EP2457093A1 - Verfahren, insbesondere enzyme-linked immunosorbent assay (elisa), zum in vitro nachweis von amyloid beta autoantikörpern, mikrotiterplatte und testkit - Google Patents

Verfahren, insbesondere enzyme-linked immunosorbent assay (elisa), zum in vitro nachweis von amyloid beta autoantikörpern, mikrotiterplatte und testkit

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EP2457093A1
EP2457093A1 EP10747569A EP10747569A EP2457093A1 EP 2457093 A1 EP2457093 A1 EP 2457093A1 EP 10747569 A EP10747569 A EP 10747569A EP 10747569 A EP10747569 A EP 10747569A EP 2457093 A1 EP2457093 A1 EP 2457093A1
Authority
EP
European Patent Office
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microtiter plate
solution
solid phase
antigen
wells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10747569A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Bacher
Richard Dodel
Karthikeyan Balakrishnan
Original Assignee
Philipps Universitaet Marburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Philipps Universitaet Marburg filed Critical Philipps Universitaet Marburg
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the invention relates to a method, in particular an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), for in vitro detection of amyloid beta autoantibodies according to the preamble of claim 1, a microtiter plate according to claim 17, and a test kit according to claim 23.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Analyte an antigen to be detected in a sample to be examined or an antibody to be detected.
  • Antigen A protein / polypeptide that causes the production of
  • Antibodies causes when it is injected into an animal organism (antigen stimulus).
  • Antibody A protein that is produced in response to the antigen stimulus and specifically recognizes and binds the stimulus-producing antigen.
  • anti-species antibody An antibody that is produced when proteins (including
  • Antibodies of a species of another species, recognize and bind to all antigens derived from the first species.
  • Binding partner An antigen or antibody that specifically binds to the analyte.
  • Detection antibody binds to the analyte, but not to the binding partner of the analyte and is either with a detection agent or with an immediately detectable substance, such as a
  • the detection means may be an enzyme which is capable of cleaving a specific substrate such that a color reaction is produced.
  • the detection antibody may also be referred to as
  • the course of such a detection method is basically as follows: The binding partner of the analyte is immobilized on a solid phase. Subsequently, the solid phase is incubated with a sample possibly containing the analyte to be detected. If analyte is present in the sample, it binds to the immobilized on the solid phase binding partner and is also immobilized in this way. The binding of the analyte to its binding partner is then detected by means of a detection antibody. For this purpose, the solid phase, on which now the binding partner holds the analyte, incubated with a solution containing the detection antibody. This binds to the immobilized analyte and can then be detected, for example, by carrying out an enzyme-substrate reaction with the aid of the enzyme conjugated to the detection antibody.
  • Such detection methods are preferably used in medical diagnostics in order to obtain tissue or body fluid samples from animals and / or humans Presence or absence of antigens. From the result of the proof then for example statements about possible illnesses of the examinee can be made.
  • a prominent example of diseases that can be examined in this way is Alzheimer's disease. This disease is characterized by a number of neuropathological characteristics, one of which is particularly typical of the formation of so-called neuritic plaques in the brain of patients. These plaques are composed of extracellularly deposited amyloid beta-peptides (A ⁇ ) that result from the cleavage of the amyloid precursor protein (APP) (Kang et al., Nature, 1987.
  • a problem with conventional ELISA for detecting A ⁇ is that not all A ⁇ forms are actually pathological, and that antibodies that specifically recognize the pathological forms are only available to a very limited extent and therefore are very expensive, so at least two specific antibodies are required for detection - one as an immobilized binding partner on the solid phase and a second as a detection antibody Accordingly, also come from different species, since the detection otherwise the risk of a very high background The risk of delivering a high number of false positive results Although the formation of nonspecific background can be reduced by the fact that the detection antibody does not bind directly to the bound Aß peptide, but to a secondary antibody, which recognizes the bound Analtyten and binds but is not enzyme-conjugated.
  • Alzheimer's disease in 2001 they observed that both in body fluids of healthy individuals and in body fluids of diseased Alzheimer's patients natural antibodies against A ⁇ peptides are present (compare Du et al., "Reduced levels of amyloid ß-peptide antibody in Alzheimer's disease", Neurology 2001), so-called amyloid beta autoantibodies (Aß autoantibodies) so-called autoantibodies, if Alzheimer's disease is present.
  • Aß autoantibodies amyloid beta autoantibodies
  • the object of the invention is therefore to provide an improved ELISA for the detection of Aß- Autoantiköpern available that allows rapid evaluation with simple and inexpensive means.
  • the ELISA should be quick and easy to perform, especially with human serum and / or plasma samples as well as CSF samples.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • providing the antigen-coated solid phase comprises incubating the solid phase with a coating solution in which an antigen having a peptide sequence selected from the group SEQ ID NO. 1, SEQ ID no. 2 or SEQ ID No 3.
  • SEQ ID no. 2 or SEQ ID NO. 3 has, is coated. Surprisingly, such 40 to 46 amino acid-long peptides show a very fast
  • the autoantibodies to be detected in the ELISA therefore bind rapidly and reliably to the antigens immobilized on the solid phase. It is particularly advantageous if the antigen has a peptide sequence corresponding to SEQ ID no. 1 or SEQ ID NO. 2 has.
  • a particularly critical point in the establishment of an ELISA is, as stated above, the coating of the solid phase with the binding partner of the analyte.
  • the coating solution is a carbonate buffer with basic pH. It has thus been shown that the antigens according to the invention bind significantly better to the solid phase in a basic medium, in particular at a pH of 9.6, than in the conventionally used neutral medium at about pH 7.
  • the incubation of the solid phase with the coating solution can be carried out both at 4 0 C overnight, which is particularly advantageous when using an antigen having a sequence corresponding to SEQ ID NO. 1, as well as at 37 ° C and 5% CO 2 for 2 hours, which is preferred when using an antigen having a sequence corresponding to SEQ ID NO. 2 is the case.
  • blocking serves to cover the areas of the solid phase surface to which no antigen is bound, so that the analyte to be detected in the subsequent incubation with the sample can bind exclusively to the antigens and not to the solid phase itself.
  • the blocking solution is a Tris-buffered protein solution with pH 7.4, containing at least one anti-microbial agent.
  • the commercially available blocking solution Superblock TBS® or Superblock® from Pierce, Germany can be used.
  • the incubation with the blocking solution is preferably carried out at 4 ° C overnight. In this way, the free surface of the solid phase can be covered at the sites where no antigen is bound particularly well with the protein contained in the blocking solution. This effectively prevents antigens or antibodies present in the sample from nonspecifically binding to the solid phase, thus providing unwanted false-positive signals, also referred to as non-specific interfering background.
  • the solid phase is a microtiter plate.
  • This usually has several sections for the analysis of patient samples or standard and control, so-called wells. All wells of a microtiter plate can be prepared identically. Usually, all wells are simultaneously coated with antigen and then blocked. Subsequently, each particular wells are filled with a defined amount of standard, patient sample and control and treated further. The same volume of liquid is filled into each well. However, the respective concentration of standard, patient sample and control is varied by suitable dilution from well to well, in order to allow the most precise possible concentration determination of the analyte to be detected.
  • Another advantage of the invention is that the wells are filled with a relatively high total volume, namely up to 300 .mu.l, but which contains only a relatively small proportion of sample (ie either standard, patient sample or control).
  • an embodiment of the detection method according to the invention provides that the wells are first filled with 250 ⁇ l of an assay buffer. Subsequently, only 10 ⁇ l of the sample to be examined are added to this buffer.
  • the assay buffer serves for the defined dilution of the sample.
  • sample dilution buffer is preferably such that it does not interfere with the serum matrix upon dilution.
  • the wells are filled with 200 ⁇ l of prediluted sample. After filling the wells with the samples (ie standard, patient sample and control), the microtiter plate is incubated for 60 minutes on a shaker at 300 to 500 rpm and room temperature.
  • the incubation of the microtiter plate with the solution to be examined advantageously comprises the following steps: introduction of diluted sample into each well of the microtiter plate, wherein the introduction of the diluted sample is carried out so that thereafter in each well a total volume of 200 to 300 .mu.l Assay buffer containing the sample, and incubate for 60 minutes on a shaker at 300 to 500 rpm and room temperature.
  • the assay buffer is preferably a sodium phosphate buffer at pH 7.0, comprising 3 to 9% BSA, 0.01 to 3% TWEEN and at least one preservative selected from the group 5-bromo-5-nitro- 1,3-dioxane (BND), 2-chloroacetamide (CAA), 2-hydroxypyridine N-oxide (HPO), N-methylisothiazolone (MIT), sodium azide, thimerosal, proclin.
  • BND 5-bromo-5-nitro- 1,3-dioxane
  • CAA 2-chloroacetamide
  • HPO 2-hydroxypyridine N-oxide
  • MIT N-methylisothiazolone
  • the next step of the method of the invention is the immunological detection of the A ⁇ autoantibody captured by the binding partner on the solid phase. This is done by the following steps: tapping the contents out of the wells, washing the wells three to five times with in each case 300 to 500 .mu.l wash solution per well, removing remaining liquid drops by stripping the wells on a suction paper, introducing from 50 .mu.l to 100 .mu.l enzyme Conjugate in each well, incubate on a shaker at 300 to 500 rpm and room temperature for 30 to 60 minutes, Shake out the contents from the wells, wash the wells three to five times with each 300 to 500 .mu.l wash solution per well, remove remaining drops of liquid by wiping the wells on a suction paper, add 50 .mu.l substrate solution to each well, incubate for 15 to 20 minutes Room temperature and stopping the enzymatic reaction by adding 100 ⁇ l stop solution to each well.
  • the washing solution is preferably a Tris buffer containing 0.01 to 3% Tween.
  • a particular advantage of the ELISA according to the invention is that the binding kinetics of the A ⁇ autoantibody to the antigens according to the invention is so optimal that a chromogenic enzyme-substrate reaction can be used for immunological detection, the result of which is determined by determining the optical density
  • the enzyme conjugate introduced into the wells after the first wash contains the detection antibody. It is preferably an antibody directed against human IgG ( ⁇ -human IgG). This may, for example, come from one of the following species: goat, mouse, guinea pig, rat, donkey, cattle, sheep or pig. While others are generally less common, they are conceivable.
  • the a-human IgG antibody is conjugated with an enzyme or a dye so that it can be visualized either directly - if it is, for example, a fluorescent dye - or by reacting a substrate with the aid of the enzyme.
  • the enzyme may be, for example, an enzyme selected from the group consisting of peroxidase (POD), horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal).
  • POD peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -gal
  • the enzyme conjugate contains an enzyme conjugated anti-human IgG antibody derived from a species selected from goat, mouse, guinea pig, rat, donkey, bovine, sheep, with the antibody conjugated to the antibody selected horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), ß-galactosidase (ß-Gal).
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • ß-Gal ß-galactosidase
  • Suitable substrates may for example be selected from the following group: 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), 4-chloro-1-naphthol (CN), tetramethylbenzidine (TMB), vomuchsin, Naphthol AS-MX phosphate, 5-bromo-5-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium chloride (NBT), 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-galactopyranoside (X- GaI), 5-bromo-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Blue-Gal), 6-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Y-GaI), 5-iodo-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Purple-Gal),
  • the substrate solution contains at least one chromophore selected from the group 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), 4-chloro-1-naphthol (CN), 3,3 ' , 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), damuchsin, naphthol AS-MX phosphate, 5-bromo-5-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium chloride (NBT), 5-bromo-4-chloro 3-indoxyl- ⁇ -D-galactopyranoside (X-GaI), 5-bromo-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Blue-Gal), ⁇ -chloro-S-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (Y -GaI), 5-iodo-3-indolyl- ⁇
  • the substrate to be cleaved by the enzyme is usually added in excess, it is necessary to end the enzyme-substrate reaction in a controlled manner after a defined period of time. This can be done, for example, by adding stop solution. This changes the reaction conditions such that the enzyme-substrate reaction can not continue.
  • the reaction is preferably stopped by adding an acid, usually sulfuric acid.
  • the stop solution is then the simplest Case from the diluted acid. It can be seen that the stop solution has a pH of less than 7.0 and is preferably a dilute hydrochloric or sulfuric acid.
  • the invention also provides a microtiter plate having at least one well, each well containing a peptide corresponding to one of the sequences SEQ ID NO. 1 to 3 is coated.
  • a microtiter plate having at least one well, each well containing a peptide corresponding to one of the sequences SEQ ID NO. 1 to 3 is coated.
  • Such a microtiter plate can be used with great advantage in order to carry out the method according to the invention.
  • the microtiter plate has at least one test unit comprising 24 wells.
  • the 24 wells can then be divided into three groups.
  • the first eight wells are loaded with eight different concentrations of the standard. From the measured values obtained therefrom, the
  • Comparison curve can be determined. The second eight wells come with eight different ones
  • the microtiter plate has a plurality of test units which can be used independently of one another.
  • a large microtiter plate with a plurality of linearly successively arranged test units is conceivable, which can be bent or broken off with the aid of a perforation or groove before use of the microtiter plate.
  • microtiter plates whose wells have a flat bottom as well as wells with a round, v-shaped or c-shaped bottom are suitable for carrying out the method according to the invention. Men therefore recognized that it is also advantageous in the case of the microtiter plate according to the invention that the wells have a round, flat, V-shaped or C-shaped bottom.
  • a microtiter plate of the invention is particularly advantageously produced by a method comprising the steps of: providing an uncoated microtiter plate, incubating the microtiter plate with a coating solution consisting of a basic pH 9.6 carbonate buffer containing 5 ⁇ g / ml of a Antigen according to one of the sequences according to SEQ ID no. 1, 2 or 3, for two hours at 37 °, and incubating the microtiter plate with a blocking solution containing a pH 7.4 Tris-buffered protein solution at least one anti-microbial agent, at 4 ° C overnight.
  • microtiter plate according to the invention for use in a method according to the invention.
  • the invention further provides a test kit for detecting A ⁇ autoantibodies in serum samples, comprising at least one antigen-coated microtiter plate, wherein the antigen is a peptide whose sequence is a sequence selected from SEQ. ID. 1, 2 or 3 corresponds. It is particularly favorable if the test kit also contains ready-made reagents for carrying out the test. The operator then only has to add the corresponding serum sample to be examined and a corresponding appropriate control sample. It is also conceivable that the test kit already contains a selection of control samples. It will be appreciated that the test kit preferably contains a standard, assay buffer, wash solution, enzyme conjugate, substrate solution and / or stop solution.
  • test kit according to the invention is suitable for use in a method according to the invention.
  • FIG. 3 with the aid of the ELISA according to the invention, embodiment 3 corresponds to certain amyloid beta-autoantibody concentrations in two of the morbus
  • all three peptides which can be used according to the invention for coating the solid phase have at least the amino acids 1 to 40 of the naturally occurring A ⁇ peptide.
  • the framed sequence regions correspond in each case to the sequence of the A ⁇ 1-4 o-peptide, the gray-shaded sequence regions of the sequence of the A ⁇ 1-42 peptide.
  • Cys amyloid beta 1-42 and SEQ ID NO. 1 corresponding sequence also includes C-terminal amino acids 41 and 42 of the amyloid beta peptide (Aß) and N-terminal four additional amino acids, namely the tetrapeptide CGKR. It is therefore the case of SEQ ID no. 1 corresponding antigen to a total of 46 amino acid polypeptide, which is composed of the tetrapeptide CGKR followed by the amino acids 1 to 42 of
  • SEQ ID NO. 1 denotes a modified human peptide whose amino acids 5 to 46 represent the sequence of the naturally occurring human amyloid beta 1-42 peptide, to which is attached N-terminally the tetrapeptide Cys Gly Lys Arg containing amino acids 1 to 4 of SEQ ID No. 1 corresponds. It is further evident in FIG. 1 that SEQ ID no. 2, which is referred to as amyloid beta 1-42, the natural sequence of the amyloid beta 1-42 peptide equivalent. It is therefore the case of SEQ ID no. 2 corresponding antigen to a total of 42 amino acids existing polypeptide, which corresponds to the amino acids 1 to 42 of the Aß 1 ⁇ 2 peptide.
  • SEQ ID NO. Designated Cys amyloid beta 1-40.
  • Figure 3 corresponds to the natural amyloid beta 1-40 peptide (A ⁇ ⁇ o). However, the peptide at the N-terminus was modified by the attachment of a cysteine. It is therefore the case of SEQ ID no. 3 corresponding antigen to a total of 41 amino acid polypeptide, which is composed of the amino acids 1 to 40 of the Aß ⁇ o-peptide and an N-terminal added cysteine.
  • SEQ ID NO. Designated Cys amyloid beta 1-40.
  • Figure 3 corresponds to the natural amyloid beta 1-40 peptide (A ⁇ ⁇ o). However, the peptide at the N-terminus was modified by the attachment of a cysteine. It is therefore the case of SEQ ID no. 3 corresponding antigen to a total of 41 amino acid polypeptide, which is composed of the amino acids 1 to 40 of the Aß ⁇ o-peptide and an N-terminal added cysteine.
  • FIG. 2 shows the OD 450 measured values of a method according to the invention carried out in accordance with the protocol of exemplary embodiment 3.
  • FIG. 3 illustrates that data obtained with the aid of the method according to the invention can be used inter alia for the diagnosis of Alzheimer's disease or other neurodegenerative diseases.
  • microtiter plates with an antigen corresponding to SEQ ID no. 1, ie an Aß peptide comprising amino acids 1 to 42 and N-terminal additionally carries the amino acid sequence CGKR coated.
  • the antigen is dissolved in a carbonate buffer with pH 9.6. After incubation with the coating solution thus prepared, the microtiter plate is incubated with blocking solution.
  • sample which is either the standard, a control or the sample actually to be assayed, to the assay buffer.
  • sample is thus diluted in assay buffer such that, in the end, there is a volume of 260 ⁇ l of diluted sample in each well.
  • the plate with the thus diluted samples is incubated for 60 minutes on a shaker at 300 to 500 rpm at room temperature.
  • the contents of the wells are immediately poured out and washed each well 3 times with 400 .mu.l washing solution.
  • the wells are tapped on absorbent paper.
  • Embodiment 2 essentially corresponds to embodiment 1 already described above. However, the wells are loaded with a total volume of 200 ⁇ l of diluted sample. After removing the sample, the wells are each washed five times with wash solution, then 100 ⁇ l enzyme conjugate are added to each well.
  • the reaction of the enzyme with the chromophore occurs during a 15 minute incubation at room temperature.
  • an antigen corresponding to SEQ ID no. 2, so the peptide A ⁇ 1-42 diluted in a concentration of 5 ug / ml in 0.1 M sodium carbonate buffer of pH 9.6.
  • This solution is used to incubate a solid phase, namely a 96-well-high-binding ELISA plate, for 2 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator at 5% CO 2 . Subsequently, the plate is incubated overnight with a commercially available blocking solution. The thus prepared plate is washed four times with a washing solution according to the invention.
  • an HRP-coupled anti-human second antibody is used for detection of A ⁇ autoantibody bound on the plate. This is diluted 1: 4000 in the previously used blocking solution.
  • the chromogenic substrate used is TMB.
  • the color reaction is stopped with the aid of sulfuric acid and evaluated at a wavelength of 450 nm by determining the OD.
  • the OD of the standards is first determined and then compared with the samples or controls. For this purpose, a comparison curve is first determined using a defined concentration series of the standard. The samples and controls are applied several times and at different dilutions.
  • microtiter plate The exemplary loading of a microtiter plate can look like this:
  • Wells 1 to 8 Standard in different concentrations to create a
  • Wells 17 to 24 Sample of a potentially ill person to be measured at various dilutions
  • the design of the test may be varied as needed.
  • a total of 40 wells to be measured in a microtiter plate were loaded as shown in table 1.
  • the first 16 wells are loaded with a standard dilution series to create a comparison curve from which the OD readings of the samples can be used to calculate the concentration of A ⁇ autoantibodies present in the samples.
  • Table 1 Loading scheme for 40 wells of a microtiter plate according to the invention:
  • Wells 17 to 24 serial dilution of a first diseased person serum
  • wells 25 to 32 dilution series of a second diseased person serum sample
  • wells 33 to 40 serial dilution of a healthy control subject serum sample.
  • the wells of the microtiter plate loaded with sample or standard as shown in Table 1 are incubated for 4 hours at 37 ° C. according to the protocol described above, then washed, incubated with enzyme conjugate, washed again and incubated with substrate solution. After stopping the enzyme-substrate reaction, the OD 450 is determined with a corresponding reader.
  • FIG. 2 a shows the measured values of such an OD 450 determination.
  • Curve 1 shows the OD readings of the wells loaded with the standard set
  • curve 2 the measured values of the diluted serum samples of the diseased person 1
  • curve 3 the measured values of the diluted serum samples of the diseased person 2
  • curve 4 the measured values of the diluted serum Samples of the control person.
  • the concentrations of A ⁇ autoantibodies in the respective serum samples can be calculated from the OD 450 values following the measurement.
  • both diseased persons each have more than 900 ug / ml Aß autoantibodies in the serum.
  • the healthy control subject shows a significantly lower value of only about 840 ⁇ g / ml.
  • 96-well ELISA plates with an antigen corresponding to SEQ ID no. 3, ie an A ⁇ ⁇ peptide, which is N-terminally provided with a cysteine coated ie an A ⁇ ⁇ peptide, which is N-terminally provided with a cysteine coated.
  • the ELISA plates are incubated at 4 C C overnight with a coating solution.
  • a coating solution 5 ⁇ g / ml of antigen are dissolved in a 100 mM sodium bicarbonate buffer of pH 9.6 immediately before incubation.
  • the plates are incubated with blocking solution for 2 hours at room temperature, or alternatively at 4 C C overnight.
  • the blocking solution used is a commercially available solution, for example SuperBlock from Pierce, Germany.
  • human IVIgG affinity purified autoantibodies are diluted with saline, which has a pH of 7.4, in concentrations from 50 to 0.78 ⁇ g / ml.
  • the standards thus prepared are incubated at 4 ° C overnight on the antigen-coated plates.
  • the second antibody used is a goat HRP-conjugated ⁇ -human antibody which specifically recognizes the heavy and light chains of immunoglobulins (HRP-labeled H & L chain specific Goat anti-human from Calbiochem, Darmstadt, Germany).
  • the chromogenic substrate used is 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB).
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • the enzymatic reaction is terminated with 2N sulfuric acid (H 2 SO 4 ).
  • the plates are evaluated at 450 nm using a Thermo Electron Corp reader.
  • the invention comprises a test kit for carrying out an ELISA according to the invention.
  • the test kit contains a microtiter plate coated with a peptide having a sequence corresponding to SED ID no. 1 has and as
  • Antigen is the immobilized binding partner for the Aß autoantibodies to be detected.
  • the kit also contains blocking solution, wash solution, assay buffer, concentrated amount of standard, enzyme conjugate, substrate and stop solution.
  • the invention is not limited to one of the above-described embodiments, but can be modified in many ways. It will be appreciated that in a method, in particular enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), for the in vitro detection of A ⁇ autoantibodies in human serum and / or plasma, comprising the steps of providing an antigen-coated solid phase, incubating the solid phase with a Blocking solution, incubating the solid phase with a sample to be examined, immunological detection of Aß- autoantibody on the solid phase and reading the detection result on the solid phase using a reader is advantageous if the provision of the antigen coated solid phase comprises incubating the solid phase with a coating solution in which an antigen is dissolved, which contains a peptide sequence selected from the group SEQ ID NO.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the antigen is preferably a peptide sequence corresponding to SEQ ID no. 1 has.
  • the coating solution is a basic pH carbonate buffer and if the blocking solution is a pH 7.4 Tris-buffered protein solution containing at least one anti-microbial agent. Incubation of the solid phase with the coating solution is carried out at 4 ° C overnight or at 37 ° C and 5% CO 2 for 2 hours. Incubation with the blocking solution is carried out at 4 ° C overnight.
  • the solid phase is preferably a microtiter plate and the incubation of the microtiter plate with the solution to be examined comprises the following steps: introduction of diluted sample into each well of the microtiter plate, wherein the introduction of the diluted sample is carried out such that thereafter in each well a total volume of 200 to 300 ⁇ l of assay buffer containing the sample, incubate for 60 minutes on a shaker at 300 to 500 rpm and room temperature.
  • the immunological detection of the A ⁇ autoantibody comprises the following steps: tapping the contents out of the wells, washing the wells three to five times with each 300 to 500 ⁇ l washing solution per well, removing remaining liquid drops by stripping the dishes on a suction paper, introducing 50 ⁇ l to 100 ⁇ l of enzyme
  • the reading of the detection result is carried out at 450 ⁇ 10 nm, preferably within 10 minutes after the addition of the stop solution.
  • the assay buffer is a sodium phosphate buffer at pH 7.0, comprising 3 to 9% BSA, 0.01 to 3% TWEEN and at least one
  • Preservatives selected from the group consisting of 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane
  • each well is reacted with a peptide corresponding to one of the sequences SEQ ID NO. 1 to 3 is coated.
  • the peptide corresponding to one of the sequences SEQ ID NO. 1 to 3 is coated.
  • Microtiter plate at least one test unit comprising 24 wells.
  • the test unit comprising 24 wells.
  • Microtiter plate very particularly preferably a plurality of test units, which are used independently of each other.
  • the wells may have a round, flat, V-shaped or C-shaped bottom.
  • a microtiter plate according to the invention is according to a
  • a process prepared comprising the steps of: providing an uncoated one
  • Microtiter plate incubate the microtiter plate with a coating solution consisting of a basic pH 9.6 carbonate buffer in which 5 ⁇ g / ml of an antigen corresponding to one of the sequences according to SEQ ID no. 1, 2 or 3 for two hours at 37 °, and incubate the microtiter plate with a blocking solution containing a pH 7.4 Tris-buffered protein solution containing at least one anti-microbial agent at 4 ° C overnight.
  • a coating solution consisting of a basic pH 9.6 carbonate buffer in which 5 ⁇ g / ml of an antigen corresponding to one of the sequences according to SEQ ID no. 1, 2 or 3 for two hours at 37 °
  • a blocking solution containing a pH 7.4 Tris-buffered protein solution containing at least one anti-microbial agent at 4 ° C overnight.
  • a test kit for detecting A ⁇ autoantibodies in serum samples at least comprising an antigen-coated microtiter plate, wherein the antigen is a peptide whose sequence is a sequence selected from SEQ. ID. 1, 2 or 3 corresponds to an advantageous embodiment of the invention. It is advantageous if the test kit contains assay buffer, wash solution, enzyme conjugate, substrate solution and / or stop solution.
  • the test kit according to the invention can advantageously be used in a method according to the invention.
  • amyloid beta-peptide comprising amino acids 1 to 40
  • a ⁇ 1-42 amyloid beta-peptide comprising amino acids 1 to 42
  • CSF Cerebrospinal Fluid

Abstract

Bei einem Verfahren, insbesondere einem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Aβ-Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, umfassend die Schritte Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase, Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung, Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe, immunologischer Nachweis des Aβ-Autoantikörpers auf der Festphase und Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes ist es vorteilhaft, wenn das Bereitstellen der Antigen-beschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 3 aufweist.

Description

Verfahren, insbesondere Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta
Autoantikörpern, Mikrotiterplatte und Testkit
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere einen Enzyme-linked Immunosorbend Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 , eine Mikrotiterplatte gemäß Anspruch 17, sowie ein Testkit gemäß Anspruch 23.
In vitro Nachweisverfahren für Antikörper, insbesondere ELISAs, sind allgemein bekannt. Sie gehören zur Gruppe der Immunassay-Verfahren. Deren Grundprinzip ist die Erkennung eines Analyten durch einen Bindungspartner in der Form der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen. Im Sinne der vorliegenden Anmeldung meint
Analyt: Ein in einer zu untersuchenden Probe nachzuweisendes Antigen oder ein nachzuweisender Antikörper.
Antigen: Ein Protein / Polypeptid, das die Produktion von
Antikörpern bewirkt, wenn es einem tierischen Organismus injiziert wird (Antigen-Stimulus). Antikörper: Ein Protein, das als Reaktion auf den Antigen-Stimulus produziert wird und spezifisch das Stimulus erzeugende Antigen erkennt und bindet. anti-Spezies Antikörper: Ein Antikörper, der produziert wird, wenn Proteine (inklusive
Antikörper) einer Spezies einer anderen Spezies injiziert werden, erkennen und binden alle Antigene, die aus der ersten Spezies stammen. Bindungspartner: Ein Antigen oder Antikörper, der spezifisch an den Analyten bindet.
Detektionsantikörper: Bindet an den Analyten, nicht jedoch an den Bindungspartner des Analyten und ist entweder mit einem Detektionsmittel oder mit einer unmittelbar nachweisbaren Substanz, wie bspw. einem
Fluoreszenzfarbstoff, gekoppelt (= konjugiert). Bei dem Detektionsmittel kann es sich beispielsweise um ein Enzym handeln, welches in der Lage ist ein spezielles Substrat derart zu spalten, dass eine Farbreaktion hervorgerufen wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung kann der Detektionsantikörper auch als
Zweitantikörper bezeichnet werden.
Der Ablauf eines solchen Nachweis-Verfahrens stellt sich grundsätzlich wie folgt dar: Der Bindungspartner des Analyten wird an einer Festphase immobilisert. Anschließen wird die Festphase mit einer Probe inkubiert, in welcher sich möglicherweise der nachzuweisende Analyt befindet. Sofern Analyt in der Probe vorhanden ist, bindet er an den auf der Festphase immobilisierten Bindungspartner und wird auf diese Weise ebenfalls immobilisiert. Die Bindung des Analyten an seinen Bindungspartner wird dann mit Hilfe eines Detektionsantikörpers nachgewiesen. Dazu wird die Festphase, auf der nun der Bindungspartner den Analyten festhält, mit einer Lösung inkubiert, welche den Detektionsantikörper enthält. Dieser bindet an den immobilisierten Analyten und kann dann beispielsweise dadurch nachgeweisen werden, dass eine Enzym-Substrat-Reaktion mit Hilfe des an den Detektionsantikörper konjugierten Enzymes durchgeführt wird.
Solche Nachweisverfahren werden bevorzugt in der medizinischen Diagnostik eingesetzt, um Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben von Tier und/oder Mensch auf das Vorhandensein oder Fehlen von Antigenen hin untersuchen zu können. Aus dem Ergebnis des Nachweises können dann beispielsweise Aussagen über mögliche Erkrankungen des zu Untersuchenden getroffen werden. Ein prominentes Beispiel für auf diesem Weg untersuchbare Erkrankungen ist der Morbus Alzheimer. Diese Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine Reihe von neuropathologischen Charakteristiken, von denen eine besonders typische die Bildung von sogenannten neuritischen Plaques im Gehirn der Patienten ist. Diese Plaques bestehen aus extrazellulär abgelagerten Amyloid-beta-Peptiden (Aß), die bei der Spaltung des amyloid precursor proteins (APP) entstehen (Kang et al. „The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor" Nature 1987; Tanzi et al. "Amyloid beta protein gene: cDNA, mRNA distribution, and genetic linkage near the Alzheimer locus" Science, 1987). Problematisch bei herkömmlichen ELISAs zum Nachweis von Aß ist, dass nicht alle Aß- Formen tatsächlich pathologisch sind, und dass Antikörper, die spezifisch die pathologischen Formen erkennen, nur in sehr begrenztem Umfang zur Verfügung stehen und entsprechend sehr teuer sind. So werden zum Nachweis wenigstens zwei spezifische Antikörper benötigt - ein erster als immobilisierter Bindungspartner auf der Festphase und ein zweiter als Detektionsantikörper. Diese sollten entsprechend auch aus unterschiedlichen Spezies stammen, da die Detektion ansonsten die Gefahr eines sehr hohen Hintergrundes und dementsprechend die Gefahr, einer hohen Anzahl falsch positiver Ergebnisse zu liefern, birgt. Die Bildung von unspezifischem Hintergrund kann zwar dadurch reduziert werden, dass der Detektionsantikörper nicht unmittelbar an das gebundene Aß-Peptid bindet, sondern an einen Zweitantikörper, der den gebundenen Analtyten erkennt und bindet jedoch nicht Enzym-konjugiert ist. Dies ist jedoch ebenfalls mit Nachteilen behaftet. So sind hierfür verhältnismäßig viele Antikörper-Antigen-Bindungsschritte notwendig - Einfangen des nachzuweisenden Aß-Peptides durch einen auf der Platte gebundenen Erstantikörper, Binden des Zweitantikörpers an das eingefangene Antigen, Binden des Zweitantikörpers durch den Detektions-Antikörper - was die Fehleranfälligkeit und mithin die Chance für falsch-positive bzw. falsch-negative Testergebnisse nicht wirklich verbessert. Du et al. haben jedoch 2001 beobachtet, dass sowohl in Körperflüssigkeiten von gesunden Individuen, als auch in Körperflüssigkeiten von erkrankten Alzheimer-Patienten natürliche Antikörper gegen Aß-Peptide vorhanden sind (vgl. Du et al.„Reduced levels of amyloid ß-peptide antibody in Alzheimer disease", Neurology 2001), sogenannte Amyloid- beta Autoantikörper (Aß-Autoantikörper). Dabei verändert sich der Titer dieser sogenannten Autoantikörper, wenn eine Alzheimer-Erkrankung vorliegt.
Diese Beobachtung kann im Prinzip ausgenutzt werden, um einen modifizierten ELISA durchzuführen. Dabei wird anstelle des Aß-Peptides der Autoantikörper nachgewiesen. Dazu werden entweder Proben der Cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) oder Serum- bzw. Plasma-Proben entnommen und untersucht. Beides ist jedoch mit deutlichen Nachteilen verbunden. So ist einerseits die Entnahme von CSF-Proben für den Patienten nicht unproblematisch und unangenehm. Andererseits ist die Analyse von Serum-Proben, die im Gegensatz dazu leicht gewonnen werden können, nur mit einem stark erhöhten Aufwand möglich. So liegt eine besondere Schwierigkeit in der enormen allgemeinen Antikörperdichte in der Serum-Matrix, die das spezifische Herausfischen der Aß- Autoantikörper durch die entsprechende auf der Festphase des Test immobilisierten Bindungspartner behindert und häufig unspezifische Bindungen bzw. unerwünschte Kreuzreaktionen hervorruft.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen verbesserten ELISA zum Nachweis von Aß- Autoantiköpern zur Verfügung zu stellen, der eine rasche Auswertung mit einfachen und kostengünstigen Mitteln erlaubt. Der ELISA soll insbesondere mit humanen Serum- und/oder Plasma-Proben sowie CSF-Proben rasch und einfach durchführbar sein.
Desweiteren ist es Aufgabe eine entsprechende Mikrotiterplatte sowie ein Testkit für die
Durchführung einen erfindungsgemäßen ELISA bereitzustellen.
Hauptmerkmale der Erfindung sind im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 , 17 und 23 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 16, 18 bis 22, 24 und
25. Bei einem Verfahren, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase,
b) Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung,
c) Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe,
d) immunologischer Nachweis des Amyloid beta Autoantikörpers auf der Festphase und
e) Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines
Lesegerätes
sieht die Erfindung vor, dass das Bereitstellen der Antigen-beschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 3 aufweist.
Dabei hat es sich insbesondere als Vorteilhaft erwiesen, wenn die Festphase mit einem Antigen, das eine Peptid-Sequenz entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1,
SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 hat, beschichtet ist. Überraschenderweise zeigen nämlich solche 40 bis 46 Aminosäure-langen Peptiden eine sehr schnelle
Aggregationskinetik mit natürlichen humanen Aß-Autoantikörpern. Die im ELISA nachzuweisenden Autoantikörper binden daher rasch und zuverlässig an die auf der Festphase immobilisierten Antigene. Dabei ist es besonders günstig, wenn das Antigen eine Peptid-Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 aufweist.
Ein besonders kritischer Punkt bei der Etablierung eines ELISAS ist, wie oben bereits ausgeführt, die Beschichtung der Festphase mit dem Bindungspartner des Analyten. Ein weiterer besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Beschichtungs-Lösung ein Carbonatpuffer mit basischem pH-Wert ist. So hat sich nämlich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Antigene im basischen Milieu, insbesondere bei einem pH-Wert von 9.6 deutlich besser an die Festphase binden, als im herkömmlicherweise verwendeten neutralen Milieu bei etwa pH 7.
Das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung kann dabei sowohl bei 40C über Nacht erfolgen, was besonders günstig bei der Verwendung eines Antigens mit einer Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 ist, als auch bei 37°C und 5% CO2 für 2 Stunden, was bevorzugt bei der Verwendung eines Antigens mit einer Sequenz entsprechend SEQ ID No. 2 der Fall ist.
Ein weiterer kritischer Punkt bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens ist das Blocken. Dieser Schritt dient dazu, die Bereiche der Festphasenoberfläche abzudecken, an denen kein Antigen gebunden ist, so dass der nachzuweisende Analyt bei der anschließend folgenden Inkubation mit der Probe ausschließlich an die Antigene und nicht an die Festphase selbst binden kann. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Blocking-Lösung eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens. So kann beispielsweise die kommerziell erhältliche Blocking-Lösung Superblock TBS® oder Superblock® der Firma Pierce, Deutschland verwendet werden. Die Inkubation mit der Blockinglösung wird bevorzugt bei 4°C über Nacht durchgeführt. Auf diese Weise kann die freie Oberfläche der Festphase an den Stellen, an denen kein Antigen gebunden ist besonders gut mit dem in der Blockinglösung enthaltenen Protein bedeckt werden. So wird effektiv verhindert, dass in der Probe vorhandene Antigene oder Antikörper unspezifisch an die Festphase binden und so unerwünschte falsch-positive Signale, die auch als unspezifischer störender Hintergrund bezeichnet werden, liefern.
Bei der Durchführung von immunologischen Assays zu diagnostischen Zwecken hat es sich bewährt, stets nicht nur eine einzelne Patienten-Probe, sondern gleichzeitig eine standardisierte Vergleichsprobe (in der Folge als Standard bezeichnet), die tatsächlich zu untersuchende Patienten-Probe und wenigstens eine Kontrolle unter gleichen Bedingungen zu analysieren. Es ist daher von Vorteil, wenn die Festphase eine Mikrotiterplatte ist. Diese hat üblicherweise mehrere Abschnitte zur Analyse von Patienten-Proben bzw. Standard und Kontrolle, sogenannte Wells. Alle Wells einer Mikrotiterplatte können identisch vorbereitet werden. Üblicherweise werden dazu alle Wells gleichzeitig mit Antigen beschichtet und anschließend geblockt. Anschließend werden jeweils bestimmte Wells mit einer definierten Menge Standard, Patienten-Probe und Kontrolle befüllt und weiter behandelt. Dabei wird in jedes Well das gleichen Volumen an Flüssigkeit gefüllt. Die jeweilige Konzentration von Standard, Patienten-Probe und Kontrolle wird jedoch durch geeignete Verdünnung von Well zu Well variiert, um eine möglichst präzise Konzentrationsbestimmung des nachzuweisenden Analyten zu erlauben.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Wells mit einem relativ hohen Gesamtvolumen, nämlich bis zu 300 μl befüllt werden, welches jedoch nur einen relativ geringen Anteil an Probe (also entweder Standard, Patienten-Probe oder Kontrolle) enthält.
So sieht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens vor, dass die Wells zunächst mit 250 μl eines Assay-Puffers befüllt werden. In diesen Puffer werden anschließend nur 10 μl der zu untersuchenden Probe gegeben. Der Assay-Puffer dient dabei der definierten Verdünnung der Probe. Insbesondere bei der Analyse von aus Serum gewonnenen Patienten-Proben ist es vorteilhaft, wenn nur ein geringes Volumen von Serum für den Nachweis eingesetzt werden muss. Dies minimiert unerwünschte Kreuzreaktionen und erhöht auf diese Weise die Spezifität des Tests.
Dabei ist es auch denkbar, dass Serum-Proben, die einen besonders hohe Konzentration an Serum-Bestandteilen aufweisen, bereits vor dem Einbringen in den Assay-Puffer mit Hilfe eines sogenannten Proben-Verdünnungs-Puffers vorverdünnt werden. Dieser Proben-Verdünnungs-Puffer ist bevorzugt so beschaffen, dass die Serum-Matrix bei der Verdünnung nicht beeinträchtigt wird. Ein weiteres Ausführungsbeispiel sieht dementsprechend vor, dass die Wells mit 200 μl vorverdünnter Probe befüllt werden. Nach dem Befüllen der Wells mit den Proben (also mit Standard, Patienten-Probe und Kontrolle) wird die Mikrotiterplatte für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur inkubiert. Diese Bedingungen haben sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, um einerseits sicher zu gehen, dass in der Patienten-Probe vorhandene Analyte wirklich an ihre auf der Mikrotiterplatte immobilisierten Bindungspartner binden, und um andererseits unerwünschte Kreuzreaktionen bzw. unspezifische Bindungen so gering wie möglich zu halten.
Man erkennt, dass das Inkubieren der Mikrotiterplatte mit der zu untersuchenden Lösung vorteilhaft die folgenden Schritte umfasst: Einbringen von verdünnter Probe in jedes Well der Mikrotiterplatte, wobei das Einbringen der verdünnten Probe derart erfolgt, dass danach in jedem Well ein Gesamtvolumen von 200 bis 300 μl Assay-Puffer enthaltend die Probe vorliegt, und Inkubieren für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur. Der Assay-Puffer ist dabei bevorzugt ein Natrium-Phosphat-Puffer mit pH 7,0 ist, umfassend 3 bis 9 % BSA, 0,01 bis 3 % TWEEN sowie wenigstens ein Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe 5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxan (BND), 2- Chloroacetamid (CAA), 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HPO), N-Methylisothiazolon (MIT), Natrium-Azid, Thimerosal, Proclin.
Der nächste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der immunologische Nachweis des durch den Bindungspartner eingefangenen Aß-Autoantikörpers auf der Festphase. Dies geschieht durch folgende Schritte: Ausklopfen des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier, Einbringen von 50 μl bis 100 μl Enzym-Konjugat in jedes Well, 30 bis 60 Minuten Inkubieren auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur, Ausschütteln des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier, Zugeben von 50 μl Substratlösung in jedes Well, 15 bis 20 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur und Stoppen der enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jedes Well.
Die Waschlösung ist dabei bevorzugt ein Tris-Puffer, enthaltend 0,01 bis 3 % Tween.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen ELISAs liegt darin, dass die Bindungskinetik des Aß-Autoantikörpers an die erfindungsgemäßen Antigene so optimal ist, dass für den immunologischen Nachweis eine chromogene Enzym-Substrat-Reaktion verwendet werden kann, deren Ergebnis durch das Bestimmen der optischen Dichte bei
450 nm gemessen werden kann. Dementsprechend erfolgt das Auslesen des
Nachweisergebnisses bei 450 ± 10 nm. Dabei ist es günstig, wenn das Auslesen innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung erfolgt.
Das nach dem ersten Waschvorgang in die Wells eingebrachte Enzym-Konjugat enthält den Detektionsantikörper. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen gegen Humane IgG gerichteten Antikörper (α-human IgG). Dieser kann beispielsweise aus einer der folgenden Spezies stammen: Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte, Esel, Rind, Schaf oder Schwein. Andere sind zwar im Allgemeinen weniger üblich, jedoch auch denkbar. Der a- human IgG Antikörper ist mit einem Enzym oder einem Farbstoff konjugiert, so dass er entweder durch direkt - wenn es sich beispielsweise um einen Fluoreszenzfarbstoff handelt - oder durch die Umsetzung eines Substrates mit Hilfe des Enzyms sichtbar gemacht werden kann. Bei dem Enzym kann es sich beispielsweise um ein aus der Gruppe Peroxidase (POD), Meerrettichperoxidas (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), ß- Galactosidase (ß-Gal) ausgewähltes Enzym handeln. Weitere Enzyme, die mit einem entsprechenden Substrat eine Farbreaktion bewirken, sind vorstellbar. Auch eine Kopplung mit Biotin oder Polymeren an welche eine Vielzahl von Enzymen gekoppelt ist, ist denkbar.
Man erkennt, dass das Enzym-Konjugat einen Enzym-konjugierten gegen Humane IgG gerichteten Antikörper enthält, der aus einer Spezies ausgewählt aus Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte, Esel, Rind, Schaf stammt, wobei das mit dem Antikörper konjugierte Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Meerrettichperoxidase (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), ß-Galactosidase (ß-Gal). Jedes dieser Enzyme kann unterschiedliche Substrate umsetzen, so dass eine auswertbare Farbreaktion hervorgerufen wird. Die Wahl des Substrates richtet sich dementsprechend nach der Wahl des Enzyms und umgekehrt. Geeignete Substrate können beispielsweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden: 3,3'- Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom-5-chlor-3- indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-ß- D-galactopyranosid (X-GaI), 5-Brom-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Blue-Gal), 6-Chlor-3- indolyl-ß-D-galactopyranosid (Y-GaI), 5-lod-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), Λ/-Methylindolyl-ß-D- galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D-galactopyranosid (MUG). Die Reaktionsbedingungen richten sich dann jeweils nach dem ausgewählten Enzym. Vorteilhaft ist es, wenn das ausgewählte Substrat derart löslich ist, dass es in einem Volumen von 50 bis 100 μl in die Wells der Mikrotiterplatte eingebracht werden kann.
Man erkennt, dass die Substratlösung wenigstens ein Chromophor, ausgewählt aus der Gruppe 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5- Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4- chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid (X-GaI), 5-Brom-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Blue-Gal), θ-Chlor-S-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Y-GaI), 5-lod-3-indolyl-ß-D- galactopyranosid (Purple-Gal), δ-Brom-θ-chlor-S-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Magenta- Gal), Λ/-Methylindolyl-ß-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D- galactopyranosid (MUG), in löslicher Form enthält, welches bei Reaktion mit dem Enzym des Enzym-Konjugates eine Farbreaktion zeigt.
Als besonders günstig hat sich die Verwendung eines HRP-gekoppelten α-human IgG Antikörper in Kombination mit dem Substrat TMB gezeigt.
Da das durch das Enzym zu spaltende Substrat üblicherweise im Überschuss zugegeben wird, ist es erforderlich, die Enzym-Substrat-Reaktion nach einem definierten Zeitraum kontrolliert zu beenden. Dies kann beispielsweise durch Zugeben von Stopplösung geschehen. Diese verändert die Reaktionsbedingungen derart, dass die Enzym-Substrat- Reaktion nicht fortgesetzt werden kann. Ist das Enzym beispielsweise HRP und das Substrat TMB, so wird die Reaktion bevorzugt durch das Zugeben einer Säure, üblicherweise Schwefelsäure, gestoppt. Die Stopp-Lösung besteht dann im einfachsten Fall aus der verdünnten Säure. Man erkennt, dass die Stopplösung einen pH-Wert kleiner als 7.0 hat und bevorzugt eine verdünnte Salz- oder Schwefelsäure ist.
Die Erfindung sieht außerdem eine Mikrotiterplatte mit wenigstens einem Well vor, wobei jedes Well mit einem Peptid entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 beschichtet ist. Eine solche Mikrotiterplatte kann mit großem Vorteil eingesetzt werden, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.
Für ein übliches Test-design ist es günstig, wenn die Mikrotiterplatte wenigstens eine Testeinheit umfassend 24 Wells aufweist. Die 24 Wells können dann in drei Gruppen unterteilt werden. Die ersten acht Wells werden mit acht verschiedenen Konzentrationen des Standards beladen. Aus den daraus erhaltenen Messwerten kann die
Vergleichskurve bestimmt werden. Die zweiten acht Wells werden mit acht verschiedenen
Verdünnungsstufen einer Serum-Probe, die einer gesunden Kontroll-Person entnommen wurde beladen. Die dritten acht Wells werden mit den entsprechenden acht
Verdünnungsstufen einer Serum-Probe einer möglicherweise erkrankten Person beladen.
Diese dreimal acht Wells bilden so gemeinsam eine Testeinheit.
Denkbar ist auch, dass die Mikrotiterplatte mehrere Testeinheiten aufweist, die unabhängig von einander verwendbar sind. So ist beispielsweise eine große Mikrotiterplatte mit mehreren linear hintereinander angeordneten Testeinheiten denkbar, die mit Hilfe einer Perforation oder Nut vor dem Gebrauch von der Mikrotiterplatte abgeknickt bzw. abgebrochen werden können. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dank der hohen Sensitivität des Verfahrens sowohl Mikrotiterplatten deren Wells einen flachen Boden haben als auch Wells mit rundem, v-förmigen oder c-förmigen Boden geeignet. Men erkannt daher, dass es auch bei der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte von Vorteil ist, dass die Wells einen runden, flachen, v-förmigen oder c-förmigen Boden haben.
Man erkennt weiter, dass eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte mit besonderem Vorteil nach einem Verfahren hergestellt ist, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer unbeschichteten Mikrotiterplatte, Inkubieren der Mikrotiterplatte mit einer Beschichtungslösung, welche aus einem basischen Carbonatpuffer mit pH 9.6 besteht, in dem 5 μg/ml eines Antigens entsprechend einer der Sequenzen nach SEQ ID No. 1 , 2 oder 3 gelöst ist, für zwei Stunden bei 37°, und Inkubieren der Miktrotiterplatte mit einer Blockinglösung, enthaltend eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens, bei 4°C über Nacht.
Dabei ist es einerseits besonders günstig, wenn die Beschichtung der Mikrotiterplatte mit dem Antigen im basischen Milieu erfolgt, weil dann - wie bereits oben ausgeführt - die Antigene besonders gut und effektiv an die Mikrotiterplatte binden. Andererseits wird durch das Inkubieren mit der erfindungsgemäßen Blockinglösung die Oberfläche der
Festphase an den Stellen, an denen kein Antigen gebunden ist, besonders gut und gleichmäßig mit dem in der Blockinlösung enthaltenen Protein abgesättigt. Auf diese
Weise wird sehr effektiv verhindert, dass in der Probe enthaltene Antigene oder Antikörper an die Festphase anstatt an die daran gekoppelten Antigene binden. Mithin wird der unspezifische Hintergrund des Assay deutlich reduziert.
Man erkennt, dass es daher besonders vorteilhaft ist eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzusehen.
Die Erfindung sieht außerdem ein Testkit zum Nachweis von Aß-Autoantikörpern in Serum-Proben vor, wenigstens umfassend eine Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte, bei dem das Antigen ein Peptid ist dessen Sequenz einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 , 2 oder 3 entspricht. Besonders günstig ist es, wenn das Testkit außerdem bereits vorgefertigte Reagenzien zur Durchführung des Tests enthält. Der Durchführende muss dann nur noch die entsprechende zu untersuchende Serum-Probe sowie eine entsprechende passende Kontroll-Probe zufügen. Denkbar ist auch, dass das Testkit bereits eine Auswahl an Kontroll-Proben enthält. Man erkennt, dass das Test-Kit bevorzugt einen Standard, Assay-Puffer, Waschlösung, Enzymkonjugat, Substratlösung und/oder Stopplösung enthält.
Man erkennt außerdem, dass das erfindungsgemäße Testkit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Abbildungen und Ausführungsbeispielen. Fig. 1 Vergleich der Antigen-Sequenzen der Ausführungsbeispiele 1 bis 5,
Fig. 2 OD 450-Messwerte eines entsprechend Ausführungsbeispiel 3 durchgeführten
ELISA,
Fig. 3 mit Hilfe des erfindungsgemäßen ELISA entsprechen Ausführungsbeispiel 3 bestimmte Amyloid-beta-Autoantikörper-Konzentration in zwei an Morbus
Alzheimer erkrankten und einer gesunden Person.
Man erkennt in Fig. 1 , dass alle drei erfindungsgemäß für das Beschichten der Festphase verwendbaren Peptide wenigstens die Aminosäuren 1 bis 40 des natürlich vorkommenden Aß-Peptides aufweisen. Dabei entsprechen die eingerahmten Sequenzbereiche jeweils der Sequenz des Aß1-4o-Peptids, die grau unterlegten Sequenzbereiche der Sequenz des Aß1-42-Peptids.
Die als Cys Amyloid-beta 1-42 bezeichnete und der SEQ ID No. 1 entsprechende Sequenz umfasst außerdem C-Terminal die Aminosäuren 41 und 42 des Amyloid beta Peptides (Aß) und N-terminal vier zusätzliche Aminosäuren, nämlich das Tetrapeptid CGKR. Mithin handelt es sich bei dem der SEQ ID No. 1 entsprechenden Antigen um ein aus insgesamt 46 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, welches zusammengesetzt ist aus dem Tetrapeptid CGKR gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 42 des
Anders ausgedrückt ist die mit SEQ ID No. 1 bezeichnete Sequenz ein modifiziertes humanes Peptid, dessen Aminosäuren 5 bis 46 die Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-42 Peptids darstellen, an welche N-terminal das Tetrapeptid Cys GIy Lys Arg angehängt ist, welches den Aminsäuren 1 bis 4 der SEQ ID No. 1 entspricht. Man erkennt in Fig. 1 weiter, dass die SEQ ID No. 2, welche als Amyloid-beta 1-42 bezeichnet wird, der natürlichen Sequenz des Amyloid beta 1-42 Peptides entspricht. Mithin handelt es sich bei dem der SEQ ID No. 2 entsprechenden Antigen um ein aus insgesamt 42 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, welches den Aminosäuren 1 bis 42 des Aß1^2-Peptides enspricht.
Die als Cys Amyloid-beta 1-40 bezeichnete SEQ ID No. 3 entspricht dem natürlichen Amyloid-beta 1-40-Peptid (Aß^o). Allerdings wurde das Peptid am N-Terminus durch das Anhängen eines Cystein modifiziert. Mithin handelt es sich bei dem der SEQ ID No. 3 entsprechenden Antigen um ein aus insgesamt 41 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, welches zusammengesetzt ist aus den Aminosäuren 1 bis 40 des Aß^o-Peptides und einem N-terminal angefügten Cystein. Anders ausgedrückt ist die mit SEQ ID No. 3 bezeichnete Sequenz ein modifiziertes humanes Peptid, dessen Aminosäuren 2 bis 41 die Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-40 Peptids darstellen, an welche N-terminal die Aminosäure Cystein angehängt ist, welche der Aminosäuren 1 der SEQ ID No. 3 entspricht.
In Fig. 2 erkennt man die OD 450 Messwerte eines entsprechend dem Protokoll vom Ausführungsbeispiel 3 durchgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 3 verdeutlicht, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnene Daten unter anderem zur Diagnose von Morbus Alzheimer oder anderen neurodegenerativen Erkrankungen herangezogen werden können.
Ausführungsbeispiel 1:
In einem ersten Ausführungsbeispiel werden Mikrotiterplatten mit einem Antigen entsprechend der SEQ ID No. 1 , also einem Aß-Peptid, welches die Aminosäuren 1 bis 42 umfasst und N-terminal zusätzlich die Aminosäurefolge CGKR trägt, beschichtet. Dazu wird das Antigen in einem Carbonatpuffer mit pH 9.6 gelöst. Nach der Inkubation mit der so hergestellten Beschichtungslösung wird die Mikrotiterplatte mit Blockinglösung inkubiert.
Als nächstes werden 250 μl Assay-Puffer in jedes Well eingebracht. In jedes so vorbereitete Well werden dann 10 μl Probe, wobei es sich entweder um den Standard, eine Kontrolle oder die tatsächlich zu messende Probe handelt, zu dem Assay-Puffer gegeben. Die Probe wird auf diese Weise derart in Assay-Puffer verdünnt, dass letztlich in jedem Well Volumen von 260 μl verdünnter Probe vorliegt.
Die Platte mit den so verdünnten Proben wird für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wird der Inhalt der Wells sofort ausgeschüttet und jedes Well 3 mal mit 400 μl Waschlösung gewaschen. Zum Entfernen von verbleibenden Flüssigkeitstropfen werden die Wells auf Saugpapier ausgeklopft.
In die gewaschenen Wells werden jeweils 50 μl Enzym-Konjugat gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm inkubiert. Danach werden die Wells erneut wie oben beschrieben gewaschen und ausgeklopft.
Anschließend werden in jedes Well 50 μl Substrat-Lösung gegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die während dieser Zeit stattfindende enzymatische Reaktion wird nach Ablauf der 20 Minuten durch Zugabe von 100 μl Stopp-Lösung beendet. Innerhalb von 10 Minuten nach dem Stoppen der Reaktion wird für jedes Well die optische Dichte (OD) bei 450±10 nm mit einem Lesegerät bestimmt. Ausführungsbeispiel 2:
Das Ausführungsbeispiel 2 entspricht im Wesentlichen dem bereits oben beschriebenen Ausführungsbeispiel 1. Die Wells werden jedoch mit einem Gesamtvolumen von 200 μl verdünnter Probe beladen. Nach dem Entfernen der Probe werden die Wells jeweils fünfmal mit Waschlösung gewaschen, danach wird in jedes Well 100 μl Enzym-Konjugat gegeben.
Die Reaktion des Enzyms mit dem Chromophor erfolgt während einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur.
Ausführungsbeispiel 3:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein Antigen entsprechend SEQ ID No. 2, also das Peptid Aß1-42, in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer des pH 9.6 verdünnt. Mit dieser Lösung wird eine Festphase, nämlich eine 96-well hochbindende ELISA Platte, für zwei Stunden bei 37°C in einem CO2-lnkubator bei 5% CO2 inkubiert. Im Anschluss daran wird die Platte mit einer kommerziell erhältlichen Blockinglösung über Nacht inkubiert. Die so vorbereitete Platte wird viermal mit einer erfindungsgemäßen Waschlösung gewaschen. Anschließend werden entsprechende Standards und verdünnte Proben zugegeben und für 4 Stunden bei 37°C in einem CO2-lnkubator bei 5% CO2 inkubiert. Im Anschluss wird die Platte erneut viermal gewaschen. Als Waschlösung wird PBS-Puffer, welcher 0,05% Tween enthält verwendet.
Zum Nachweis von auf der Platte gebundenen Aß-Autoantikörper wird ein HRP- gekoppelter anti-human-Zweitantikörper verwendet. Dieser wird im Verhältnis 1 :4000 in der zuvor verwendeten Blocking-Lösung verdünnt. Als chromogenes Substrat wird TMB verwendet. Die Farbreaktion wird mit Hilfe von Schwefelsäure gestoppt und bei einer Wellenlänge von 450 nm durch Bestimmung der OD ausgewertet. Bei der Auswertung wird zunächst die OD der Standards bestimmt und dann mit den Proben bzw. Kontrollen verglichen. Dazu wird zunächst mit Hilfe einer festgelegten Konzentrationsreihe des Standards eine Vergleichskurve bestimmt. Die Proben und Kontrollen werden jeweils mehrfach und in unterschiedlichen Verdünnungen aufgetragen.
Die beispielhafte Beladung einer Mikrotiterplatte kann dabei wie folgt aussehen:
Wells 1 bis 8: Standard in verschiedenen Konzentrationen zur Erstellung einer
Vergleichskurve
Wells 9 bis 16: Kontroll-Probe aus einer nicht erkrankten Person in verschiedenen
Verdünnungen
Wells 17 bis 24: Zu messende Probe einer möglicherweise erkrankten Person in verschiedenen Verdünnungen Das jeweilige Design des Tests kann dabei je nach Bedarf variiert werden. So wurden für ein entsprechend der Ausführungsvariante 3 beispielhaft durchgeführtes Nachweisverfahren insgesamt 40 zu messende Wells einer Mikrotiterplatte wie in Tabelle 1 dargestellt beladen. Dabei wurden zwei erkrankte Personen und eine Kontrollperson, deren Alter dem Alter der erkrankten Person Nr. 1 entspricht, untersucht. Allen drei Personen wurde dazu jeweils eine Serumprobe entnommen.
Die ersten 16 Wells werden mit einer Standard-Verdünnungsreihe beladen, um eine Vergleichskurve zu erstellen, anhand derer dann aus den OD-Messwerten der Proben die in den Proben vorhandene Konzentration an Aß-Autoantikörper errechnet werden kann.
Als Standard wird ein Gemisch an natürlich im Serum vorkommenden Aß-Autoantikörpern verwendet, das aus einem kommerziell erhältlichen Produkt zur intravenösen Applikation von Immunglobulinen, hergestellt wurde.
Erkrankte Person Nr.1 Erkrankte Person Nr.2 Kontrollperson
Serumprobe Serumprobe
Serumprobe
Well Nr. Verdünnung Well Nr. Verdünnung Well Nr. Verdünnung
17 1:1.000 25 1:1.000 33 1:1.000
18 1:5.000 26 1:5.000 34 1:5.000
19 1:10.000 27 1:10.000 35 1:10.000
20 1:25.000 28 1:25.000 36 1:25.000
21 1:50.000 29 1:50.000 37 1:50.000
22 1:100.000 30 1:100.000 38 1:100.000
23 1:500.000 31 1:500.000 39 1:500.000
24 1:1.000.000 32 1:1.000.000 40 1:1.000.000
Tabelle 1 : Beladungsschema für 40 Wells einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte:
Wells I bis 16: Standard-Konzentrationsreihe zur Erstellung einer Vergleichs-
Standardkurve,
Wells 17 bis 24: Verdünnungsreihe einer Serumprobe einer ersten erkrankten Person, Wells 25 bis 32: Verdünnungsreihe einer Serumprobe einer zweiten erkrankten Person, Wells 33 bis 40: Verdünnungsreihe einer Serumprobe einer gesunden Kontrollperson. Die wie in Tabelle 1 dargestellt mit Probe bzw. Standard beladenen Wells der Mikrotiterplatte werden entsprechend dem oben beschriebenen Protokoll für 4 Stunde bei 37°C inkubiert, anschließend gewaschen, mit Enzymkonjugat inkubiert, erneut gewaschen und mit Substratlösung inkubiert. Nach dem Stoppen der Enzym-Substrat-Reaktion wird die OD 450 mit einem entsprechenden Lesegerät bestimmt.
In Fig. 2a sind die Messwerte einer solchen OD 450-Bestimmung dargestellt. Kurve 1 zeigt die OD-Messwerte der mit der Standardreihe beladenen Wells, Kurve 2 die Messerwerte der verdünnten Serum-Proben der erkrankten Person 1 , Kurve 3, die Messwerte der verdünnten Serum-Proben der erkrankten Person 2 und Kurve 4 die Messerwerte der verdünnten Serum-Proben der Kontrollperson.
Durch Vergleich der Messwerte der erkrankten Personen bzw. der Kontrollperson mit den gemessenen Standardwerten bekannter Antikörper-Konzentration, lassen sich im Anschluss an die Messung aus den OD 450 Werten die Konzentrationen von Aß- Autoantikörper in den jeweiligen Serum-Proben berechnen.
In Fig. 2b erkennt man, dass beide erkrankte Personen jeweils mehr als 900 μg/ml Aß- Autoantikörper im Serum aufweisen. Die gesunde Kontrollperson zeigt einen demgegenüber deutlich geringeren Wert von nur etwa 840 μg/ml.
Ausführungsbeispiel 4:
In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden 96-well-ELISA Platten mit einem Antigen entsprechend SEQ ID No. 3, also einem A^ ^-Peptid, welches N-terminal mit einem Cystein versehen ist, beschichtet.
Hierzu werden die ELISA-Platten bei 4CC über Nacht mit einer Beschichtungslösung inkubiert. Zur Herstellung der Beschichtungslösung werden unmittelbar vor der Inkubation 5 μg/ml Antigen in einem 100 mM Natriumbicarbonat-Puffer mit pH 9.6 gelöst.
Im Anschluss werden die Platten mit Blockinglösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur, oder alternativ bei 4CC über Nacht inkubiert. Als Blockinglösung wird eine kommerziell erhältliche Lösung verwendet, beispielsweise SuperBlock der Firma Pierce, Deutschland.
Zur Etablierung von Standards werden humane IVIgG affinitätsgereinigte Autoantikörper mit Salzlösung, welche einen pH von 7.4 hat, derart verdünnt, dass sie in Konzentrationen von 50 bis 0,78 μg/ml vorliegen. Die so hergestellten Standards werden bei 4°C über Nacht auf den Antigen-beschichteten Platten inkubiert.
Als Zweitantikörper wird ein HRP-konjugierter α-human-Antikörper aus Ziege verwendet, der spezifisch die schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen erkennt (HRP- labeled H&L chain specific Goat anti-human von Calbiochem, Darmstadt, Deutschland).
Dieser wird in einer Verdünnung von 1 :3000 eingesetzt. Die Inkubation erfolgt für eine
Stunde bei 37°C. Als chromogenes Substrat wird 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) verwendet. Die enzymatische Reaktion wird mit 2N Schwefelsäure (H2SO4) terminiert. Die Platten werden mit Hilfe eines Lesegerätes von Thermo Electron Corp bei 450 nm ausgewertet.
Die Waschschritte, sowie die enzymatische Reaktion erfolgen bei diesem Ausführungsbeispiel entsprechend den oben bereits beschriebenen Ausführungsbeispielen.
Ausführungsbeispiel 5
In einer weiteren Ausführungsvariante umfasst die Erfindung ein Testkit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen ELISA. Das Testkit enthält eine Mikrotiterplatte, welche mit einem Peptid beschichtet ist, das eine Sequenz entsprechend SED ID No. 1 hat und als
Antigen der immobilisierte Bindungspartner für die nachzuweisenden Aß-Autoantikörper ist. In dem Testkit sind außerdem Blocking-Lösung, Waschlösung, Assay-Puffer, eine konzentrierte Menge an Standard, Enzym-Konjugat, Substrat- und Stopplösung vorhanden.
Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. Man erkennt, dass es bei einem Verfahren, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Aß-Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, umfassend die Schritte Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase, Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung, Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe, immunologischer Nachweis des Aß- Autoantikörpers auf der Festphase und Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes vorteilhaft ist, wenn das Bereitstellen der Antigen- beschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid- Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 3 aufweist. Dabei ist es besonders günstig, wenn das Antigen bevorzugt eine Peptid-Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 aufweist. Vorteilhaft ist es außerdem, wenn die Beschichtungs-Lösung ein Carbonatpuffer mit basischem pH-Wert ist und wenn die Blocking-Lösung eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens. Das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung erfolgt bei 4°C über Nacht oder bei 37°C und 5% CO2 für 2 Stunden. Die Inkubation mit der Blocking-Lösung wird bei 4°C über Nacht durchgeführt.
Bevorzugt ist die Festphase eine Mikrotiterplatte und das Inkubieren der Mikrotiterplatte mit der zu untersuchenden Lösung umfasst die folgenden Schritte: Einbringen von verdünnter Probe in jedes Well der Mikrotiterplatte, wobei das Einbringen der verdünnten Probe derart erfolgt, dass danach in jedem Well ein Gesamtvolumen von 200 bis 300 μl Assay-Puffer enthaltend die Probe vorliegt, Inkubieren für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur.
Der immunologische Nachweis des Aß-Autoantikörpers umfasst die folgenden Schritte: Ausklopfen des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der WeIIs auf einem Saugpapier, Einbringen von 50 μl bis 100 μl Enzym-
Konjugat in jedes Well, 30 bis 60 Minuten Inkubieren auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur, Ausschütteln des Inhaltes aus den Wells, drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well, Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier,
Zugeben von 50 μl Substratlösung in jedes Well, 15 bis 20 Minuten Inkubieren bei
Raumtemperatur, Stoppen der enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 100 μl
Stopplösung in jedes Well.
Das Auslesen des Nachweisergebnisses erfolgt bei 450 ± 10 nm, bevorzugt innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung.
Günstig ist es, wenn der Assay-Puffer ein Natrium-Phosphat-Puffer mit pH 7,0 ist, umfassend 3 bis 9 % BSA, 0,01 bis 3 % TWEEN sowie wenigstens ein
Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe Gruppe 5-Bromo-5-nitro-1 ,3-dioxan
(BND), 2-Chloroacetamid (CAA), 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HPO), N-Methylisothiazolon (MIT), Natrium-Azid, Thimerosal, Proclin, wenn die Waschlösung ein Tris-Puffer ist, enthaltend 0,01 bis 3 % Tween, wenn das Enzym-Konjugat einen Enzym-konjugierten gegen Humane IgG gerichteten Antikörper enthält, der aus einer Spezies ausgewählt aus Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte, Esel, Rind, Schaf stammt, wobei das mit dem Antikörper konjugierte Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Meerrettichperoxidase (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), beta-Galactosidase (ß-Gal), wenn die Substratlösung wenigstens ein Chromophor, ausgewählt aus der Gruppe 3,3'- Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom-5- chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4-chlor-3- indoxyl-ß-D-galactopyranosid (X-GaI), 5-Brom-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Blue-Gal), 6-Chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Y-GaI), 5-lod-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), N- Methylindolyl-ß-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D- galactopyranosid (MUG), in löslicher Form enthält, welches bei Reaktion mit dem Enzym des Enzym-Konjugates eine Farbreaktion zeigt und wenn die Stopplösung einen pH-Wert kleiner als 7.0 hat und bevorzugt eine verdünnte Salz- oder Schwefelsäure ist.
Man erkennt, dass es bei einer Mikrotiterplatte zum Nachweis von Aß-Autoantikörpern mit wenigstens einem Well, vorteilhaft ist, dass jedes Well mit einem Peptid entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 beschichtet ist. Bevorzugt weist die
Mikrotiterplatte wenigstens eine Testeinheit umfassend 24 Wells auf. Dabei weist die
Mikrotiterplatte ganz besonders bevorzugt mehrere Testeinheiten auf, die unabhängig von einander verwendbar sind. Dabei können die Wells einen runden, flachen, v-förmigen oder c-förmigen Boden haben. Eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte ist nach einem
Verfahren hergestellt, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer unbeschichteten
Mikrotiterplatte, Inkubieren der Mikrotiterplatte mit einer Beschichtungslösung, welche aus einem basischen Carbonatpuffer mit pH 9.6 besteht, in dem 5 μg/ml eines Antigens entsprechend einer der Sequenzen nach SEQ ID No. 1 , 2 oder 3 gelöst ist, für zwei Stunden bei 37°, und Inkubieren der Miktrotiterplatte mit einer Blockinglösung, enthaltend eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti- mikrobielles Agens, bei 4°C über Nacht.
Zweckmäßig ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte in einem erfindungsgemäßen Verfahren. Man erkennt, dass außerdem ein Testkit zum Nachweis von Aß-Autoantikörpern in Serum-Proben, wenigstens umfassend eine Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte, wobei das Antigen ein Peptid ist dessen Sequenz einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 , 2 oder 3 entspricht, eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist. Dabei ist es günstig, wenn das Test-Kit Assay-Puffer, Waschlösung, Enzymkonjugat, Substratlösung und/oder Stopplösung enthält. Das erfindungsgemäße Testkit kann vorteilhaft in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.
Bezugszeichenliste
SEQ ID No. 1 Cys-Amyloid-beta 1-42
SEQ ID No. 2 Amyloid-beta 1-42
SEQ ID No. 3 Cys-Amyloid-beta 1-40
Kurve 1 Standard
Kurve 2 erkrankte Person 1
Kurve 3 erkrankte Person 2
Kurve 4 Kontrollperson
N-Terminus N-terminale Aminosäure des natürlichen Aß-Peptides
1 Aminosäure Nr. 1 des natürlichen Aß
10 Aminosäure Nr. 10 des natürlichen Aß
20 Aminosäure Nr. 20 des natürlichen Aß
30 Aminosäure Nr. 30 des natürlichen Aß
40 Aminosäure Nr. 40 des natürlichen Aß
Abkürzungen
Aß Amyloid beta
Aß! -40 Amyloid beta-Peptid, umfassend die Aminosäuren 1 bis 40
Aß1-42 Amyloid beta-Peptid, umfassend die Aminosäuren 1 bis 42
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol
AP alkalische Phosphatase
APP Amyloid percursor protein
BCIP 5-Brom-5-chlor-3-indoxylphosphat
Blue-Gal Brom-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
BND 5-Bromo-5-nitro-1 ,3-dioxan
CAA 2-Chloroacetamid
CN 4-Chlor-1-Naphtol
CSF Cerebrospinale Flüssigkeit (Liquor)
ßGal beta Galactosidase Green-gal /V-Methylindolyl-ß-D-galactopyranosid,
DAB 3,3'-Diaminobenzidin
ELISA Enzyme-linked immunosorbent Assay
HPO 2-Hydroxypyridin-N-oxid
HRP Meerrettichperoxidase
α-human IVIgG intravenös verabreichbare Immunglobuline
Magenta-Gal δ-Brom-β-chlor-S-indolyl-ß-D-galactopyranosid
MIT N-Mthylisothiazolon
MUG 4-Methyl-umbelliferyl-ß-D-galactopyranosid
NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
OD Optische Dichte
OD 450 Optische Dichte bei 450 nm
Purple-Gal 5-lod-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
rpm Umdrehungen pro Minute
TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
X-GaI δ-Brom^-chlor-S-indoxyl-ß-D-galactopyranosid
Y-GaI θ-Chlor-S-indolyl-ß-D-galactopyranosid
Sequenzprotokoll - freier Text
Modifiziertes humanes Peptid
N-terminal angehängte Tetrapeptidseqeunz Cys GIy Lys Arg
Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-42 Peptids
Cystein
Sequenz des natürlich vorkommenden humanen Amyloid beta 1-40 Peptids

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren, insbesondere Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern in humanem Serum und/oder Plasma, sowie CSF, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer Antigen-beschichteten Festphase,
b) Inkubieren der Festphase mit einer Blocking-Lösung,
c) Inkubieren der Festphase mit einer zu untersuchenden Probe,
d) immunologischer Nachweis des Amyloid beta Autoantikörpers auf der Festphase und
e) Auslesen des Nachweisergebnisses auf der Festphase mit Hilfe eines Lesegerätes
dadurch gekennzeichnet,
dass das Bereitstellen der Antigen-beschichteten Festphase das Inkubieren der Festphase mit einer Beschichtungs-Lösung umfasst, in der ein Antigen gelöst ist, welches eine Peptid- Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No 3 aufweist.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen bevorzugt eine Peptid-Sequenz entsprechend SEQ ID No. 1 aufweist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtungs-Lösung ein Carbonatpuffer mit basischem pH-Wert ist. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocking-Lösung eine Tris-gepufferte Proteinlösung mit pH 7.
4 ist, enthaltend wenigstens ein anti-mikrobielles Agens.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung bei 4°C über Nacht erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren der Festphase mit der Beschichtungs-Lösung bei 37°C und 5% CO2 für 2 Stunde erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mit der Blockinglösung bei 4CC über Nacht durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase eine Mikrotiterplatte ist und dass das Inkubieren der Mikrotiterplatte mit der zu untersuchenden Lösung die folgenden Schritte umfasst
a) Einbringen von verdünnter Probe in jedes Well der Mikrotiterplatte, wobei das
Einbringen der verdünnten Probe derart erfolgt, dass danach in jedem Well ein
Gesamtvolumen von 200 bis 300 μl Assay-Puffer enthaltend die Probe vorliegt, b) Inkubieren für 60 Minuten auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und
Raumtemperatur
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Assay-Puffer ein Natrium-Phosphat-Puffer mit pH 7,0 ist, umfassend
a) 3 bis 9 % BSA,
b) 0,01 bis 3 % TWEEN
c) sowie wenigstens ein Konservierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe 5-
Bromo-5-nitro-1 ,3-dioxan (BND), 2-Chloroacetamid (CAA), 2-Hydroxypyridin-N- oxid (HPO), N-Methylisothiazolon (MIT), Natrium-Azid, Thimerosal, Proclin.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologische Nachweis des Amyloid-beta Autoantikörpers die folgenden Schritte umfasst
a) Ausklopfen des Inhaltes aus den Wells
b) drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl Waschlösung pro Well
c) Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier
d) Einbringen von 50 μl bis 100 μl Enzym-Konjugat in jedes Well
e) 30 bis 60 Minuten Inkubieren auf einem Schüttler bei 300 bis 500 rpm und Raumtemperatur
f) Ausschütteln des Inhaltes aus den Wells
g) drei- bis fünfmaliges Waschen der Wells mit jeweils 300 bis 500 μl
Waschlösung pro Well
h) Entfernen verbleibender Flüssigkeitstropfen durch Abstreifen der Wells auf einem Saugpapier
i) Zugeben von 50 μl Substratlösung in jedes Well
j) 15 bis 20 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur k) Stoppen der enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jedes Well
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Waschlösung ein Tris-Puffer ist, enthaltend 0,01 bis 3 % Tween.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen des Nachweisergebnisses bei 450 ± 10 nm erfolgt
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym-Konjugat einen Enzym-konjugierten gegen Humane IgG gerichteten Antikörper enthält, der aus einer Spezies ausgewählt aus Ziege, Maus, Meerschwein, Ratte (?),
Esel, Rind, Schaf stammt, wobei das mit dem Antikörper konjugierte Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Meerrettichperoxidase (HRP), Alkalische Phosphatase (AP), beta-Galactosidase (ß-Gal).
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratlösung wenigstens ein Chromophor, ausgewählt aus der Gruppe 3,3'- Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-Naphtol (CN), S.S'.S.δ'-Tetramethylbenzidin (TMB), Neufuchsin, Naphthol-AS-MX-Phosphat, 5-Brom- 5-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP), Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), 5-Brom-4- chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid (X-GaI), 5-Brom-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
(Blue-Gal), 6-Chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Y-GaI), 5-lod-3-indolyl-ß-D- galactopyranosid (Purple-Gal), 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (Magenta-Gal), Λ/-Methylindolyl-ß-D-galactopyranosid (Green-gal), 4-Methyl- umbelliferyl-ß-D-galactopyranosid (MUG), in löslicher Form enthält, welches bei Reaktion mit dem Enzym des Enzym-Konjugates eine Farbreaktion zeigt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Stopplösung einen pH-Wert kleiner als 7.0 hat und bevorzugt eine verdünnte Salzoder Schwefelsäure ist.
17. Mikrotiterplatte mit wenigstens einem Well, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Well mit einem Peptid entsprechend einer der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 3 beschichtet ist.
18. Mikrotiterplatte nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte wenigstens eine Testeinheit umfassend 24 Wells aufweist.
19. Mikrotiterplatte nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte mehrere Testeinheiten aufweist, die unabhängig von einander verwendbar sind.
20. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Wells einen runden, flachen, v-förmigen oder c-förmigen Boden haben.
21. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren hergestellt ist, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer unbeschichteten Mikrotiterplatte
b) Inkubieren der Mikrotiterplatte mit einer Beschichtungslösung, welche aus einem basischen Carbonatpuffer mit pH 9.6 besteht, in dem 5 μg/ml eines Antigens entsprechend einer der Sequenzen nach SEQ ID No. 1, 2 oder 3 gelöst ist, für zwei Stunden bei 37°, und
c) Inkubieren der Miktrotiterplatte mit einer Blockinglösung, enthaltend eine Tris- gepufferte Proteinlösung mit pH 7.4 ist, enthaltend wenigstens ein anti- mikrobielles Agens, bei 4°C über Nacht.
22. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 17 bis 21 zur Verwendung in einem Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 16.
23. Testkit zum Nachweis von Amyloid-beta Autoantikörpern in Seruπv/Plasma- und/oder CSF-Proben, wenigstens umfassend eine Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Peptid ist dessen Sequenz einer
Sequenz ausgewählt aus SEQ ID No. 1 , 2 oder 3 entspricht.
24. Testkit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Test-Kit Assay-Puffer, Waschlösung, Enzymkonjugat, Substratlösung und oder Stopplösung enthält.
25. Testkit nach einem der Ansprüche 23 oder 24 zur Verwendung in einem Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 16.
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