Punkte (Messwerte). Noch spezifischer kann die Zahl der Messwerte z. B. etwa 50 bis 500 betragen, und beispielsweise kann ein Korrelationskoeffizient von etwa 0,7 aus etwa 100 Messwerten erhalten werden.
Um die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier zu bestimmen, wird die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus den Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen des Testtiers z. B. durch eine Anwendung bestimmt, wie sie nachstehend beschrieben wird. Die auf diese Weise bestimmte Konzentration wird in der vorstehend erhaltenen Korrelation, z. B. der Korrelation (Funktion) y = ax + b, als x eingesetzt, wodurch y als die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier berechnet werden kann.
Nachstehend wird hierin die Anwendung der vorliegenden Erfindung weiter beschrieben. Es ist bekannt, dass die exzessive Ansammlung von intraabdominalem Fettgewebe eng mit dem Ausbruch von Erkrankungen in Beziehung steht, einschließlich Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes, Hyperlipämie und Arteriosklerose, sowie mit Herzgefäß-Erkrankungen wie z. B. Herzkranzgefäß-Erkrankungen, Angina und Myokardinfarkt (Visceral Fatty-Type Obesity), 1995, veröffentlicht durch lyaku Journal Ltd.. Da die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Kontrolllösung in einer positiven Beziehung zu der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe steht, wie vorstehend beschrieben wurde, steht die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Kontrolllösung eng mit dem Ausbruch dieser Erkrankungen in Beziehung. Dementsprechend wird (1) die Zunahme oder die Abnahme der Menge an intraabdominalem Fettgewebe im gleichen Testtier über einen vorher bestimmten Zeitraum unter Verwendung des analytischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung bestimmt, (2) die Zunahme oder die Abnahme der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des gleichen Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers über einen vorher bestimmten Zeitraum bestimmt, (3) die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier unter Verwendung des in vitro-Analyseverfahrens der vorliegenden Erfindung bestimmt und dann mit der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem gesunden Tier der gleichen Art (Species) wie das Testtier verglichen oder (4) die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers wird mit der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines gesunden Tiers der gleichen Art wie das Testtier oder in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des gesunden Tiers verglichen, wodurch das Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen, die eng mit der Zunahme der Menge an intraabdominalem Fettgewebe in Beziehung stehen, vorhergesagt werden kann, oder wodurch eine Beurteilung über die Erholung von einer Krankheit in dem Testtier erfolgen kann.
Zum Beispiel wird die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier als eine zu Beginn vorhandene Menge durch das in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt. Nach einem vorher bestimmten Zeitraum, zum Beispiel nach einem Zeitraum von einem halben Monat oder länger, wird die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in demselben Testtier bestimmt und mit der zuvor vorhandenen Menge verglichen, so dass eine Zunahme oder eine Abnahme der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe im gleichen Testtier bekannt ist. Weiterhin gilt, dass, indem die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe im gleichen Testtier mehrere Male aufgezeichnet wird, zum Beispiel dreimal oder mehr, die Veränderung der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe im Laufe der Zeit im gleichen Testtier ebenfalls bestimmt werden kann. Dadurch kann das Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen vorhergesagt werden, die mit einer Erhöhung der Menge an intraabdominalem Fettgewebe in enger Beziehung stehen. Dies bedeutet, dass wenn sich die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier erhöht hat, ein höheres Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen vorhergesagt werden kann, wohingegen, wenn sich die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier vermindert hat, das Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen als geringer vorhergesagt werden kann. Natürlich kann die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen des Testtiers oder in zubereiteten Testlösungen aus den Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen des Testtiers direkt verwendet werden, und zwar anstelle der Menge an intraabdominalem Fettgewebe des Testtiers.
Die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier, wie sie durch die Verwendung des in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, kann auch als Fläche des intra-abdominalen Fettgewebes in einem Querschnitt des Abdomens ausgedrückt werden. Insofern kann das Risiko für den Ausbruch der Erkrankungen als hoch vorhergesagt werden, wenn diese Fläche größer als eine Standardfläche ist, die als Indikator für ein hohes Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen angesehen wird. Entsprechend kann das Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen als gering vorhergesagt werden, wenn die Fläche kleiner als die Standardfläche ist, die als Indikator für ein hohes Risiko für den Ausbruch der Erkrankungen angesehen wird. Die Standardfläche, die als Indikator für ein hohes Risiko für den Ausbruch von Erkrankungen angesehen wird, variiert in Abhängigkeit von der Art, dem Geschlecht und dem Alter des Testtiers sowie der Art der Erkrankung usw., aber die bevorzugte Standardfläche beim Menschen beträgt z. B. etwa 90 bis 130 cm².
Die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier oder die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus den Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zellen des Testtiers wie sie durch die Anwendung des analytischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, kann auch mit der durchschnittlichen Menge an intra-abdominalem Fettgewebe oder mit der durchschnittlichen Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in Testlösungen verglichen werden, die aus einer Population erhalten wurden, welche vorwiegend aus gesunden Individuen einer ähnlichen Art (Species) wie das Testtier, bevorzugt der identischen Art (oder einer identischen menschlichen Rasse, wenn es sich bei dem Testtier um Menschen handelt), des gleichen Geschlechts und eines ähnlichen Alters des Testtiers zusammengesetzt ist. Wenn der auf diese Weise für das Testtier erhaltene Wert größer als der Durchschnittswert ist, ist das Risiko für den Ausbruch der Erkrankungen in der Regel höher. Wenn der Wert des Testtiers z. B. zweimal größer als der Durchschnittswert ist, kann das Risiko für den Ausbruch der Erkrankungen als hoch vorhergesagt werden, und wenn der Wert dreimal größer als der Durchschnittswert ist, kann das Risiko für den Ausbruch der Erkrankungen als extrem hoch vorhergesagt werden, obwohl eine solche Vorhersage vor der Art der Erkrankung abhängig ist.
Das in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung wie es vorstehend beschrieben wurde, ist für die Kontrolle der Testtiere sehr nützlich, um ihre Gesundheit zu bewahren.
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier verwendet werden, das heißt einer Analyse des intra-abdominalen Fettgewebes, welche die Bestimmung der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier mittels der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers umfasst, und zwar basierend auf der positiven Beziehung zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Kontrolltier, um die Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Testtier zu analysieren.
Die Testtiere, bei denen das in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung und die Anwendung der vorliegenden Erfindung wie vorher beschrieben, anwendbar sind, umfassen z. B. Säuger und bevorzugt Menschen und Affen.
Bei dem in vitro-Verfahren oder bei der Verwendung des Proteins der Erfindung für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Messung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Tiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle dieses Tiers oder in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Testtiers kann es sich um jedes beliebige Verfahren handeln, das in der Lage ist, das Protein spezifisch zu identifizieren, wobei Beispiele dafür umfassen:

1) eine immunchemische Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein Protein, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
2) ein Verfahren, bei dem der Überstand, der durch Zentrifugation einer Kontrolllösung oder einer Testlösung erhalten wurde, mittels Flüssigkeits-Chromatographie aufgetrennt wird, wodurch im Überstand enthaltene Proteine voreinander getrennt und fraktioniert werden, und das Protein der vorliegenden Erfindung mittels Massenspektroskopie identifiziert und quantifiziert wird;
3) ein Verfahren, bei dem eine Kontrolllösung oder eine Testlösung zur Entfernung von überflüssigen Proteinen wie z. B. Albumin und Immunglobulin vorbehandelt wird, und dann einer zweidimensionalen Elektrophorese unterworfen wird, wobei die Bestandteile in der Kontrolle auf Grundlage der Unterschiede in den isoelektrischen Punkten und den Molekulargewichten der Proteine in zwei Dimensionen aufgetrennt und entwickelt werden, um einen Fleck (spot) des Proteins der vorliegenden Erfindung zu identifizieren und zu quantifizieren (Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics, S. 190, 1997, veröffentlicht von Springer-Verlag); und
4) ein Verfahren, in dem Moleküle (DNA, RNA, Protein, niedermolekulare Verbindungen usw.), die in der Lage sind, das Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch zu erkennen, aus einer molekularen Bank/Sammlung ausgewählt werden, welche in zufälliger Weise synthetisiert wurde, und wobei, basierend auf der Spezifität und Affinität des Proteins der vorliegenden Erfindung für diese Moleküle, das Protein der vorliegenden Erfindung von einer Kontrolllösung oder von einer Testlösung spezifisch abgetrennt und quantifiziert wird.

Unter diesen vorstehend erwähnten Verfahren wird die immunchemische Analyse nachstehend in Einzelheiten als spezifischeres Beispiel beschrieben.
(1) Herstellung des Antigens
Für die Herstellung eines Antikörpers, der bei der immunchemischen Analyse verwendet werden kann, wird zuerst ein Antigen hergestellt. Als Antigen kann ein Protein verwendet werden, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst (hierin nachstehend als antigenes Protein bezeichnet).
Das antigene Protein kann in großen Mengen durch herkömmliche gentechnische Verfahren (z. B. Verfahren, die durch J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis in „Molecular Cloning", 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben werden) hergestellt und erhalten werden, dies erfolgt unter Verwendung eines Gens, welches das antigene Protein codiert, wie zum Beispiel einer DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und spezifischer einer DNA, die die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst. Noch genauer wird ein Plasmid hergestellt, das in der Lage ist, ein Gen, welches das antigene Protein codiert, in Wirtszellen zu exprimieren, in Wirtszellen transformiert und die so erhaltene Transformante wird angezogen.
Beispiele für solche Wirtszellen umfassen eukaryontische und prokaryontische Mikroorganismen oder Tierzellen wie z. B. Säuger- und Insektenzellen, und bevorzugt umfassen sie E. coli.
Bei dem Plasmid handelt es sich um eines, das sich autonom vermehren kann und das die genetische Information enthält, um sich in den Wirtszellen replizieren zu können, und vorzugsweise können die Plasmide aus den Wirtszellen auch leicht isoliert und gereinigt werden, enthalten einen Promotor, der in der Lage ist, in den Wirtszellen zu funktionieren, und besitzen ein Gen, welches das antigene Protein codiert, wobei dieses Gen in einen Expressionsvektor eingebracht wird, der einen nachweisbaren Marker enthält. Eine Vielzahl von Expressionsvektoren ist kommerziell erhältlich und zum Beispiel sind Expressionsvektoren, die einen Promotor wie z. B. lac, trp oder tac enthalten, die für die Expression in E. coli verwendet werden können, z. B. von Pharmacia und Takara Shuzo Co., Ltd. kommerziell erhältlich. Restriktionsenzyme, die für die Einbringung des Gens, welches das antigene Protein codiert, in den Expressionsvektor verwendet werden, sind ebenfalls z. B. von Takara Shuzo Co., Ltd. kommerziell erhältlich. Weiterhin kann eine Ribosomenbindestelle an einen Bereich ligiert werden, der stromaufwärts des Gens liegt, welches das antigene Protein codiert, so dass in einigen Fällen eine höhere Expression erreicht werden kann. Die Ribosomenbindestelle ist gemäß einer Veröffentlichung von Guarente, L. et al., (Cell 20, 543 (1980)) oder eines Berichts von Taniguchi et al. (Gentics of Industrial Microorganisms, S. 202 (1982), veröffentlicht durch Kodansha) bekannt.
Das so erhaltene Plasmid kann in die Wirtszellen unter Verwendung der üblichen gentechnischen Verfahren eingebracht werden.
Die Kultur der Wirtszellen kann mittels herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, die für mikrobielle Kulturen angewendet werden. So können die Wirtszellen zum Beispiel in einem Medium angezogen werden, das geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Spuren-Nährstoffe wie z. B. Vitamine enthält. Das Anzuchtverfahren kann entweder auf festem oder in flüssigem Medium durchgeführt werden, bevorzugt handelt es sich um eine Schüttelkultur unter Belüftung.
Aus den so erhaltenen Wirtszellen kann das antigene Protein durch eine Kombination von Verfahren hergestellt werden, die üblicherweise bei der Isolierung und Reinigung von gewöhnlichen Proteinen angewendet werden. Zum Beispiel kann das antigene Protein nach der Kultur durch die Sammlung der Wirtszellen in einer Zentrifuge, Lyse oder Durchführung einer Bacteriolyse der Wirtszellen, einer fakultativen Solubilisierung des antigenen Proteins und der Durchführung einer Kombination verschiedener chromatographischer Schritte wie z. B. Ionenaustausch-, hydrophobe und Gelfiltrations-Chromatographie gereinigt werden. Falls nötig können darüber hinaus Arbeitsschritte zur Rückfaltung der Struktur des Proteins durchgeführt werden.
Für die Herstellung des Antikörpers, der bei der vorstehend beschriebenen immunchemischen Analyse verwendet wird, kann ein Antigen, das nach den folgenden Verfahren hergestellt wurde, ebenfalls verwendet werden. Beispiele für diese Verfahren umfassen ein Verfahren, bei dem ein antigenes Peptid, das eine bestimmte Teil-Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung enthält, in den polymeren Zustand überführt wird, oder ein Verfahren, bei dem das antigene Peptid direkt oder indirekt über einen Abstandshalter (Spacer) an einen hochmolekularen Träger gebunden wird, um einen Komplex zu bilden. Bei diesen Verfahren handelt es sich in der Regel um solche, bei denen das antigene Peptid, das aufgrund des niedrigen Molekulargewichts teilweise antigen wirkt, das heißt ein „unvollständiges" Antigen darstellt, in ein „vollständiges" Antigen überführt wird, indem sein Molekulargewicht erhöht wird. Nachstehend wird hierin ein Verfahren für die Überführung eines antigenen Peptids in ein vollständiges Antigen beschrieben.
Das antigene Peptid kann z. B. unter Verwendung eines Verfahrens für die Vorhersage eines Epitops in einem Protein ausgewählt werden wie es in „Experimental Protocols an Anti-Peptide Antibody", veröffentlicht durch Shujunsha, beschrieben wird. In der Regel wird ein Peptid, das aus 10 bis 20 Aminosäuren besteht, als antigenes Peptid ausgewählt. Bei diesem verwendeten antigenen Peptid, das eine Teil-Aminosäuresequenz enthält, handelt es sich bevorzugt um ein Peptid mit einem hohen Reinheitsgrad, und seine Synthese und Reinigung werden ebenfalls in „Experimental Protocols an Anti-Peptide Antibody", veröffentlicht durch Shujunsha, beschrieben. Falls nötig, kann das Peptid zum Beispiel zuvor durch übliche Verfahren wie z. B. hochauflösende Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt werden.
Das Verfahren für die Überführung des antigenen Peptids in einen polymeren Zustand umfasst z. B. das MAP- (multiple antigen peptide) Verfahren, das von Tam et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5409, 1988) entwickelt wurde. Gemäß diesem Verfahren wird ein Lysin-Rest an den C-Terminus des antigenen Peptids im Verlauf seiner Synthese angehängt, und das Peptid wird der Reihe nach unter Verwendung der α- und der ε-Aminogruppe des Lysins verzweigt, um das antigene Peptid in einen polymeren Zustand zu überführen, so dass die Antigenität des Peptids gesteigert wird. Da verschiedene Arten von bereits verzweigten und an Lysin gebundenen Harzen für das MAP-Verfahren kommerziell erhältlich sind, kann jede Aminosäure in dem antigenen Peptid, das eine Teil-Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenz des antigenen Proteins enthält, der Reihe nach an ein solches Harz unter Verwendung herkömmlicher Peptidsynthese-Verfahren angefügt werden, um die Peptidkette zu verlängern.
Bei dem Verfahren, bei dem das antigene Peptid, das eine bestimmte Teil-Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenz des antigenen Proteins enthält, direkt oder indirekt über einen Abstandshalter an ein hochmolekulares Trägermolekül gebunden wird, um einen Komplex zu bilden, kann das hochmolekulare Trägermolekül, das für die Bindung des antigenen Peptids verwendet wird, reaktionsfähige Gruppen enthalten, die für eine Verknüpfungsreaktion mit dem antigenen Peptid, das eine bestimmte Aminosäuresequenz enthält, oder mit einer Verbindung, an die ein Abstandshalter gebunden ist, (hierin nachstehend werden beide zusammen als unvollständiges Antigen bezeichnet) frei verfügbar sind, und in der Lage sein, ihnen Immunogenität (antigene Eigenschaften) zu verleihen oder in der Lage sein, die ursprüngliche Immunogenität des antigenen Peptids durch die Verknüpfung mit dem unvollständigen Antigen zu erhöhen. Eine makromolekulare Verbindung, die frei verfügbare reaktionsfähige Aminogruppen enthält, wird besonders bevorzugt. Beispiele für solche makromolekularen Verbindungen umfassen mit Lysin angereicherte Proteine, die Molekulargewichte von etwa 10.000 bis 150.000 aufweisen. Noch spezifischer umfassen solche makromolekularen Verbindungen Rinder-Serumalbumin (BSA: Molekulargewicht 66.200), menschliches Serumalbumin (HSA: Molekulargewicht 58.000), Kaninchen-Serumalbumin (RSA: Molekulargewicht 68.000), Ziegen-Serumalbumin (GSA: Molekulargewicht 68.000) und Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH: Molekulargewicht > 1.000.000). Andere makromolekulare Verbindungen, welche die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllen, können ebenfalls als Trägermoleküle verwendet werden, und solche Verbindungen umfassen z. B. Schweine-Thyroglobulin, B2-Mikroglobulin, Hämocyanin, Immunglobuline, Toxine (Cholera-Toxin, Tetanus-Toxin, Diphtherie-Toxin usw.), Polysaccharide, Liposaccharide, natürlich vorkommende oder synthetische Polyadenylsäure und Polyuridylsäure, Polyalanyl- und Polylysin-Polypeptide oder zelluläre Membranbestandteile wie z. B. mit Formalin oder mit Glutaraldehyd behandelte Erythrocyten-Membranen.
Bei dem Verfahren für die Bindung des unvollständigen Antigens an das vorstehend beschriebene hochmolekulare Trägermolekül kann es sich um ein Verfahren handeln, bei dem die Region der bestimmten Aminosäuresequenz des unvollständigen Antigens frei verfügbar sein kann, so dass eine spezifische Immunantwort induziert werden kann, das heißt, dass die Bildung eines spezifischen Antikörpers induziert wird. Noch spezifischer wird zum Beispiel bevorzugt, dass (1) ein unvollständiges Antigen ausgewählt wird, in dem die bestimmte Aminosäuresequenz so nahe wie möglich an der äußeren Oberfläche davon lokalisiert ist, und (2) die Stelle, an der die bestimmte Teil-Aminosäuresequenz des ausgewählten unvollständigen Antigens lokalisiert ist, sich so weit wie möglich an der äußersten Oberfläche des hochmolekularen Trägermoleküls befindet.
Wenn es sich bei der reaktionsfähigen Gruppe in dem unvollständigen Antigen um eine reaktionsfähige Aminogruppe handelt, wird die reaktionsfähige Gruppe des Abstandshalters an eine der reaktionsfähigen Aminogruppen des hochmolekularen Trägermoleküls unter Verwendung eines Dialdehyds wie z. B. Glutaraldehyd gebunden. Wenn es sich bei der reaktionsfähigen Gruppe in dem unvollständigen Antigen um eine reaktionsfähige SH-Gruppe handelt, wird die reaktionsfähige Gruppe des unvollständigen Antigens unter Verwendung von z. B. einer Oxidationsreaktion an eine der reaktionsfähigen SH-Gruppen des hochmolekularen Trägermoleküls gebunden. Wenn es sich bei der reaktionsfähigen Gruppe in dem unvollständigen Antigen um eine reaktionsfähige Carboxygruppe handelt, wird die reaktionsfähige Gruppe in dem unvollständigen Antigen an eine der reaktionsfähigen Aminogruppen des hochmolekularen Trägermoleküls unter Verwendung von z. B. Carbodiimid, bevorzugt 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid gebunden. Beispielsweise kann ein unvollständiges Antigen, das eine reaktionsfähige Carboxygruppe enthält, mit einer reaktionsfähigen Aminogruppe des hochmolekularen Trägermoleküls z. B. über ein Aktiv-Ester-Verfahren gebunden werden, das durch H. Hosoda et al. in Chem. Pharm. Bull. 31 (11), 4001-4007 (1983) beschrieben wurde, oder durch ein Verfahren mit einem gemischten sauren Anhydrid, das durch B.F. Erlanger et al. in J. Biol. Chem. 234, 1090-1094 (1959) beschrieben wurde.
Der Abstandshalter, der bei einer indirekten Verbindung über einen Abstandshalter verwendet wird, ist eine Verbindung, die eine oder mehrere Arten von reaktionsfähigen Gruppen enthält, welche in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit einer frei verfügbaren reaktionsfähigen Gruppe des hochmolekularen Trägermoleküls zu bilden. Ein Beispiel für einen Abstandshalter ist eine Verbindung, die 2 bis 16 vernetzende Kohlenstoffatome und eine oder mehrere reaktionsfähige Gruppen enthält, wie z. B. eine Aminogruppe, eine Carboxygruppe, eine Maleimid-Gruppe oder eine SH-Gruppe. Noch spezifischer stellt eine Verbindung mit der allgemeinen Formel H₂N(CH₂)_nCOOH (n ist eine ganze Zahl zwischen 2 und 16) ein bevorzugtes Beispiel dar. Die Verknüpfung des Abstandshalters mit dem antigenen Peptid, das eine bestimmte Aminosäuresequenz enthält, kann auf ähnliche Weise durchgeführt werden, wie das vorstehend beschriebene Verfahren für die Bindung einer reaktionsfähigen Gruppe des unvollständigen Antigens an eine der reaktionsfähigen Gruppen des hochmolekularen Trägermoleküls.
(2) Schritt der Immunisierung und der Sensitivierung von Säugern und Herstellung eines Antikörpers
Das so erhaltene Antigen wird verwendet, um Säuger zu immunisieren, wie z. B. Mäuse, Hamster, Meerschweinchen, Hühner, Ratten, Kaninchen und Hunde, dies erfolgt gemäß der üblichen Immunisierungs- und Sensitivierungs-Verfahren, die z. B. durch W.H. Newsome et al. in J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70 (6), 1025-1027 (1987) beschrieben werden. Das Antigen kann einmalig oder mehrere Male verabreicht werden.
Das Antigen wird bevorzugt 3- oder 4-mal in Zeitabständen von 7 bis 30 Tagen, insbesondere 12- bis 16-tägigen Intervallen, verabreicht. Die Dosis des Antigens beträgt zum Beispiel etwa 0,05 bis 2 mg Antigen bei jeder Verabreichung. Die Art der Verabreichung kann ausgewählt werden unter einer subcutanen Verabreichung, einer intracutanen Verabreichung, einer intraabdominalen Verabreichung, einer intravenösen Verabreichung und einer intramuskulären Verabreichung, und eine Injektion, die intravenös, intraabdominal oder subcutan verabreicht wird, ist eine bevorzugte Form der Verabreichung. Darüber hinaus wird eine Kombination der subcutanen Injektion und der intraabdominalen Injektion besonders bevorzugt. In solchen Fällen wird das Antigen üblicherweise verwendet, nachdem es in einem geeigneten Puffer gelöst wurde, wie zum Beispiel in Natriumphosphat-Puffer oder in physiologischer Kochsalzlösung, der/die ein üblicherweise verwendetes Adjuvans enthält, wie z. B. komplettes Freundsches Adjuvans (ein Gemisch von Aracel A, Bayol F und abgetöteten Tuberkulose-Bazillen), das RAS-Adjuvans-System [MPL (Monophosphoryl-Lipid A) + TDM (synthetisches Trehalose-dicorynomycolat) + CWS (Zellwandskelett)] oder Aluminiumhydroxid. In Abhängigkeit von der Art der Verabreichung oder den Bedingungen, sollten die vorstehend beschriebenen Adjuvantien jedoch nicht verwendet werden. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Adjuvans" einen Stoff, der nach der Verabreichung mit dem Antigen die Immunreaktion gegen das Antigen unspezifisch steigert.
Nachdem der Säuger einen halben bis 4 Monate keine Verabreichung des Antigens erhielt, wird eine kleine Menge Blut z. B. aus einer Ohrvene des Säugers entnommen und der Titer des Antikörpers wird gemessen. Wenn der Antikörper-Titer steigt, wird die Verabreichung des Antigens die je nach Fall erforderlichen Male wiederholt. So kann zum Beispiel das Antigen 1- bis 5-mal in einer Dosis von 100 μg bis 1 mg bei jeder Verabreichung verabreicht werden. Ein oder zwei Monate nach der letzten Verabreichung wird das Blut auf die übliche Weise von dem immunisierten und sensitivierten Tier gesammelt, und durch Trennung und Reinigung des Blutes mittels herkömmlicher Verfahren wie z. B. durch Sedimentation mittels Zentrifugation oder durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat oder Polyethylenglycol und durch Chromatographie wie z. B. Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Antikörper als polyclonales Antiserum erhalten werden. Darüber hinaus kann das Antiserum z. B. einer 30-minütigen Behandlung bei 56°C unterworfen werden, um das Komplementsystem zu inaktivieren.
Des Weiteren können immunkompetente B-Zellen aus dem vorstehend beschriebenen immunisierten und sensitivierten Säuger isoliert werden, und diese immunkompetenten Zellen können mit Tumorzellen fusioniert werden, die zur kontinuierlichen Zellteilung fähig sind, und anschließend werden die fusionierten Zellen isoliert. Nach einer Durchmusterung werden die Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper herstellen, cloniert, und die Hybridomzellen werden in vitro oder in vivo angezogen, um einen monoclonalen Antikörper herzustellen, wodurch auch ein Antikörper hergestellt werden kann, der einen hohen Grad an Spezifität und Affinität aufweist.
(3) Quantifizierung des Proteins der vorliegenden Erfindung mit Hilfe des Antikörpers
Das in vitro-Verfahren oder die Verwendung des Proteins der Erfindung zur Herstellung einer diagnostischer Zusammensetzung für die Messung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung mit Hilfe des auf diese Weise hergestellten Antikörpers wird durch Bezugnahme auf die folgenden typischen Beispiele beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können als Antikörper, die bei den folgenden Verfahren für die Quantifizierung des Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Moleküle verwendet werden, die eine Antikörper-Aktivität aufweisen, wie z. B. ein polyclonaler oder ein monoclonaler Antikörper, jede beliebige Klasse oder Unterklasse eines Antikörpers sowie Fab- und Fab'-Fragmente.
(A) Immunblot-Verfahren
Bei Immunblot-Verfahren wird das Protein der vorliegenden Erfindung, das an einen festen Träger gebunden ist, durch einen Antikörper gegen das Protein erkannt (hierin nachstehend wird auf diesen Antikörper als „primärer Antiköper" Bezug genommen) und der Antikörper wird nachgewiesen. Das Prinzip und die Durchführung eines solchen Verfahrens werden z. B. in: Antibodies – A Laboratory Manual, S. 471 (1988, Cold Spring Harbor Laboratory) beschrieben.
Als fester Träger wird im Allgemeinen Nitrocellulose verwendet, die in Form einer Membran, eines Blattes, eines Filters usw. vorliegt, aber für die festen Träger besteht keine besondere Einschränkung, sofern das Protein der vorliegenden Erfindung sich gut an sie anheften kann und die festen Träger die Antigenität des Proteins der vorliegenden Erfindung nicht eliminieren. Wenn eine Nitrocellulosemembran verwendet wird, wird eine Lösung, die durch Verdünnung des Proteins der vorliegenden Erfindung bis zu einer geeigneten Konzentration mit einem geeigneten Puffer wie z. B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung erhalten wurde, auf die Nitrocellulosemembran aufgetragen, wodurch das Protein der vorliegenden Erfindung an die Nitrocellulosemembran gebunden wird. Die Menge des für die Quantifizierung aufgetragenen Flecks beträgt bevorzugt 1 μl/3 mm², oder es handelt sich um eine Menge, bei der der primäre Antikörper im Überschuss vorliegt. Um zu ermöglichen, dass das Protein der vorliegenden Erfindung durch den primären Antikörper erkannt werden kann, wird bevorzugt, die Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, z. B. mit 0,1% (Gew./Vol.) SDS zu behandeln oder 0,1% (Gew./Vol.) SDS in den Puffer mit einzuschließen, der bei der Bindung an die Nitrocellulosemembran verwendet wird. Alternativ wird eine Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, mit einem geeigneten Puffer wie z. B. Phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und durch eine Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel geeigneter Konzentration aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wird das Protein der vorliegenden Erfindung durch ein Elektro-Blot-Verfahren oder durch ein halb-trockenes Blot-Verfahren (Bio Experiment Illustrated 5, S. 105, veröffentlicht durch Shujyunsha) auf eine geeignete Membran wie z. B. Hybond-N (Amersham) übertragen.
Um zu verhindern, dass sich der Antikörper auf der Nitrocellulosemembran mit dem auf diese Weise aufgetragenen Protein der vorliegenden Erfindung oder auf der Nitrocellulosemembran, auf die das Protein der vorliegenden Erfindung durch Elektrophorese übertragen wurde, an Stellen, die das Protein der vorliegenden Erfindung nicht enthalten, unspezifisch anheftet, wird die Nitrocellulosemembran, an die das Protein der vorliegenden Erfindung gebunden wurde, etwa 20 Minuten bis 24 Stunden bei Zimmertemperatur bis 37°C in einer Lösung inkubiert, die hochmolekulare Trägermoleküle enthält, welche durch den primären Antikörper nicht erkannt werden, das heißt Gelatine, Magermilch oder hochmolekulare Trägermoleküle (z. B. Serumalbumin aus einer anderen Tierart wie z. B. Ziege oder Rind), und welche unter den hochmolekularen Trägermolekülen, die bei dem Schritt der Überführung des antigenen Peptids, das eine bestimmte Aminosäuresequenz aufweist, zu einem vollständigen Antigen, verwendet werden können, bei der Herstellung des primären Antikörpers nicht verwendet wurden, so dass die Oberfläche der Nitrocellulosemembran mit den hochmolekularen Trägermolekülen besetzt wird. Nach der Inkubation wird die Nitrocellulosemembran gewaschen, um die vorstehenden hochmolekularen Trägermoleküle in den freien Zustand zu überführen und zu entfernen. Die so hergestellte Nitrocellulosemembran wird mit einer zubereiteten Lösung gemischt, die den primären Antikörper enthält, und dann 10 Minuten bis 3 Stunden bei Zimmertemperatur bis 37°C unter Rühren inkubiert. Die zubereitete Lösung, die den primären Antikörper enthält, bezieht sich auf eine zubereitete Lösung, in der der primäre Antikörper in freier Form in destilliertem Wasser oder in einer Lösung wie z. B. einem Puffer oder in Kochsalzlösung vorliegen kann. Auf diese Weise kann das Protein der vorliegenden Erfindung durch den primären Antikörper erkannt werden. Nachstehend wird hierin das Verfahren für den Nachweis des Antikörpers beschrieben.
Wenn der primäre Antikörper mit einem Enzym wie z. B. Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase markiert wurde, wird der in freier Form vorliegende primäre Antiköper nach der Inkubation durch Waschen entfernt, ein Substrat für das vorstehend erwähnte und zur Markierung eingesetzte Enzym zugegeben und mit dem Enzym zur Reaktion gebracht, und die Reaktion wird unter Verwendung der Farbreaktion gemessen, wobei der primäre Antikörper nachgewiesen wird. Wenn der primäre Antikörper zum Beispiel mit Peroxidase markiert wurde, ergibt eine Kombination aus Wasserstoffperoxid als Substrat und Diaminobenzidin oder o-Phenylendiamin als Farbreagenz eine braune oder gelbe Färbung, und daher kann die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung durch die Quantifizierung der Extinktion bei einer Wellenlänge bestimmt werden, die dieser Färbung entspricht. Für ein alternatives Verfahren zum Nachweis eines mittels Peroxidase markierten Antigen-Antikörper-Komplexes ist das ECL-Nachweis-System (Clin. Chem. Bd. 25, S. 1531, 1979) (Amersham) kommerziell verfügbar, durch das ein Signal des angezielten Antigens auf einem Röntgenfilm durch Chemilumineszenz nachgewiesen werden kann. Bei einem solchen Verfahren kann das Signal, das auf dem Röntgenfilm nachgewiesen wird, mit einem Densitometer quantifiziert werden. Im dem Fall, dass der primäre Antikörper mit Glucoseoxidase markiert wurde, wird z. B. 2,2'-Azido-di-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) verwendet. In dem Fall, in dem der primäre Antikörper mit Biotin markiert wurde, kann Streptavidin verwendet werden, das eine hohe Affinität für Biotin besitzt, um ein Signal des Antigens durch eine ähnliche Farbreaktion nachzuweisen, wie bei einem primären Antikörper, der mit einem Enzym markiert wurde.
Wenn ein Enzym-markierter sekundärer Antikörper verwendet wird, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet, wird der primäre Antikörper, der in freier Form vorliegt, nach der Inkubation durch Waschen entfernt, und anschließend wird die Membran mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Dieser sekundäre Antikörper, der zum Beispiel mit einem Enzym markiert ist, ist ein Antikörper gegen den primären Antikörper und er ist mit einem Enzym wie z. B. Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase markiert, oder es handelt sich um einen Antikörper gegen den primären Antikörper, der mit Biotin markiert ist. Noch spezifischer gilt, dass wenn ein Kaninchen-Antiserum als primärer Antikörper verwendet wird, es sich bei dem sekundären Antikörper bevorzugt z. B. um mit Peroxidase markiertes Anti-Kaninchen-Immunglobulin-(IgG)-Esel-Immunglobulin (IgG) oder um Anti-Kaninchen-Immunglobulin-(IgG)-Ziegen-Immunglobulin (IgG) handeln sollte. Anti-Kaninchen-IgG-Esel-IgG oder Anti-Kaninchen-IgG-Ziegen-IgG sind leicht kommerziell erhältlich. Als Verfahren zum Nachweis dieser sekundären Antikörper kann ein ähnliches Verfahren wie zum Nachweis des primären Antiköpers verwendet werden, wie es vorstehend beschrieben wurde. Darüber hinaus kann mit ¹²⁵I-markiertes Protein A (Amersham) ebenfalls als sekundären Antikörper verwendet werden. Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit des Proteins A, sich an Antikörper binden zu können, so dass das Signal auf einem Röntgenfilm nachgewiesen und mit Hilfe eines Densitometers quantifiziert werden kann.
(B) Trennung durch Immunpräzipitation
Bei dem Verfahren der Immunpräzipitation wird das Protein der vorliegenden Erfindung durch den primären Antikörper erkannt, der so erhaltene Immunkomplex, der den Antikörper und das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, wird gereinigt, um das Protein der vorliegenden Erfindung abzutrennen und werden Verfahren wie z. B. Gelelektrophorese, Enzymaktivitätsmessungen und Immunblot-Verfahren für die Quantifizierung des Proteins der vorliegenden Erfindung angewendet.
Zuerst wird eine Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, mit dem primären Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung etwa 1 bis 24 Stunden bei 4°C unter Rühren gemischt, wodurch ein Immunkomplex gebildet wird. Das Mischungsverhältnis von Probe zu primärem Antikörper beträgt etwa 1: 8, kann jedoch in Abhängigkeit von der Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung variieren. Es wird bevorzugt, dass die Probe vorher mit 0,1% (Gew./Vol.) SDS behandelt wird.
Dann wird ein sekundäres Reagenz, das in der Lage ist, an den primären Antikörper spezifisch zu binden und den primären Antikörper und das Protein der vorliegenden Erfindung, an das der primäre Antikörper spezifisch gebunden hat, von der Lösung abzutrennen, dem gebildeten Immunkomplex hinzugefügt, sofern dies nötig ist, und das so erhaltene Gemisch wird inkubiert, wodurch ein Komplex gebildet wird, der den Immunkomplex und das sekundäre Reagenz enthält, und der dann zurück gewonnen werden kann. Das sekundäre Reagenz umfasst zum Beispiel Antikörper-bindende Proteine, die auf Bakterienzellwänden lokalisiert sind, wie z. B. Protein A und Protein G, oder Anti-Immunglobulin-Antikörper. Wenn ein sekundäres Reagenz verwendet wird, das zuvor an einen unlöslichen Träger gebunden wurde, kann der Komplex, der den Immunkomplex und das sekundäre Reagenz enthält, sehr leicht durch Zentrifugation und Waschungen zurück gewonnen werden. Alternativ kann, ohne dass das sekundäre Reagenz wesentlich verwendet wird, ein primärer Antikörper, der direkt an einen unlöslichen Träger gebunden ist, einer Probenlösung hinzu gegeben werden, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, und das Protein der vorliegenden Erfindung, das auf diese Weise in einen unlöslichen Zustand überführt wurde, kann zurück gewonnen werden. Die unlöslichen Träger können ein Vierzahl von Entwürfen und Formen aufweisen, die von dem spezifischen beabsichtigten Verwendungszweck abhängen. So können zum Beispiel Kügelchen, Plättchen, Kugeln, Platten, kleine Stäbchen, Zellen, kleine Fläschchen, kleine Röhrchen, Fasern und Netze als unlösliche Träger erwähnt werden. Spezifischere Beispiele umfassen Kügelchen (z. B. Sepharose, Bio-Gel usw.), die aus Polysacchariden wie z. B. aus Agarose bestehen, und Mikrotiterplatten, die aus durchsichtigen Plastikmaterialien wie z. B. aus Polyvinylchlorid oder Polystyrol bestehen, sowie kleine Kügelchen, Röhrchen oder Stäbchen, die aus Polystyrol und Polystyrol-Latex bestehen. Auf Agarose basierende Kügelchen wie z. B. durch Bromcyan aktivierte Sepharose und Affi-Gel, auf Cellulose basierende Kügelchen und auf Polyacrylamid basierende Kügelchen sind zum Beispiel kommerziell erhältlich und die funktionellen Gruppen auf den Kügelchen sind bereits zuvor aktiviert worden, so dass das sekundäre Reagenz oder der primäre Antikörper durch eine Kopplungsreaktion direkt daran gebunden werden kann (Affinity Chromatography, veröffentlicht von Pharmacia, oder Nature, Bd. 214, S.1302, 1967). Darüber hinaus sind bereits an Agarose-Kügelchen gebundenes Protein A und Protein G ebenfalls kommerziell erhältlich.
Anschließend wird das Protein der vorliegenden Erfindung von dem zurück gewonnenen Komplex durch Verfahren wie z. B. eine Hitzebehandlung oder eine Flution mit einem Puffer mit einem niedrigen pH-Wert freigesetzt." Dann liegt das Protein der vorliegenden Erfindung in freier Form vor und kann durch Verfahren wie z. B. Gelelektrophorese, Enzymaktivitätsmessungen und Immunblot-Verfahren nachgewiesen und quantifiziert werden.
(C) Enzym-Immun-Testansätze
Enzym-Immun-Testansätze (bzw. -Assays) umfassen z. B. ein Sandwich-Verfahren und einen kompetitiven Testansatz. Bei dem Sandwich-Verfahren erlaubt man einer Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, mit dem auf einem festen Träger gebundenen primären Antikörper zu reagieren, freie Bestandteile, die nicht an den festen Träger gebunden sind, werden durch Waschen entfernt und die Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung, das einen Antigen-Antikörper-Komplex auf dem festen Träger gebildet hat, wird mit einem markierten sekundären Antikörper oder mit einem markierten Antikörper, der an den sekundären Antikörper spezifisch bindet, quantifiziert, wodurch die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Probe bestimmt wird.
Bei dem kompetitiven Testansatz wird das Antigen oder der primäre Antikörper, die an einen festen Träger gebunden sind, so zur Reaktion gebracht, dass das Antigen mit einer Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung und den primären Antikörper enthält, kompetitiv umgesetzt wird, und wird der primäre Antikörper mit der Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung und freies kompetitives Antigen enthält, kompetitiv umgesetzt. Danach werden die freien Bestandteile, die nicht an den festen Träger gebunden haben, durch Waschen entfernt. Die Menge des Antikörpers oder des kompetitiven Antigens, die einen Antigen-Antikörper-Komplex auf dem festen Träger gebildet haben, wird mittels des Enyzm-Moleküls, mit dem der Antikörper markiert worden war, quantifiziert, oder das Antigen wird mittels eines markierten sekundären Antikörpers, der an den primären Antikörper spezifisch bindet, wodurch die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Probe bestimmt wird.
Die Prinzipien und die detaillierten Vorschriften für solche Verfahren werden in „Seikagaku Jikkenho 11 (Biochemical Experimental Method 11) (Tokyo Kagaku Dojin Ltd.) und in Methods in Enzymology, Bd. 70, (Academic Press) beschrieben.
Der Sandwich-Testansatz wird unter Bezugnahme auf das folgende typische Beispiel näher beschrieben.
Der primäre Antikörper kann direkt an einen festen Träger gebunden werden, oder indirekt über einen Abstandshalter (Spacer) oder über ein hochmolekulares Trägermolekül, das durch den sekundären Antikörper und den markierten Antikörper, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, nicht erkannt wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich „hochmolekulares Trägermolekül, das durch den sekundären Antikörper und den markierten Antikörper, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist", auf ein hochmolekulares Trägermolekül, das unter den hochmolekularen Trägermolekülen, die bei dem Schritt der Überführung eines antigenen Peptids, das eine bestimmte Aminosäuresequenz des Antigens enthält, in ein vollständiges Antigen verwendet werden können, bei der Herstellung des sekundären Antikörpers und des markierten Antikörpers, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, nicht verwendet wird. Weiterhin gilt, dass in den Fällen, in denen der primäre Antikörper über einen Spacer oder über einen hochmolekularen Träger, die durch den sekundären Antikörper und den markierten Antikörper, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, nicht erkannt werden, gebunden werden sollen, der Spacer oder der hochmolekulare Träger auf ähnliche Weise gebunden werden können, wie sie bei dem Schritt der Überführung eines antigenen Peptids, das eine bestimmte Aminosäuresequenz des Antigens enthält, in ein vollständiges Antigen beschrieben wurde.
Die festen Träger, die für eine direkte oder eine indirekte Bindung des primären Antikörpers verwendet werden können, umfassen die üblicherweise verwendeten Materialien wie z. B. Polystyrol, Polyacryl, Polycarbonat, Polymethacrylat, Teflon^TM, Nitrocellulose-Membranen, Filterpapier, Dextran, Glas, Agarose, Ferrit und Latex (natürlicher Gummi). Die festen Träger können ein Vielzahl von Gestalten und Formen aufweisen, die von dem spezifischen beabsichtigten Verwendungszweck abhängen. So können zum Beispiel Plättchen, Kugeln, Platten, kleine Stäbchen, Zellen, kleine Fläschchen, kleine Röhrchen, Fasern, Netze, Gele und Säulenharze als Formen des festen Trägers erwähnt werden. Spezifischere Beispiele, die als feste Träger erwähnt werden können, umfassen Mikrotiterplatten, die aus durchsichtigen Plastikmaterialien wie z. B. Polyvinylchlorid oder Polystyrol bestehen, kleine Kügelchen, Röhrchen oder Stäbchen, die aus Polystyrol und Polystyrol-Latex bestehen.
Für die Bindung des primären Antikörpers an die festen Träger, die direkt oder indirekt über einen Spacer oder über ein hochmolekulares Trägermolekül erfolgen kann, das durch den sekundären Antikörper und den markierten Antikörper, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, nicht erkannt wird, kann ein kovalentes oder ein nicht kovalentes Verfahren angewendet werden (hierin nachstehend als „Beschichten" bezeichnet).
Für eine kovalente Bindung werden die festen Träger vorher über ein übliches Verfahren aktiviert, wie zum Beispiel mit Glutaraldehyd oder mit Bromcyan.
Die dabei verwendete Beschichtungslösung umfasst z. B. etwa 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,4), der 140 mM Natriumchlorid enthält, oder PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ (pH 7,4)). Vorzugsweise werden die Beschichtungsbedingungen so gewählt, dass die Konzentration des primären Antikörpers in der Beschichtungslösung z. B. etwa 0,05 μg/ml bis 100 μg/ml beträgt, und die Beschichtungszeit liegt zwischen mehreren Stunden und einigen Tagen, vorzugsweise z. B. etwa zwischen 6 Stunden und 24 Stunden. Die verwendete Beschichtungstemperatur beträgt z. B. 4°C bis 37°C. Um eine unspezifische Bindung zu vermeiden, wird eine Lösung, die 0,1 bis 5% Rinderserumalbumin, Gelatine oder Magermilch enthält, dem (so erhaltenen) primären Antikörper zugegeben, der direkt oder indirekt an den festen Träger gebunden wird, bevor eine Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, dem so erhaltenen primären Antikörper, der direkt oder indirekt an den festen Träger gebunden ist, zugegeben wird.
Eine Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, wird dem auf diese Weise erhaltenen primären Antikörper zugegeben, der direkt oder indirekt an den festen Träger gebunden ist, und dann bei 4°C bis 37°C inkubiert. Nach einer Inkubation von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen, vorzugsweise etwa 2 Stunden bis über Nacht, wird der feste Träger gewaschen. Dann wird eine Lösung zugegeben, die den sekundären Antikörper enthält, und bei 4°C bis 37°C etwa 10 Minuten bis über Nacht inkubiert. Wenn der sekundäre Antikörper mit Biotin oder mit einem Enzym wie z. B. Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase markiert wurde, kann die Menge des sekundären Antikörpers, der an den festen Träger gebunden hat, direkt durch das vorstehend bei den Immunblot-Verfahren beschriebene Verfahren gemessen werden.
Wenn ein mit einem Enzym oder mit Biotin markierter Antikörper verwendet wird, der den sekundären Antikörper erkennen und spezifisch an ihn binden kann, wird der freie sekundäre Antikörper durch Waschen entfernt und der feste Träger wird mit einer Lösung des markierten Antikörpers bei 4°C bis 37°C inkubiert. Nach einer Inkubation von etwa 10 Minuten bis über Nacht wird der feste Träger gewaschen und die Menge des markierten Antikörpers, der nach der Waschung an den festen Träger gebunden blieb, wird bestimmt. Solche markierten Antikörper umfassen Antikörper, die z. B. mit Biotin oder mit einem Enzym wie z. B. mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase markiert wurden.
In den Fällen, in denen ein markierter Antikörper verwendet wird, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, gehören der primäre und der sekundäre Antikörper in der Regel unterschiedlichen Klassen an oder sie stammen aus unterschiedlichen Tierarten, um eine Bindung des markierten Antikörpers, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, an den primären Antikörper, der auf dem festen Träger gebunden ist, im Wesentlichen zu vermeiden. Wenn zum Beispiel ein monoclonaler Maus-Antikörper als primärer Antikörper, der an den festen Träger gebunden ist, verwendet wird, kann ein polyclonaler Kaninchen-Antikörper als sekundärer Antikörper verwendet werden und mit Peroxidase markiertes Anti-Kaninchen-IgG aus Esel oder Ziege kann als markierter Antikörper, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, verwendet werden.
Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird unter Verwendung unterschiedlich verdünnter Lösungen, die das Protein der vorliegenden Erfindung in bekannten Konzentrationen enthalten, zuvor eine Eichkurve (Kalibrationskurve) erstellt. Dann wird eine Probe gemessen, die das Protein der vorliegenden Erfindung in einer unbekannten Konzentration enthält, und die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Probe wird mit Hilfe der Eichkurve bestimmt.
(D) Radioimmun-Testansätze
Die grundlegenden Prinzipien von Radioimmun-Testansätzen sind im Wesentlichen die Gleichen wie bei Enzym-Immun-Testansätzen. Beispielsweise wird eine Probe, die das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, einer Reaktionslösung hinzugefügt, die bekannte Mengen eines markierten Antigens und einen Antikörper enthält, so dass eine kompetitive Reaktion erfolgt. Dann werden der gebildete Antigen-Antikörper-Komplex und das Antigen, das in freier Form vorliegt, voneinander getrennt, und eines von beiden wird quantifiziert und mit einer Eichkurve verglichen, wodurch die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Probenlösung quantifiziert wird (New Lecture an Experiments in Biochemical Chemistry 12, veröffentlicht durch Tokyo Kagaku Dojin und Methods in Enzymology, Bd. 70, veröffentlicht durch Academic Press).
Üblicherweise wird das bei einem Radio-Immun-Testansatz verwendete Antigen mit ¹²⁵I markiert und die Einführung von ¹²⁵I in das antigene Protein kann gemäß dem Verfahren von Bolton-Hunter (Biochem. J. Bd. 133, S. 529, 1973) oder durch das Chloramin T-Verfahren durchgeführt werden.
Die Messung wird in der Regel unter Verwendung eines Gamma-Zählers und in ähnlicher Weise wie bei Enzym-Immun-Testansätzen durchgeführt, z. B. wird zuvor eine Eichkurve unter Verwendung von Lösungen erstellt, die das Antigen in bekannten Konzentrationen enthalten. Dann wird eine Probe gemessen, die das Protein der vorliegenden Erfindung in einer unbekannten Konzentration enthält, und die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Probe wird mit Hilfe der Eichkurve bestimmt.
Nachstehend wird hierin ein Kit der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das Kit für die Durchführung des analytischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung und das Untersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden. Das Kit kann das Protein der vorliegenden Erfindung als ein Standard-Reagenz für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Tier umfassen und vorzugsweise umfasst das Kit, wenn es für die Durchführung des analytischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines immunchemischen Analysverfahrens verwendet wird, ebenfalls einen Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung.
Darüber hinaus kann das Kit der vorliegenden Erfindung die folgenden konstitutionellen Zutaten umfassen. Das heißt, die konstitutionellen Bestandteile, die für das Sandwich-Verfahren bei Enzym-Immun-Testansätzen enthalten sein können, umfassen typischerweise (1) einen festen Träger, (2) ein Reagenz, das einen Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung enthält, das heißt den primären Antikörper, (3) ein Reagenz, das den sekundären Antikörper enthält, und (4) ein Reagenz, das einen markierten Antikörper gegen den sekundären Antikörper enthält, das heißt, ein Reagenz, das einen Antikörper enthält, der mit einem Enzym markiert ist und der den sekundären Antikörper erkennen und spezifisch an ihn binden kann. Zusätzlich können je nach Bedarf (5) eine Substrat-Verbindung für das Enzym, das zur Markierung des Antikörpers verwendet wurde, (6) ein Standard-Reagenz, das ein Protein enthält, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, oder ein Protein, das durch einen Antikörper gegen dieses Protein erkannt werden kann, (7) ein Puffer, (8) Zusatzstoffe wie z. B. ein Detergenz und hochmolekulare Träger zur Verhinderung einer unspezifischen Anheftung und Bildung von Aggregaten und (9) eine Pipette, ein Reaktionsgefäß oder eine Eichkurve ebenfalls hinzugefügt werden.
Der feste Träger in (1) kann den primären Antikörper in (2) bereits gebunden enthalten, und zwar direkt oder indirekt über einen Spacer oder über ein hochmolekulares Trägermolekül, das durch den sekundären Antikörper und den markierten Antikörper, der für den sekundären Antikörper spezifisch ist, nicht erkannt wird.
Das Reagenz, das den primären Antikörper in (2), den sekundären Antikörper in (3) oder den markierten Antikörper in (4) enthält, kann in Form einer Lösung in einem Puffer oder in Wasser bereitgestellt werden, oder es kann als gefriergetrocknetes Produkt bereitgestellt werden, das kurz vor der Verwendung gelöst wird. Darüber hinaus können (2), (3) und (4) einen Stabilisator enthalten wie z. B. Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von etwa 0,1 bis 10% (Gew./Vol.) nach Auflösung, und wenn gewünscht kann auch ein Detergens wie z. B. Tween-20 in einer Konzentration von 0,1 bis 2% (Gew./Vol.) nach Auflösung enthalten sein.
Bei dem Puffer in (7) kann es sich um einen Puffer handeln, der dazu verwendet werden kann, eine Körperflüssigkeit, ein Gewebe oder eine Zelle eines Kontrolltieres oder eine zubereitete Lösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Kontrolltieres oder eine Körperflüssigkeit, ein Gewebe oder eine Zelle eines Testtiers oder eine zubereitete Testlösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle eines Testtieres zu verdünnen, ebenso kann er verwendet werden, um den festen Träger zu waschen und die Bestandteile in (2), (3), (4) und (5) vorstehend zu lösen und zu verdünnen.
Weiterhin können das in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung und die Anwendung der vorliegenden Erfindung auch unter Verwendung einer Kombination von Vorrichtungen durchgeführt werden. Beispielweise werden bei dem in vitro-Analyseverfahren der vorliegenden Erfindung und der Anwendung der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von immunchemischen Analysen zur Messung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung Vorrichtungen verwendet, welche so hergestellt wurden, dass sie folgendes umfassen (1) eine Thermostat-Kammer für die Inkubation einer Körperflüssigkeit, eines Gewebes oder einer Zelle eines Kontrolltieres oder einer zubereiteten Lösung aus einer Körperflüssigkeit, einem Gewebes oder einer Zelle eines Kontrolltieres oder einer Körperflüssigkeit, eines Gewebes oder einer Zelle eines Testtieres oder einer zubereiteten Lösung aus einer Körperflüssigkeit, eines Gewebes oder einer Zelle eines Testtieres, zusammen mit dem den Antikörper enthaltenden Reagenz bei einer Temperatur, bei der das Protein der vorliegenden Erfindung in der Kontrolllösung oder in der Testlösung mit dem Antikörper reagieren kann, (2) einen Detektor, ausgewählt unter einem Densitometer für den Nachweis eines Signals bei Immunblot-Verfahren oder bei der Immunpräzipitation, ein Photometer für die Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz einer Reaktionslösung bei Enzymimmun-Testansätzen und einen Gamma-Zähler, der bei Radio-Immun-Testansätzen verwendet wird, (3) eine Computer-Software für die Berechnung der Menge an intraabdominalem Fettgewebe in einem Testtier aus der Messung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Testlösung, die in (2) erhalten wurde, und zwar aufgrund der positiven Beziehung zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Kontrolllösung und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe, und (4) einen Computer zur Durchführung der Berechnung in (3).
BEISPIELE
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung hierin in Einzelheiten durch Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, von denen jedoch nicht beabsichtigt wird, dass sie die vorliegende Erfindung einschränken.
Beispiel 1. Isolierung eines Gens, das das Protein codiert, welches die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst
1,0 μg Gesamt-RNA, die aus menschlichem intra-abdominalem Fettgewebe durch das Guanidinthiocyanat(GTC)/Cäsiumchlorid(CsCl)-Verfahren (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18, 5294, 1979) hergestellt worden war, wurde als Matrize verwendet und mit Oligo-dT-Primern gemischt, die in einem cDNA-Synthese-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) enthalten waren. Dazu wurden 50 E MMTV-Reverse Transkriptase in Anwesenheit von 1 mM dNTP hinzugefügt und dann wurde das Gemisch 10 Minuten bei Zimmertemperatur und anschließend 15 Minuten bei 42°C und 5 Minuten bei 99°C inkubiert, wodurch einzelsträngige cDNA synthetisiert wurde.
Dann wurden 55 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus eine Inkubation bei 94°C für 1 Minute, 55°C für eine Minute und 72°C für 2 Minuten umfasste, und wobei 2,0 ng der einzelsträngigen cDNA als Matrize und jeweils 20 pmol der beiden Oligonucleotide, die die in SEQ ID NO: 2 und 3 gezeigten Nucleotidsequenzen umfassten, als Primer in Gegenwart von 200 μM dNTP, 1,5 mM MgCl₂ und 1 E DNA-Polymerase (Perkin Elmer) verwendet wurden. Das so erhaltenen PCR-Reaktionsprodukt wurde einer 1%-igen Agarose-Gelelektrophorese (Elektrophorese-Puffer: Tris-Borsäure-Puffer (Nakalai Tesque)) unterworfen, und es wurde eine DNA-Bande mit einer Länge von etwa 1,5 kBp aus dem Gel gewonnen und in die HincII-Schnittstelle des Plasmid-Vektors pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) durch das von J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis in „Molecular Cloning" (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) beschriebene Verfahren cloniert. Die auf diese Weise clonierte DNA wurde mit dem von Applied Biosystems hergestellten DNA-Sequenziergerät 373A sequenziert, wobei das Taq-Dye-Primer-Cycle-Seq uenzierungs-Kit und das Taq-Dye-Deoxy-Terminator-Cycle-Sequenzierungs-Kit (Applied Biosystems) verwendet wurden. Die DNA umfasste die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Nucleotidsequenz und diese Nucleotidsequenz codiert die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird.
Beispiel 2. Herstellung des Protein-Standards (I), der eine Teilsequenz der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst
Es wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus eine Inkubation bei 94°C für 1 Minute, 60°C für eine Minute und 72°C für 2 Minuten umfasste, und wobei die in Beispiel 1 clonierte DNA als Matrize und Oligonucleotide, die die in der SEQ ID NO: 4 oder 5 gezeigten Nucleotidsequenzen umfassten, als Primer verwendet wurden. Dadurch wurde eine DNA amplifiziert, die aus der Nucleotidsequenz zwischen der Position 96 und 1493 der in SEQ ID NO: 6 gezeigten Nucleotidsequenz bestand. Die amplifizierte DNA wurde mit NdeI und BamHI verdaut und in die NdeI- und die Bam-HI-Schnittstelle des Expressionsvektors pET11a (Novagen) subcloniert, um das Expressionsplasmid pET11a085 (1) für die Expression eines Proteins zu erhalten, das Met an den Aminoterminus einer Aminosäuresequenz angehängt enthält, die an der Aminosäure 27 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz beginnt.
Anschließend wurde das Expressionsplasmid pETa085 in E. coli DE3 (Novagen) transformiert.
Die so erhaltene Transformante wurde bei 37°C angezogen, bis die O.D. der Kultur bei 600 nm den Wert 0,6 erreichte und dann wurde IPTG als Induktor bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Transformante wurde über Nacht weiter kultiviert. Dann wurde die Transformante durch Zentrifugation geerntet und anschließend in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 5 mM EDTA × 2 Na, 5 mM DTT und 1 mM PMSF enthielt (hierin nachstehend als Puffer A bezeichnet), suspendiert und durch eine Behandlung mit Ultraschall (3-mal 5 Minuten, unter Kühlung auf Eis) aufgebrochen, und diese aufgeschlossene Lösung wurde 15 Minuten bei 12.000 × g und 4°C zentrifugiert, wodurch ein Präzipitat als Einschlusskörper(inclusion body)-Fraktion gewonnen wurde.
Die Einschlusskörper-Fraktion wurde in Puffer A suspendiert, dem Harnstoff in einer Endkonzentration von 2 M zugegeben worden war, danach erfolgte eine Behandlung mit Ultraschall (5 Minuten, unter Kühlung auf Eis). Die so erhaltene Suspension wurde 15 Minuten bei 12.000 × g und 4°C zentrifugiert, und dann wurde dem so erhaltenen Präzipitat Puffer A zugegeben, dem Harnstoff in einer Endkonzentration von 4 M zugefügt worden war, und das vorstehend beschriebene Verfahren wurde wiederholt. Anschließend wurde dann ein ähnliches Verfahren wiederholt, dies erfolgte unter Verwendung von Puffer A, dem Harnstoff in einer Endkonzentration von 6 M zugefügt worden war, und das auf diese Weise erhaltene Präzipitat wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) suspendiert, der 2 mM DTT und 8 M Harnstoff enthielt, anschließend wurde 15 Minuten bei 2.000 × g und 4°C zentrifugiert, danach wurde der Überstand gewonnen. Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde einer Gelfiltationschromatographie über Hi-Load-Superdex 200 pg (Säule: 16 mm Durchmesser × 60 cm (Pharmacia); Durchflussrate: 1,0 ml/Min.; Nachweis bei 280 nm) unterworfen. Eine Peak-Fraktion, die nach einer Retentionszeit von 45 bis 55 Minuten eluierte, wurde gesammelt und mit Centricon^TM (Fraktionierungs-Molekulargewicht 30.000, ein Produkt von Grace Japan (vormals Amicon Ltd.)) aufkonzentriert und dann einer Ionenaustauschchromatographie auf einer Mono Q HR10/10-Säule (Säule: 10 mm Durchmesser × 10 cm (Pharmacia); Durchflussrate: 1,0 ml/Min.; 1 M NaCl-Gradient; Nachweis bei 280 nm) unterworfen. Eine Fraktion, die zwischen 100 bis etwa 200 mM NaCl eluierte, wurde gesammelt und auf eine Konzentration von 1 mg/ml Protein mit Centricon^TM (Fraktionierungs-Molekulargewicht 30.000, ein Produkt von Grace Japan) aufkonzentriert. Die bei der vorstehend beschriebenen Prozedur erhaltene Fraktion wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließende Silber-Färbung analysiert. Als Ergebnis wurde eine einzelne Bande nachgewiesen.
Der so erhaltenen Fraktion wurde unter sanftem Rühren 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) zugegeben, bis die in ihr enthaltene Harnstoff-Konzentration auf 6 M erniedrigt war. Das sanfte Rühren wurde bei Zimmertemperatur über Nacht fortgesetzt. Dann wurde die Fraktion 20 Minuten bei 18.000 × g und 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde gewonnen und 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), der 2 M Harnstoff, 4 mM reduziertes Glutathion und 0,4 mM oxidiertes Glutathion enthielt, wurden ihm hinzugefügt, bis die Endkonzentration des Harnstoffs auf 2,5 M erniedrigt worden war. Diese Lösung wurde in einen Dialyseschlauch mit einem Ausschluss-Molekulargewicht von 25.000 überführt und etwa 8 Stunden bei 4 °C gegen ein 1000-faches Überschuss-Volumen von 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) dialysiert, der 2 mM Harnstoff, 4 mM reduziertes Glutathion und 0,4 mM oxidiertes Glutathion enthielt. Das Dialysat wurde erneut über Nacht gegen ein 1000-faches Überschuss-Volumen von 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) dialysiert, der 2 mM reduziertes Glutathion und 0,2 mM oxidiertes Glutathion enthielt, und dann bei 4°C über Nacht gegen ein 1000-faches Überschuss-Volumen von 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) dialysiert. Ein Aliquot der bei der vorstehend beschriebenen Prozedur erhaltenen Fraktion wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie analysiert und als Ergebnis wurde ein einzelner Peak nachgewiesen. Das so erhaltene Protein wurde als. Protein-Standard (I) bezeichnet.
Beispiel 3. Herstellung eines Antikörpers gegen den Protein-Standard (I) (der die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst)
Der nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellte Protein-Standard (I) wurde als Antigen für die Immunisierung von Kaninchen verwendet und aus den Kaninchen wurde ein Antikörper erhalten.
Bei der ersten Immunisierung wurden 1,0 mg des nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Protein-Standards mit Freundschem Adjuvans gemischt und subcutan Kaninchen verabreicht. Anschließend wurde das Antigen 4-mal in 2-wöchigen Intervallen auf ähnliche Weise verabreicht. Eine Woche nach der letzten Verabreichung des Antigens wurde eine kleine Menge an Serum aus einer Ohrvene der Kaninchen erhalten und der Titer des Antikörpers wurde gemessen. Anschließend wurde das Antigen noch einmal zusätzlich verabreicht und dann wurde den Kaninchen Blut entnommen. Das Blut wurde zentrifugiert, um eine Serumfraktion zu erhalten, die dann über Nacht gegen ein 100-faches Überschuss-Volumen an 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) bei 4°C dialysiert wurde. Das dialysierte Serum wurde einer Protein A (Pharmacia)-Säulenchromatographie unterworfen, die adsorbierte Fraktion wurde mit 100 mM Citrat-Puffer (pH 4,0) eluiert und sofort anschließend wurde das Eluat mit 1M Tris-HCl (pH 9,0) neutralisiert, so dass eine Antikörper-Lösung erhalten wurde.
Beispiel 4. Immobilisierung des Antikörpers auf Trägern
Der in dem Verfahren von Beispiel 3 erhaltene Antikörper wurde an durch Bromcyan aktivierte Sepharose-Kügelchen gemäß einem Verfahren gebunden, das in Affinity Chromatography (veröffentlicht von Pharmacia) beschrieben ist. Das spezifische Verfahren war wie folgt: Der Antikörper wurde mit einem Puffer, der 150 mM NaHCO₃ und 500 mM NaCl (pH 8,3) umfasste (hierin nachstehend als Puffer B bezeichnet), auf eine Konzentration von 2,5 mg Protein/ml verdünnt, dann auf eine PD-10-Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit Puffer B eluiert. 0,5 g der mit Bromcyan aktivierten Sepharose-Kügelchen (Pharmacia) wurden in 1 mM HCl vorgequollen, das zuvor auf Eis abgekühlt worden war, und dann durch Äquilibrierung der Kügelchen mit 200 ml Puffer B, der 1 mM HCl enthielt, geliert. Dann wurden 1,75 ml des vorstehenden Eluats hinzugefügt und mit dem Gel vermischt, und die Suspension wurde bei 4°C über Nacht gerührt. Diese vermischte Suspension wurde über einen Büchner-Trichter abfiltriert, wobei das Filtrat durch Absaugen entfernt wurde. Die verbliebenen Kügelchen wurden in 3,0 ml 1 M Ethanolamin, das 500 mM NaCl (pH 8,3) enthielt, suspendiert und 6 Stunden bei 4°C gerührt, um die verbliebenen aktiven Gruppen zu blockieren. Dann wurden die Kügelchen mit 3,0 ml Puffer B und durch Absaugen über einen Büchner-Trichter gewaschen und anschließend mit 3,0 ml eines Puffers gewaschen, der 100 mM Essigsäure und 500 mM NaCl (pH 4,0) enthielt (hierin nachstehend als Puffer C bezeichnet). Die Arbeitschritte des abwechselnden Waschens mit Puffer B und dann mit Puffer C wurden 5-mal wiederholt, und dann wurden die Kügelchen mehrere Male mit einem Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6) 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02% Na₃N) gewaschen, anschließend in dem Lyse-Puffer im Verhältnis 1:1 von Gelbrei zu Puffer suspendiert und bei 4°C aufbewahrt. In dem Filtrat nach der Immobilisierung konnte der Antikörper nicht quantitativ nachgewiesen werden, was bestätigte, dass der Antikörper vollständig an den Kügelchen immobilisiert worden war.
Beispiel 5. Messung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Probenlösung durch Immunpräzipitation und Western-Blot-Verfahren
Aus menschlichen Blutproben wurden Serumfraktionen durch Zentrifugation (3.000 × g, 10 Min., 4°C) hergestellt und dann als Testlösungen verwendet. 5 μl der in Beispiel 4 hergestellten Kügelchen mit dem immobilisierten Antikörper wurden zu jeweils 200 μl der Testlösungen hinzugefügt und 4 Stunden bei 4°C sanft gerührt. Die Kügelchen wurden durch 5 Sekunden Zentrifugation bei 12.000 × g und 4°C sedimentiert, um den Überstand zu entfernen, und dann wurden jeweils 500 μl Lyse-Puffer den Kügelchen zugegeben, die dann sanft gerührt wurden und anschließend 5 Sekunden bei 12.000 × g und 4°C zentrifugiert wurden, um den Überstand zu entfernen. Der vorstehende Arbeitschritt der Waschung der Kügelchen wurde 4 Mal wiederholt und dann wurden jeweils 500 μl destilliertes Wasser den Kügelchen zugegeben und eine ähnliche Waschprozedur wie vorstehend wurde 3-mal wiederholt. Nach der Zentrifugation enthielten die Kügelchen keine wesentliche Flüssigkeitsmenge mehr und es wurden jeweils 75 μl einer 2%-igen wässrigen Essigsäure-Lösung den Kügelchen zugegeben, die dann sanft gerührt wurden. Die Kügelchen wurden durch 5 Sekunden Zentrifugation bei 12.000 × g und 4°C präzipitiert und der Überstand wurde gewonnen, anschließend wurde das gleiche Extraktionsverfahren durch Zugabe von 2% Essigsäure zu den Kügelchen durchgeführt. Die so erhaltenen Eluate mit 2% Essigsäure wurden gesammelt und dann wurde den Eluaten Rinderserumalbumin als Träger in einer Endkonzentration von 150 μg/ml hinzugefügt. Weiterhin wurden anschließend jeweils 75 μl einer TCA-Lösung hinzu gegeben und die Gemische wurden über Nacht auf Eis belassen. Diese Proben wurden 20 Minuten bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugiert und das präzipitierte Protein wurde gewonnen, mit 500 μl eiskaltem Aceton gewaschen und dann getrocknet.
Die so erhaltenen Präzipitate wurden in einer Lösung gelöst, die 50 mM Tris und 0,04 N wässriges NaOH enthielt. Nachdem ihnen das gleiche Volumen an SDS-Probenpuffer hinzugefügt worden war, wurde das gelöste Protein (das Protein der vorliegenden Erfindung) einer 10- bis 20%-igen SDS-PAGE-Gelelektrophorese (Bio-Craft Ltd.) unterworfen. Das nach der Elektrophorese im Gel enthaltene Protein wurde auf eine Hybond-N-Membran (Amersham) durch ein Elektroblot-Verfahren übertragen (Transfer-Puffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol; 4°C, 80 V, 1,5 Stunden). Die so hergestellte Membran wurde mit TTBS-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,05% Na₃N) gewaschen und dann in TTBS-Puffer, der 3% Gelatine enthielt, 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran 1 Stunde bei 37°C in einer Lösung inkubiert, die eine 1.000-fache Verdünnung des in Beispiel 3 erhaltenen Antikörpers in TTBS-Puffer und 1% Rinderserumalbumin enthielt. Dann wurde die Membran 3-mal 5 Minuten mit TTBS-Puffer bei Zimmertemperatur gewaschen und dann 1 Stunde bei 37°C in einer Lösung inkubiert, die durch eine 1.000-fache Verdünnung eines Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers aus Esel, der mit Meerrettich-Peroxidase markiert worden war, in TTBS, das 1% Rinderserumalbumin enthielt, inkubiert. Danach wurde die Membran 3-mal für 5 Minuten mit TTBS-Puffer bei Zimmertemperatur gewaschen und anschließend dem ECL-Nachweis-System (Amersham) unterworfen. Die Membran wurde gegenüber einem Hyperfirm-ECL-Film (Amersham) exponiert, und es wurde ein Fluoreszenzsignal (in der Nähe von 50 kDa) auf dem Hyperfirm-ECL-Film (Amersham) nachgewiesen (2).
Die Intensität des so erhaltenen Fluoreszenzsignals wurde mit einem Densitometer quantifiziert. Die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in jeder Testlösung wurde aus der Signalintensität jeder Probe mit Hilfe der Eichkurve berechnet, die zuvor unter Verwendung von 0,1 bis 5 ng des Proteinstandards (I) hergestellt worden war, der in Beispiel 2 erhalten worden war.
Beispiel 6. Messung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in einer Testlösung durch Enzym-Immun-Testansätze
Es wurde eine Beschichtungslösung hergestellt, indem dem in Beispiel 3 erhaltenen Antikörper PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ (pH 7,4)) in einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt wurde. Die Beschichtungslösung wurde in die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 150 μl pro Vertiefung gegeben und bei 4°C über Nacht inkubiert. Nachdem die Beschichtungslösung entfernt worden war, wurde jede Vertiefung zweimal mit 300 μl PBS gewaschen und dann wurde die Mikrotiterplatte umgedreht und sanft auf einem Papierhandtuch ausgeschlagen, um die Lösung aus den Vertiefungen der Platte zu entfernen. Dann wurde PBS, das 1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt, den Vertiefungen der Mikrotiterplatte in einem Volumen von 150 μl pro Vertiefung zugegeben und zum Blockieren bei 4°C über Nacht inkubiert.
Nachdem die Blockierungslösung entfernt worden war, wurde die Mikrotiterplatte zweimal mit 300 μl einer Waschlösung (50 mM Na₂PO₄-Na₂HPO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4, 2,0% Tween 20) gewaschen. Anschließend wurden durch Zentrifugation (3.000 × g, 10 Minuten, 4°C) Serumfraktionen von menschlichen Blutproben hergestellt und dann als Testlösungen verwendet. Es wurden 120 μl einer Reaktionslösung, die durch die Zugabe von 1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin zu der Waschlösung hergestellt worden war, jeder Vertiefung zugegeben und dann wurden jeweils 30 μl der Testlösung jeder Vertiefung zugegeben und bei Zimmertemperatur über Nacht inkubiert. Dann wurde die Reaktionslösung entfernt und jede Vertiefung wurde 3-mal mit 300 μl Waschlösung gewaschen.
Anschließend wurde ein Fab'-Antikörper-Fragment, das durch einen Verdau des in Beispiel 3 erhaltenen Antikörpers mit Pepsin und anschließende Reduktion hergestellt worden war, mit Peroxidase gemäß dem Maleimid-Scharnier-Verfahren (beschrieben in Enzyme Immunoassays, 3. Ausgabe, veröffentlicht durch Igakushoin) markiert. 150 μl einer Antikörper-Reaktionslösung (50 mM Na₂PO₄ – Na₂HPO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4, 2,0% Tween 20, 1% (Gew./Vol.) normales Kaninchenserum, 0,067% (Gew./Vol.) 4-Aminoantipyrin), die das so erhaltene mit Peroxidase markierte Fab'-Antikörper-Fragment in einer Konzentration von 5 μg/ml enthielt, wurde jeder Vertiefung zugegeben und 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Nachdem die so erhaltene Antikörper-Reaktionslösung entfernt worden war, wurde jede Vertiefung 4-mal mit 300 μl Waschlösung gewaschen.
Dann wurden 50 mM Phosphat-/25 mM Citrat-Puffer (pH 4,8), der 1,0 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,017% (Vol./Vol.) Wasserstoffperoxid enthielt, kurz vor der Verwendung hergestellt, und dieser Puffer wurde den Vertiefungen der Mikrotiterplatte in einem Volumen von 150 μl pro Vertiefung zugegeben. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte mit Aluminiumfolie abgedeckt und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 2 N Schwefelsäure beendet und die Färbung der Mikrotiterplatte wurde auf Unterschiede in der Extinktion zwischen den Wellenlängen 492 nm und 595 nm in einem Multi-Scanning-Spektrophotometer (Bio-Rad) gemessen.
Verdünnte Lösungen des Protein-Standards (I), die in Konzentrationen von 0 bis 100 ng/ml hergestellt worden waren, wurden verwendet, um eine Eichkurve für die Extinktionsunterschiede des Protein-Standards (I) herzustellen, und die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in jeder Testlösung wurde mit Hilfe der Eichkurve bestimmt.
Beispiel 7. Bestätigung (1) der Korrelation zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe
200 μl-Serumfraktionen wurden durch Zentrifugation (3.000 × g, 10 Minuten, 4°C) aus Blutproben von 100 Personen hergestellt und als Kontrolllösungen verwendet. Die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in jeder der so erhaltenen Kontrolllösungen wurde durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren bestimmt.
Die Fläche an intra-abdominalem Fettgewebe (cm²), die für jede der 100 Personen mittels Computer-Tomographie eines Querschnitts des Abdomens unter Verwendung des CT-Scannings bestimmt worden war, wurde auf der y-Achse abgetragen und die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung (ng/200 μl) in jeder der Kontrolllösungen auf der x-Achse (3) aufgetragen. Aus den dadurch erhaltenen graphischen Darstellungen wurde der Korrelationskoeffizient zwischen x und y zu einem Wert von etwa 0,7 bestimmt und so wurde die Korrelation y = 78,8x + 51,4 zwischen x und y erhalten.
Beispiel 8. Bestätigung (2) der Korrelation zwischen der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung und der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe
Die Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung in den Blutproben von 5 Testpersonen wurde vor und nach einem vorher bestimmten Zeitraum durch den in Beispiel 6 beschriebenen Enzym-Immun-Testansatz gemessen. Die Veränderung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung vor und nach den vorher bestimmten Zeitraum stimmte mit der Veränderung der Fläche an intra-abdominalem Fett überein, die durch Tomographie eines Querschnitts des Abdomens mittels CT-Scanning vor, beziehungsweise nach dem vorher bestimmten Zeitraum gemessenen worden war. Das heißt, eine Testperson, die eine Verminderung der Fläche an intra-abdominalem Fett aufwies, zeigte ebenfalls eine Verminderung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut, und eine Testperson, die eine Erhöhung der Fläche an intra-abdominalem Fett aufwies, zeigte ebenfalls eine Erhöhung der Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung (4).
Beispiel 9. Messung des Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut von Patienten mit Erkrankungen, die eng mit der Erhöhung an intra-abdominalem Fettgewebe in Beziehung stehen
Die Konzentrationen des Proteins der vorliegenden Erfindung in Blutproben, die von 38 Patienten mit Diabetes und 14 Patienten mit Koronararterien-Erkrankungen gesammelt worden waren, wurden gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut

Blutspender Konzentration des Proteins der vorliegenden Erfindung im Blut (Durchschnittswerte, ng/ml)

Patienten mit Diabetes 14,7

Patienten mit Koronararterien-Erkrankungen 9,8
Wie hierin vorstehend erläutert, wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe bereitgestellt, das leicht und rasch mit zufrieden stellender Genauigkeit anwendbar ist.
FREIER TEXT ZU DEM SEQUENZPROTOKOLL

SEQ ID NO: 2 zeigt einen Oligonucleotid-Primer, der entworfen wurde, um das Antigen-Gen zu amplifizieren.
SEQ ID NO: 3 zeigt einen Oligonucleotid-Primer, der entworfen wurde, um das Antigen-Gen zu amplifizieren.
SEQ ID NO: 4 zeigt einen Oligonucleotid-Primer, der entworfen wurde, um das Antigen-Gen zu amplifizieren.
SEQ ID NO: 5 zeigt einen Oligonucleotid-Primer, der entworfen wurde, um das Antigen-Gen zu amplifizieren.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Analyse der Menge von intra-abdominalem Fettgewebe.
Verwendung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Vorhersage des Risikos eines Krankheitsausbruchs, wobei die Krankheit in engem Zusammenhang mit der Menge von intra-abdominalem Fettgewebe steht, oder für die Beurteilung der Genesung von dieser Krankheit.
Verwendung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Vorhersage des Risikos der Entstehung von Diabetes oder von Kranzgefäßkrankheiten, oder für die Beurteilung der Genesung von Diabetes oder Kranzgefäßkrankheiten.
Verwendung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, und eines Antikörpers, welcher das Protein erkennt, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, zur Herstellung eines Kits für die Analyse der Menge von intra-abdominalem Fettgewebe.
Verwendung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, und eines Antikörpers, welcher das Protein erkennt, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, zur Herstellung eines Kits für die Vorhersage des Risikos eines Krankheitsausbruchs, wobei die Krankheit in engem Zusammenhang mit der Menge von intra-abdominalem Fettgewebe steht, oder für die Beurteilung der Genesung von dieser Krankheit.
Verwendung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, und eines Antikörpers, welcher das Protein erkennt, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, zur Herstellung eines Kits für die Vorhersage des Risikos der Entstehung von Diabetes oder von Kranzgefäßkrankheiten, oder für die Beurteilung der Genesung von Diabetes oder Kranzgefäßkrankheiten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Menge an intraabdominalem Fettgewebe eine Menge von intra-abdominalem Gewebe in einem Testtier ist, welche aus der Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Testtiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle dieses Testtiers bestimmt wird, basierend auf der positiven Beziehung zwischen der Menge des intra-abdominalen Fettgewebes in einem Tier und der Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle dieses Tiers oder in einer zubereiteten Kontrolllösung aus der Körperflüssigkeit im Gewebe oder der Zelle des Tiers.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Menge an intraabdominalem Fettgewebe ein Bereich des intra-abdominalen Fettgewebes in einem Abschnitt des Abdomens ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die positive Beziehung eine Beziehung ist, die sich als lineare Funktion einer korrelierenden Funktion ausdrückt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Konzentration des Proteins in der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Tiers oder in einer zubereiteten Kontrolllösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Tiers eine Konzentration ist, welche durch eine immunchemische Analyse bestimmt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Konzentration des Proteins in einer Körperflüssigkeit, einem Gewebe oder einer Zelle des Tiers oder in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers eine Konzentration ist, welche durch immunchemische Analyse bestimmt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Testtier ein Säuger ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Protein in der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Tiers oder in der zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers, das Protein im Blut ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Risiko für den Ausbruch einer Krankheit welche in enger Beziehung zur Menge an intra-abdominalem Fettgewebe steht, vorausgesagt oder die Genesung von dieser Krankheit in einem Individuum beurteilt wird, basierend auf der Untersuchung der Erhöhung oder der Senkung der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe des Individuums in einem vorher bestimmten Zeitabschnitt durch die Analyse der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei die Menge an intraabdominalem Fettgewebe in dem Testtier eine Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in dem Testtier ist, die mit der Menge von intra-abdominalem Fettgewebe in einem gesunden Tier derselben Spezies des Testtiers verglichen wird.
In vitro-Analyseverfahren zur Bestimmung der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe, umfassend die Bestimmung der Konzentration eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst oder von einem Antikörper gegen ein Protein erkannt wird, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt umfasst, in einer zubereiteten Testlösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers, basierend auf der positiven Beziehung zwischen der Menge an intra-abdominalem Fettgewebe in einem Tier und der Konzentration des Proteins in einer zubereiteten Kontrolllösung aus der Körperflüssigkeit, dem Gewebe oder der Zelle des Testtiers.