DE69933707T2

DE69933707T2 - Serum amyloid a als marker für entzündungsreaktion, milchqualität und die anwesenheit von kolostrum in milch

Info

Publication number: DE69933707T2
Application number: DE69933707T
Authority: DE
Inventors: L. Thomas Omaha MCDONALD; Annika Omaha WEBER
Original assignee: Accuplex LLC
Current assignee: Accuplex LLC
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-08-26
Also published as: JP3511023B2; AU5585199A; EP1224319A4; AU770994B2; WO2001014580A1; EP1224319B1; JP2003507725A; EP1224319A1; DE69933707D1; US7569338B1

Description

FACHRICHTUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf den Diagnostikbereich. Insbesondere stellt die Erfindung eine Methode zur Verfügung, um Infektionen und andere entzündliche Zustände zu diagnostizieren, indem das Auftreten von Serum A in einem abgesonderten biologischen Fluid gemessen wird. Des Weiteren stellt die Erfindung einen Prüfkoffer zur Verwendung mit der Methode zur Verfügung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Auf etliche wissenschaftliche oder Patentveröffentlichungen wird in dieser Patentanmeldung Bezug genommen, um den Stand der Technik zu beschreiben, den die Erfindung betrifft.
Säuger reagieren auf Gewebsverletzungen, Wunden oder Infektionen, indem sie eine komplexe Serie biologischer Reaktionen vollziehen, um weitere Gewebsverletzungen zu verhindern, Heilung verletzten Gewebes zu beginnen und infektiöse Organismen zu isolieren und zu zerstören. Dieser Prozess wird entzündliche Reaktion genannt, wobei die frühen und Zwischenphasen als Akutphasenreaktion bezeichnet werden.
Die Akutphasenreaktion schließt eine große Vielzahl von Mediatoren ein, einschließlich Zytokine, Interleukine und Tumor-Nekrose-Faktor. Auch schließt sie eine radikale Änderung im biosynthetischen Profil der Leber ein. Unter normalen Umständen synthetisiert die Leber eine Auswahl von Plasmaproteinen in stabilen Konzentrationen. Einige dieser Proteine, die „Akutphasen"-Proteine, werden in die entzündliche Reaktion bis zu einem Level induziert, das viele Male größer ist, als unter normalen Umständen vorgefundene Level. Akutphasen-Proteine werden von Stell & Whitehead bewertet (Immunology Today 15: 81-87, 1994).
Eines der massiv induzierten Akutphasen-Proteine ist Serum Amyloid A (SAA). Eigentlich umfasst SAA eine Familie von durch viele Gene in einer Vielzahl von Säugetierspezies kodierten polymorphen Proteinen. SAAs sind kleine Apolipoproteine, die sich akkumulieren und während der Akutphase der entzündlichen Reaktion schnell mit Lioporoteinen hoher Dichte (HDL3) verbinden. Die meisten SAAs werden als Reaktion auf die Entzündung induziert; jedoch scheinen gewisse SAAs (z.B. menschliches SAA4) konstitutiv ausgedrückt oder in der entzündlichen Reaktion minimal induziert zu werden.
SAAs werden transkriptionell und post-transkriptionell reguliert, gleichwenn transkriptionelle Regulierung zu dominieren scheint. Es wurde beobachtet, dass SAAmRNA-Leve1 in den einem entzündlichen Reiz folgenden Stunden auf das bis zu 1000fache anstiegen. Ebenso stellte sich heraus, dass SAA-Protein-Plasmakonzentrationen für kurze entzündlichen Reizen folgenden Zeiträume um das 1000fache ansteigen, auf Levels nahe 1 mg/ml.
Der massive Anstieg in SAA Plasmalevel als Reaktion auf sowohl infektiöse und nichtinfektiöse entzündliche Reize führte zu dessen Verwendung als ein diagnostischer Entzündungsmarker. Unter den effektivsten Assays befinden sich Immunoassays, die in einer Art verursachte Antikörper verwenden, die keine feststellbaren Mengen von SAA produzieren. Zum Beispiel beschreibt McDonald et al. (J, Immunol. Meth. 144: 149-155, 1991) ein Antikörpersandwichassay unter der Verwendung zweier gereinigter Rattenmonoklonalantikörper, die gegen menschliche SAA erzeugt werden. Diese Antikörper verwendenden Immunoassays bewiesen sich als verlässlich und sensitiv und bedürfen vor dem Assay keiner Denaturierung der Probe (McDonald et al., 1991, supra). Gleichermaßen beschreiben Satoh et al. (AM J. Vet. Res. 56: 1286-1291) ein ELISA-Assay zum Messen von SAA-Level in Pferdeserum unter der Verwendung von Hase-Antipferd-SAA-Antikörpern. Obwohl effektiv sind diese und ähnliche Immonoassays insoweit invasiv, als dass sie einer Blutprobe bedürfen. Darüber hinaus können sie zur Früherkennung örtlich begrenzter Entzündung, welche im Zusammenhang mit einer Vielzahl von infektiösen und nichtinfektiösen Gewebsverletzungen üblich ist, ungeeignet oder unwirksam sein.
Ein exzellentes Beispiel einer nicht-systemischen entzündungsverwandten Erkrankung großer ökonomischer Wichtigkeit für die Milchindustrie ist die Mastitis. Im Allgemeinen wird Mastitis als eine Entzündung der Brustdrüse betrachtet. Die Krankheit kann jeden Säuger betreffen, ist jedoch ökonomisch höchst signifikant bei Milchfärsen und -kühen. Im Allgemeinen resultiert Mastitis aus Besiedlung der Brustdrüse durch pathogene Bakterien. Jedoch können auch physische Verletzungen oder lokale mechanische oder chemische Spannungen im Euter eine lokale Entzündungskaskade auslösen ohne die Beteiligung irgendeiner primären bakteriellen Infektion (manchmal als sterile Mastitis bezeichnet).
Mastitis kann bei klinischen oder subklinischen Leveln exprimiert werden und kann an nur einem Teil des Euters lokalisiert werden. Subklinische oder lokalisierte Mastitis ist ökonomisch schädigend, da sie oftmals unentdeckt und unbehandelt bleibt, jedoch in verminderter Milchproduktion resultiert. Demgemäß ist es in der Frühdiagnose von Mastitis wichtig, Infektionen erkennen zu können, bevor klinische Symptome auftreten, und die Infektion spezieller Bereiche des Euters lokalisieren zu können.
Aktuelle klinische Labormethoden, die zur Diagnose von Mastitis verwendet werden, beinhalten eine Bewertung somatischer Zellenzählung (SCC), zahlreicher Elektrolytelevel und löslicher Proteine wie Laktat-Dehydrogenase (LDH) und N-Acetyl-β-D-Glukosamidase (NAG), in Milchproben, von denen alle augrund der durch die Infektion verursachten entzündlichen Reaktion einen Zusammenbruch in der Blut-Milch-Barriere widerspiegeln.
Bestimmte dieser Parameter, z.B. SCC und Elektrolyteschätzungen, sind außerstande infektiöse von nichtinfektiösen Bereichen des Euters zu differenzieren (Zank & Slatterer, J. Vet. Med. 45: 41-51, 1998), während andere, z.B. LDH- und NAG-Nachweis, für eine sehr frühe Diagnose nicht hinreichend sensitiv sein können. Demgemäß werden neue Indikatoren benötigt, die beim Ausbruch einer Mastitisinfektion zu einem frühen Zeitpunkt höchst prädiktiv sind.
SIPE J D ET AL: JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V., AMSTERDAM, NL, Bd. 125, Nr. ½, 1989, Seiten 125-135; MCDONALD T L ET AL: JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V., AMSTERDAM, NL, Bd. 144, 1991, Seiten 149-155; WO 97/06184 A; URIELI-SHOVAL SIMCHA ET AL: JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, Bd. 46, Nr. 12, Dezember 1998 (1998 – 12) Seiten 1377-1384 offenbaren Baukästen umfassend einen oder mehrere Antikörper, die immunologisch spezifisch sind für eine oder mehrere SAA-Isoformen und Reagenzien für einen Immunoassay damit, sowie Baukästen umfassend ein oder mehrere Nucleinsäuremoleküle, das speziell hybridisiert zu eine oder mehrere SAA-Isoformen und Reagenzien kodierende mRNA, um die Hybridisationsassays durchzuführen.
SCHRÖDL W ET AL. TIERÄRZTLICHE PRAXIS. AUG 1995, Bd. 23, Nr. 4, August 1995 (1995 – 08), Seiten 337-341, offenbart C-reaktives Protein CRP als ein Marker für Mastitis in Kuhmilch. NEWSTEAD D F: NEW ZEALAND JOURNAL OF DAIRY SCIENCE AND TECHNOLOGY, Bd. 6, Nr. 2, 1971, Seite 92, offenbart Rinder-Ig als einen Marker für Kolostrum in Kuhmilch.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Nach einem erfindungsgemäßen Aspekt wird eine schnelle und zweckmäßige Methode zur Verfügung gestellt, um eine entzündliche Reaktion in einer Brust eines säugenden Säugers zu entdecken. Das Verfahren umfasst das Messen des Auftretens oder der Menge des Serums Amyloid A (SAA)-Proteins oder das Protein verschlüsselndes mRNA in einer von der Brust erhaltenen Milchprobe, wobei die in der Probe vorhandene SAA-Protein- oder mRNA-Menge mit der entzündlichen Reaktion positiv korreliert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform spiegelt die entzündliche Reaktion Mastitis in dem Tier wider, die entweder durch Infektion mit einem krankheitserregenden Organismus oder durch eine nicht-infektiöse Spannung oder Verletzung des Brustgewebes verursacht wurde.
Die in der Milch entdeckte und quantifizierte SAA umfasst vorzugsweise eine oder mehrere Entzündungs-reagierende SAA-Isoformen. Besonders umfasst die SAA eine Aminosäurensequenz, die ausgewählt wurde aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 1-15.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst die Methode das Messen der Menge von SAA-Proteinen in der Milchprobe. Vorzugsweise wird die Menge der SAA-Proteine gemessen mittels eines immunologischen Assays mit Antikörpern, die spezifisch sind für eine oder mehrere SAA-Isoformen. Am Bevorzugtesten ist das immunologische Assay ein ELISA-Assay
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung umfasst das Messen der SAA mRNA-Menge in der Milchprobe. Vorzugsweise wird die SAA mRNA-Menge mittels eines Hybridisationsassays mit Nukleinsäuremolekülen gemessen, die zu SAA mRNA komplementär sind.
Die Verfahren dieser Erfindung können für eine Vielzahl von Zwecken angepasst werden.
In einem Ausführungsbeispiel werden die erfindungsgemäßen Verfahren angewandt, um Milchqualität zu überwachen. Proben von Milchchargen werden bzgl. dem Auftreten und der Menge von SAA untersucht und mit einer als Standard für eine vorbestimmte Milchqualität akzeptierten Probe verglichen. Die SAA-Vergleichsmenge in der Probe verglichen mit dem Standard wird verwendet, um der Milchcharge eine Milchqualität zuzuordnen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden die erfindungsgemäßen Verfahren benutzt, um das Auftreten und die Menge von Kolostrum in einer Milchprobe fest zustellen. Dieses Ausführungsbeispiel wendet die Entdeckung des Erfinders an, dass SAA-Level im Kolostrum angehoben werden, jedoch nicht in normaler Milch. Proben aus Milchchargen, die unter dem Verdacht stehen, Kolostrum zu enthalten, werden auf SAA hin untersucht (vorzugsweise ein kolostrumspezifisches SAA) und mit einer Probe verglichen, von der man weiß, dass diese kolostrumfrei ist. Die SAA-Vergleichsmenge in der Probe verglichen mit der Kontrollprobe bestimmt, ob die Probe mit Kolostrum behaftet ist.
Geeignet zur Verwendung in der Erfindung ist ein Diagnosebaukasten zum Screening von Milchproben, um eine Entzündung in Brüsten säugender Säuger festzustellen. Ein Testbaukasten kann einen Behälter umfassen mit einem oder mehreren Antikörpern, die in Geweben von Säugern oder Milchabsonderungsprodukt vorhanden sind und welche kreuzreagierend sind mit Rinder-SAA, die immunologisch spezifisch ist für eine oder mehrere SAA Isoformen, und Anweisungen zur Durchführung von immunologischen Assays von Milchproben für SAA unter der Verwendung von Antikörpern. Ein Testbaukasten kann einen Behälter umfassen, der ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle beinhaltet, das speziell mit einem oder mehreren SAA-Isoformen kodierendem mRNA kreuzt, das isoliert wurde von mit Mastitis bedingter Entzündung zugehörigem Gewebe, und Anweisungen zur Durchführung von Hybridisationsassays von Milchproben für SAA unter der Verwendung von Nukleinsäuren. Diese Baukästen können zur Durchführung der immunologischen oder Hybridisationsassays des Weiteren zumindest ein zusätzliches Reagens umfassen.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen, detaillierten Beschreibungen und Beispiele besser verständlich sein.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Definitionen
Verschiedene Begriffe, die sich auf die Verfahren der vorliegenden Erfindung beziehen, werden zuvor und auch überall in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet.
Bezug nehmend auf die Antikörper bezieht sich der Begriff „immunologisch spezifisch" auf Antikörper, die sich mit einem oder mehreren Epitopen eines Proteins von Interesse verknüpfen, die jedoch andere Moleküle in einer einen gemischten Bestand von antigenen biologischen Molekülen beinhaltenden Probe im Wesentlichen nicht erkennen oder binden.
Hinsichtlich Oligonukleotiden oder anderer ein-strangiger Nukleinsäuremolekülen bezieht sich der Ausdruck „speziell hybridisierend" auf die Verbindung zwischen zwei-strangigen Nukleinsäuremolekülen von ausreichender Komplementärsequenz, um ein solches Hybridisieren unter vorbestimmten, allgemein in der Technik angewandten Konditionen (manchmal bezeichnet als „wesentlich komplementär") zu gestatten. Insbesondere bezieht sich der Ausdruck auf ein Oligonukleotid mit einer wesentlich komplementären Sequenz, die in einem ein-strangigen DNA- oder RNA-Molekül beinhaltet ist, auf den wesentlichen Hybridisierungsausschluss der Oligonukleotide mit einstrangigen Nukleinsäuren von nicht-komplementärer Sequenz.
II. Beschreibung
Serum Aminoloid A (SAA) ist ein Akutphasenprotein, das in der Leber produziert wird und bei erhöhten Leveln in dem Serum von Säugern als Reaktion auf Entzündung verbunden mit Gewebeverletzung oder Infektion auftritt. Die vorliegende Erfindung geht hervor aus der überraschenden Entdeckung, dass erhöhte SAA-Level auch in der Milch von stillenden Frauen auftreten, als Reaktion auf Entzündungen in der Brust. Insbesondere zeigen Kühe mit Mastitis erhöhte SAA-Level, die mit der Schwere der Infektion korrelieren, und die auf den Bereich des Euters beschränkt sind, der von der Entzündung durch Mastitis betroffen ist. Es wird davon ausgegangen, dass dies die erste Beobachtung von gesteigerter SAA-Produktion in einem abgesonderten biologischen Fluid als Reaktion auf eine Entzündung in dem Gewebe ist, in dem das Fluid produziert wird.
Ohne durch irgendeine besondere Erklärung eingeschränkt zu werden, kann das in der Milch von entzündetem Brustgewebe gefundene SAA teilweise von einem Zu sammenbruch in der Blut-Milch-Barriere resultieren, wodurch es zellulärem Material und Plasmaenzymen gelangt, in die Milch zu entweichen. Jedoch zeigten durch die Erfinder gewonnene experimentelle Ergebnisse, dass SAA-Level in Kühen von Kolostrum und Milchserum-SAA unabhängig sind. In Proben von Kolostrum, Molke und Serum, die von Testkühen entnommen wurden, stellte sich heraus, dass Serum SAA im Bereich von 10μg/ml lag, während im Kolostrum SAA erhöht war auf Level im Bereich von 470 μg/ml (Mittelwert von fünf Kühen). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Quelle des SAA in Milch aus einer unabhängigen Quelle in dem Säugergewebe hervorgeht, z.B. duktale Epithelzellen.
Die Messung von SAA-Leveln in Milch zur Früherkennung von Entzündungen verbunden mit Mastitis wird hier beispielhaft dargestellt. Durchschnittsfachleuten wird es jedoch bekannt sein, dass die auf SAA-Nachweis in Milch angewandten Prinzipien zur Diagnose von mit Mastitis in Verbindung stehender Entzündung ebenfalls angewandt werden können, um durch andere Erreger, wie z.B. unwillkürlicher Verletzung, granulomatöser Erkrankung, fibrozystischer Erkrankung und Krebs, hervorgerufene entzündliche Zustände nachzuweisen.
Wenn SAA in Milch als ein Indikator einer Entzündung in dem Gewebe nachgewiesen wird, von welchem die Milch abgesondert wurde, wird des Weiteren angenommen, SAA in anderen von entzündetem Gewebe abgesonderten biologischen Fluiden vorzufinden. Beispielsweise wird das Auftreten erhöhter SAA-Level im Urin einer infektiösen Niere oder Blase vermutet. Erhöhte SAA-Level könnten auch in Speichel, Sputum, Schweiß oder Tränen auftreten, die von infektiösem oralem, Lungen-, Haut- bwz. tränenreichem Gewebe stammen.
Der SAA-Gehalt in Sputum könnte beispielsweise zur Identifizierung einer Vielzahl von Lungenentzündungskonditionen, einschließlich Pilz- und bakterieller Infektionen der Lunge, in einem Patienten (Mensch oder Tier) dienen, sowie bei überempfindlicher Pneumonitis (z.B. Famerlunge), bakterieller Besiedlung und Anstieg von zystischem Fibroseaufflammen (vornehmlich verursacht durch Pseudomonas) und Krebs. Solch eine Applikation wird als besonders nützlich erachtet bei pferdetierärztli chen Applikationen, wo unspezifizierte oder subklinische Lungenentzündungen den allgemeinen Gesundheitszustand wertvoller Pferde wie Rennpferde unterminieren können (siehe z.B. Equine Veterinary Journal 21: 106-109, 1989; Journal Veterinary Medical Science 55: 1011-1116, 1993).
Als ein weiteres Beispiel könnte der SAA-Gehalt im Urin dazu dienen, eine Vielzahl entzündlicher Konditionen von Niere oder Blase in einem Patienten (Mensch oder Tier) zu identifizieren, einschließlich interstitieller Zystitis (Blase oder Niere betroffen) und Nierentransplantationsabstoßung.
Nunmehr auf die beispielhafte Ausführungsform der Erfindung Bezug nehmend wird Milch auf das Auftreten und die Menge von SAA hin analysiert als ein diagnostischer Test auf Entzündung, die gewöhnlich mit Mastitis einhergeht. Die erfindungsgemäßen Assays umfassen das Bereitstellen einer Milchtestprobe von Gewebe, von dem vermutet wird entzündet zu sein. Der SAA-Level in der Probe wird gemessen und vorzugsweise mit einer Milchprobe verglichen, die von einem bekanntermaßen normalen Gewebe stammt. Die Menge der SAA-Zunahme in der Testprobe wie mit der Kontrollprobe verglichen verhält sich direkt proportional zu dem in dem Gewebe gegenwärtigen Entzündungslevel, von dem die Probe stammt.
SAA existiert in verschiedenen Isoformen bei gesteigerter Produktion der meisten bei einer entzündlichen Reaktion. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jede auf Entzündung reagierende Isoform oder eine Kombination von Isoformen in dem Assay entdeckt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, das zum Testen von Kuhmilch anwendbar ist, werden Rinder-SAA-Isoformen entdeckt. Bisher wurde über eine Isoform von Rinder-SAA berichtet. Jedoch wurde gemäß der vorliegenden Erfindung eine neue Rinder-SAA-Isoform identifiziert, die kolostrumzugehörig ist, und die einen Teil oder alle in Milch von entzündetem Gewebe gefundene SAA umfassen kann. Dementsprechend beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine oder beide SAA-Isoformen in Assays von Kuhmilch aufzuspüren. Ein Teil der Aminosäurensequenz umfassend das rinderkolostrumzugehörige SAA wird hier aufgezeigt als SEQ ID NO:1.
Ein Teil der Aminosäurensequenz der Rinderserum-SAA-Isoform wird hier aufgezeigt als SEQ ID NO:2.
In alternativen Ausführungsformen werden SAA-Isoformen verschiedener Spezies aufgespürt (partielle Aminosäuresequenzen dieser Isoformen werden hier aufgezeigt). Ohne darauf beschränkt zu sein beinhalten diese menschliches SAA1 (SEQ ID NO:3), menschliches SAA3 (SEQ ID NO:4), Hasen-SAA1 (SEQ ID NO:5), Hasen-SAA3 (SEQ ID NO:6), Mäuse-SAA1 (SEQ ID NO:7), Mäuse-SAA3 (SEQ ID NO:8), Hamster-SAA1 (SEQ ID NO:9), Hamster-SAA3 (SEQ ID NO:10), Pferde-SAA (SEQ ID NO:11), Pferde-kolostrumzugehöriges-SAA (SEQ ID NO:12), Schweine-kolostrumzugehöriges-SAA, (SEQ ID NO:13), Nerz-SAA1 (SEQ ID NO:14) und Hunde-SAAa (SEQ ID NO:15).
Ein Assay, das SAA in einer Probe aufspürt und quantifiziert ist zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Zwei Kategorien von Nachweisverfahren werden bevorzugt. Das eine ist ein immunologisches Nachweisverfahren für SAA-Protein und das andere ist ein Hybridisationsassay für SAA-Protein kodierende mRNA. Letzterer Assay ist effektiv, da SAA transkriptional reguliert wird. Entsprechend umfasst die entzündliche Reaktion einen Anstieg der SAA mRNA-Produktion und einen konkomitierenden Anstieg der Proteinproduktion.
Immunologische Nachweisverfahren für SAA bedürfen Antikörper, die für eine oder mehrere SAA-Isoformen immunologisch spezifisch sind. Gegen SAA gerichtete polyklonale oder monoklonale Antikörper können nach Standardverfahren hergestellt werden. Standardprotokollen folgend können monoklonale Antikörper entsprechend allgemeiner Verfahren nach Köhler und Milstein hergestellt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden anti-SAA-Antikörper in Tieren gezüchtet, die selbst nur wenig oder keine SAA produzieren, da für diese Tiere SAA immunogener ist. Eine bevorzugte Tierquelle für anti-SAA-Antikörper ist die Ratte. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Antikörper hergestellt, die auf eine Vielzahl von SAA-Isoformen reagieren. Solche Antikörper können polyklonale und monoklonale Antikörper sein. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Antikör per wie die von McDonald et al. (J. Imunol. Meth. 144: 149-155, 1991) beschriebenen verwendet. Diese gegen menschliches SAA gezüchteten Antikörper reagieren auch auf eine Vielzahl von SAA-Isoformen anderer Spezies einschließlich boviner SAA.
Eine Vielzahl aus dem Stand der Technik bekannter immunologischer Nachweisverfahren ist verfügbar, um SAA in Milchproben oder Proben anderer abgesonderter biologischer Fluide zu erkennen und zu quantifizieren. Ohne darauf beschränkt zu sein beinhalten diese (1) Immunopräzipitation gefolgt von Proteinquantifikation; (2) Immunoblot Analyse (d.h. Punktblot, Westernblot) (3) radioimmune Nachweisverfahren, (4) Nephelometrie, turbidometrische oder immonuchromatografische (Lateral-Flow-)Assays und (5) enzymgebundene Nachweisverfahren, einschließlich ELISA und einer Vielzahl von qualitativen Schnelltests (z.B. Dipstick- und ähnliche Tests). Aufgrund ihrer einfachen und sparsamen Verwendung und ihrer Portabillität zur Verwendung in dem Fachbereich sind von den genannten die ELISA-Assays die bevorzugt für die Erfindung benutzten.
ELISA-Assays sind entwickelt und verwendet worden, um die SAA-Menge in einer Blutprobe zu messen. Dieselben Nachweisverfahren, oder Variationen dieser wie von einem Durchschnittsfachmann erfunden, können in den Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Assays werden im Stand der Technik detailliert beschrieben (z.B. McDonald et al., 1991, supra; Satoh et al., Am. J. Vet. Res. 56: 1286-1291; Wilkins et al., Clin. Chem. 40: 1284-1290, 1994; Taktak & Lee, J. Immonul. Meth. 136: 11-16, 1991). Ein beispielhaftes Nachweisverfahren ist in Beispiel 1 dargelegt.
Hybridisationsassays zum Messen des Auftretens und der Menge von SAA-kodierender mRNA in einer Probe bedürfen Nukleinsäuresonden, die speziell mit den eine oder mehrere SAA-Isoformen kodierenden mRNA hybridisieren. Die Nutzbarkeit von Aminosäure- und Nucleotidsequenzeninformationen für eine große Vielzahl von SAAs ermöglicht die Gestaltung und Herstellung solcher Sonden gemäß bekannter Methoden. In einem Ausführungsbeispiel können die Sonden so konzipiert sein, dass sie mit einem mRNA hybridisieren, das eine bestimmte SAA-Isoform kodiert, indem Seg mente des mRNA ausgewählt werden, die auf diese Isoform beschränkt sind. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die Sonden konzipiert, um mit einem Teil des das SAA-kodierende mRNA zu hybridisieren, der über Isoformen konserviert ist, wodurch eine Sonde hergestellt wird, die eine Vielzahl von SAA-Isoform-mRNAs in der Versuchsprobe entdeckt.
Wie aus dem Stand der Technik bekannt, umfassen geeignete Hybridisationssonden einstrangige DNA- oder RNA-Moleküle. Vorzugsweise sind diese zwischen 10 und 200 Nukleotide lang und am Bevorzugtesten zwischen 18 und 100 Nukleotide lang. Die können mit einem Nachweisetikett hergestellt sein; alternativ können sie nach der Synthese nachweisbar gekennzeichnet werden. Ebenso können Sonden aus nachgebildeter DNA, die SAA kodiert, hergestellt sein.
Verfahren, in welchen die zuvor genannten Nukleinsäuren als Sonden für Hybridisationsassays verwendet werden können, beinhalten ohne darauf beschränkt zu sein: (1) Dot-Blot-Hybridisation; (2) Southern-Hybridisation (3) Northern-Hybridisation; und (4) gemischte Verstärkungsreaktionen wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden Schnellhybridisationsassays, wie Dot-Blot oder portable auf PCR basierende Nachweisverfahren, bevorzugt. Diese Nachweisverfahren sind zur Anwendung in klinischer oder fachgebietlicher Ausstattung geeignet. Solche Assays werden im Stand der Technik detailliert beschrieben (siehe z.B. „Current Protocols in Molecular Biology", eds. Frederick M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1999).
Die erfindungsgemäßen Nachweisverfahren sind in einer Vielzahl von Anwendungen von großem Nutzen und Wert. Fokussierend auf die beispielhafte Ausführungsform der Erfindungen sind die Nachweisverfahren besonders zur Verwendung in Früh- und örtlich begrenzter Erkennung von Brustentzündung verbunden mit Mastitis geeignet. Auf diesen Nutzen erweiternd können die Nachweisverfahren auch verwendet werden, um die therapeutische Wirkungsweise der Behandlung von Mastitis zu beobachten. Die Behandlung kann eine bewährte Behandlung umfassen. Alternativ können die Assays verwendet werden, um die Wirkungsweise von neuen therapeutischen Mitteln und Heilbehandlungskuren zu überprüfen und auszuwerten. In diesem Ausführungsbeispiel wird die Milch von (neuen Verfahren oder Mitteln ausgesetzten) Kontroll- und Testtieren auf das Vorhandensein und die Menge von SAA unersucht. Ein SAA-Anstieg in der Versuchsprobe, verglichen mit der Kontrollprobe, ist Indikativ dafür, dass das neue therapeutische Mittel oder Verfahren wirksam ist die Entzündung zu beeinflussen.
Die oben beschriebenen Nachweisverfahren können auch verwendet werden, um festzustellen, ob auf Eutergewebe applizierte therapeutische oder andere Mittel irgendwelche schädlichen entzündlichen Nebenwirkungen verursachen. In diesem Ausführungsbeispiel, wie oben erwähnt, werden von behandelten Testtieren stammende Proben mit Milchproben von Kontrolltieren bzgl. Auftreten und Menge von SAA verglichen. In diesem Ausführungsbeispiel indiziert ein erhöhter SAA-Level in der Testprobe verglichen mit der Kontrollprobe, dass die Behandlung eine schädliche entzündliche Nebenwirkung hat.
Die erfindungsgemäßen Assays können ebenfalls zur Überwachung von Milchqualität verwendet werden. Eine geläufige Praxis in vielen Teilen der Welt ist es, einer Milchcharge eine Wertigkeit zuzuordnen. Auf diese Weise wird eine von einem Landwirt verkaufte Milchcharge auf Qualität überprüft, indem die Anzahl der somatischen Zellen in einer Milchprobe gemessen wird, die der Prävalenz von klinischer und subklinischer Mastitis in der Milchherde entspricht. Die Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung bieten eine schnelle, zweckmäßige Alternative zur Messung somatischer Zellen, um die Qualität einer Milchcharge auszuwerten.
Da SAA in der Kolostralmilch und nicht in der von normalem Brustgewebe stammenden Milch erhöht ist, kann als ein weiteres nützliches Ausführungsbeispiel die Messung von SAA in einer Milchprobe verwendet werden, um Kolostrum von Milch zu differenzieren. Somit können in Umständen, in denen es unerwünscht ist, dass die Milch Kolostrum enthält (in einigen Ländern existieren hierzu Gesetze), die Verfahren der Erfindung verwendet werden, um mit Kolostrum behaftete Milch zu erkennen.
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Erfindung noch detaillierter zu beschreiben. Durch sie soll die Erfindung dargestellt, jedoch nicht begrenzt werden.
BEISPIEL I
Immunoassay für SAA
1. Zubereitung von Mikrotiter-Platten
96 Well Mikrotiter-Platten wurden hergestellt durch Bebrüten jedes Wells mit 100 μl Rattenmonoklonalantikörper zu boviner SAA (Titer = 5,0 μg/ml) in Karbonatpuffer (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃ und einem pH von 9,6). Dieser plattenbedeckende Antikörper wird als C-100-8 bezeichnet. Platten wurden für 12 Stunden bei 4 °C bebrütet, sodann wird die Antiserenlösung aspiriert und die Platten gewaschen, indem alle Wells viermal mit PBS-Tween gefüllt und geleert werden, das aus 0,05 % v/v Tween 20 (Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat) in Phosphat gepufferte Saline (PBS = 0,010 M Na₂HPO₄,2H₂O, 0,003 M KH₂ PO₄, 0,132 M NaCl, pH von 7,2). Platten wurden bei 22 °C für 1 Stunde mit StabilCoat (SurModicsInc., Eden Prairie, MN) behandelt, dann in Folienbeutel eingeschlossen.
2. Bezugsnormal:
Eine Lösung, die bekannte Standardkonzentrationen boviner SAA mit 37,5 ng/ml enthält, wurde zweifach serienmäßig sechsmal in PBS-Tween weiter verdünnt. Fünfzig Mikroliter (50 μl) der Norm und jede der folgenden 6 Serienverdünnungen wurden zur Festsetzung einer Standardkurve auf der Platte verwendet. Die Norm beinhaltete 37,5 ng/ml und die folgenden Zweifachverdünnungen beinhalteten 18,8, 9,4, 4,7, 2,3, 1,20 bzw. 0,60 ng/ml. Fünfzig μl PBS-Tween ohne SAA begründeten Hintergrundmesswerte.
3. Nachweisverfahren (Standard-Sandwich-ELISA)

a. Wells wurden dreimal mit PBS-Tween Waschpuffer gewaschen. Nach der letzten Wäsche werden die Wells auf Saugpapier getrocknet.
b. 50 μl biotinisierte Rattenmonoklonalantikörper wurden zu boviner SAA (1 μg/ml) jedem Well zugegeben. Dieser Antikörper wird als C-100-7 bezeichnet und hat eine andere Epitopausprägung für SAA als der plattenbedeckende Antikörper.
c. Serum, Kolostrum oder Milchproben wiesen Raumtemperatur auf und wurden energisch gevortext, bevor Lösungen hergestellt wurden. Proben wurden 1 : 500 verdünnt. In einigen Fällen können Proben größerer Verdünnung bedürfen, um in den Bereich des Assays zu fallen. 50 μl der verdünnten Probe oder der Norm wurden jedem Well zugeführt. Seiten der Platte wurden zum behutsamen Mischen abgeklopft.
d. Die Platte wurde mit einer Staubschicht bedeckt und für 1 h bei 37 °C bebrütet. e. Im Anschluss an die Bebrütung wurde die Platte aspiriert oder abgegossen, sodann dreimal mit PBS-Tween Waschpuffer gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurde die Platte auf Saugpapier getrocknet.
f. 100 μl Streptavidin-Peroxidase (100 ng/ml) wurde jedem der Wells zugeführt.
g. Die Platte wurde abgedeckt und bei Raumtemperatur im Dunklen für 30 Minuten bebrütet.
h. Die Wells wurden aspiriert oder abgegossen, dann mit PBS-Tween dreimal gewaschen und die Platte nach der letzten Wäsche getrocknet.
i. 100 μl Substrat bestehend aus 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin wurde bei 10 μg/ml (0,1 mg gelöst in 0,1 ml Dimethylsulfoxyd und 9,9 ml von 0,1 M Sodiumacetat pH 6,0 zugeführt) zugeführt.
j. Die Platte wurde bedeckt und für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur bebrütet.
k. 50 μl einer Stoplösung aus H₂SO4 (zubereitet durch Zugabe von 2,8 ml konzentriertem H₂SO4 zu 97,2 ml Wasser) wurde zugeführt.
l. Die Absorption eines jeden Wells wurde bei 450 nm abgelesen, wobei der Plattenableser gelöscht wurde gegen ein Chromagenrohstück einzig bestehend aus 100 μl TBM-Substrat und 50 μl Stoplösung.
m. Die Absorption der Normen wurde über Standardkonzentration auf Millimeterpapier aufgetragen. Die Hintergrundabsorption für die 0 ng/ml kann von jedem der Datenpunkte abgezogen werden, einschließlich der Normen, Unbekannten und Kontrollen vor dem Auftragen.
n. Die Konzentrationen der Testproben und Kontrollen wurden von der Standardkurve bestimmt, indem der interpolierte Wert mit dem zugehörigen Verdünnungsfaktor (z.B. 500 verdünntes Kolostrum oder Milch sollte multipliziert werden mit 500) multipliziert wurde. Proben mit einer Anzeige, die größer ist, als die höchste Norm, wurden in Verdünnungspuffer weiter verdünnt und erneut analysiert.

BEISPIEL II
Bestimmung von SAA in Kolostrum und anschließende serielle Milchprobenentnahme
Der Zweck dieser Studie war es, Kolostrum und anschließende serielle Milchproben auszuwerten, um den SAA-Gehalt zu bestimmen. Proben wurden erlangt von Holstein-Milchkühen der Universität von Nebraska – Lincoln Molkereiforschungseinrichtung. Kolostrumproben wurden während des Kalbens entnommen und anschließende Milchproben wurden drei Wochen lang zweimal wöchentlich entnommen. Proben von allen vier Euterquadranten wurden zusammengefasst. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Die oben erzielten Ergebnisse für Kühe 83, 908 und 961, von denen jede in allen Quadranten frei von Mastitis war, zeigen den geringen fundamentalen Level von in normalen Milchproben vorhandenem SAA nachdem das Kolostrum beseitigt wurde.
Die oben erzielen Ergebnisse für Kuh 932 demonstrieren, dass SAA-Leve1 effektiv Mastitis in einer quadrantenspezifischen Weise entdecken kann. Mitten in der Probenentnahmeperiode konnte beobachtet werden, dass die Kuh 932 in einem Quadranten symptomatisch für Mastitis war. Obwohl die Milch aller vier Quadranten in den ersten drei Milchprobenentnahmen zusammengefasst wurde, wiesen die Proben eine SAA-Erhöhung auf. In den anschließenden Probenentnahmen wurde der Mastitisquadrant nicht gemolken und daher nicht mit der Milch der nicht betroffenen Quadranten zusammenfasst. Das Ergebnis war, dass SAA-Level in diesen Proben auf ungefähr die Level zurückgingen, die in vollständig asymptomatischen Kühen beobachtet wurden.
BEISPIEL III
SAA-Level als quadrantspezifischer Indikator für Mastitis
Der Zweck dieser Studie war es festzustellen, ob SAA mit Mastitis in Beziehung stehende Entzündung bestimmen kann und ob SAA nur in dem betroffenen Quadranten oder in Milch aller Quadranten erhöht ist.
Proben wurden erlangt von Holstein-Milchkühen der Universität von Nebraska – Lincoln Molkereiforschungseinrichtung. Drei Kühe mit Mastitis im linken hinteren (LR) Quadranten des Euters wurden ausgewählt. Jede Kuh wurde bezüglich des in jeder Kuh vorhandenen Entzündungslevels visuell beurteilt. Kuh 874 entwickelte eine minderwertige Entzündung, während Kuh 59 eine signifikante Entzündung entwickelte und Kuh 978 eine hochgradige Entzündung entwickelte.
Milchproben wurden von allen vier Quadranten jeder Kuh entnommen und SAA-Level wurden durch ELISA für die nicht zusammengefassten Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: SAA-Level in Milch von Euterquadranten
Die Ergebnisse demonstrieren, dass SAA-Level einen quadrantenspezifischen Entzündungsindikator aufgrund von Mastitis zur Verfügung stellen. Die SAA-Erhöhung ist auf den betroffenen Quadranten beschränkt. Darüber hinaus wurde eine direkte Korrelation zwischen den visuellen Entzündungssymptomen und den in den betroffenen Quadranten entdeckten SAA-Level beobachtet.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele begrenzt, sondern kann innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche modifiziert werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Ermitteln einer entzündlichen Reaktion in einer Brust eines säugenden Säugers, welches Messen des Auftretens oder der Menge eines Serums Amyloid A (SAA)-Proteins oder das Protein verschlüsselndes mRNA in einer von der Brust erhaltenen Milchprobe umfasst, wobei die in der Probe vorhandene SAA-Protein- oder mRNA-Menge mit der entzündlichen Reaktion positiv korreliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die entzündliche Reaktion des Säugers Mastitis ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mastitis durch Infektion mit einem Mikroorganismus verursacht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die entzündliche Reaktion durch ein nicht-infektiöses Mittel verursacht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das SAA eine oder mehrere auf Entzündung reagierende SAA-Isoformen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das SAA eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS : 1-15.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Messen der SAA-Proteinmenge in der Milchprobe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die SAA-Proteinmenge gemessen wird durch ein immunologisches Nachweisverfahren mit Antikörpern, die für eine oder mehrere SAA-Isoformen immunologisch spezifisch sind.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologische Nachweisverfahren ein ELISA-Assay ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Messen der SAA mRNA-Menge in der Milchprobe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die SAA mRNA-Menge gemessen wird mit einem Hybridisationsassay mit zu den SAA mRNA komplementären Nukleinsäuremolekülen.
Verfahren zur Qualitätsbewertung einer Milchprobe, welches umfasst: (a) Festsetzen eines Standards, der eine vorbestimmte Milchqualität mit einer vorbestimmten darin enthaltenen SAA-Konzentration korreliert; (b) Messung von SAA-Konzentration in der auf Qualität untersuchten Milchprobe; (c) Vergleich der SAA-Menge in der Milchprobe mit dem festgesetzten Standard; und (d) Bestimmung einer Qualitätsbeurteilung der Milchprobe basierend auf dem Vergleich mit dem Standard.
Verfahren zum Ermitteln des Auftretens oder der Menge eines Kolostrums in einer Milchprobe, welches umfasst: (a) Messen von SAA-Konzentration in einer mutmaßlich Kolostrum enthaltenden Milchtestprobe; (b) Vergleich der SAA-Menge in der Testprobe mit einer SAA-Menge in einer als frei von Kolostrum bekannten Kontrollmilchprobe, wobei eine SAA-Erhöhung in der Testprobe verglichen mit der Kontrollprobe Indikativ für das Auftreten und die Menge von Kolostrum in der Testprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass dieses des Weiteren Messen einer kolostrumspezifischen SAA-Isoform umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass dieses des Weiteren Messen einer kolostrumspezifischen SAA-Isoform umfasst.