CN103308688A - 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用。本发明的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)抗原，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗Cap蛋白抗体酶结合物。本发明试剂盒的特异性达100％，灵敏度高达1∶800，可用于猪群PCV2感染的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及其检测方法和其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。除了引发PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。截止目前，我国养猪业受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2血清抗体检测试剂盒的临床需求日益迫切，而检测猪圆环病毒特异性IgM抗体为早期诊断该疾病提供了新的方法。
PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成，包含两个大的开放阅读框架ORF1和ORF2，分别编码病毒蛋白复制酶(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，含有4个抗原表位，具有较好的免疫原性和抗原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。但是，PCV2在体外培养不产生细胞病变，病毒繁殖能力低，难于获得高产量的病毒抗原，故难以用于诊断目的。昆虫杆状病毒表达系统以其表达外源蛋白产量高、免疫活性好、产物易纯化、反应背景低等优点，在多种动物疫病诊断中得到应用。为此，检测PCV2的衣壳蛋白IgM抗体可以早期诊断猪群PCV2感染情况，便于制定最佳的免疫程序或淘汰选育，有效预防和控制PCV2的侵袭和传播，降低甚至避免经济损失。
目前，国内外采用的PCV2检测方法主要包括病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶单层实验(IMPA)、原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(PCR)等。尽管这些方法可以检测PCV2或抗体水平，但极少检测PCV2 IgM抗体。国外已有的检测猪IgM抗体的试剂盒主要用于检测猪IgM抗体，而不能检测特异性抗原的抗体，即检测抗何种病原的抗体，如PCV2 IgM-Cap蛋白抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)抗原，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗Cap蛋白抗体酶结合物。
本发明的优选技术方案中，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔包被猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9.6。
本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3。
本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
本发明的优选技术方案中，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为：配置pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN3，即得。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，其配置为：称取100mg TMB，将其加入到10ml二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物B溶液0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0，其配置为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30％H2O2，即得。
本发明的优选技术方案中，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得显色液。
本发明的优选技术方案中，所述试剂盒中还含有阳性对照液和阴性对照液，其中，所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
本发明的优选技术方案中，所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法包括下述步骤：
1)利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物，其中，
上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，
下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，
上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’
下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，
以PGR从PCV2基因组中扩增出ORF2基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dua1中，构建ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)，将重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)转化到大肠杆菌DH10Bac，获得重组bacmid；
2)将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)；
3)将重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)感染Sf9细胞，使其表达Cap蛋白，并自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种利用猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶-兔抗Cap蛋白抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
本发明的另一目的在于提供本发明的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒用于制备诊断猪群PCV2早期感染的试剂盒中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述的猪群PCV2早期感染选自自然感染、疫苗接种的任一种或其组合。
为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定：
本发明的猪IgM单克隆抗体可商购，如购自MP Biomedicals，Incorporated；或按照本领域的常规方法制备本发明的猪IgM单克隆抗体，如参照文献(单克隆抗体的制备，曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京：科学出版社，2009.18-33.)公开的方法制备。
本发明的辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文献(曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京：科学出版社，2009；酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法，[EB/OL]http://www.seekbio.com/biotech/Immunity/2007/2007831543528.html2007-8-3.)公开的方法制备，其中，所述的抗Cap蛋白抗体选自多抗、单抗的任一种或其组合。
本发明的辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物的制备方法，包括下述步骤：
1)将纯化的PCV2-Cap蛋白常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1∶1000以上时，取血清；
2)将步骤1)制得的血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化血清；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化血清进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物；
4)在酶标记物(即辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物)中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。
本发明的浓缩洗涤液为10倍洗涤液，检测时需用纯净水稀释10倍，制得洗涤液。
本发明的显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
本发明所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阳性血清配制而成。
本发明所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
本发明所述的空白对照液为样品稀释液。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有下述有益技术效果：
1、本发明的猪圆环病毒2型(PCV2)IgM抗体ELISA检测试剂盒采用猪IgM单克隆抗体制备反应板，进而组成用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测猪圆环病毒2型特异性IgM抗体的试剂盒。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，还克服了抗原问题所致的灵敏度低等缺陷，显著提高了检测的灵敏度和特异性。
2、本发明构建了ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)，继而进行转化和蛋白的表达，显著提高了蛋白的表达量和特异性。
3、本发明采用捕获法检测IgM抗体，夹心法检测特异的PCV2-Cap IgM抗体。本发明的检测方法具有特异性强(特异性达100％)、灵敏度高(灵敏度为1∶800)等优点，可用于猪群PCV2感染的早期诊断。
附图说明
图1本发明试剂盒的制备工艺流程图。
图2本发明试剂盒的检测原理示意图。
图3实施例1制得的PCV2-cap蛋白SDS-PAGE分析图，其中，M是Marker，1是纯化的PCV2-cap蛋白。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例1 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒的制备
1.本实施例的猪IgM单克隆抗体购自MP Biomedicals，Incorporated；
2.辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物的制备，包括下述步骤：
1)将纯化的PCV2-Cap蛋白常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1∶1000以上时，取血清；
2)将步骤1)制得的血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化血清；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化血清进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物；
4)在酶标记物(即辣根过氧化物酶(HRP)-抗Cap蛋白抗体酶结合物)中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；
3.本发明所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法，包括下述步骤：
1)利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物，其中，
上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，
下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，
上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’
下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，
以PGR从PCV2基因组中扩增出ORF2基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dua1中，构建ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)，将该重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组bacmid；
2)将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)；
3)将重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)感染Sf9细胞，表达Cap蛋白，且自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白，其检测结果见图3；
4.酶标板孔均匀包被猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1μg-1μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6，即1升溶液中含1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3；
5、封闭液为质量浓度为1-10％的BSA或脱脂牛奶的任一种或其组合；
6、试剂盒中其他溶液的配制：①样品稀释液：配置pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN3，即得；②浓缩洗涤液：在0.1mol/LPBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％，即得；③酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，其配置为：称取100mg TMB，加入到10ml二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得；④酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0，其配置为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30％H2O2，即得；⑤显色液，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；⑥终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000ml，即得；⑦阳性对照液，将含有抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阳性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成；⑧阴性对照液，将不含有抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阴性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成。
实施例2 猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的检测方法
利用本发明猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶-兔抗Cap蛋白抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
实施例3 本发明试剂盒的特异性和灵敏度测试
1.特异性检测
按照实施例2所述的检测方法，利用实施例1制得的试剂盒分别检测猪PCV2灭活疫苗免疫早期血清、猪PCV2感染早期血清、纯化的猪PCV2 IgG抗体、猪PCV1感染早期血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清和猪PCV2阴性血清。
将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体0.1μg-1μg/孔的酶标板孔中，每孔加100μl，平行设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
表1本发明试剂盒的特异性测试
| 序号 | 检测样品 | 检测结果(OD450nm) | 结果分析 |
| 1 | 猪PCV2灭活疫苗免疫早期血清 | 1.584 | 样品值＞1，阳性 |
| 2 | 猪PCV2感染早期血清 | 0.982 | 样品值＞1，阳性 |
| 3 | 纯化的猪PCV2IgG抗体 | 0.103 | 样品值＜1，阴性 |
| 4 | 猪PCV1感染早期血清 | 0.089 | 样品值＜1，阴性 |
| 5 | 猪蓝耳病毒抗体阳性血清 | 0.081 | 样品值＜1，阴性 |
| 6 | 猪伪狂犬病毒阳性血清 | 0.071 | 样品值＜1，阴性 |
| 7 | 猪瘟病毒抗体阳性血清 | 0.101 | 样品值＜1，阴性 |
| 8 | 猪PCV2阴性血清 | 0.062 | 样品值＜1，阴性 |
| 9 | 阳性对照组 | 1.102 | |
| 10 | 阴性对照组 | 0.079 | |
| 11 | 空白对照组 | 0.056 |
由表1可见，猪PCV2免疫早期血清和PCV2感染早期血清检测为阳性，其他样品检测为阴性，本发明试剂盒的检测特异性为100％。
2.灵敏度检测
按照实施例2所述的检测方法，利用实施例1制得的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清。
将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体0.1μg-1μg/孔的酶标板孔中，每孔加100μl，平行设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
表2本发明试剂盒检测不同稀释度阳性参考血清的结果
| 序号 | 不同稀释度的阳性参考血清 | 检测结果(OD450nm) | 结果分析 |
| 1 | 1∶100 | 1.557 | 样品值＞1，阳性 |
| 2 | 1∶200 | 1.018 | 样品值＞1，阳性 |
| 3 | 1∶400 | 0.637 | 样品值＞1，阳性 |
| 4 | 1∶800 | 0.425 | 样品值＞1，阳性 |
| 5 | 1∶1600 | 0.158 | 样品值＜1，阴性 |
| 6 | 阳性对照组 | 1.107 | |
| 7 | 阴性对照组 | 0.078 | |
| 8 | 空白对照组 | 0.055 |
由表2可见，本发明的试剂盒的最高检测到阳性参考样品的稀释度为1∶800。
Claims (12)
1.一种猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)抗原，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗Cap蛋白抗体酶结合物。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔包被猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9.6。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na2CO3和2.93gNaHCO3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白和含有0.01-0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
6.根据权利要求1-5任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。
7.根据权利要求1-6任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
8.根据权利要求1-7任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中还含有阳性对照液和阴性对照液，其中，所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释含有抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗PCV2-cap蛋白IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
10.根据权利要求1-9任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法包括下述步骤：
1)利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物，其中，
上游引物1：5’-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’，
下游引物1：5’-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，
上游引物2：5’-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3’
下游引物2：5’-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’，
以PCR从PCV2基因组中扩增出ORF2基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dua1中，构建ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)，将重组质粒pFastBac-Dua1-ORF2(2×)转化至大肠杆菌DH10Bac，获得重组bacmid；
2)将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)；
3)将重组杆状病毒rBac-ORF2(2×)感染Sf9细胞，使其表达Cap蛋白，并自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。
11.一种利用权利要求1-10任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶-兔抗Cap蛋白抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm其测定光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
12.权利要求1-10任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒用于制备诊断猪群PCV2早期感染的试剂盒中的应用，优选所述的猪群PCV2早期感染选自自然感染、疫苗接种的任一种或其组合。
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