CN1584597A - 猪圆环病毒2型抗原或抗体检测elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体检测ELISA试剂盒。试剂盒内试剂盒内设有抗原检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其中，抗原检测板为吸附抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb1的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb2，阳性对照为重组猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白溶液，阴性对照为牛血清白蛋白溶液。本发明有益的积极效果是：检测ELISA试剂盒操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。

Description

猪圆环病毒2型抗原或抗体检测ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种家畜疫病快速诊断器具，特别是涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体检测ELISA试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是目前发现的最小的动物病毒，病毒粒子直径约17nm，为共价闭合，环状，单股DNA病毒，PCV具有两种基因型：PCV1和PCV2。PCV1无致病性，但广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系，PCV2对猪有致病性，主要引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)。PMWS为一种新的传染病，1991年首次在加拿大发现，主要发生于5-12周龄断奶仔猪，表现为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、腹泻、黄疸。随后，美国，英国，德国，法国，爱尔兰，捷克，西班牙，中国台湾，荷兰，瑞士，阿根廷，墨西哥，日本，丹麦，意大利，韩国，匈牙利，泰国等国相继报道了该病，流行病学调查表明，该病在中国也广泛流行，并造成相当严重的经济损失。PCV2除了引起PMWS外，还可引起育肥猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并与怀孕母猪的繁殖障碍，新生仔猪的先天性阵颤，新生仔猪腹泻和增生性坏死性肺炎关系密切。根据PMWS的流行病学，临床症状和剖检病理变化可对PCV2感染作出初步诊断，但确诊仍需要以实验室诊断技术检测PCV2抗原及其抗体。对猪群PCV2抗体水平，特别是母源抗体水平，进行监测，可确实了解猪体免疫水平，把握疫病最适免疫时机，确保获得良好免疫效果，有效预防和控制PCV2的侵袭和传播，避免因此而引起的重大损害。

目前，国内外采用的PCV2检测技术主要有：病毒分离培养，间接免疫荧光(IFA)，免疫酶单层试验(IMPA)，原位杂交(ISH)，聚合酶链式反应(PCR)等等。上述技术和方法虽然可以检测PCV2及其抗体水平，在实践中也取得一定的效果，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，常限于实验室内进行，很难在基层普及和推广。因此，研制开发适用于养殖基层的快捷、简便的PCV2及其抗体水平检测器具，对猪群PCV2免疫水平进行实时监测，建立科学的、灵活的猪群疫病免疫程序，对疫病的预防和控制有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体检测ELISA试剂盒。

猪圆环病毒2型抗原检测ELISA试剂盒：在试剂盒内设有抗原检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液。所说的抗原检测板为吸附抗PCV2去核定位信号肽衣壳蛋白(dCap)单克隆抗体mAb1的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记抗PCV2dCap蛋白单克隆抗体mAb2，阳性对照为PCV2 dCap重组蛋白溶液，阴性对照为牛血清白蛋白(BSA)溶液。样品稀释液为0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，显色液A为四甲基联苯胺溶液(TMB)，显色液B为含0.005％过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸溶液。重组PCV2 dCap蛋白为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，与猪圆环病毒2型阳性血清特异结合。抗PCV2 dCap蛋白单克隆抗体特异识别PCV2 dCap蛋白，与猪圆环病毒1型(PCV1)Cap蛋白无交叉反应，可有效区分PCV1和PCV2病毒。

猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒：在试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液。所说的抗体检测板为吸附抗PCV2 dCap蛋白单克隆抗体mAb1并结合有重组PCV2 dCap蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为HR标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪PCV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清。样品稀释液为0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，显色液A为四甲基联苯胺溶液，显色液B为含0.005％过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸溶液。重组PCV2d Cap蛋白为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，与猪圆环病毒2型阳性血清特异结合。抗PCV2 dCap蛋白单克隆抗体能特异识别PCV2 dCap蛋白，与猪圆环病毒1型(PCV1)Cap蛋白无交叉反应，可有效区分PCV1和PCV2病毒。

本发明有益的积极效果是：PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒具有下列优点：

(1)特异性强，敏感性高。PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒以单克隆抗体或基因工程表达的重组dCap蛋白为基础制备而成；单克隆抗体为高亲和力的抗PCV2 dCap特异性均质抗体，特异识别PCV2 Cap衣壳蛋白，与PCV1无交叉反应；重组dCap蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性。

(2)操作简便快速。使用PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒检测PCV2抗原或抗体时，无需另配其它试剂，在0.5-1小时内即可判定检测结果。

(3)显示检测结果形象、直观准确。PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒以显色的深浅显示检测结果，即检测孔出现蓝色显色为阳性，中止后呈黄色，无色为阴性，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。

(4)成本低，投资少。PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒可在检测现场完成操作，检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

附图说明

图1是PCV2抗原检测ELISA试剂盒检测原理示意图；

图2是PCV2抗体检测ELISA试剂盒检测原理示意图，图中：

1为酶标板，2为抗PCV 2dCap蛋白单克隆抗体mAb1，3为PCV2 dCap抗原，4为猪抗PCV2抗体，5为HRP标记抗PCV2 dCap蛋白单克隆抗体mAb2，6为HRP标记山羊抗猪IgG多克隆抗体。

图3是重组PCV2 dCap蛋白的抗原活性鉴定结果，图中：

A为重组蛋白的SDS-PAGE分析，B为重组蛋白的Western Blot鉴定，1为大肠杆菌BL21，2为含空载体pGEX-4T-1的诱导菌体，3为含重组质粒未诱导菌体，4.为含重组质粒诱导4h菌体，5.为纯化的重组GST-dCap融合蛋白，6为经凝血酶切割后的重组dCap蛋白，M.为蛋白质Marker。

图4是抗PCV2 dCap单克隆抗体特异性鉴定结果，图中：

1为抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1特异性识别GST-dCap融合蛋白，2为抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb2特异性识别GST-dCap融合蛋白，3为mAb1特异性识别PCV2病毒天然Cap蛋白，4为mAb2特异性识别PCV2病毒天然Cap蛋白，5为mAb1不识别PCV1重组Cap蛋白，6为mAb2不识别PCV1重组Cap蛋白。

具体实施方式

本发明的技术方案是：一种PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒，试剂盒设有检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液。PCV2抗原检测ELISA试剂盒的检测板为吸附抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为HRP标记抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb2，阳性对照为重组PCV2 dCap蛋白溶液，阴性对照为牛血清白蛋白(BSA)溶液；PCV2抗体检测ELISA试剂盒的检测板为吸附抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1并结合有重组PCV2 dCap蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为HRP标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪PCV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清。

(1)重组PCV2 dCap蛋白的制备

用基因工程技术高效表达PCV2去核定位信号肽衣壳蛋白(dCap)，制备重组PCV2 dCap蛋白。根据PCV2基因序列设计Cap特异性引物(上游引物：5’-GC GGATCCAATGGCATCT  TCAACAC-3’；下游引物：5’-CCG CTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGG-3’)，以PCR从猪PCV2基因组中扩增不含核定位信号的Cap基因，将其亚克隆于原核高效表达载体pGEX-4T-1，在N端与GST融合，构建pGEX-dORF2重组表达载体。经0.1mM IPTG诱导表达后，用超声波裂解细菌，利用GST亲和层析柱纯化表达的融合蛋白(GST-dCap)，再以凝血酶酶解去除GST标签，获得重组PCV2 dCap蛋白(图3)，分别测定GST-dCap融合蛋白和重组dCap蛋白抗原活性和蛋白浓度(10-20mg/ml)，用于制备抗PCV2 dCap单克隆抗体。

(2)抗PCV2 dCap单克隆抗体的制备

将重组PCV2 dCap蛋白与免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50-100μg/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15-30天；第3次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，麻醉致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×10⁸的脾细胞与2-5×10⁷的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，在37℃的水浴中将0.7-1ml的40％-50％PEG4000(pH8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育1min后，缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100μl-200μl/孔)，置37℃5％CO₂培养箱中培养。培养7-10天后，以5-10μg/ml的PCV2dCap重组蛋白包被96孔酶标板，以ELISA检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(OD₄₉₂＝0.8以上)，经连续3次的有限稀释法克隆化，制备抗PCV2 dCap单克隆抗体，所建立杂交瘤细胞株的染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体特异识别重组PCV2 dCap蛋白和纯化的PCV2病毒的天然衣壳蛋白(Cap)，与其它蛋白，特别是PCV1 Cap蛋白不发生交叉反应(图4)，亲和力常数达10-9，轻链亚型为κ，重链亚型为IgG1，所制备的抗PCV2 dCap单克隆抗体，用于制备PCV2抗原或抗体试剂盒检测板或酶结合物工作液。

(3)PCV2抗原或抗体检测板的制备

用0.01M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1至终浓度50ng/ml，4℃过夜包被可拆96孔酶标板，用0.1％BSA 37℃封闭1小时，以含0.05％吐温-20的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)充分洗涤，制备抗原检测板；同理，在抗原检测板中加入1μg/ml重组dCap蛋白，在37℃反应1小时，PBST洗涤液充分洗涤，进而制备抗体检测板检测板。分别用10％蔗糖溶液处理抗原或抗体检测板，用于PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒装配。

(4)山羊抗猪IgG多克隆抗体的制备

采取猪全血，分离血清，以饱和硫酸铵制备猪IgG蛋白，取1份猪血清加1份生理盐水混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱3h，4℃4000r/min离心15min，弃上清；以适量生理盐水溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置4℃冰箱3h，4℃4000r/min离心15min，弃上清；以少量生理盐水溶解沉淀，置4℃冰箱内用生理盐水过液透析，换液2～3次，4℃4000r/min离心15min，收集上清，测定蛋白浓度(10-20mg/ml)。以50～100μg/kg体重的猪IgG蛋白加免疫佐剂经皮下和肌肉注射免疫健康山羊3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清；以饱和硫酸铵法纯化山羊抗猪IgG抗体，不重述，再经DEAE纤维素离子交换层析纯化，收集浓缩羊抗猪多克隆抗体，用于PCV2抗体检测ELISA试剂盒酶结合物工作液。

(5)PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒酶结合物工作液的制备

用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物(HRP)酶偶联于抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb2或山羊抗猪IgG多克隆抗体，在1ml HRP溶液(5mg/ml)中加入0.2ml新配的0.06M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌30min，对1mM醋酸钠缓冲液(pH4.4)4℃过夜透析，加20μl 0.2M碳酸盐缓冲液(pH9.5)，调pH到9.0-9.5，然后立即加入10mg抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb2或山羊抗猪IgG多克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2h，加0.2ml新配的5mg/ml NaBH₄溶液，混匀，置4℃2h，对0.15M PBS(pH7.4)4℃过夜透析，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h，3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M PBS中，对0.15M的PBS(pH7.4)缓冲盐水透析，10000r/min离心30min去除沉淀，制备PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒酶结合物工作液。

(6)PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒阳性对照和阴性对照的制备

以0.1M PBS(pH7.4)溶液配制1μg/ml重组dCap蛋白为PCV2抗原检测ELISA试剂盒阳性对照，BSA溶液为阴性对照，以PCV2标准阳性血清为PCV2抗体检测ELISA试剂盒阳性对照，PCV2标准阴性血清为阴性对照。

(7)PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒缓冲液的制备

配制0.1M PBS(pH7.4)溶液作为PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒的样品稀释液，含0.5％吐温-20的1M PBS(pH7.2)为10×浓缩洗涤液。

(8)PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒显色剂的制备

称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配制显色液A。称取9.33g柠檬酸，14.6g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，6.4ml 0.75％过氧化氢尿素，调pH值到5.0-5.4，双蒸水定容至1000ml，配显色液B。显色液A与B等体积混合，即为显色剂。量取111.2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000ml，配制2M硫酸溶液，用作显色终止液。

(9)PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒实施检测反应原理

PCV2抗原检测ELISA试剂盒检测反应原理为：待检样品加入抗原检测板的酶标孔后，样品中的PCV2抗原可与酶标板上预吸附的抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1结合，并被随后加入的HRP标记抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb2识别，结合的HRP则可催化显色底物呈现蓝色显色反应，以硫酸中止显色后变为黄色，如待检样品中没有PCV2抗原，则HRP标记抗体不能结合到酶标板，不出现显色反应，检测中设立阳性和阴性对照作质量控制。

PCV2抗体检测ELISA试剂盒检测反应原理为：待检样品加入抗体检测板的酶标孔后，样品中的PCV2抗体可与酶标板上预结合于抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1的重组PCV2 dCap蛋白结合，并被随后加入的HRP标记山羊抗猪IgG多克隆抗体识别，结合的HRP则可催化显色底物呈现蓝色显色反应，以硫酸中止显色后变为黄色，如待检样品中没有PCV2抗体，则HRP标记抗体不能结合到酶标板，不出现显色反应，检测中设立阳性和阴性对照作质量控制。

(10)PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒检测实例操作方法

检测样品溶液的制备：采集待检猪淋巴结，脾，肺或血清，以样品稀释液或生理盐水1∶5，1∶10，1∶20倍比稀释，制备梯度稀释样品溶液。

PCV2抗原或抗体检测ELISA试剂盒检测实例操作方法：将梯度稀释样品溶液，阳性和阴性对照分别加入抗原或抗体检测板，室温作用3min，甩掉后，用10倍稀释的洗涤液洗6次，滴加酶结合物工作液1滴，室温作用3min，甩掉后同上洗涤，不重述，加入显色液A，显色液B各1滴，室温避光显色3-5min，滴加终止液1滴终止显色反应，观察显色结果，阳性对照呈强的显色反应，阴性对照基本没有显色，根据检测孔显色的深浅判为强阳性，阳性，弱阳性或阴性，检测孔为阳性的样品最高稀释度为待检样品的PCV2抗原或抗体滴度，如果阳性对照无明显显色反应，或阴性对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。

实施例1 PCV2抗原检测ELISA试剂盒

参见图1，按实施例中(1)方法步骤制备重组PCV2 dCap蛋白，按实施例中(2)方法步骤制备抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1和mAb2，按实施例中(3)方法步骤制备PCV2抗原检测板，按实施例中(5)方法步骤制备PCV2抗原检测ELISA试剂盒酶结合物工作液，按实施例中(6)方法步骤制备抗原检测ELISA试剂盒阳性对照和阴性对照，按实施例中(7)方法步骤制备样品稀释液，10×浓缩洗涤液，按实施例中(8)方法步骤制备显色液A，显色液B和终止液，最后，将各种组成成份装配成PCV2抗原检测ELISA试剂盒。

使用PCV2抗原检测ELISA试剂盒检测猪PCV2感染时，采集待检猪淋巴结，脾或肉样，充分研磨后，以样品稀释液1∶5或1∶10稀释，制备待检样品溶液，将梯度稀释样品溶液，阳性和阴性对照分别加入抗原检测板，室温作用3min，甩掉后，用10倍稀释的洗涤液洗6次，滴加酶结合物工作液1滴，室温作用3min，甩掉后同上洗涤，不重述，加入显色液A，显色液B各1滴，室温避光显色3-5min，滴加终止液1滴终止显色反应，观察显色结果，阳性对照呈强的显色反应，阴性对照基本没有显色，根据检测孔显色的深浅判为强阳性，阳性，弱阳性或阴性，检测孔为阳性的样品最高稀释度为待检样品的PCV2抗原滴度，如果阳性对照无明显显色反应，或阴性对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。

实施例2 PCV2抗体检测ELISA试剂盒

参见图2，制备重组PCV2 dCap蛋白，抗PCV2 dCap单克隆抗体mAb1，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B，终止液的方法步骤与实施例一类同，不重述。按实施例中(3)方法步骤制备PCV2抗体检测板，按实施例中(4)或(5)方法步骤制备PCV2抗体检测ELISA试剂盒酶结合物工作液，按实施例中(6)方法步骤制备抗体检测ELISA试剂盒阳性对照和阴性对照，装配PCV2抗体检测ELISA试剂盒。

使用PCV2抗体检测ELISA试剂盒检测猪PCV2抗体水平时，采集待检猪血液，分离血清，以样品稀释液作1∶10，1∶20，1∶40倍比稀释，制备待检样品溶液，试剂盒操作方法与实施例一类同，不重述，不同的是检测孔为阳性的样品最高稀释度为待检样品的PCV2抗体滴度。

Claims (8)

1.一种猪圆环病毒2型抗原检测ELISA试剂盒，其特征在于：试剂盒内设有抗原检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其中，抗原检测板为吸附抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb1的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb2，阳性对照为重组猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白溶液，阴性对照为牛血清白蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原检测ELISA试剂盒，其特征在于：所说的样品稀释液为0.1M磷酸盐缓冲液，10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的1M磷酸盐缓冲液，显色液A为四甲基联苯胺溶液，显色液B为含0.005％过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸溶液。

3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原检测ELISA试剂盒，其特征在于：所说的重组猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，与猪圆环病毒2型阳性血清特异结合。

4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗原检测ELISA试剂盒，其特征在于：所说的抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体特异识别猪圆环病毒2型衣壳蛋白，与猪圆环病毒1型衣壳蛋白无交叉反应。

5.一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于：试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其中，抗体检测板为吸附抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体mAb1并结合有重组猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪圆环病毒2型标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清。

6.根据权利要求5所述的一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于：所说的样品稀释液为0.1M磷酸盐缓冲液，10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的1M磷酸盐缓冲液，显色液A为四甲基联苯胺溶液，显色液B为含0.005％过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸溶液。

7.根据权利要求5所述的一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于：所说的重组猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，与猪圆环病毒2型阳性血清特异结合。

8.根据权利要求5所述的一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于：所说的抗猪圆环病毒2型去核定位信号肽衣壳蛋白单克隆抗体特异识别猪圆环病毒2型衣壳蛋白，与猪圆环病毒1型衣壳蛋白无交叉反应。

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