CN203838160U - 猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒。该试剂盒有一个盒体，盒体内设有抗原包被反应板和操作说明书存放槽及9个孔槽；各槽中分别放置抗原包被反应板、说明书，装有gB抗体阳性对照液、gE抗体阳性对照液、gB和gE抗体阴性对照液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液、终止液的试剂瓶。抗原包被反应板分为检测区Ⅰ和检测区Ⅱ，分别包被gB和gE蛋白抗原。本实用新型可同时批量检测出待检样品是否含有猪伪狂犬病毒gB和gE抗体，用于PRV野毒感染及疫苗免疫的鉴别诊断和评估PRV疫苗的免疫效果。具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点。
Description
技术领域
本实用新型属于兽用疫病检测技术领域，具体涉及一猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒。
背景技术
伪狂犬病（Pseudorabies）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病最主要的贮存宿主和传染源。健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。成年猪常为隐性感染；受感染的怀孕母猪则出现流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等病征；受感染的新生仔猪出现发热及神经症状，甚至衰竭死亡，死亡率可达100%。伪狂犬病对我国乃至全球养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。
在PRV与宿主的相互作用中，结构蛋白gB非常保守，具有良好的免疫原性且抗原表位分析清晰，可作为理想的血清学检测用抗原。gE糖蛋白是PRV的一种十分重要的糖蛋白，在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但gE不是PRV增殖所必需的蛋白，常作为缺失的候选基因。猪伪狂犬病毒gE抗体检测能有效地区分野毒感染，结合gB抗体的检测，能在区分野毒感染的同时监测疫苗抗体水平。
实用新型内容
本实用新型的目的是为了提供一种快速、有效、同时检测猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒。为实验动物筛选、PRV疫苗效果的评价和猪场PRV净化提供新的快捷高效的工具。
为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：
一种猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体1，盒体1内设有抗原包被反应板存放槽2、猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液孔槽3、猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液孔槽4、猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液孔槽5、样品稀释液孔槽6、酶结合物孔槽7、浓缩洗涤液孔槽8、酶底物A溶液孔槽9、酶底物B溶液孔槽10、终止液孔槽11和操作说明书存放槽12；抗原包被反应板存放槽2内放置抗原包被反应板，各孔槽中（3-11）放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽12内放置操作说明书。所述的抗原包被反应板分为检测区Ⅰ和检测区Ⅱ，检测区Ⅰ和检测区Ⅱ分别包被猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。
上述的猪伪狂犬病毒gB和gE蛋白抗原均为高纯度的原核表达蛋白，可按照本领域常规技术制备或购买市售产品均可。
所述的抗原包被反应板的规格优选为96孔，从上至下平均分为检测区Ⅰ和检测区Ⅱ，每个区域48孔。
所述的样品稀释液优选为在0.01mol/L、pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中加入BSA和 NaN3，使BSA和 NaN3的浓度分别为0.1-10%和0.01-0.05%；按20mL/瓶分装。
所述的猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液和猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液优选为将猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的猪阳性血清分别用样品稀释液100倍稀释配制而成；分别按1mL/瓶分装。
所述的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液优选为将不含有猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的猪阴性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成；按1mL/瓶分装。
所述的酶结合物优选为用样品稀释液将商品化小鼠抗猪IgG酶标二抗按1:2000稀释制成；按10mL/瓶分装。
所述的浓缩洗涤液优选为在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20（Tween-20），使得吐温-20的浓度为0.5%（v/v），使用时用水10倍稀释；按30mL/瓶分装。
所述的酶底物A溶液优选为含有0.01-0.1%过氧化氢（H2O2）的1%乙酸钠溶液，pH5.0；按5mL/瓶分装。
所述的酶底物B溶液优选为溶有0.2-1g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的10mL二甲基亚砜与溶有10g乙酸钠、pH5.0的1000mL水取990mL的混合溶液；按5mL/瓶分装。
所述的终止液优选为取54.3mL 95%浓硫酸，加蒸馏水至1000mL得到；按5mL/瓶分装。
本实用新型采用酶联免疫间接法，将猪伪狂犬病毒gB和gE蛋白抗原分别包被在抗原包被板的两个检测区内，可分别于待检样品中的特异性抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加入小鼠抗猪IgG二抗的酶结合物，形成“抗原-抗体-二抗-酶”复合物，最后通过加入酶底物A液和B液进行显色，并读取光吸收值（OD450nm）。
结果计算与判定：Cut off（CO值）=阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值=样品光吸收值OD450nm/ CO值，其中，样品值>1为阳性；样品值≤1为阴性。
本实用新型的试剂盒具有以下优点：
（1）本实用新型以基因表达的重组蛋白为检测抗原，安全性好，无杂蛋白，具有特异性好，灵敏度高，可大批量检测等优点。
（2）本实用新型可以在同一块板子上同时检测猪伪狂犬病毒gB和gE抗体，在区别野毒感染的同时可以进一步确定是否有PRV抗体。可同时用于PRV野毒感染及疫苗免疫的鉴别诊断和评估PRV疫苗的免疫效果。
附图说明
图1为本实用新型的横切面剖视图，即盒体各组成部分及位置示意图；其中，1-盒体，2-抗原包被反应板存放槽，3-猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液孔槽，4-猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液孔槽，5-猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液孔槽，6-样品稀释液孔槽，7-酶结合物孔槽，8-浓缩洗涤液孔槽，9-酶底物A溶液孔槽，10-酶底物B溶液孔槽，11-终止液孔槽，12-操作说明书存放槽。
图2为本实用新型抗原包被反应板的结构示意图；其中，Ⅰ区包被猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原，Ⅱ区包被猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于此。
实施例1
一种猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，其横切面剖视图如图1所示，该试剂盒有一个盒体1，盒体1内设有抗原包被反应板存放槽2、猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液孔槽3、猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液孔槽4、猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液孔槽5、样品稀释液孔槽6、酶结合物孔槽7、浓缩洗涤液孔槽8、酶底物A溶液孔槽9、酶底物B溶液孔槽10、终止液孔槽11和操作说明书存放槽12；抗原包被反应板存放槽2内放置抗原包被反应板，各孔槽中（3-11）放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽12内放置操作说明书。
其中，所述的抗原包被反应板的规格为96孔，其结构示意图如图2所示，从上至下平均分为检测区Ⅰ和检测区Ⅱ，每个区域48孔；所述检测区Ⅰ包被猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原，检测区Ⅱ包被猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。
上述猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒制备方法如下：
（1）抗原包被反应板：酶标板孔均匀包被猪伪狂犬病毒gB和gE蛋白抗原，包被量为0.1-1μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液（即1升碳酸盐缓冲液中含1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3），2～8℃过夜后，洗板2次。加入封闭液，封闭液为质量浓度为1-10%的BSA或脱脂牛奶的任一种或其组合，200μL/孔，37℃进行封闭2小时，干燥。
（2）样品稀释液：配制浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值7.2-7.4，再加入BSA和 NaN3，使其浓度分别为0.1-10%BSA和0.01-0.05%NaN3，即得；按20mL/瓶分装。
（3）酶结合物：用样品稀释液将商品化小鼠抗猪IgG酶标二抗按1:2000稀释制成，按10mL/瓶分装。
4）浓缩洗涤液（10×）：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20（Tween-20），使得吐温-20的浓度为0.5%（v/v），即得；按30mL/瓶分装。
（5）酶底物A溶液：含有0.01-0.1%过氧化氢（H2O2）的1%乙酸钠溶液，pH5.0，其配制为：称取准确称量乙酸钠10g溶于900mL超纯水中，用乙酸调pH值至5.0，加入30%过氧化氢（H2O2）0.333-3.33mL，加超纯水定容至1000mL，即得；按5mL/瓶分装。
（6）酶底物B溶液：准确称量3,3’,5,5’-四甲基联苯胺0.2-1g溶解于10mL二甲基亚砜（DMSO）中制成母液1；准确称量乙酸钠10g溶于1000mL超纯水中，用乙酸调pH值至5.0制成母液2；将母液1溶于990mL母液2中制成酶底物B溶液；按5mL/瓶分装。
（7）终止液：取54.3mL浓度为95%浓硫酸，加蒸馏水至1000mL，即得；按5mL/瓶分装。
（8）阳性对照液：将猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的猪阳性血清分别用样品稀释液100倍稀释配制而成；分别按1mL/瓶分装。
（9）阴性对照液，将不含有猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的猪阴性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成；按1mL/瓶分装。
（10）组装：按每一个试剂盒配抗原包被反应板1块、猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液1瓶、猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液1瓶、猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液1瓶、样品稀释液1瓶、酶结合物1瓶、浓缩洗涤液1瓶、酶底物A溶液1瓶、酶底物B溶液1瓶、终止液1瓶和操作说明书1份进行装盒。
实施例2 猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒的检测方法：
（1）将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其分别加入抗原包被反应板中检测区Ⅰ和检测区Ⅱ，每孔加100μL，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μL阳性对照液，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样2个孔；
（2）加样完成后，将抗原包被反应板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
（3）每孔再加入100μL酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
（4）每孔加入100μL显色液，避光显色5-10 分钟，每孔加入50μL终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液和酶底物A溶液1:1（体积比）混合制得；
（5）将抗原包被反应板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD450nm；
（6）结果计算与判定：Cut off（CO值）=阴性对照平均光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值=样品平均光吸收值OD450nm/ CO值，其中，样品值﹥1为阳性；样品值≤1为阴性。
上述实施例为本实用新型较佳的实施方式，但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被反应板存放槽(2)、猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液孔槽(3)、猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液孔槽(4)、猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液孔槽(5)、样品稀释液孔槽(6)、酶结合物孔槽(7)、浓缩洗涤液孔槽(8)、酶底物A溶液孔槽(9)、酶底物B溶液孔槽(10)、终止液孔槽(11)和操作说明书存放槽(12)；抗原包被反应板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，各孔槽中(3-11)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(12)内放置操作说明书；所述的抗原包被反应板分为检测区Ⅰ和检测区Ⅱ，检测区Ⅰ和检测区Ⅱ分别包被猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的抗原包被反应板的规格为96孔，从上至下平均分为检测区Ⅰ和检测区Ⅱ。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的猪伪狂犬病毒gB抗体阳性对照液和猪伪狂犬病毒gE抗体阳性对照液分别为用样品稀释液100倍稀释的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的猪阳性血清；分别按1mL/瓶分装。
4.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体阴性对照液为用样品稀释液100倍稀释的不含有猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的猪阴性血清。
5.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gB和gE抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的酶结合物为用样品稀释液2000倍稀释的商品化小鼠抗猪IgG酶标二抗；按10mL/瓶分装。
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