CN105535957A - 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105535957A
CN105535957A CN201510917849.XA CN201510917849A CN105535957A CN 105535957 A CN105535957 A CN 105535957A CN 201510917849 A CN201510917849 A CN 201510917849A CN 105535957 A CN105535957 A CN 105535957A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouth disease
foot
type
marker vaccine
deactivation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510917849.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李平花
刘在新
卢曾军
白兴文
孙普
付元芳
陈应理
李冬
包慧芳
曹轶梅
谢宝霞
袁红
殷宏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN201510917849.XA priority Critical patent/CN105535957A/zh
Publication of CN105535957A publication Critical patent/CN105535957A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗及其制备方法，所述标记疫苗种毒为O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad和A型口蹄疫重组病毒A/rV-2，其中，所述O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad的基因组序列为SEQ？ID？NO:2，所述O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad含3A？91-114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98？VP1氨基酸编码序列；所述A型口蹄疫重组病毒A/rV-2的基因组序列为SEQ？ID？NO:4，该重组病毒含3A？104-115位氨基酸的缺失。本发明的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗既可以预防O、A型口蹄疫流行毒株的攻击，又能够准确区分免疫动物和自然感染动物，在口蹄疫免疫预防与疫情控制、进出口动物及其肉制品检验检疫等领域具有重要的市场价值和指导意义。

Description

一种口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种既可免疫预防，又能区分自然感染和疫苗免疫的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-MouthDisease,FMD)是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播速度快，发病率高，曾多次在世界范围内发生流行性暴发，给发病地区的政治、经济造成巨大损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报疫病，我国规定为一类动物传染病。FMD的病原是口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus,FMDV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。病毒具有七个血清型(A，O，C，Asial，SAT1，SAT2和SAT3)，型间不交叉保护。FMDV的多型性给FMD的预防和控制带来了巨大的困难。
口蹄疫在我国长期流行，对我国的政治、经济发展带来了严重的危害。据报道，我国每年仅口蹄疫引起的损失，占所有疾病损失的38％，直接经济损失150～200亿元，间接损失高达400亿元左右。近几年来，我国的口蹄疫疫情发生更加频繁，呈现多血清型(特别O型和A型)和多谱系病毒共存的局面。疫苗免疫和精确区分疫苗免疫动物与自然感染动物是FMD防控的两个关键环节。但在口蹄疫灭活疫苗的制备过程中，一些游离的，以及与病毒粒子大小相近的非结构蛋白复合物难以清除，他们或多或少的在疫苗中残留，多次免疫动物后也能在动物体内产生相应的抗体。因此以检测病毒非结构蛋白抗体为金标准的鉴别诊断技术也难以精准区别疫苗免疫和自然感染动物，这给疫病防控和活畜贸易造成了极大障碍。
针对上述不足，利用反向遗传操作技术发展携带有特定分子标记的鉴别诊断疫苗成为一个新的技术途径。国际上防制口蹄疫的成功经验也显示双价或多价灭活疫苗对易感动物进行预防接种是多血清型口蹄疫综合防制的最有效措施之一。但是到目前为止，尚未研制出同时预防O、A两型口蹄疫的标记疫苗。因此，一种既可同时预防O、A型口蹄疫流行毒株的攻击，又能够用配套的鉴别诊断方法精确区分免疫动物和自然感染动物的O、A型双价口蹄疫灭活标记疫苗的研制对于我国的口蹄疫的有效预防、控制具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种既可同时预防O、A型口蹄疫流行毒株的攻击，又能够用配套的鉴别诊断方法精确区分免疫动物和自然感染动物的双价灭活标记疫苗。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗，该标记疫苗种毒为O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad和A型口蹄疫重组病毒A/rV-2，其中，所述O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad的基因组序列为SEQIDNO:2，该O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad含3A91-114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98VP1氨基酸的编码序列；所述A型口蹄疫重组病毒A/rV-2的基因组序列为SEQIDNO:4，该重组病毒含3A104-115位氨基酸的缺失。
本发明还公开了一种口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备方法，包括下述步骤：
(1)O型口蹄疫标记疫苗毒株的构建：1)O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；2)置换VP1基因和缺失3A蛋白91-114氨基酸编码区的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；3)拯救缺失3A蛋白91-114氨基酸编码区的重组病毒rV-O/3Ad，作为O型口蹄疫标记疫苗毒株；
(2)A型口蹄疫标记疫苗毒株的构建：1)A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；2)缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；3)拯救缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的重组病毒A/rV-2，作为A型口蹄疫标记疫苗毒株；
(3)口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备：1)O型口蹄疫标记疫苗毒株rV-O/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的增殖培养；2)O型口蹄疫标记疫苗毒株rV-O/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的病毒含量测定及特异性检验；3)O型口蹄疫标记疫苗毒株rV-O/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的灭活及其灭活抗原的检验；4)采用一步乳化法配制口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗.
在上述基础上，还包括如下步骤：5)口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗安全性及效力检验；6)利用O、A型双价标记疫苗进行多次免疫与鉴别诊断。
优选地，所述口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的配制步骤具体为：采用一步乳化法，即先配制佐剂，取疫苗佐剂加入到乳化器中，边搅拌边缓慢加入已灭活的抗原，该抗原包含已灭活的O型口蹄疫抗原rV-O/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2，待抗原和佐剂搅匀后，一次性通过均质机乳化成油乳剂疫苗，即为O、A双价口蹄疫灭活标记疫苗。
优选地，疫苗佐剂和已灭活抗原按照体积比为1∶1，其中，该已灭活抗原由等重量已灭活的O型口蹄疫抗原rV-O/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2混合而成。
研究结果表明，本发明提供的O、A型双价灭活标记疫苗既可以预防O、A型口蹄疫流行毒株的攻击，又能够准确区分免疫动物和自然感染动物，在口蹄疫免疫预防与疫情控制、进出口动物及其肉制品检验检疫等领域具有重要的市场价值和指导意义。
附图说明
图1.为FMDVOZK/93-08株全基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(1.DL5000DNAmarker；2.Z1PCR片段；3.Z2PCR片段；4.Z1和Z2PCR融合片段；5.Z3PCR片段；6.Z4PCR片段)。
图2为FMDVOZK/93-08株基因组全长cDNA克隆的构建策略示意图。
图3显示了重组质粒pOMQ-Z1234D转染BHK细胞60h后引起的CPE(A：正常BHK细胞，B：出现CPE的BHK细胞)。
图4为拯救病毒rV-O/3Ad与OZK/933A蛋白氨基酸的比对。
图5为拯救病毒rV-O/3Ad与OZK/93VP1蛋白氨基酸的比对。
图6为间接免疫荧光检测拯救病毒在BHK上的复制。
图7显示了FMDVA/GDMM/CHA/2013株全基因组PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(1.DL12000DNAmarker；2.A1PCR片段；3.A2PCR片段；4.A1和A2PCR融合片段；5.A3PCR片段；6.A4PCR片段)。
图8显示了FMDVA/GDMM/CHA/2013株全长cDNA分子克隆的构建策略。
图9显示了重组质粒pQAGD/3A104-115转染BSR/T7细胞60h后引起的CPE(A：出现CPE的BSR/T7细胞，B：正常BSR/T7细胞)。
图10为标记病毒A/rV-2和A/GDMM/CHA/2013病毒3A蛋白氨基酸的比对图。图11为重组病毒的间接免疫荧光检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、O型FMDV标记疫苗毒株的构建
1、FMDVOZK/93-08株基因组全长cDNA克隆的构建
根据FMDVOZK/93-08全基因组序列设计下列寡核苷酸引物，由上海桑尼有限公司合成。(FMDVOZK/93-08毒株在农业部兽医局指定口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得)。
表1构建FMDVOZK/93-08株全长cDNA克隆的引物
提取FMDVOZK/93-08株(购买自国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室)的总RNA，用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物分别反转录合成第一链cDNA，反转录反应体系见表2。
表2反转录反应体系
反应条件：离心混匀后，42℃水浴1h，置-20℃冰箱中备用。
以合成的第一链cDNA为模板，用4对引物Z1/Z1-2、Z2/Z2-2、Z3/Z3-2和Z4/Z4-2，分别扩增获得OZK/93-08病毒全基因组4个相互重叠的cDNA片段，分别命名为Z1、Z2、Z3和Z4(见图1)，扩增体系见表3。
表3PCR扩增体系
扩增程序为：94℃预变性1min后，98℃20min，68℃1min/1kb，30个循环后,72℃8min。
纯化回收Z1和Z2片段，并以回收的这两个片段为模板，用引物Z1/Z2-2进行融合PCR，得Z12片段(见图1)。Z12片段与pMD20-T载体(大连宝生物生物有限公司)连接，得到重组质粒pMD-Z12。pMD-Z12和pBluescriptIISKhdv质粒载体((pBluescriptSKhdv载体在文献“《华北农学报》2010年第25卷第3期，曹伟军，李平花，白兴文等，口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定”中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。)分别用KpnI/XbaI(所有限制性内切酶均购自大连宝生物生物有限公司)双酶切消化，纯化回收相应的目的片段，连接、转化、筛选阳性克隆，得到阳性重组质粒pOZKF-Z12。
纯化回收的Z3片段和pBluescriptIISK(-)质粒载体(Invitrogen公司)分别用XbaI和BglII消化后，纯化回收相应的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-Z3。
纯化回收的Z4片段和pBluescriptIISK(-)质粒载体分别用BglII/NotI消化，纯化回收相应的片段，连接、转化、筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-Z4。
利用QuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司)定点突变试剂盒，以重组质粒pSK-Z3为模板，以T1/T1-2和T2/T2-2为引物分别依次突变重组质粒pSK-Z3中2985位(C变A)和4238(C变A)位的核苷酸，消除了这两个核苷酸相对应的NotI和BglII位点，引入了分子标签，最终得到阳性重组质粒pOZKF-Z3。
BglII/XbaI分别双酶切消化重组质粒pOZKF-Z12和pOZKF-Z3，纯化回收相应的目的片段，连接、转化、筛选阳性克隆，得到重组质粒pOZKF-Z123。最后用BglII/NotI消化重组质粒pOZKF-Z123和Z4片段，纯化回收，连接、转化、筛选阳性克隆，得到含FMDVOZK/93-08株基因组全长cDNA克隆的重组质粒pOZKF-Z1234。FMDVOZK/93-08株基因组全长cDNA克隆的构建策略见图2。构建的重组质粒pOZKF-Z1234送上海桑尼有限公司测序，结果见SEQIDNO:1，即为FMDVOZK/93-08株全基因组序列(其中结构蛋白VP1的编码序列位于3228-3867，3A蛋白编码序列位于5332-5760，3A的91-114位氨基酸编码序列位于5602-5643)。
2、置换VP1基因和缺失3A蛋白91-114氨基酸OZK/93-08病毒全长cDNA克隆的构建
考虑到近几年的FMDV优势流行毒为缅甸98系，为增强本发明的适用性，将pOZKF-Z1234中含FMDV主要抗原表位区VP1基因置换，并同时缺失病毒基因组3A蛋白91-114氨基酸作为阴性的标记。
设计合成下列寡核苷酸引物并由上海桑尼有限公司合成：
表4构建嵌合缅甸98VP1基因和缺失3A蛋白91-114氨基酸的FMDVOZK/93-08全长cDNA克隆的引物
用RNeasyminiKit(Qiagen)提取FMDVO/CHN/Mya98/2010S株(购买自国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室)的总RNA，用MQVP1(-)引物，合成第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，用MQVP1(+)/MQVP2(-)引物扩增获得缅甸98口蹄疫病毒的VP1基因，命名为E片段(E片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第3216-3890位核苷酸)。然后以pOZK-Z123质粒为模板，用E2903(+)/MQVP1(-)和MQVP2(+)/E4183(-)为引物，分别PCR扩增D片段(D片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第2888-3251位核苷酸)和F(F片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第3855-4203位核苷酸)片段。扩增的D、E、F三片段用凝胶纯化回收做模板，用E2903(+)/E4183(-)引物融合扩增DEF(DEF片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第2888-4203位核苷酸)。该片段经BssHII和NheI酶消化并纯化回收后插入用同样酶消化的质粒pOZK-Z123中，得到的阳性重组质粒记作pOMQ-Z123。
以已构建保存的质粒pSK-Z4为模板，分别用OZ5269(+)/OZD91(-)和OZD91(+)/OZ6811(-)为引物，PCR分别扩增得M片段(M片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第5269-5621位核苷酸)和N片段(N片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第5582-6783位核苷酸)。纯化的M片段和N片段等量混合做为模板，以OZ5269(+)/OZ6811(-)为引物PCR扩增得MN片段(MN片段的核苷酸序列为SEQIDNO:2中第5269-6783位核苷酸)。该MN片段含FMDV非结构蛋白3A91-114位氨基酸的缺失)。MN片段用BglII/EcoRI(TakaRa)内切酶消化后，插入用BglII/EcoRI(TakaRa)酶消化的质粒pSK-Z4中，得到阳性重组质粒记作pSK-Z4D。用NotI和BglII双酶切质粒pSK-Z4D，回收Z4D片段，将其插入用同样酶消化的重组质粒pOMQ-Z123中，得到的阳性质粒记作pOMQ-Z1234D。重组质粒pOMQ-Z1234D送上海桑尼有限公司测序，结果见SEQIDNO:2，即为含缅甸98病毒VP1基因和缺失3A蛋白91-114位氨基酸的O型FMDV基因组全长cDNA克隆。
3、标记病毒的拯救
BHK-21细胞购自中国兽医监察所，产品目录号为BHK21F5620071213。
用QIAGENPlasmidMidiKits(QIAGEN公司)制备质粒pOMQ-Z1234D和pcDNAT7P。pcDNAT7P质粒在文献“《中国农业科学》2009年第42卷第2期，李平花，白兴文，卢曾军等，“细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒”中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。
用NotⅠ线化pOMQ-Z1234D后，加入蛋白酶K(终浓度为0.25μg/mL，Invitrogen公司)，37℃温育30min后，纯化后作为转染cDNA模板。常规培养的单层BHK-21细胞生长至70％～80％时用于转染。转染时各取2μg线化cDNA模板和pcDNAT7P用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)介导转染BHK-21细胞。转染后6h吸去细胞上清，加入2mL含8％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)，置37℃5％CO2培养箱，48h后收获病毒，冻融1次后，在BHK-21上连续10传代，出现典型细胞病变(CPE)(图3，A：正常BHK-21细胞，B：重组质粒转染60h后的BHK细胞)，收集病毒液，即为目的病毒，命名为rV-O/3Ad。用该病毒在培养的BHK-21细胞上传代增殖30代，-70℃保存各代病毒备用。
4、重组病毒的鉴定
4.1、RT-PCR鉴定标记病毒基因
取连续传10代的rV-O/3Ad细胞毒，用RNAasyMiniKit提取细胞毒总RNA，RT-PCR方法扩增含VP1基因和3A基因的特定片段，纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，测定的VP1和3A基因所编码的氨基酸与OZK/93-08相对应的氨基酸比对，比对结果见图4和图5。RT-PCR引物见表5。
表5RT-PCR引物
结果显示：测序及氨基酸序列比对分析结果表明rV-O/3Ad病毒含3A91-114位氨基酸的缺失(图4)，并且含有缅甸98VP1的氨基酸序列(图5)，表明本发明构建的rV-O/3Ad基因组序列正确。
重组病毒rV-O/3Ad的基因组序列见SEQIDNO:2；嵌合的缅甸98系病毒VP1基因序列位于3228-3867，3A蛋白的基因序列位于5332-5718。
4.2、间接免疫荧光鉴定病毒蛋白
BHK-21单层细胞(分与六孔培养板)生长至70％时接种转染的上清，接种病毒的BHK-21(单层细胞生长至70％)，8h后进行间接免疫荧光法鉴定。一抗为FMDV3A单抗3A24或3B单抗3B4B1，二抗为山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。结果表明，接种转染上清的BHK细胞用3A单抗作用看不到可见的绿色荧光，而用3B单抗作用则能看到明显的可见荧光，对照细胞3A和3B单抗作用均看不到可见荧光，说明本发明拯救的标记病毒为正确的构建。(见图6)。
3A单抗3A24在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定》，中国兽医科学2010,40(04):331-336中公开过，3B单抗3B4B1在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定》，江苏农业学报,2009,25(2):296～300中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。
4.3、拯救病毒的遗传稳定性分析
将rV-O/3Ad病毒按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现典型细胞病变(CPE)的时间，并对5、10代病毒进行RT-PCR，检测拯救病毒3A氨基酸的变化情况。结果表明拯救病毒rV-O/3Ad连续传至第8代后，出现的CPE的时间趋于稳定，100％病变时间约8-10h，20代病毒转入大转瓶，100％病变时间约为11-12小时，病变时间稳定。拯救病毒5和10代3A基因的序列测定结果表明，3A蛋白91-114位氨基酸的缺失在连续传代过程中未发生任何变化。
二、A型FMDV标记疫苗毒株的构建
1、FMDVA/GDMM/CHA/2013株基因组全长cDNA克隆的构建
根据已经公布的A型FMDV全基因组序列，将A/GDMM/CHA/2013株(GenBank:KF450794.1)基因组分为4个重叠的片段，设计合成4对寡核苷酸引物，由上海桑尼有限公司合成。
表6构建FMDVA/GDMM/CHA/2013株全长cDNA使用的引物
注：(+)：表示正向引物，(-)：表示反向引物。加横线的核苷酸为引入的限制性酶切位点，斜体为T7启动子序列。
用RNeasyminiKit(Qiagen)提取口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株的总RNA，分别用A2(-)，A3(-)和A4(-)引物，反转录合成第一链cDNA。反转录反应体系见表2。
以反转录的第一链cDNA为模板，用引物A1(+)/A1(-)、A2(+)/A2(-)、A3(+)/A3和A4(+)/A4(-)扩增4个相互重叠的cDNA片段，扩增片段分别命名为A1、A2、A3和A4(见图7)。扩增体系见表3。
纯化回收A1和A2片段，并以回收的这两个片段为模板，用引物A1(+)/A2(-)进行融合PCR，得A12片段(见图7)。A12与pBluescriptSKhdv载体分别用SphI/XbaI双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A12。重组质粒pSK-A12和A3片段分别用XbaI/BglII双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A123。A4片段和pBluescriptSKhdv载体分别用BglII/NotI双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A4。最后用BglII/NotI分别消化重组质粒pSK-A123和pSK-A4，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到含FMDVA/GDMM/CHA/2013株全长cDNA克隆pQAGD。FMDVA/GDMM/CHA/2013株基因组全长cDNA克隆的构建策略见图8。
将酶切鉴定正确的全长质粒pQAGD进行测序验证，结果显示在pBluescriptSKhdv质粒载体的SphI/NotI位点间插入了SEQIDNO:3所示核苷酸序列，即FMDVA/GDMM/CHA/2013株全基因组序列。3A蛋白基因序列位于第5387-5845核苷酸。
2、3A蛋白104-115氨基酸缺失的A型FMDV基因组全长cDNA克隆的构建
研究表明口蹄疫病毒3A非结构蛋白的109-115(AEKNPLE)为免疫优势的B细胞表位，故我们选择包含该区段的基因组104-115作为缺失的靶点。设计合成下列寡核苷酸引物，并由上海桑尼有限公司合成：
表7构建FMDVA/GDMM/CHA/2013株3A104-115位氨基酸缺失全长cDNA使用的引物
以已构建保存的pSK-A4为模板，分别用A/GD5321(+)/A/GD104-115(-)和A/GD104-115(+)/A/GD6767(-)引物对，PCR分别扩增得到C片段(C片段核苷酸序列为SEQIDNO:1中第5321-5751)和D(D片段序列为SEQIDNO:1中第5751-6786核苷酸)片段。纯化的C片段和D片段等量混合做为模板，以OZ5321(+)/OZ6767(-)为引物PCR扩增得CD片段(CD片段的序列为SEQIDNO:1中第5321-6786位核苷酸)。然后pSK-A4用HindIII/NotI酶消化，CD片段用BglII/HindIII酶消化后，pSK-A1234用NotI/BglII消化后，分别纯化回收相应的片段，三片段连接得到重组质粒pQAGD/3A104-115。重组质粒pQAGD/3A104-115送上海桑尼有限公司测序，结果见SEQIDNO:4，即为含3A104-115位氨基酸缺失的FMDVA/GDMM/CHA/2013株全长cDNA克隆。
3、拯救3A104-115位氨基酸缺失的重组病毒
用QIAGENPlasmidMidiKits制备质粒pQAGD/3A104-115，NotI线化回收后用LipofectamineTM2000介导转染生长至70％～80％满的BSR/T7细胞。转染后5h加入1mLGMEM完全培养基，置37℃CO2培养箱继续培养。转染60h后细胞出现明显的细胞病变(cytopathogeniceffct,CPE)(见图9)。72h后收获细胞，反复冻融三次后在BHK-21上连续传代。拯救的基因工程病毒命名为A/rV-2。
4、重组病毒A/rV-2的鉴定
4.1、测序鉴定病毒基因
取转染的细胞上清用RNAasyMiniKit提取细胞毒总RNA，RT-PCR方法扩增含有3A基因的特定片段，纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，测定的3A基因所编码的氨基酸与A/GDMM/CHA/2013相对应的氨基酸比对。
用于扩增含3A基因的特定片段的RT-PCR引物为:
A/GD5321(+):GTTCAGGAGGTGATTGATCG
A/GD6767(-):AACACGCCGTGTGCCACGGT
结果显示：本发明构建的A/rV-2基因组序列正确，含3A104-115位氨基酸的缺失(见图10)。
4.2、间接免疫荧光鉴定病毒蛋白
BHK-21单层细胞(分与六孔培养板)生长至70％时接种转染的上清，8h后吸弃培养液，用PBS缓冲液漂洗3次，吸完残液，3.7％多聚甲醛室温固定30min，PBS缓冲液洗涤3次，加0.5％TritonX-100室温作用10min，PBS缓冲液洗涤3次，吸干残液。滴加FMDV3A单抗3A24或3B单抗3B4B1，37℃孵育1h，PBS漂洗3次后，加FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma)，37℃孵育1h，PBS漂洗3次后，用甘油封片于Olympus荧光显微镜下观察并拍照。
结果表明接种转染上清的BHK细胞用3A单抗作用看不到可见的绿色荧光，而用3B单抗作用则看到明显的可见荧光，对照细胞3A和3B单抗作用均看不到可见荧光，说明本发明拯救的重组病毒为正确的构建。(见图11)。
4.3、拯救病毒的遗传稳定性分析
将A/rV-2病毒按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现典型细胞病变的时间，并对5、15、20代病毒进行RT-PCR检测拯救病毒3A蛋白氨基酸的变化。RT-PCR检测的引物为：
A/GD5321(+):GTTCAGGAGGTGATTGATCG
A/GD6767(-):AACACGCCGTGTGCCACGGT
结果表明拯救病毒A/rV-2用小方瓶连续传至第6代后，出现的CPE的时间趋于稳定，100％病变时间约10-13h，小方瓶20代病毒转入大转瓶，100％病变时间约为12-14h，病变时间稳定。拯救病毒5、15、20代3A基因的序列测定结果表明，3A蛋白104-115位氨基酸的缺失稳定存在。
二、疫苗的制备
1、制苗病毒的大量增殖
将传至第8代的拯救病毒rV-O/3Ad和A/rV-2作为制苗种毒。BHK21细胞培养长至致密单层后，向其中分别加入病毒液和培养液。其中种毒按10％体积比例加入，补加培养液至培养容器体积的1/20-1/30。37℃继续培养，待95％以上细胞出现细胞CPE时，收获病毒液，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH值至7.6～7.8，-20℃保存备用。
2、制苗病毒的检验
2.1无菌检验按《中国兽药典》进行，均应无细菌、霉菌支原体生长。
2.2病毒含量测定将制苗用病毒液，用DMEM液(pH值7.6)进行10倍系列稀释，接种BHK21细胞单层，每个稀释度接种4个细胞管，每管1ml。置37℃培养72小时，观察CPE，按Karber法计算TCID50。每毫升病毒含量均应不低于107.0TCID50。
2.3特异性检验将制苗病毒与不同血清型的FMDV及猪水泡病阳性血清进行细胞中和试验，结果制苗毒液仅可被A型或O型FMD阳性血清中和，生产毒种具有FMDA或O型FMD特异性。
3、制苗病毒的灭活
将制苗病毒液经80目铜纱网滤过除去细胞碎片，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH值为7.6～7.8，加入200U/ml青霉素、链霉素。给已过滤的O、A型病毒液分别加入BIE(终浓度为2mmol/L)，在30℃下持续灭活28小时，期间每2小时摇振1次。灭活终止后加入2％的硫代硫酸钠溶液，置2～8℃保存备用。
4、灭活抗原的检验
4.1无菌检验灭活病毒液按《中国兽药典》进行，应无菌生长。
4.2灭活检验取2～4日龄乳鼠4只颈背部皮下接种灭活的病毒液，每只0.2ml。另取对照乳鼠2只，接种PBS。接种后，将乳鼠分别与母鼠一起饲养，连续观察7日，接种与对照乳鼠均应全部健活。
5、疫苗的配制
采用一步乳化法。将IS201佐剂加入到乳化器中，不断搅拌，然后在搅拌下缓慢加入已灭活的抗原(该抗原由已灭活的O型FMDV抗原rV-O/3Ad和A型FMDV抗原A/rV-2等量混合而成)。待抗原和佐剂搅匀后，一次性通过均质机乳化成油乳剂疫苗，即为O\A双价FMDV标记疫苗，置4-8℃保存。其中佐剂和抗原的体积比为1∶1。
6、疫苗的检验
6.1物理性状的检验
制备的疫苗为矿物油乳剂，外观呈乳白色或淡粉红色粘滞性均匀乳状液。乳剂4000rpm离心15分钟应不分层。37℃下存放15日应无破乳现象，吸入内径为1.2mm的1ml吸管中，垂直下滴每分钟不少于13滴。
6.2无菌检验按《中国兽药典》进行，应无菌生长。
6.3安全检验
6.3.1用体重20～25g的小鼠4只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，接种与对照乳鼠均应全部健活。。
6.3.2用至少45～50日龄的健康易感猪(口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体滴度﹤1∶8，3ABC抗体阴性)3头，每头耳根后肌肉注射疫苗6ml，连续逐日观察10天，均不应出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。
7、疫苗效力的检验
选用45日龄以上健康易感猪12头，8头接种2ml双价疫苗，4头接种2mlMEM。28天后，免疫双价疫苗的猪分为2组，一组用1000ID50/2ml的A型口蹄疫同源鼠毒(A/GDMM/CHA/2013)攻击，另一组用1000ID50/2ml的O型口蹄疫同源鼠毒(OZK/93-08)攻击。接种MEM的4头猪，2头用1000ID50/2mlOZK/93-08鼠毒攻击，另外2头用A/GDMM/CHA/2013鼠毒攻击。攻击方法：耳根后肌肉接种。实验动物连续观察10日，对照猪均应至少一蹄出现水疱病变，免疫猪无临床症状判为保护。结果免疫猪在实验期间均未出现任何口蹄疫的临床症状，全部得到了保护，而对照猪全部4蹄出现口蹄疫水泡性症状。因此，用本发明方法得到的双价疫苗免疫动物，对A型和O型口蹄疫都有很好的免疫保护效果。
表8口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗免疫动物的保护情况
8、疫苗的多次免疫
45日龄以上的健康易感猪30头，牛30头，随机分为分2组，每组含猪、牛各15头。第一组免疫上述“口蹄疫O、A双价标记疫苗”，肌肉接种，2ml/头。第二组接种常规口蹄疫O、A双价灭活疫苗(购自中农威特生物科技股份有限公司)，肌肉接种，2ml/头。疫苗接种动物每间隔至少14天接种一次，连续接种5次。最后一次接种后21天，采集免疫动物的血清置-20℃备用。
9、血清抗体检测
将上述采集的免疫动物血清和实验室口蹄疫感染的20份猪血清，20份牛血清用3A单抗阻断ELISA检测。步骤如下：
①包被：用包被缓冲液稀释2C多抗至工作浓度，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜。将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干；
②封闭：每孔加封闭液100μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤3遍，拍干；
③用2C多抗捕获2C3AB蛋白：用血清稀释液(含10％马血清(Hyclone)，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液)将2C3AB蛋白稀释至工作浓度，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干；
④加待测血清：用血清稀释液将阳性、阴性对照血清及待测血清样品1∶5稀释，每孔100μL加入酶标板，反应24小时，PBST洗涤5遍，拍干；
⑤加酶标3A单抗：用血清稀释液将酶标3A单抗(用EZ-LinkPlusActivatedPeroxidase试剂盒标记口蹄疫病毒3A单抗3A24)。稀释至最适工作浓度，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干；
⑥加底物显色每孔：100μL加入TMB底物溶液，37℃避光反应10～15min；
⑦终止：每孔加入0.3mol/LH2SO4使反应终止；
⑧测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值；
⑨计算血清样品抗体阻断率，根据评判标准判定结果。阻断率(％)＝[(阴性参考血清OD－样品OD)/阴性参考血清OD]×100。阻断率大于或等于46％样品判为3A蛋白104-115位氨基酸表位抗体阳性，阻断率小于46％判为3A蛋白104-115位氨基酸表位抗体阴性。
结果表明，用本发明方法得到的双价标记疫苗免疫动物5次后，群体动物血清中检测不到针对3A相应表位的抗体(阻断率小于46％)，而常规双价灭活疫苗免疫动物5次后，用3A单抗竞争ELISA法能够检测到群体动物血清中有针对3A相应表位的抗体(阻断率大于46％)(见表9)，说明用本发明方法得到的疫苗免疫动物，能够精确区分口蹄疫感染动物和疫苗免疫动物。
综上，本发明方法得到的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗即对口蹄疫O和A型有良好的免疫保护效果，又可以用配套的鉴别诊断方法精确区分口蹄疫感染动物和疫苗免疫动物。
表9针对3A相应表位的抗体检测结果

Claims (5)

1.一种口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗，其特征在于，所述标记疫苗种毒为O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad和A型口蹄疫重组病毒A/rV-2，其中，所述O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad的基因组序列为SEQIDNO:2，所述O型口蹄疫重组病毒rV-O/3Ad含3A91-114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98VP1氨基酸编码序列；所述A型口蹄疫重组病毒A/rV-2的基因组序列为SEQIDNO:4，该重组病毒含3A104-115位氨基酸的缺失。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)O型口蹄疫标记疫苗毒株的构建：1)O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；2)置换VP1基因和缺失3A蛋白91-114氨基酸编码区的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；3)拯救缺失3A蛋白91-114氨基酸编码区的重组病毒rV-O/3Ad，作为O型口蹄疫标记疫苗毒株；
(2)A型口蹄疫标记疫苗毒株的构建：1)A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；2)缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；3)拯救缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的重组病毒A/rV-2，作为A型口蹄疫标记疫苗毒株；
(3)口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备：1)O型口蹄疫标记疫苗毒株rV-O/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的增殖培养；2)O型口蹄疫标记疫苗毒株rV-O/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的病毒含量测定及特异性检验；3)O型口蹄疫标记疫苗毒株rV-O/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的灭活及其灭活抗原的检验；4)采用一步乳化法配制口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗。
3.如权利要求2所述的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备方法，其特征在于，还包括对所得疫苗进行安全性及效力检验；利用O、A型双价标记所得疫苗进行免疫与鉴别诊断的步骤。
4.如权利要求2所述的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备方法，其特征在于，所述口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的配制步骤具体为：采用一步乳化法，先取疫苗佐剂加入到乳化器中，边搅拌边缓慢加入已灭活的抗原，该已灭活的抗原包含已灭活的O型口蹄疫抗原rV-O/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2，待抗原和佐剂搅匀后，一次性通过均质机乳化成油乳剂疫苗，即为O、A双价口蹄疫灭活标记疫苗。
5.如权利要求4所述的口蹄疫O、A型双价灭活标记疫苗的制备方法，其特征在于，疫苗佐剂和已灭活抗原体积比例为1∶1，其中，该已灭活抗原由等重量已灭活的O型口蹄疫抗原rV-O/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2混合而成。
CN201510917849.XA 2015-12-11 2015-12-11 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法 Pending CN105535957A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510917849.XA CN105535957A (zh) 2015-12-11 2015-12-11 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510917849.XA CN105535957A (zh) 2015-12-11 2015-12-11 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105535957A true CN105535957A (zh) 2016-05-04

Family

ID=55815833

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510917849.XA Pending CN105535957A (zh) 2015-12-11 2015-12-11 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105535957A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108872574A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于塞尼卡谷病毒结构蛋白vp1抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒
CN111944770A (zh) * 2020-08-27 2020-11-17 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种口蹄疫病毒致弱突变株及其制备方法和应用
CN111961654A (zh) * 2020-08-05 2020-11-20 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102614507A (zh) * 2012-02-17 2012-08-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法
CN104826098A (zh) * 2015-05-14 2015-08-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种a型口蹄疫标记疫苗及其构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102614507A (zh) * 2012-02-17 2012-08-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法
CN104826098A (zh) * 2015-05-14 2015-08-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种a型口蹄疫标记疫苗及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARVIN J GRUBMAN: "development of novel strategies to control foot-and-mouth disease: marker vaccines and antivirals", 《BIOLOGICALS》 *
宁宜宝主编: "《兽用疫苗学》", 30 November 2008 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108872574A (zh) * 2018-07-12 2018-11-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于塞尼卡谷病毒结构蛋白vp1抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒
CN111961654A (zh) * 2020-08-05 2020-11-20 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗
CN111961654B (zh) * 2020-08-05 2022-03-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗
CN111944770A (zh) * 2020-08-27 2020-11-17 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种口蹄疫病毒致弱突变株及其制备方法和应用
CN111944770B (zh) * 2020-08-27 2022-04-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种口蹄疫病毒致弱突变株及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103751774B (zh) 稳定表达猪瘟病毒e2蛋白的重组细胞系及其在制备猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂中的应用
CN103172749B (zh) 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备
CN100354414C (zh) 一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用
CN102614507B (zh) 一种o型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法
CN113337478B (zh) 一株猫细小病毒毒株及其应用
CN102967710A (zh) 小反刍兽疫抗体检测的竞争elisa试剂盒及其制备方法
CN107841507A (zh) 一种高效表达的猪圆环病毒2型Cap‑穿膜肽融合蛋白基因及其应用
CN107899008B (zh) 一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗
CN107541500A (zh) 一种a型口蹄疫病毒单克隆抗体及应用
CN104826098B (zh) 一种a型口蹄疫标记疫苗及其构建方法
CN109136198A (zh) 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗
CN105535957A (zh) 一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法
CN102816246A (zh) 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途
CN105039233B (zh) 一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
CN102747092B (zh) 表达o型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用
CN110038124A (zh) 猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用
CN102010876A (zh) 重组枯草芽孢杆菌ev71-vp1表达载体及其制备方法与应用
CN101322844B (zh) 无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法
CN111729091B (zh) 一种用家兔检验猪塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法
CN108315306A (zh) 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN102533798B (zh) 表达a型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用
CN106967691A (zh) 一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用
CN100410378C (zh) 编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用
CN106916832A (zh) O型口蹄疫病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160504

RJ01 Rejection of invention patent application after publication