CN109490539A - 检测某种动物病原抗体的elisa试剂盒 - Google Patents

检测某种动物病原抗体的elisa试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物病原抗体检测技术领域，且公开了检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，包括预包被板、经过标记酶标记的待测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、终止液、底物缓冲液、TMB使用液、ABTS使用液，预包被板为96孔聚苯乙烯板，标记酶为辣根过氧化物酶，包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，包被缓冲液由1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3和1000mL的蒸馏水混合制得，洗涤缓冲液为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液。该检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，可以直接从猪的粪便中提取待测抗体，无需将猪固定住以后再从猪的身上采取血清，简化了工作流程，且有效地避免了采取血清时而对猪的健康成长造成影响。

Description

检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及动物病原抗体检测技术领域，具体为检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒。
背景技术
病毒性传染病已成为威胁我国生猪养殖健康发展的严重障碍，其爆发和流行给养猪业者造成了极大经济损失。目前，包括猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒是养猪业重点防控的病毒性疫病。在生猪疾病的预防工作中，通过实时检测和评价疫苗免疫后血清中抗体水平和区分抗体来源是评价疫苗接种效果、保护猪群健康的关键环节。猪病毒性传染性疾病的血清抗体检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集试验、血凝试验、病毒中和试验、单层酶联免疫吸附实验等。ELISA试剂盒在国内有许多种叫法，例如：ELISA检测试剂盒、ELISA Kit、酶联免疫试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、酶免试剂盒等，比较常见的叫法是ELISA检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒等。
ELISA试剂盒自从60-70年代问世以来，得到全世界科研工作者的认可及推崇，在欧美及中国获得很大的推广，尤其是国内生化领域的长足发展，ELISA生物试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。
目前，针对猪的病原体检测通常采用的是间接ELISA，这种方式需要从猪的身上采取血清，每次检测都要重新在猪的身上采取新的血清，当在猪身上采取血清时，先要人工将猪固定住才能进行采取，人工将猪固定时比较麻烦，且从猪身上采取血清也会对猪的健康成长造成一定的影响。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，具备可以直接从猪的粪便中提取所需的待测抗体，简化了工作流程，且有效地避免了采取血清时而对猪的健康成长造成影响等优点，解决了间接ELISA中，先要人工将猪固定住才能进行采取血清，人工将猪固定时比较麻烦，且从猪身上采取血清也会对猪的健康成长造成一定的影响的问题。
(二)技术方案
为实现上述可以直接从猪的粪便中提取所需的待测抗体,简化了工作流程，且有效地避免了采取血清时而对猪的健康成长造成影响的目的，本发明提供如下技术方案：检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，包括预包被板、经过标记酶标记的待测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、终止液、底物缓冲液、TMB使用液、ABTS使用液，所述预包被板为96孔聚苯乙烯板。
优选的，所述标记酶为辣根过氧化物酶。
优选的，所述包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，所述包被缓冲液由1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3和1000mL的蒸馏水混合制得。
优选的，所述洗涤缓冲液为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液，所述洗涤缓冲液由0.2g的KH2PO4、2.9g的Na2HPO4、Na2HPO4·12H2O、0.8g的NaCl、0.2g的KCl、0.5mL的浓度为0.05％的吐温20和1000mL的蒸馏水混合制得。
优选的，所述终止液为H2SO4溶液，所述终止液由178.2mL的蒸馏水和21.8mL的浓度为98％的浓硫酸混合制得。
优选的，所述底物缓冲液为pH值为5.5的磷酸枣柠檬酸，所述底物缓冲液由25.6mL浓度为28.4g/L的Na2HPO4、24.4mL浓度为19.2g/L的柠檬酸和50mL的蒸馏水混合制得。
优选的，所述TMB使用液由0.5mL浓度为2mg/mL的TMB无水乙醇溶液、10mL底物缓冲液和35μL的浓度为0.75％的双氧水混合制得，所述ABTS使用液由0.5mg的ABTS、1mL底物缓冲液和2μL的浓度为3％的双氧水混合制得。
本发明还提供了一种用于上述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒进行检测的方法，其步骤具体如下：
S1：包被：用包被缓冲液将待测抗体稀释至蛋白质含量为5μL/mL，在预包被板反应孔的内部加入0.1mL的稀释后的溶液，将预包被板置于4℃的冰箱内，经过12h后取出，去除预包被板反应孔内部的溶液，且用洗涤缓冲液冲洗4次，每次4分钟；
S2：添加样品：加入0.1mL的待测抗体稀释后的溶液至已包被的预包被板上的反应孔内部，将预包被板放置在37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，然后用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4分钟；
S3：添加待测抗体：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的新鲜稀释后的待测抗体，将预包被板放入37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，用洗涤液冲洗4次，每次4分钟；
S4：添加底物液显色：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的刚配置的TMB使用液，将预包被板置于37℃的孵育箱的内部，经0.5h后取出；
S5：结束反应：向预包被板上的反应孔内部添加0.05mL的终止液；
S6：判定结果：以ABTS使用液显色，于410nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，具备以下有益效果：
该检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，通过以双抗体夹心ELISA代替间接ELISA，可以直接从猪的粪便中提取所需的待测抗体，无需将猪固定住以后再从猪的身上采取血清，简化了工作流程，且有效地避免了采取血清时而对猪的健康成长造成影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，包括预包被板、经过标记酶标记的待测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、终止液、底物缓冲液、TMB使用液、ABTS使用液，预包被板为96孔聚苯乙烯板，标记酶为辣根过氧化物酶。
包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，包被缓冲液由1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3和1000mL的蒸馏水混合制得。
洗涤缓冲液为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤缓冲液由0.2g的KH2PO4、2.9g的Na2HPO4、Na2HPO4·12H2O、0.8g的NaCl、0.2g的KCl、0.5mL的浓度为0.05％的吐温20和1000mL的蒸馏水混合制得。
终止液为H2SO4溶液，终止液由178.2mL的蒸馏水和21.8mL的浓度为98％的浓硫酸混合制得。
底物缓冲液为pH值为5.5的磷酸枣柠檬酸，底物缓冲液由25.6mL浓度为28.4g/L的Na2HPO4、24.4mL浓度为19.2g/L的柠檬酸和50mL的蒸馏水混合制得。
TMB使用液由0.5mL浓度为2mg/mL的TMB无水乙醇溶液、10mL底物缓冲液和35μL的浓度为0.75％的双氧水混合制得，ABTS使用液由0.5mg的ABTS、1mL底物缓冲液和2μL的浓度为3％的双氧水混合制得。
本发明还提供了一种用于上述检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒进行检测的方法，其包括以下步骤：
S1：包被：用包被缓冲液将待测抗体稀释至蛋白质含量为5μL/mL，在预包被板反应孔的内部加入0.1mL的稀释后的溶液，将预包被板置于4℃的冰箱内，经过12h后取出，去除预包被板反应孔内部的溶液，且用洗涤缓冲液冲洗4次，每次4分钟；
S2：添加样品：加入0.1mL的待测抗体稀释后的溶液至已包被的预包被板上的反应孔内部，将预包被板放置在37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，然后用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4分钟；
S3：添加待测抗体：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的新鲜稀释后的待测抗体，将预包被板放入37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，用洗涤液冲洗4次，每次4分钟；
S4：添加底物液显色：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的刚配置的TMB使用液，将预包被板置于37℃的孵育箱的内部，经0.5h后取出；
S5：结束反应：向预包被板上的反应孔内部添加0.05mL的终止液；
S6：判定结果：以ABTS使用液显色，于410nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
实施例2
检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，包括预包被板、经过标记酶标记的待测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、终止液、底物缓冲液、TMB使用液、ABTS使用液，预包被板为96孔聚苯乙烯板，标记酶为辣根过氧化物酶。
包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，包被缓冲液由1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3和1000mL的蒸馏水混合制得。
洗涤缓冲液为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤缓冲液由0.2g的KH2PO4、2.9g的Na2HPO4、Na2HPO4·12H2O、0.8g的NaCl、0.2g的KCl、0.5mL的浓度为0.05％的吐温20和1000mL的蒸馏水混合制得。
终止液为H2SO4溶液，终止液由178.2mL的蒸馏水和21.8mL的浓度为98％的浓硫酸混合制得。
底物缓冲液为pH值为5.5的磷酸枣柠檬酸，底物缓冲液由25.6mL浓度为28.4g/L的Na2HPO4、24.4mL浓度为19.2g/L的柠檬酸和50mL的蒸馏水混合制得。
TMB使用液由0.5mL浓度为2mg/mL的TMB无水乙醇溶液、10mL底物缓冲液和35μL的浓度为0.75％的双氧水混合制得，ABTS使用液由0.5mg的ABTS、1mL底物缓冲液和2μL的浓度为3％的双氧水混合制得。
本发明还提供了一种用于上述检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒进行检测的方法，其包括以下步骤：
S1：包被：用包被缓冲液将待测抗体稀释至蛋白质含量为5μL/mL，在预包被板反应孔的内部加入0.1mL的稀释后的溶液，将预包被板置于4℃的冰箱内，经过12h后取出，去除预包被板反应孔内部的溶液，且用洗涤缓冲液冲洗5次，每次3分钟；
S2：添加样品：加入0.1mL的待测抗体稀释后的溶液至已包被的预包被板上的反应孔内部，将预包被板放置在37℃的孵育箱的内部，经过0.5h后取出，然后用洗涤缓冲液洗涤5次，每次3分钟；
S3：添加待测抗体：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的新鲜稀释后的待测抗体，将预包被板放入37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，用洗涤液冲洗5次，每次3分钟；
S4：添加底物液显色：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的刚配置的TMB使用液，将预包被板置于37℃的孵育箱的内部，经0.25h后取出；
S5：结束反应：向预包被板上的反应孔内部添加0.05mL的终止液；
S6：判定结果：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果，反应孔内部的颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
综上所述，该检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，通过以双抗体夹心ELISA代替间接ELISA，可以直接从猪的粪便中提取所需的待测抗体，无需将猪固定住以后再从猪的身上采取血清，简化了工作流程，且有效地避免了采取血清时而对猪的健康成长造成影响。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括预包被板、经过标记酶标记的待测抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、终止液、底物缓冲液、TMB使用液、ABTS使用液，所述预包被板为96孔聚苯乙烯板。
2.根据权利要求1所述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述标记酶为辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1所述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被缓冲液为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，所述包被缓冲液由1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3和1000mL的蒸馏水混合制得。
4.根据权利要求1所述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述洗涤缓冲液为pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液，所述洗涤缓冲液由0.2g的KH2PO4、2.9g的Na2HPO4、Na2HPO4·12H2O、0.8g的NaCl、0.2g的KCl、0.5mL的浓度为0.05％的吐温20和1000mL的蒸馏水混合制得。
5.根据权利要求1所述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液为H2SO4溶液，所述终止液由178.2mL的蒸馏水和21.8mL的浓度为98％的浓硫酸混合制得。
6.根据权利要求1所述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述底物缓冲液为pH值为5.5的磷酸枣柠檬酸，所述底物缓冲液由25.6mL浓度为28.4g/L的Na2HPO4、24.4mL浓度为19.2g/L的柠檬酸和50mL的蒸馏水混合制得。
7.根据权利要求1所述的检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述TMB使用液由0.5mL浓度为2mg/mL的TMB无水乙醇溶液、10mL底物缓冲液和35μL的浓度为0.75％的双氧水混合制得，所述ABTS使用液由0.5mg的ABTS、1mL底物缓冲液和2μL的浓度为3％的双氧水混合制得。
8.检测某种动物病原抗体的ELISA试剂盒进行检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：包被：用包被缓冲液将待测抗体稀释至蛋白质含量为5μL/mL，在预包被板反应孔的内部加入0.1mL的稀释后的溶液，将预包被板置于4℃的冰箱内，经过12h后取出，去除预包被板反应孔内部的溶液，且用洗涤缓冲液冲洗4次，每次4分钟；
S2：添加样品：加入0.1mL的待测抗体稀释后的溶液至已包被的预包被板上的反应孔内部，将预包被板放置在37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，然后用洗涤缓冲液洗涤4次，每次4分钟；
S3：添加待测抗体：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的新鲜稀释后的待测抗体，将预包被板放入37℃的孵育箱的内部，经过1h后取出，用洗涤液冲洗4次，每次4分钟；
S4：添加底物液显色：向预包被板上的反应孔的内部添加0.1mL的刚配置的TMB使用液，将预包被板置于37℃的孵育箱的内部，经0.5h后取出；
S5：结束反应：向预包被板上的反应孔内部添加0.05mL的终止液；
S6：判定结果：以ABTS显色，于410nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
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