CN101322844B

CN101322844B - 无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN101322844B
Application number: CN 200810116725
Authority: CN
Inventors: 刘在新; 卢曾军; 田美娜; 李永亮; 孙普; 曹轶梅; 李平花; 包慧芳; 郭建宏; 陈应理; 谢宝霞; 谢庆阁
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-07-16
Filing date: 2008-07-16
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2028-07-16
Also published as: CN101322844A

Abstract

本发明公开了一种制备口蹄疫疫苗的方法。本发明所提供的制备口蹄疫疫苗的方法，包括如下步骤：用口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体去除目标物中的口蹄疫病毒非结构蛋白，再将其制成口蹄疫疫苗；所述目标物为口蹄疫病毒培养物或含有口蹄疫病毒非结构蛋白和口蹄疫病毒结构蛋白的基因工程表达物。用本发明的疫苗免疫动物，再区分感染动物和免疫动物，可信度大大提高，而且制备无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的方法简单、方便、有效，不需增加昂贵的设备，适用于规模化应用。因此，本发明的无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法在检疫口蹄疫中具有重大的意义，在预防和控制口蹄疫中将发挥重要作用。

Description

无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是危害偶蹄动物的烈性传染病，尤其对主要畜种猪、牛、羊的危害特别严重，能造成畜种生产力下降和不良的社会影响。因其传染性极强，世界动物卫生组织(FAO/OIE)将其列为A类传染病之首。有该病流行的国家，被强迫国际和地区贸易禁运，经济损失巨大。在世界上许多国家，尤其是非洲、亚洲和南美洲国家，该病发生次数频繁，流行严重。此外，不时出现全球的流行性爆发。

口蹄疫的病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)。口蹄疫病毒有7个血清型(A，O，C，Asia1，SAT1，SAT2和SAT3)，各型中又有许多基因和抗原有差异的分离株，其血清型由结构蛋白决定，非结构蛋白无血清型之分。和大多数病毒一样，口蹄疫病毒的基因组上既有组成病毒粒子的结构蛋白基因，也有仅参与复制过程而非病毒粒子成分的非结构蛋白基因(no-structure proteins，NSPs)(Forss S，Strebel K，Beck E，et al.Nucleotide sequence and genomeorganization of foot and-mouth disease virus，Nucleic AcidsResearch，1984，12：6587-6601，Acharya R，Fry E，Stuart D I，et al.Thethree-dimersional structure of foot and mouth disease virus at 2.9

.Nature，1989，337：709-716)。口蹄疫病毒感染动物后，在体内大量复制时，既能产生结构蛋白(VP4，VP2，VP3和VP1)，也能产生非结构蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D；一些非结构蛋白能形成复合聚体，如3AB，3ABC)(Belsham GJ.Distinctivefeatures of foot-and-mouth disease virus，a member of the picornavirusfamily；aspects of virus protein synthesis，protein processing and structure.Prog Biophy Mol Biol，1993，60：241-260.)，两者作为抗原，刺激动物体产生相应的抗体。因此，感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋白抗体。据此，可以判定动物是否感染(过)口蹄疫病毒。

口蹄疫病毒感染动物可变成无症状的病毒携带者，是口蹄疫传播的一大隐患。因此，除患病动物外，无症状的病毒携带者成为预防和控制口蹄疫的重点监控对象。

预防和控制口蹄疫采取的措施是严格检疫，进出口限制，屠宰患病动物，及有计划地实施疫苗免疫易感动物。检疫的技术难题是如何区分感染动物和免疫动物。

目前，区分口蹄疫感染动物和免疫动物的策略是检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体。其理论依据是口蹄疫病毒在感染动物体内复制产生的非结构蛋白，刺激动物体产生相应的抗体；而疫苗免疫动物的血清中检测不到相应的抗体，因疫苗制造工艺的除细胞碎片环节去除了大部分非结构蛋白。研究表明，在众多非结构蛋白中，检测3AB或3ABC抗体区分感染动物和免疫动物的可信度最高(Sorensen KJ，MadsenKA，Madsen EA，et al..Differentntiation of infection from vaccination infoot-and-mouth disease by the detection of antibodies to the non-structuralproteins 3D，3AB and 3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus.Arch Virol，1998，143：1-16，)。因此，国际上多个实验室建立了不同模式的检测3AB、3A或3ABC抗体ELISA方法(Alfonso Clavijo，Peter Wright，Paul Kitching，etal.Developments in diagnostic techniques for differentiating infectionfrom vaccination in foot-and-mouth disease.The Veterinary Journal，2004，167：9~22.)。世界动物卫生组织(FAO/OIE)的动物疫病诊断手册中推荐应用该法(Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals，http\\www.oie.int)。

口蹄疫免疫常用疫苗是灭活疫苗。该苗的生产采用的是病毒接种细胞、组织培养物，病毒增殖后，收获培养物，加化学灭活剂(如二乙烯亚胺，BEI)使病毒失去感染性，与佐剂混合乳化制成疫苗。病毒在细胞内增殖，结构蛋白和非结构蛋白同时表达，但部分非结构蛋白的一个可能的特性是与细胞膜成份结合，在疫苗制造工艺的除细胞碎片环节去除了。然而，游离的，以及与病毒粒子大小相近的非结构蛋白复合物是难以清除的，在疫苗中或多或少的残留，多次免疫动物后也能产生相应的抗体(Bergmann I E，Malirat E V，Neitzert E，Beck N，et al.Improvementof a serodiagnostic strategy for foot-and-mouth disease virus surveillancein cattle under systematic vaccination：a combined system of an indirectELISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay.ArchVirol，2000，145：473～489)，给区分感染动物和免疫动物带来了障碍。世界动物卫生组织(FAO/OIE)的动物疫苗手册中将口蹄疫疫苗免疫动物3次能否产生非结构蛋白抗体，作为疫苗评价的一项指标(Manual of diagnostic tests and vaccinesfor terrestrial animals，http\\www.oie.int)。

口蹄疫灭活疫苗的制造要动用活病毒，考虑到严格的生物安全，已开始了口蹄疫基因工程疫苗的研制和使用。但一些基因工程疫苗也使用了口蹄疫病毒的一些非结构蛋白基因(Abrams C C，King A M Q，Belsham G J.Assembly of foot-and-mouthdisease virus empty capsids synthesized by a vaccinia virus expressionsystem.J Gen Virol，1995，76：3089-3098.)，在疫苗中存有这些非结构蛋白，多次免疫动物后也能产生相应的抗体，同样给区分感染动物和免疫动物带来了障碍。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备口蹄疫疫苗的方法。

本发明所提供的制备口蹄疫疫苗的方法，包括如下步骤：用口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体去除目标物中的口蹄疫病毒非结构蛋白，再将其制成口蹄疫疫苗；所述目标物为口蹄疫病毒培养物或含有口蹄疫病毒非结构蛋白和口蹄疫病毒结构蛋白的基因工程表达物。

所述方法中，所述口蹄疫病毒非结构蛋白为下述8种蛋白中的至少一种：2B、2C、2C3AB、3A、3B、3AB、3ABC和3D蛋白；优选为3B、3A、3ABC和2C3AB蛋白中的至少一种。

所述口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体为2B、2C、2C3AB、3A、3B、3AB、3ABC和3D非结构蛋白的单克隆抗体；优选为口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体、口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体、口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB的单克隆抗体和口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体中的至少一种。

所述口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体为由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生；

所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体为由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生；

所述口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB的单克隆抗体为由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生。

所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体为由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生。

所述方法中，用口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体去除目标物中的口蹄疫病毒非结构蛋白的方法如下：将所述单克隆抗体与载体进行偶联，得到单克隆抗体载体偶联物，再将所述单克隆抗体载体偶联物与所述目标物混匀，作用1-5小时后形成抗原抗体复合物，去除所述抗原抗体复合物。

所用单抗的使用形式是偶联在载体(基底物)上，载体可以为动物红血球、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶和其它大分子聚合物微球，优选为红血球和琼脂糖凝胶。

所述口蹄疫疫苗中还含有佐剂。

由上述任一所述方法制备的口蹄疫疫苗也属于本发明的保护范围。

下述四种单克隆抗体中的至少一种也属于本发明的保护范围：由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生的口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体，由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生的口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体，由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生的所述口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB的单克隆抗体，和由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生的所述口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体。

下述四种杂交瘤细胞中的至少一种也属于本发明的保护范围：保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb，保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb，保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb，及保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb。

在制备以上蛋白的单抗时，可以通过基因工程表达获得以上蛋白抗原，包括原核和真核表达。

口蹄疫病毒培养物或含有非结构蛋白的基因工程表达物的获得一般是选用能使口蹄疫病毒增殖的生物材料，或能使口蹄疫病毒基因表达产生口蹄疫病毒蛋白的生物系统，具体可为体外培养的细胞系(如BHK21、IBRS2、CHO、PK15、MDBK等)、动物体或组织、基因工程表达生物反应器等。

所述去除抗体抗原复合物的方法包括自然沉淀、过滤和离心，优选过滤或离心。过滤法可以为将得到的混合物过100-200目滤网、振动膜或超滤膜；离心法具体可为以2000-3000转/分(rpm)的转速离心。

口蹄疫疫苗一般是分为通过病毒培养物制得的口蹄疫病毒灭活疫苗和通过口蹄疫病毒基因表达物制得的疫苗。使用一种血清型的无病毒非结构蛋白抗原物(灭活病毒物或基因表达物)是无病毒非结构蛋白口蹄疫单价疫苗，使用两种及两种以上血清型的无病毒非结构蛋白抗原物(灭活病毒物或基因表达物)是无病毒非结构蛋白口蹄疫多价疫苗。

本发明的无病毒非结构蛋白口蹄疫疫苗无血清型和毒株限制。用各血清型的不同毒株，通过本发明的制备方法都可获得无病毒非结构蛋白口蹄疫疫苗。

由本发明方法制备的无病毒非结构蛋白口蹄疫灭活疫苗、无病毒非结构蛋白口蹄疫亚单位疫苗和单价、双价和多价无病毒非结构蛋白口蹄疫疫苗都属于本发明的保护范围。

用本发明所制备的无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗，免疫动物6-8次后才有可能检测出非结构蛋白的抗体，远远超过了世界动物卫生组织(FAO/OIE)的动物疫苗手册中“将口蹄疫疫苗免疫动物3次能否产生非结构蛋白抗体，作为疫苗评价的一项指标”所规定的疫苗评价指标，本发明的口蹄疫疫苗使感染动物和免疫动物更加容易区分，解决了口蹄疫检疫中所存在的难于区分感染动物和免疫动物的难题。而且制备无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的方法简单、方便、有效，不需增加昂贵的设备，适用于规模化应用。因此，本发明的无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法在检疫口蹄疫中具有重大的意义，在预防和控制口蹄疫中将发挥重要作用。

附图说明

图1为口蹄疫病毒非结构蛋白3A和3B表达产物的Western blot检测。

图2为口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB和3ABC表达产物的Western blot检测及纯化。

图3为口蹄疫病毒非结构蛋白表达产物纯化。

图4为纯化单抗的结果。

图5为单抗效价测定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、口蹄疫病毒非结构蛋白(2C3AB、3A、3B、3ABC)的单克隆抗体的制备

本实施例中制备单抗所需要的主要试剂如下：

(1)杂交瘤技术中使用的细胞培养基RPMI-1640为Sigma公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，均在4℃保存。

(2)不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml，100×L-谷氨酰胺溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5％NaHCO₃溶液1-2ml。

(3)完全RPMI-1640培养基：不完全RPMI-1640培养基80ml，胎牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。

(4)HT培养基：完全RPMI-1640培养基98ml，50×HT贮存液2ml。

(5)HAT培养基：完全RPMI-1640培养基96ml，50×HT贮存液2ml，50×A贮存液2ml。

(6)氨基喋呤(A)贮存液(50×)、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(50×)、L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×，0.2mol/L)、8-氮鸟嘌呤贮存液(50×)均为Sigma公司产品，-20℃保存，50％ PEG1000也为Sigma公司产品，4℃保存。

(7)青、链霉素(双抗)溶液(100×)：取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶(4-5ml/瓶)，-20℃冻存。

(8)7.5％ NaHCO₃溶液：称取分析纯NaHCO₃7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶(4-5ml/瓶)，盖紧瓶塞，4℃保存。

参考文献如下：

1、金伯泉主编《细胞和分子免疫学》科学出版社2001年；

2、陈慰峰主编《医学免疫学》人民卫生出版社2000年；

3、殷震，刘景华主编《动物病毒学》第二版科学出版社1997年。

具体实验步骤如下：

(一)口蹄疫病毒非结构蛋白(2C3AB、3A、3B、3ABC)的表达及纯化

1、基因的扩增：

按常规技术克隆和表达目的基因。参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)、pGEM-T(Promega)和pET(Novagen)试剂手册进行操作。

参考口蹄疫病毒2C3AB、3A、3B、3ABC的基因序列(GenBank Accession NumberAF506822)，设计特异引物，并在引物的5’和3’端分别加入不同的限制性酶切位点序列。设计的引物序列如下：

2C3AB基因的引物序列为：

B+：5’-GGCCATGGCACTCAAAGCACGTGACATCAAT-3′ (Nco I)

C-：5’-GCGTCGACCTACTCAGTGACAATCAAGTT-3′ (Sal I)

3A基因的引物序列为：

3A+：5’-AGGGATCCATCTCAATTCCTTCCCAAAAGGCTGTG-3’ (BamH I)

3A-：5’-AGGTCGACTTATTCAGCTCGTGGTTGTTCTTCCACGG-3’ (Sal I)

3B基因的引物序列为：

3B+：5’-AGGGATCCGGACCCTACACCGGTCCACTCGAGCGT-3’ (BamH I)

3B-：5’-AGGTCGACTTACGGGGGAGCACCACTCTCAGTGACA-3’ (Sal I)

3ABC基因的引物序列为：

3ABC+：5’-AGGGATCCATCTCAATTCCTTCCCAAAAGGCTGTG-3’ (BamH I)

3ABC-：5’-AGGTCGACACGAGAAAGTGTCGAGTCACC-3’ (Sal I)

提取O/Chnia/99口蹄疫病毒株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室)基因组RNA(Genbank Accession Number，AF506822)，利用上述引物、采用RT-PCR技术分别扩增2C3AB、3A、3B和3ABC基因。

将扩增得到的2C3AB、3A、3B和3ABC基因分别连接到pGEM-T Easy中，得到重组克隆载体pGEM-2C3AB、pGEM-3A、pGEM-3B和pGEM-3ABC，将四种重组载体分别转化至DH5a中，筛选阳性克隆并进行测序验证。

2、重组表达载体的构建：

分别提取4种阳性重组克隆载体，然后进行如下实验：将阳性重组质粒pGEM-2C3AB用限制性内切酶Nco I和Sal I进行酶切，回收目的片段，再将其连接到经同样双酶切的载体pET28a中，得到重组表达载体pET28a/pGEM-2C3AB；将阳性重组质粒pGEM-3A用限制性内切酶BamH I和Sal I进行酶切，回收目的片段，再将其连接到经同样双酶切的载体pET28a中，得到重组表达载体pET28a/pGEM-3A；将阳性重组质粒pGEM-3B用限制性内切酶BamH I和Sal I进行酶切，回收目的片段，再将其连接到经同样双酶切的载体pET28a中，得到重组表达载体pET28a/pGEM-3B；将阳性重组质粒pGEM-3ABC用限制性内切酶BamH I和Sal I进行酶切，回收目的片段，再将其连接到经同样双酶切的载体pET28a中，得到重组表达载体pET28a/pGEM-3ABC；将4种重组表达载体分别转化至大肠杆菌BL21，并进行筛选培养得到阳性克隆，并通过菌液PCR检测进行验证。

3、非结构蛋白的表达：

按照步骤2中所述方法制备和筛选阳性重组菌，将4种重组菌分别接种于含有卡那霉素的LB培养基中，在37℃条件下振荡培养，至菌体浓度的OD₆₀₀值大约1.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导培养10小时，收集表达产物。

将表达产物进行Western blotting分析。其中，所用的特异性抗体为感染O/Chnia/99口蹄疫病毒株的猪血清。检测结果如图1和图2所示(图1中，M为蛋白分子量标准对照，泳道1表示3A蛋白，泳道2表示3B蛋白；图2中，A表示2C3AB蛋白的western blot检测：其中，泳道1和4表示空白对照，泳道2和3表示2C3AB蛋白，泳道5表示marker；B表示3ABC蛋白的western blot检测：其中，泳道1和4表示空白对照；泳道2和3表示3ABC蛋白)，表明纯化的表达蛋白能与口蹄疫感染动物血清发生特异性反应。

4、2C3AB、3A、3B和3ABC蛋白的纯化

选用丙烯酰胺凝胶电泳法纯化目的蛋白：向步骤3得到的表达产物中分别加入蛋白酶抑制剂，用12％的胶进行SDS-PAGE电泳，用0.3M的硫酸锌染色(负染，目的带无颜色)；将目的条带切下，将其置于溶液(0.25M EDTA，0.25M Tris，pH9.0)中漂洗去除金属离子；然后再将切下的条带置于处理好的透析袋中(选择孔径小于目的蛋白分子量的1/3倍的透析袋)，并加入蛋白酶抑制剂，透析袋内外均加入1×蛋白电泳液，将透析袋垂直于电流方向置于核酸电泳槽中，4℃，60mA稳流电泳5h，接着将电极反插，电泳5-10min，将透析袋内的液体吸到新的透析袋中，用PEG8000在4℃浓缩。纯化结果如图3所示(图3A中，M表示蛋白分子量标准对照，泳道1表示纯化的3ABC蛋白，泳道2表示纯化的3D蛋白，泳道3表示纯化的2C蛋白，泳道4表示纯化的3B蛋白，泳道5表示纯化的3A蛋白；图3B中为2C3AB蛋白的纯化结果，泳道1表示纯化的2C3AB蛋白，泳道2表示空白对照)。

5、蛋白浓度的测定

用Bradford蛋白定量试剂盒(天根公司)对所纯化的蛋白定量，具体方法参照试剂盒说明书。定量结果：2C3AB为0.7mg/ml；3A为0.65mg/ml；3B为0.5mg/ml；3ABC为0.6mg/ml。

下述(二)至(九)所述的实验方法以制备2C3AB蛋白的单克隆抗体为例，其方法同样适用于蛋白3A、3B和3ABC蛋白的单克隆抗体的制备。

(二)BaLb/c小鼠的免疫

选用6周雌性纯种BaLb/c小鼠。以用上述纯化得到的2C3AB蛋白免疫小鼠为例叙述蛋白免疫小鼠的实验方法，其它三种蛋白(3A、3B和3ABC)免疫小鼠的方法相同，具体实验方法如下：

初次免疫：取上述纯化得到的2C3AB蛋白5～50μg，加弗氏完全佐剂(Sigma公司)，得到注射液，使其中2C3AB蛋白的浓度至50％；背部皮下多点注射(总剂量不超过1ml，0.1ml/点)；2-3周后，进行第二次免疫。

第二次免疫：取上述纯化得到的2C3AB蛋白5～50μg，加弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，得到注射液，使其中2C3AB蛋白的浓度至50％；背部皮下多点注射(剂量不超过0.5ml，0.1ml/点)，2-3周后，进行第三次免疫。

第三次免疫：取上述纯化得到的2C3AB蛋白液(含量为5～50μg)，不加佐剂，大腿内侧皮下多点注射(总剂量不超过1ml，0.1ml ml/点)。5～7天后采血，测其效价，结果表明小鼠免疫血清的1∶3200稀释的OD值是小鼠阴性血清1∶20稀释的OD值的3.5倍；2-3周后，进行加强免疫。

加强免疫：剂量以50～500μg/只为宜，腹腔注射或尾静脉注射。加强免疫后第3天，取脾细胞进行融合。

(三)细胞融合

1、骨髓瘤细胞的培养：

骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63Ag8.653等，本发明选用骨髓瘤细胞系为SP2/0。

骨髓瘤细胞的培养用RPMI 1640培养基(Sigma)。胎牛血清(Hyclone)的浓度一般在10％～20％，细胞浓度以10⁴～5×10⁵/ml为宜，最大浓度不得超过10⁶/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1∶3～1∶5的比例传代。每2～4天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，SP2/0细胞系为半贴壁生长的细胞系，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。取对数生长期的骨髓瘤细胞离心，用无血清RPMI 1640培养基(Sigma)洗2次，计数，取1×10⁷个细胞备用。

2、饲养细胞的培养：

在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如细胞融合、克隆化和扩大培养过程中。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量一般为2×10⁴～10⁵细胞/孔。本实验用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法：取6～10周龄BaLb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟。将其腹部朝上固定到解剖板上，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入腹腔内5-10ml 1640培养基，反复冲洗，吸出冲洗液，置入10ml离心管，2000转/分离心5～6分钟，用含20％胎牛血清(FCS)的完全培养基混悬，调整细胞数1×10⁵/ml，加入96孔板(100μl/孔)，37℃，CO₂培养箱培养。养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×10⁶腹腔巨噬细胞。

3、小鼠脾细胞的制备：

取加强免疫2C3AB蛋白后第3天的小鼠，摘眼球放血后，颈椎脱位处死，75％酒精浸泡消毒，无菌取脾脏，1640培养基洗1次，置平皿中的200目不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液，将细胞悬液离心，细胞用不完全培养基洗2次，2000r/min离心4min，弃上清后，加入适量无血清培养液，计数，取10⁸个脾淋巴细胞悬液备用。一般每只小鼠的脾细胞数为2×10⁸个左右。

4、杂交瘤细胞的制备：

将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养基洗1次，以1200rpm的速度离心5分钟，弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度；轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；在37℃水浴中1min内加入37℃预热的50％PEG(Sigma，分子量1000)0.65ml，边加边轻轻摇动离心管，静置90秒，30秒内缓缓加入37℃预热的RPMI1640不完全培养液1ml，以中止PEG作用，再在30秒内缓缓加入37℃预热的RPMI1640不完全培养液5ml，然后分别在1min内加5ml、10ml、10ml 37℃预热的RPMI1640不完全培养基。1000rpm，离心10分钟，弃上清，用含20％小牛血清HAT(Sigma)选择培养基重悬细胞。将上述细胞，加到已加入饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4-6块96孔板。将培养板置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(四)杂交瘤细胞筛选及抗体检测

1、筛选培养：

在用HAT培养液选择培养1-2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液，再维持2周，改用完全培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/5到1/2面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天半量换培养液。

2、抗体检测：

本发明选用间接酶联免疫吸附试验方法(iELISA)检测抗体，具体步骤如下：

(1)溶液配置：

包被液：碳酸盐缓冲液(Sigma)

洗涤液：PBST(PH7.4)

稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加洗涤液至100ml。

封闭液：5g脱脂奶粉，加洗涤液至100ml。

终止液：2M H₂SO₄

底物B液：磷酸-柠檬酸缓冲液(Sigma)

底物A液：OPD(Sigma)

(2)抗体对照：以骨髓瘤细胞上清做为阴性对照，以免疫鼠血清为阳性对照。

(3)抗原包被：

用口蹄疫病毒(FMDV)免疫的猪的阳性血清(O/Chnia/99口蹄疫病毒株免疫猪得到的)滴定3A、3B、2C3AB和3ABC的效价，以阴性血清为对照。确定其最佳包被浓度。滴定结果为：3A为1∶1600、3B为1∶800、2C3AB为1∶1000；3ABC为1∶800。

(4)对辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(Sigma)进行滴定，确定其工作浓度为1∶40000。

(5)用包被液将抗原稀释到工作浓度，100μl/孔，4℃过夜，洗涤，拍干。

(6)用封闭液封闭，100μl/孔，37℃，1h，洗涤，拍干。

(7)加待测单抗样品，每板加阴阳性对照，100μl/孔，37℃，1h，洗涤，拍干。

(8)加酶标二抗：用稀释液将酶标二抗稀释到工作浓度，100μl/孔，37℃，1h，洗涤，拍干。

(9)加底物显色：将底物A和B按1∶50比例混匀，100μl/孔，37℃，10-15min。

(10)终止反应：每孔加终止液100μl。

(11)测定OD₄₅₀的值。

(12)结果判定：若待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即判定为阳性。

结果4种单抗均得到阳性克隆株。将产生蛋白3A的单克隆抗体的一株杂交瘤细胞取名为口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb，于2008年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101)，保藏编号为CGMCC No.2585；将产生蛋白3B的单克隆抗体的一株杂交瘤细胞取名为口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb，于2008年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101)，保藏编号为CGMCC No.2586；将产生蛋白2C3AB的单克隆抗体的一株杂交瘤细胞取名为口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb，于2008年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101)，保藏编号为CGMCC No.2584；将产生蛋白3ABC的单克隆抗体的一株杂交瘤细胞取名为口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV3ABC McAb，于2008年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101)，保藏编号为CGMCC No.2583。

(五)杂交瘤的克隆化

(1)克隆前1天制备饲养细胞层：方法同上。

(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内混匀，计数。调整细胞浓度为10个细胞/ml。取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5％CO₂孵箱中。

(3)培养第5天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天细胞克隆形成，及时检测杂交瘤细胞活性。

(4)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养，并尽快冻存。

(六)杂交瘤细胞的冻存与复苏

1、冻存：

细胞冻存液的配制：45％小牛血清；45％不完全培养液；10％DMSO(二甲基亚砜)。

取待冻存的细胞，离心后弃上清，将细胞打散，加入冻存液1ml，梯度降温至-70℃，次日转入液氮中。

2、复苏：

将冻存管自液氮中小心取出，放37℃水浴中，使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后放入培养液瓶内，置37℃、5％CO2孵箱中培养，2-5天，检测抗体活性。

(七)单克隆抗体的大量生产

可用下述(1)或(2)的方法生产单克隆抗体：

(1)体外培养杂交瘤细胞株生产单克隆抗体：按上述方法复苏和培养杂交瘤细胞，从上清液中获取单克隆抗体，上清中抗体含量为10～500μg/ml。

(2)体内诱生单克隆抗体：先腹腔注射0.5ml降植烷(Pristane)于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射2×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用12号针头抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml。可将腹水中细胞冻存，复苏后转种小鼠腹腔产生腹水快、量多。

(八)单克隆抗体的鉴定

(1)McAb的Ig类与亚类的鉴定：按鼠源单克隆抗体分型试剂盒(Sigma)操作说明书进行鉴定。由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3AMcAb产生的3A的单抗2D7为IgG1，由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生的3B的单抗4El1为IgG2b，由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生的2C3AB的单抗5B6为IgG2b，由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABCMcAb分泌产生的3ABC的单抗4C6为IgG1。

(2)McAb的效价：取浓度为1μg/ml的纯化抗原3A、浓度为1μg/ml的纯化抗原3B、浓度为1μg/ml的纯化抗原2C3AB、浓度为1μg/ml的纯化抗原3ABC分别包被聚苯乙烯板，0.1ml/孔，4℃过夜；洗涤后，加入系列稀释的已知浓度的单抗，0.1ml/孔，37℃，1h；洗涤后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，0.1ml/孔，37℃，1h；洗涤后，加入底物(OPD溶液)0.1ml/孔，37℃，避光反应10-15min；用2M H₂SO₄终止反应，0.1ml/孔，测定各孔的OD₄₉₂值。

各蛋白抗原的单抗的效价如图5所示，图中横坐标为抗体的稀释度，纵坐标为OD值(图中，系列1表示3ABC蛋白单抗，系列2表示3D蛋白单抗，系列3表示2C蛋白单抗，系列4表示2C3AB蛋白单抗，系列5表示3B蛋白单抗，系列6表示3A蛋白单抗)。结果表明，各单抗均满足使用的单抗的效价不低于10⁴。

(九)单克隆抗体的纯化

用微孔滤膜过滤步骤(七)中得到的腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g，15分钟高速离心(4℃)除去细胞残渣及小颗粒物质。

按常规硫酸铵法粗提单抗。选用Hi Trap rProtein A FF，1ml(Amersham)或Hi Trap rProtein G FF，1ml(Amersham)亲和层析柱纯化单抗(参照说明书)。用至少5个柱体积的洗脱缓冲液再生柱，洗去柱内的乙醇保存液；用5-10个柱体积的结合缓冲液平衡柱；用结合缓冲液稀释粗提的单抗(一般按1∶3-1∶5进行稀释)，用注射器上样，流速不得超过0.5ml/min，将洗脱下的液体反复上样；用5-10个柱体积的结合缓冲液平衡柱，流速不得超过1ml/min；用2-5个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱，将洗脱下来的样品用1M Tris-Hcl(PH9.0)调pH值中性。测定单抗浓度C(mg/ml)＝(1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀)，分装保存。

将纯化的单抗进行电泳，结果如图4所示(M表示蛋白分子量标准对照，泳道1表示纯化的2C蛋白单抗，泳道2表示纯化的3ABC蛋白单抗，泳道3表示纯化的2C3AB蛋白单抗，泳道4表示纯化的3B蛋白单抗，泳道5表示纯化的3A蛋白单抗)。

结果表明，3A蛋白单抗的浓度为9mg/ml，3B蛋白单抗的浓度为12mg/ml，2C3AB蛋白单抗的浓度为7mg/ml，3ABC蛋白单抗的浓度为6mg/ml。

实施例2、无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的制备及检测

本实施例中共设三组实验，第一组实验是用第一组单抗(即3A蛋白单抗(由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生)和3B蛋白单抗(由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生)去除病毒非结构蛋白，制得无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗，并进行检测；第二组实验是用第二组单抗(即3ABC蛋白单抗由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生)去除病毒非结构蛋白，制得无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗，并进行检测；第三组实验是用第三组单抗(即2C3AB蛋白单抗由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV2C3AB McAb分泌产生)去除病毒非结构蛋白，制得无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗，并进行检测；

一、用第一组单抗进行实验：

(一)口蹄疫疫苗的制备

1、病毒培养物制备

病毒培养物是通过在培养的细胞系(或动物及组织)中接种病毒制备的。细胞系常用的是BHK21或IBRS2，单层或悬浮培养。按现用或改进的灭活疫苗制造工艺中病毒抗原的制备方法获得。其核心是病毒在细胞内大量增殖，完成了复制周期，即产生了病毒结构蛋白，组装成病毒粒子，又产生了非结构蛋白的病毒培养物。

具体实验方法如下：

静止或旋转培养BHK21细胞至单层细胞长满，向其中加入病毒液和培养液，其中病毒液按5-10％体积比例加入，补加培养液至培养容器体积的1/20-1/30；37℃继续培养，待出现细胞病变效应(cytopathogenic effct，CPE)，收获病毒液即为病毒培养物，置-20--40℃保存。培养液的组成为：水解乳蛋白液(93-97％)、氨基酸溶液(2-5％)、抗生素液(1％)、HEPES液(0.5％)，加7.5％的NaHCO₃调pH至7.5-7.7；所述百分含量为体积百分含量(水解乳蛋白液、氨基酸溶液、抗生素液和HEPES液均为invitrogen公司产品)。

用上述方法制备O型口蹄疫病毒培养物：所用病毒株为O/Chnia/99口蹄疫病毒株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室，参考文献：《中国科学》(C辑)，2003年，第33卷第5期，P461-467，口蹄疫病毒O/Chnia/99基因组RNA序列测定及比较分析)。

用上述方法制备Asia1型口蹄疫病毒培养物：所用病毒株为Asia I/JS/05株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室，参考文献：Arch Virol，2007，152：1699-1708 Comparisons of the complete genomes of two Chineseisolates of a recent foot-and-mouth disease type Asia 1virus。GenBank序列号：EF149009)。

2、单抗载体偶联物的制备

按照下述(1)或(2)中所述方法进行制备。

(1)单抗绵羊红细胞偶联物

参照《动物病毒学》(第二版，殷震、刘景华主编，科学出版社1997年)。3A蛋白单抗(由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生)和3B蛋白单抗(由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生)的使用浓度为0.2mg-0.8mg/ml。制备的单抗绵羊红细胞偶联物置4℃保存。

(2)单抗琼脂糖凝胶偶联物

单抗与环氧活化后的琼脂糖凝胶6BFF(Pharmacia，北京本元正阳公司)的偶联，参照试剂说明书和《医学免疫学》(陈慰峰主编，人民卫生出版社2000年)。3A蛋白单抗(由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生)和3B蛋白单抗(由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生)的使用浓度为0.5-1.0mg/ml。制备的单抗琼脂糖凝胶偶联物置4℃保存。

3、去除病毒培养物中病毒非结构蛋白及其结果检测

(1)用单抗除去细胞培养物中的非结构蛋白：

取步骤1得到的O型口蹄疫病毒培养物1000ml，向其中添加2％-20％体积(20ml-200ml)的3A蛋白单抗(由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生)琼脂糖凝胶偶联物和2％-20％体积(20ml-200ml)的3B蛋白单抗(由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3BMcAb分泌产生)琼脂糖凝胶偶联物，充分摇震混合，室温作用1-5h，期间摇震3次；过100目滤网，收集滤液；BEI灭活病毒，即得到O型疫苗抗原，-20℃保存备用。

取步骤1得到的Asia1型口蹄疫病毒培养物1000ml，向其中添加2％-20％体积(20ml-200ml)的3A蛋白单抗(由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生)绵羊红细胞偶联物和2％-20％体积(20ml-200ml)的3B蛋白单抗(由保藏编号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3BMcAb分泌产生)绵羊红细胞偶联物，充分摇震混合，室温自动连续搅拌作用1-5h，以3000rpm的速度离心10min，收集上清，BEI灭活病毒，即得到Asia1型疫苗抗原，-20℃保存备用。

(2)病毒培养物中口蹄疫病毒非结构蛋白检测

用3A、3B、3A+3B、2C3AB和3ABC抗原蛋白的任意一种检测步骤(1)中得到的O型疫苗抗原和Asia1型疫苗抗原及没有加单抗偶联物处理的病毒培养物。下面以用3A抗原蛋白检测O型疫苗抗原为例叙述检测方法，其余的除所用的抗原和单抗外均相同。当抗原为3B时，单抗为由保藏号为2586的口蹄疫病毒3B单克隆抗体细胞株FMDV 3B McAb分泌产生的，当抗原为2C3AB时，单抗为由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生的，当抗原为3ABC时，单抗为由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生的，当抗原为3A时，单抗为由保藏编号为2585的口蹄疫病毒3A单克隆抗体细胞株FMDV 3A McAb分泌产生的。

实验步骤如下：

a、用包被缓冲液稀释3A蛋白至工作浓度(2ug/ml)，然后用其包被96孔U型酶标板，每孔50ul，4℃过夜。

b、在96孔V型板上孔中分别加检测物及对照物，具体如下：

实验组1：各孔加50μl步骤1得到的O型口蹄疫病毒培养物，再加入50μl用PBST稀释到使用浓度为0.4ug/ml的3A单抗；

实验组2：各孔加50μl步骤3(1)得到的O型疫苗抗原，再加入50μl用PBST稀释到使用浓度为0.4ug/ml的3A单抗；

空白对照：加100μl的PBST；

阴性对照：加50μl正常细胞液的上清液和50μl用PBST稀释到使用浓度为0.4ug/ml的3A单抗；

阳性对照(抗体对照)：加入100μl用PBST稀释到使用浓度为0.4ug/ml的3A单抗；

振荡均匀，封板，4℃过夜。

c、洗包被酶标板，拍干，将抗原抗体混合物从96孔V型板上按次序转移至U型酶标板上的相应孔，每孔50μl，37℃，1h。

d、洗酶标板，拍干，加工作浓度的酶标山羊抗小鼠抗体(165ng/ml)，每孔50μl，37℃，1h。

e、洗酶标板，每孔加OPD底物50μl，37℃，15min。加50μl/孔2M H₂SO₄终止液，读450nmOD值。

f、结果判定：抗体对照孔OD值应在1.5±0.5范围内，求其平均值，即该值为临界值，表示阻断50％反应的对照OD值。被测孔大于该值的孔为阴性孔，小于或等于该值的孔为阳性孔。不含有非结构蛋白3A的被测物定义为阳性，含有非结构蛋白3A的被测物定义为阴性。

结果表明，步骤1得到的O型口蹄疫病毒培养物为阴性，检测到非结构蛋白3A；而步骤3(1)得到的不含有非结构蛋白3A的O型疫苗抗原为阳性，没有检测到非结构蛋白3A。其它O型疫苗抗原和Asia1型疫苗抗原中3A、3B、2C3AB和3ABC抗原蛋白的检测结果相同。

4、无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的配制

采用常规方法配置疫苗，方法如下：

(1)“抗原/佐剂/抗原”双相佐剂型。将步骤3制备的O型抗原和Asia1型抗原以1∶1比例混合，再加入等量的ISA206佐剂(法国SEPPIC)，用乳化机搅拌均匀后即成。

(2)“抗原/佐剂/抗原”比例“3/5/3”，即3份抗原加入含10％司班80的白(轻)油(杭州炼油厂)中，乳化均匀，再加3份含4％吐温80的抗原，继续乳化均匀后即成。置4-8℃。

本实施例使用方法(1)。

(二)无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗与常规疫苗的比对

疫苗接种动物(包括实验小动物和猪、牛、羊)，单价疫苗剂量0.5-2ml，多价疫苗剂量1-5ml；优选接种途径为肌肉或皮下接种；每间隔至少14天接种一次。每次接种前采集血清检测非结构蛋白抗体，优先是3A、3AB、2C3AB或3ABC抗体。

按常规程序向非口蹄疫感染和非口蹄疫疫苗免疫动物(各型口蹄疫抗体滴度小于1∶8)接种步骤(一)得到的无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗(N)，接种后14-20天，采集免疫动物的血清，检测其中是否含有3ABC抗体，检测方法按下述文献中描述的进行：Lu Z，Cao Y，Guo J，et al.Development and validation of a 3ABCindirect ELISA for differentiation of foot-and-mouth disease virus infectedfrom vaccinated animals[J]Vet Microbiol.2007，125(1-2)：157-169.

以接种常规疫苗(C)作为对照。常规疫苗的制备方法如下：将O/Chnia/99和Asia I/JS/05两病毒株的培养物按1∶1比例混合，按《中华人民共和国兽药典》中兽用生物制品的口蹄疫灭活疫苗规程制备。

接种程序和结果如表1所示。

表1、疫苗接种方法及结果

其中：N-疫苗代表本实验一的无病毒非结构蛋白口蹄疫疫苗；C-疫苗代表常规口蹄疫灭活疫苗；n代表未测；“-”表示检测阴性即待测血清中无3ABC抗体；“+”表示检测阳性即待测血清中有3ABC抗体；“±”表示检测可疑即待测血清中的3ABC抗体处于临界状态。

结果表明，用常规灭活疫苗免疫动物3-5次，用3ABC非结构蛋白ELISA抗体检测法能检测到群体动物血清中有相应的抗体；而用本发明方法得到的的疫苗免疫动物6-8次后，群体动物血清中检测不到3ABC抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，再区分感染动物和免疫动物，可信度将会很高。

二、用第二组单抗进行实验：

(一)口蹄疫疫苗的制备

1、病毒培养物制备

病毒培养物的制备与实验一(一)中所述一致。分别得到O型口蹄疫病毒培养物和Asia1型口蹄疫病毒培养物。

2、单抗载体偶联物的制备

按照下述(1)或(2)中所述方法进行制备。

(1)单抗绵羊红细胞偶联物

参照《动物病毒学》(第二版，殷震、刘景华主编，科学出版社1997年)。3ABC蛋白单抗(由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABCMcAb分泌产生)的使用浓度为0.2mg-0.8mg/ml。制备的单抗绵羊红细胞偶联物置4℃保存。

(2)单抗琼脂糖凝胶偶联物

单抗与环氧活化糖凝胶6BFF(Pharmacia，北京本元正阳公司)的偶联，参照试剂说明书和《医学免疫学》(陈慰峰主编，人民卫生出版社2000年)。3ABC蛋白单抗(由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生)的使用浓度为0.5-1.0mg/ml。制备的单抗琼脂糖凝胶偶联物置4℃保存。

3、去除病毒培养物中病毒非结构蛋白及其结果检测

(1)用单抗除去细胞培养物中的非结构蛋白：

取步骤1得到的O型口蹄疫病毒培养物1000ml，向其中添加2％-20％体积(20ml-200ml)的3ABC蛋白单抗(由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生)琼脂糖凝胶偶联物，充分摇震混合，室温作用1-5h，期间摇震3次；过100目滤网，收集滤液；BEI灭活病毒，即得到O型疫苗抗原，-20℃保存备用。

取步骤1得到的Asia1型口蹄疫病毒培养物1000ml，向其中添加2％-20％体积(20ml-200ml)的3ABC蛋白单抗(由保藏编号为2583的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体细胞株FMDV 3ABC McAb分泌产生)绵羊红细胞偶联物，充分摇震混合，室温自动连续搅拌作用1-5h，以3000rpm的速度离心10min，收集上清，BEI灭活病毒，即得到Asia1型疫苗抗原，-20℃保存备用。

(2)病毒培养物中口蹄疫病毒非结构蛋白检测

用3A抗原蛋白检测O型疫苗抗原的具体实验步骤如实验一中相应所述一致。

4、无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的配制

采用常规方法配置疫苗，方法如下：

本实验使用方法(1)。

(二)无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗与常规疫苗的比对

接种程序和结果如表2所示。

表2、疫苗接种方法及结果

其中：N-疫苗代表实验二的无病毒非结构蛋白口蹄疫疫苗；C-疫苗代表常规口蹄疫灭活疫苗；n代表未测；“-”表示检测阴性即待测血清中无3ABC抗体；“+”表示检测阳性即待测血清中有3ABC抗体；“±”表示检测可疑即待测血清中的3ABC抗体处于临界状态。

结果表明，用常规灭活疫苗免疫动物3-5次，用3ABC非结构蛋白ELISA抗体检测法能检测到群体动物血清中有相应的抗体；而用本发明方法得到的疫苗免疫动物6-8次后，群体动物血清中检测不到3ABC抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，再区分感染动物和免疫动物，可信度将会很高。

三、用第三组单抗进行实验：

(一)口蹄疫疫苗的制备

1、病毒培养物制备

2、单抗载体偶联物的制备

按照下述(1)或(2)中所述方法进行制备。

(1)单抗绵羊红细胞偶联物

参照《动物病毒学》(第二版，殷震、刘景华主编，科学出版社1997年)。2C3AB蛋白单抗(由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV2C3AB McAb分泌产生)的使用浓度为0.2mg-0.8mg/ml。制备的单抗绵羊红细胞偶联物置4℃保存。

(2)单抗琼脂糖凝胶偶联物

单抗与环氧活化糖凝胶6BFF(Pharmacia，北京本元正阳公司)的偶联，参照试剂说明书和《医学免疫学》(陈慰峰主编，人民卫生出版社2000年)。2C3AB蛋白单抗(由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3ABMcAb分泌产生)的使用浓度为0.5-1.0mg/ml。制备的单抗琼脂糖凝胶偶联物置4℃保存。

3、去除病毒培养物中病毒非结构蛋白及其结果检测

(1)用单抗除去细胞培养物中的非结构蛋白：

取步骤1得到的O型口蹄疫病毒培养物1000ml，向其中添加2％-20％体积(20ml-200ml)的2C3AB蛋白单抗(由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生)琼脂糖凝胶偶联物，充分摇震混合，室温作用1-5h，期间摇震3次；过100目滤网，收集滤液；BEI灭活病毒，即得到O型疫苗抗原，-20℃保存备用。

取步骤1得到的Asia1型口蹄疫病毒培养物1000ml，向其中添加2％-20％体积(20ml-200ml)的2C3AB蛋白单抗(由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生)绵羊红细胞偶联物，充分摇震混合，室温自动连续搅拌作用1-5h，以3000rpm的速度离心10min，收集上清，BEI灭活病毒，即得到Asia1型疫苗抗原，-20℃保存备用。

(2)病毒培养物中口蹄疫病毒非结构蛋白检测

4、无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗的配制

采用常规方法配置疫苗，方法如下：

本实验使用方法(1)。

(二)无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗与常规疫苗的比对

按常规程序向非口蹄疫感染和非口蹄疫疫苗免疫动物(各型口蹄疫抗体滴度小于1∶8)接种步骤(一)得到的无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗(N)，接种后14-20天，采集免疫动物的血清，检测其中是否含有3ABC抗体，检测方法按下述文献中描述的进行：Lu Z，Cao Y，Guo J，etal.Development and validation of a 3ABCindirect ELISA for differentiation of foot-and-mouth disease virus infectedfrom vaccinated animals[J]Vet Microbiol.2007，125(1-2)：157-169.

接种程序和结果如表3所示。

表3、疫苗接种方法及结果

其中：N-疫苗代表实验三的无病毒非结构蛋白口蹄疫疫苗；C-疫苗代表常规口蹄疫灭活疫苗；n代表未测；“-”表示检测阴性即待测血清中无3ABC抗体；“+”表示检测阳性即待测血清中有3ABC抗体；“±”表示检测可疑即待测血清中的3ABC抗体处于临界状态。

Claims

1.一种制备口蹄疫疫苗的方法，包括如下步骤：用口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体去除目标物中的口蹄疫病毒非结构蛋白，再将其制成口蹄疫疫苗；所述目标物为口蹄疫病毒培养物或含有口蹄疫病毒非结构蛋白和口蹄疫病毒结构蛋白的基因工程表达物；

所述口蹄疫病毒非结构蛋白为3B、3A、3ABC和2C3AB蛋白中的至少一种；

所述口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体为口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体、口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体、口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB的单克隆抗体和口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体中的至少一种；

所述口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB的单克隆抗体为由保藏编号为2584的口蹄疫病毒2C3AB单克隆抗体细胞株FMDV 2C3AB McAb分泌产生；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，用口蹄疫病毒非结构蛋白的单克隆抗体去除目标物中的口蹄疫病毒非结构蛋白的方法如下：将所述单克隆抗体与载体进行偶联，得到单克隆抗体载体偶联物，再将所述单克隆抗体载体偶联物与所述目标物混匀，作用1-5小时后形成抗原抗体复合物，去除所述抗原抗体复合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述载体为动物红血球或大分子聚合物微球；所述大分子聚合物微球为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述载体为红血球或琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述口蹄疫疫苗中还含有佐剂。

6.由权利要求1至5中任一所述方法制备的口蹄疫疫苗。