CN102010876A - 重组枯草芽孢杆菌ev71-vp1表达载体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体：载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有EV71病毒的衣壳蛋白VP1的编码基因。构建方法如下：(1)扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及编码序列，并连接到pMD18T载体，得到质粒pDG1662-CotB；(2)扩增肠道病毒71型衣壳蛋白VP1抗原序列，然后连接到质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-VP1，即为重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体。将本发明的重组载体导入宿主细胞培养后，可用于制备预防或治疗EV71引起的疾病的口服疫苗。

Description

重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体及其制备方法、表达宿主及作为口服疫苗的应用，属于基因工程领域。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员。EV71病毒的基因组为含有大约7500个核苷酸的单正链RNA。EV71病毒颗粒大致呈球形，无包膜和突起，病毒衣壳由60个亚单位相互连接而成，每个亚单位由病毒基因组编码的衣壳蛋白VP1、VP2、VP3、VP4聚合而成，VP1、VP2、VP3三个蛋白暴露在病毒衣壳表面，VP4则包埋在病毒衣壳的内侧与病毒核心紧密连接。

EV71和柯萨奇病毒A16(coxsackievirus A16，CA16)同为引起儿童和婴幼儿手足口病的常见病原体。虽然EV71和CA16两者在遗传上有较高的同源性，但是与CA16通常只引起手足口病不同，EV71的感染还可以引起很多严重的中枢神经系统疾病，如无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹。

1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚爆发的表现为神经系统症状疾病的患者中分离到EV71病毒，随后，世界上许多国家相继报道了EV71在不同地区的流行情况。1975年保加利亚EV71的流行造成了44人死于脊髓灰质炎样疾病；随后，由EV71引起的中枢神经系统疾病开始在纽约、澳大利亚、欧洲和亚洲出现；马来西亚的一次EV71的流行导致了35名儿童的死亡，这些儿童在出现手足口病的症状的同时伴随有心肌炎和肺水肿的发生；1998年中国台湾爆发大规模的EV71流行，90000多名儿童感染并出现手足口病症状，其中320名病人出现无菌性脑膜炎、脑炎和严重的迟缓性麻痹症状，至少55名患者死亡；1998年，何雅青等人在我国深圳的手足口病患者的体液和粪便标本中分离到了EV71病毒；2008年我国安徽地区爆发了大规模的EV71感染，河南，北京地区也有病例报道；今年我国山东、河南地区再次大规模爆发EV71感染。

目前还没有有效的药物和疫苗用来治疗和预防EV71的感染，避免与感染者密切接触被认为是有效地预防措施。由于EV71感染所带来的危害日益严重，所以研发有效地疫苗保护易感人群，寻找合适的药物治疗患者显得日趋重要。

传统的疫苗，如减毒的活病毒疫苗和灭活的病毒颗粒疫苗，在某些病毒疾病的预防上取得了显著地成功。1954年，第一个灭活的脊髓灰质炎疫苗在美国被批准上市，这种疫苗是将脊髓灰质炎病毒在37℃、PH＝7的条件下，于1/10000的福尔马林中孵化12到14天得到的。灭活疫苗成功之后，Sabin等人又研发出了用于预防脊髓灰质炎的口服减毒活疫苗并与1962年在美国投放上市。这两种疫苗在全世界范围内极其有效地控制了脊髓灰质炎的蔓延。EV71与脊髓灰质炎病毒同属小RNA病毒科肠道病毒属，但与脊髓灰质炎病毒相比，并没有有效的灭活疫苗和减毒活疫苗得到应用。一些研究人员利用动物模型实验证明了灭活的EV71病毒可以起到良好的免疫保护作用。Lin YC等人在研究中发现了一株EV71的Vero细胞适应株YN3-4a，它表现出了与其亲本病毒株不同的特性，在Vero细胞中的生长速度快，病毒载量大，对新生小鼠有着较低的半数致死剂量，并且抗YN3-4a的小鼠血清可以与不同血清型的EV71病毒株发生中和作用，Lin YC认为该病毒株可以用来制备灭活的病毒疫苗。Arita M等人构造了一株温度敏感的A型的EV71突变株EV71(S1-3’)，通过静脉注射的方法感染猕猴后，EV71(S1-3’)与EV71 BrCr株相比表现的较低的神经毒性。接种过EV71(S1-3’)的猕猴再注射致死剂量的BrCr株病毒后，只表现出了轻微的神经系统症状并存活下来。接种过EV71(S1-3’)的猕猴的血清能够与大多数亚型的EV71病毒株发生中和作用，但是效价上有明显的差异，中和活性从高到低分别为：A，B1，C4，B4，C2。

在早期的一些有关EV71的研究中，通过免疫荧光实验，补体结合试验和免疫扩散实验证明了CA16与EV71有一些共同的抗原位点。Te Chia Wu等人通过动物模型实验证明了感染了CA16的老鼠的血清中的抗体可以对EV71病毒产生较弱的中和作用。乳鼠在注射了抗CA16血清后，再次接种致死剂量的EV71病毒时，与没有注射CA16血清的对照组相比，能够使病死率降低了10％到20％。这个实验结果让我们联想到了利用CA16或者其他的肠道病毒作为EV71的异源疫苗的可能性，因为CA16的感染者通常不会出现严重的症状，就如同利用牛痘作为天花疫苗一样。

亚单位疫苗和其他基因工程疫苗：用纯化的病毒组分而不是全病毒做疫苗，这就是亚单位疫苗。用来做亚单位疫苗的通常是决定诱导人体的抗体和CTL的病毒蛋白，大多数情况下，这些蛋白是病毒的结构蛋白，尤其是病毒颗粒的表面蛋白。肠道病毒没有包膜，病毒颗粒由VP1-4四种衣壳蛋白聚合而成。VP4位于病毒衣壳的内侧，被认为不具有抗原位点；VP1、VP2、VP3则暴露在病毒的衣壳表面，向宿主提供免疫识别位点，其中VP1被认为有着最多的抗原决定簇。因此VP1蛋白成为了制备EV71亚单位疫苗的最佳候选。

目前已经有相当多的研究证实了VP1蛋白作为抗原用于诊断和疫苗预防的有效性。hin-RuShih等人利用大肠杆菌在原核系统中表达出了VP1，并证实了该蛋白可以有效的与EV71患者血清中的抗体发生中和反应。Cheng-Nan Wu和他的小组对EV71 VP1蛋白的免疫效果做了较为深入的研究。他们同时构建了能够表达VP1基因的原核表达载体和真核表达载体，分别在大肠杆菌和BHK细胞中得到了成功的表达，他们将原核表达的VP1蛋白纯化出来作为亚单位疫苗，并将含有VP1基因的真核表达载体作为DNA疫苗以及灭活的病毒作为传统疫苗同时利用小鼠模型做了其免疫效果的研究。他们的研究结果表明，与阴性对照组相比，三种疫苗都能够有效的引起接种小鼠的免疫反应，三种疫苗都能够使小鼠体内产生相同滴度的中和抗体；但是灭活的全病毒可以带来更多的特异性IgG和更强的T辅助免疫细胞的反应。同时，通过免疫孕鼠的方式来被动免疫乳鼠的实验表明，相比于灭活的全病毒，VP1的重组蛋白疫苗和DNA疫苗并不能对注射了致死剂量的EV71的乳鼠带来有效的免疫保护作用。C.S.Tan等人分别在原核表达系统中表达出了完整的VP1蛋白和N端50％氨基酸序列、C端50％氨基酸序列的蛋白并进行了免疫学的研究，发现相比于C端，N端的氨基酸能够引起更高效价的抗体，他们的实验结果与Sivasamugham LA等人的实验结果是一致的。Sivasamugham LA等人使EV71 VP1蛋白的六个片段与新城疫病毒的NP蛋白融合表达，使得VP1蛋白片段在新城疫病毒上展示出来，免疫学实验表明，这种带有VP1蛋白氨基酸片段的重组新城疫病毒能够在家兔体内诱导产生EV71的特异性抗体，而靠近N端的氨基酸系列明显的能够引起更强的免疫反应。Chen HF等人构建的能够表达VP1的转基因番茄，实验结果表明VP1蛋白在番茄中得到了成功的表达，通过口服这种能够表达VP1蛋白的番茄的方式免疫小鼠后，在小鼠的血清中检测到了EV71的特异性抗体。Chen HL和他的研究小组则采取的制作转基因小鼠的方式，使VP1蛋白在雌性ICR小鼠的乳腺中获得表达并在乳汁中成功检测到了EV71的VP1蛋白。免疫学研究和动物模型实验表明通过进食这种含有VP1蛋白的小鼠乳汁可以产生有效的免疫保护反应。Chiu CH等人则用减毒的鼠疫沙门氏菌展示表达了VP1蛋白并将其作为疫苗，其免疫保护作用在小鼠模型的实验中得到了证实。Foo DG等人则仅仅利用VP1蛋白上的一段多肽序列就在小鼠模型中观察到了良好的免疫保护反应。

此外，Yao-Chi Chung等人构建了含有P1前体蛋白和3CD前体蛋白的真核表达载体，在哺乳动物细胞中得到了正确的表达，这两个蛋白在没有完整病毒基因组存在的条件下成功的完成了表达后的加工修饰过程，P1蛋白在3CD蛋白的辅助下成功的裂解为具有正确构象的病毒衣壳蛋白VP1-VP4并成功的组装成为了病毒样颗粒，这个人工构建的病毒样颗粒在接下来的实验中也表现出了较为理想的免疫保护作用。Tung WS等人则构建了含有VP1基因序列的真核表达载体，将其作为DNA疫苗并做了一定的免疫学研究，实验结果表明，在第一次注射这种DNA疫苗后，小鼠体内的抗VP1的IgG出现了明显的升高，但是当第二次注射后，特异性IgG抗体开始下降，这和Cheng-Nan Wu的研究结论是一致的。

虽然有许多的研究人员做了大量的研究，但是目前并没有确切有效的疫苗被应用于EV71的防治。将枯草芽孢杆菌用于表达重组EV71-VP1衣壳蛋白制备粘膜途径疫苗在国内外均未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体，及其制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种含有表达重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的宿主细胞。

本发明的第三个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌EV71-VP表达载体或上述的宿主细胞在制备预防或治疗EV71引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体，载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有EV71病毒的衣壳蛋白VP1的编码基因。

所述载体及EV71病毒的衣壳蛋白VP1的编码基因均为现有技术中已有的，在此不再赘述。

所述的重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及编码序列；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体，测序；

(c)将测序正确的CotB片段双酶切后连接到相同双酶切的pDG1662上，得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)PCR方法扩增肠道病毒71型衣壳蛋白VP1抗原序列；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体，测序；

(c)将测序正确的VP1片段双酶切后连接到相同双酶切的步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-VP1，即为重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体。

详细步骤如下：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的(BGSC NO.1A771株)CotB基因调控序列及编码序列：

PCR扩增的上游引物序列为：5’GAATCCGAGTTTCGCAAGTCCT3’；

下游引物序列为：5’CAAGCTTGGATGATTGATCATCTGAAGATTTT3’；

位置：两端酶切位点分别为EcoR I、HindIII；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、53℃30Sec、75℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体：PCR扩增产物测序正确后分别用EcoRI和HindIII双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR既双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)PCR方法扩增肠道病毒71型衣壳蛋白VP1抗原序列：

上游引物序列为：5’CATACAAAGCTTGATAGGGTGGCAGATGTAAT3’；

下游引物序列为：5’CGCAACGGATCCTCAGTTGGCTTTGAATAGGTAGTT3’；

位置：两端酶切位点分别为HindIII、BamH I；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、52℃30Sec、72℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR产物连接到步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上：PCR产物测序正确后分别用HindIII和BamH I双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR既双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB-VP1，即为重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体；

(3)验证枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体：

(a)扩增上述阳性克隆的大肠杆菌DH5α，试剂盒提取质粒pDG1662-CotB-VP1，NdeI、Xba I双酶切线性化后，电转化枯草芽孢杆菌，转化方法为：

①挑取一环孢子接种于少量生长培养基中，过夜培养种子液；

②将种子以1/16的接种量接种于生长培养基中，37℃摇床震荡培养，至OD600在0.85～0.95；

③冰水浴冷却培养物10min，4℃，5000×g，离心5min收集菌体；

④反复用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞收集物4次；

⑤用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，使得细胞浓度在1～1.3×1010cfu/ml，-80℃保存(不需要液氮预冻)；

⑥转化：转化条件为：60μl感受态细胞+1μl(50ng/μl)DNA混匀并转移到冰冷的电转化杯(1mm gap)中，冰浴1～1.5min后，电击一次；注意：在电压高于20kV/cm的时候，若电击时间常数少于4.2ms，转化效率将急剧下降；这种情况下为了获得较高的转化效率就必须再次用电击缓冲液洗涤或者稀释细胞；

⑦电击完毕之后，立即加入1ml复苏培养基，7℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂氯霉素抗性平板筛选阳性克隆；

(b)提取枯草芽孢杆菌基因组，进行PCR鉴定，以及应用抗生素抗性鉴定质粒与枯草芽孢杆菌基因组是否重组；取PCR鉴定为阳性，且质粒与枯草芽孢杆菌基因组重组者，进行下一步操作；

(c)取上述转化成功的枯草芽孢杆菌，摇菌发酵，37℃培养96h，待枯草芽孢杆菌绝大部分转变成芽孢后，收集芽孢，提取芽孢衣壳蛋白，Western-Blot鉴定目的蛋白是否有效表达。

所述步骤(1)(a)中，扩增的枯草芽胞杆菌为BGSC NO.1A771株。

所述步骤(3)(a)①中的生长培养基为LB+0.5M山梨醇。

所述步骤(3)(a)②中的生长培养基为LB+0.5M山梨醇。

所述步骤(3)(a)④、⑤中的电击缓冲液为：LB+0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油。

所述步骤(3)(a)⑥中的电击条件为：25μF，200Ω，4.5～5.0ms。

所述步骤(3)(a)⑦中的复苏培养基为：LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇。

所述提取芽孢衣壳蛋白的方法为：

①10000g离心10min收集菌体，用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次；

②用10mL SET buffer重悬沉淀，加10mg/mL溶菌酶1mL，37℃孵育1h，10000g离心得沉淀；

③用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次，用decoating buffer(0.1M NaOH 0.1M NaCl10％SDS 0.1M DTT)重悬沉淀，300rpm 70℃孵育1h；

④12000g离心10min，上清即为衣壳蛋白。

所述Western-Blot鉴定目的蛋白是否得到有效表达的方法为：

①50uL蛋白上清加50uL 2×上样缓冲液煮沸5min；

②常规方法制备15％聚丙烯酰胺凝胶后上样，10uL/道；

③80V 20min后120V 45min；

④转硝酸纤维素膜，条件为100mA 3h；

⑤将硝酸纤维素膜用TBST洗3次，5min/次，加1∶100稀释的阳性小鼠血清10mL，37℃孵育1h，轻轻震动；

⑥TBST洗膜3次，5min/次，加1∶5000稀释的酶标二抗10mL，37℃孵育1h，轻轻震动；

⑦TBST洗膜3次，5min/次，加ECL发光底物显色。

一种含有重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的宿主细胞，宿主为枯草芽孢杆菌。

一种预防或治疗EV71引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，该口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是由重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的宿主细胞培养液添加药学上可以接受的辅料或辅助性成分制备而成的。

所述口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂的剂型为口服液、片剂或胶囊剂等常规剂型。

本发明用EV71-VP1重组载体构建重组枯草芽孢杆菌口服疫苗的研究方案是“扬长避短”的一种新尝试，即模拟病毒自然感染之道，研制“保护性抗原重组”疫苗。

本发明中涉及使用的现有核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物即GenBank中检索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或实验手册的基础上完成本发明涉及的分子生物学和细胞生物学试验。

本发明的有益效果如下：

1、安全高效，枯草芽孢杆菌对人类和家畜不致病，是一种食用菌，具有很高的安全性，用它做重组载体活疫苗的表达系统，不存在菌体产生外毒素、无致热源和独立返祖等潜在的治病危险，有利于直接把抗原表达在粘膜淋巴细胞表面而被识别和提呈。该疫苗安全性高，表达抗原肽亚单位没有感染性，还可能发挥粘膜免疫增效剂和辅助治疗作用。

2、模块化研制，模块化组合，可将不同血清型的EV71流行株的VP1克隆到不同的枯草芽孢杆菌中，构建EV71的VP1亚单位疫苗库，当临床上出现不同的EV71流行株时，可根据实际情况，从菌种库中调取相应的VP1亚单位枯草芽孢杆菌疫苗，随时组合出能够有效应对临床需要的疫苗，使EV71亚单位疫苗的研制走向模块化发展道路，改变当前没有有效疫苗的困境。

3、快捷重组，该方案使疫苗研制工作能够及时根据临床流行株的抗原变异而改变疫苗抗原的重组方式，达到以变应变的主动效果，以现有的基因克隆和测序技术，一个星期就可以完成载体的构建工作，使EV71重组口服活疫苗研制的理想方案。

4、经济实惠，口服方便，与重组减毒活疫苗相比，本发明活疫苗发明具有经济适用的特点，发酵产品不需要进一步的纯化，其研制费用低廉，而剂型可使用发酵品或胶囊等剂型，便于儿童服用。

综上所述，本发明枯草芽孢杆菌EV71-VP1重组载体活疫苗效果好，安全性强，使用方便。成本低，具有很好的使用前途。

附图说明

图1为本发明的枯草芽孢杆菌EV71-VP1重组载体的构建示意图。

图2为双酶切鉴定电泳图，其中，A泳道为pDG1662-CotB-VP1质粒酶切前，B泳道为pDG1662-CotB-VP1质粒用BamHI、EcoRI双酶切后。

图3为Western-blot鉴定pDG1662-CotB-VP1重组载体图；其中，A泳道为pDG1662-CotB-VP1重组载体，B泳道为无重组载体对照，由图可见pDG1662-CotB-VP1重组载体成功表达了VP蛋白。

具体实施方式

实施例1构建重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体，并进行验证方法如下：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的(BGSC NO.1A771株)CotB基因调控序列及编码序列：

PCR扩增的上游引物序列为：5’GAATCCGAGTTTCGCAAGTCCT3’；

下游引物序列为：5’CAAGCTTGGATGATTGATCATCTGAAGATTTT3’；

位置：两端酶切位点分别为EcoR I、HindIII；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、53℃30Sec、75℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体(大连宝生物试剂盒)，反应体系为：5μL连接buffer+0.5μL pMD18T载体+4.5μL目的片段；转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增阳性的菌株送测序

(c)测序正确的质粒用EcoR I和HindIII双酶切，电泳回收目的片段，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR既双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)PCR方法扩增肠道病毒71型衣壳蛋白VP1抗原序列：

上游引物序列为：5’CATACAAAGCTTGATAGGGTGGCAGATGTAAT3’；

下游引物序列为：5’CGCAACGGATCCTCAGTTGGCTTTGAATAGGTAGTT3’；

位置：两端酶切位点分别为HindIII、BamH I；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、52℃30Sec、72℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体(大连宝生物试剂盒)，反应体系为：5μL连接buffer+0.5μL pMD18T载体+4.5μL目的片段；转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增阳性的菌株送测序

(c)将EV71VP1基因接到步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上：将上述测序正确的质粒用HindIII和BamH I双酶切，电泳回收目的片段后，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB-VP1，即为重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体；

(3)验证枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体：

(a)扩增上述阳性克隆的大肠杆菌DH5α，试剂盒提取质粒pDG1662-CotB-VP1，NdeI、Xba I双酶切线性化后，电转化枯草芽孢杆菌，转化方法为：

①挑取一环孢子接种于少量生长培养基(LB+0.5M山梨醇)中，过夜培养种子液；

②将种子以1/16的接种量接种于生长培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃摇床震荡培养，至OD600在0.85～0.95；

③冰水浴冷却培养物10min，4℃，5000×g，离心5min收集菌体；

④反复用冰冷的电击缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)洗涤细胞收集物4次；

⑤用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，使得细胞浓度在1～1.3×1010cfu/ml，-80℃保存(不需要液氮预冻)；

⑥转化：转化条件为：60μl感受态细胞+1μl(50ng/μl)DNA混匀并转移到冰冷的电转化杯(1mm gap)中，冰浴1～1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5～5.0ms)；注意：在电压高于20kV/cm的时候，若电击时间常数少于4.2ms，转化效率将急剧下降；这种情况下为了获得较高的转化效率就必须再次用电击缓冲液洗涤或者稀释细胞；

⑦电击完毕之后，立即加入1ml复苏培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，7℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂氯霉素抗性平板筛选阳性克隆；

(b)提取枯草芽孢杆菌基因组，进行PCR鉴定，以及应用抗生素抗性鉴定质粒与枯草芽孢杆菌基因组是否重组；取PCR鉴定为阳性，且质粒与枯草芽孢杆菌基因组重组者，进行下一步操作；

(c)取上述转化成功的枯草芽孢杆菌，摇菌发酵，37℃培养96h，待枯草芽孢杆菌绝大部分转变成芽孢后，收集芽孢，提取芽孢衣壳蛋白，Western-Blot鉴定，目的蛋白得到有效表达，如图3所示。

所述提取芽孢衣壳蛋白的方法为：

①10000g离心10min收集菌体，用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次；

②用10mL SET buffer重悬沉淀，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，37℃孵育1h，得沉淀；

③用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次，用decoating buffer(0.1M NaOH 0.1M NaCl10％SDS 0.1M DTT)重悬沉淀，300rpm 70℃孵育1h；

④12000g离心10min，上清即为衣壳蛋白。

所述Western-Blot鉴定目的蛋白的方法为：

①50uL蛋白上清加50uL 2×上样缓冲液煮沸5min；

②常规方法制备15％聚丙烯酰胺凝胶后上样，10uL/道；

③80V 20min后120V 45min；

④转硝酸纤维素膜，条件为100mA 3h；

⑤将硝酸纤维素膜用TBST洗3次，5min/次，加1∶100稀释的阳性小鼠血清10mL，37℃孵育1h，轻轻震动；

⑥TBST洗膜3次，5min/次，加1∶5000稀释的酶标二抗10mL，37℃孵育1h，轻轻震动；

⑦TBST洗膜3次，5min/次，加ECL发光底物显色。

实施例2

(一)以枯草芽孢杆菌的CotB基因(BSU36050cotB)的启动子及部分编码序列(位置-263～825nt)为载体蛋白与EV71VP1部分编码序列一同连接到整合质粒pDG1662(BGSCAccession：ECE113)amyE基因中间部位。

具体步骤如下：

1.以BGSC  1A771菌株基因组为模板，pfu DNA聚合酶通过PCR扩增获载体蛋白部分编码序列及其启动子。

引物序列如下：

上游：5-AGCGCCGgaattcACGGATTAGGCCGTTTGTCC-3(位置：-263/-244，含EcoRI酶切位点)

下游：5-CAATCATCCaagcttGGATGATTGATCATCTGAAG-3(位置：+806/+825，含HindIII酶切位点)

PCR扩增条件：95℃4min，(95℃30sec、53℃30sec、72℃1min)×30个循环。

结果：获得1088bp的包含CotB启动子及部分编码序列的DNA片段，进行T-A连接，测序正确后记作CotB保存。

2.以EV71基因组为模板扩增EV71 VP1部分编码序列。

引物序列如下：

上游：5-catacaaagcttGATAGGGTGGCAGATGTAAT-3(位置：2441/2460，含HindIII酶切位点)

下游：5-cgcaacggatccTCAGTTGGCTTTGAATAGGTAGTT-3(位置：3265/3245，含BamHI酶切位点及终止密码子)

PCR扩增条件：95℃4min，(95℃30sec、53℃30sec、72℃1min)×30个循环。

结果：获得824bp的EV71VP蛋白编码序列的DNA片段，进行T-A连接，测序正确后记作VP1保存。

用BamHI和EcoRI双酶切pDG1662质粒，EcoRI、HindIII双酶切CotB，BamHI、HindIII双酶切VP1，电泳回收目的片段后连接，转化大肠杆菌DH5α，在氯霉素抗性LB平板上挑取单克隆，摇菌后提取质粒做PCR及双酶切鉴定，阳性克隆命名为pDG1662-CotB-VP1，电泳图如图2所示。

(二)含pDG1662-CotB-VP1重组载体的枯草芽孢杆菌种子菌的制备

转化枯草芽孢杆菌的过程如下：

于第一天上午取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37℃培养箱培养12h。挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃，250rmin培养过夜。第二天上午取160μl培养液转接至8mlSPI培养基中，37℃，250rmin培养至对数生长末期(约4～5h)，取0.2ml培养液至2mlSPII培养基中，37℃，100rmin培养90min，加入20ul 10mmolL EGTA，再于37℃，100rmin培养10分钟。分装成0.5ml每管，加入5ul酶切线性化的目的DNA，再于37℃，250rmin培养90分钟，取菌液涂布氯霉素抗性LB筛选平板，从而获得转EV71 VP1基因的枯草芽孢杆菌，抗生素抗性试验、PCR、SDS-PAGE和Western-blot鉴定后的阳性克隆即为基因组中重组入目的序列的枯草芽孢杆菌种子菌。

(SP盐：0.2％(NH4)2SO4，1.4％K2HPO4，0.6％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.1％柠檬酸钠；SP I培养基：SP盐溶液加入1％体积浓度为50％葡萄糖溶液，1％体积100×CAYE溶液；SPII培养基：SP I培养基加入1％体积50mmol/LCaCl2溶液，1％体积250mmol/L MgCl2溶液)

(三)种子菌的大规模液体接种扩增培养

将(二)构建的枯草芽孢杆菌种子菌复苏后涂布于氯霉素抗性LB平板，37℃培养20h，挑取单一的抗性菌落与抗性培养基中增菌培养，经PCR鉴定VP1阳性的枯草芽孢杆菌再次涂抗性平板，如此反复集中培养至不低于15代时PCR鉴定VP1仍为阳性的克隆作为大规模接种扩增培养的种子菌，保藏备用。

(四)枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-VP1重组载体口服活疫苗制剂的制备及该疫苗的药效试验

1.枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-VP1重组载体口服疫苗具体制备过程如下：

a)配方：将种子液按1∶100接种到氯霉素抗性的LB培养液中，37℃200rpm培养3d，显微镜观察芽孢成率达95％以上时收获菌体。4℃10000g离心15min，用生理盐水洗芽孢3次。用含5％蔗糖，0.5％明胶的磷酸缓冲液稀释芽孢至1.0×10¹¹/ml。可用单批原液或多批原液配置。

b)包装胶囊：按0.5g/支规格进行胶囊包装，4℃保藏，既得。

上述的枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-VP1重组载体口服活疫苗微生物指标：活性枯草芽孢杆菌≥2×10¹⁰cpu/ml，大肠菌群数＜30cfu/100ml，致病菌不得检出。

2.口服活疫苗的药效验证

a)试验分组(24日龄雄性BALB/c小鼠30只，随机分成下述3组)：

疫苗免疫组、无重组载体的枯草芽孢杆菌对照组和生理盐水对照组。

b)BALB/c小鼠灌胃免疫试验(10¹⁰菌/只)：

无重组载体的枯草芽孢杆菌对照组：用不含VP1的pDG1662转化的枯草芽孢杆菌在第0d，1d，2d，3d，11d，12d，13d，21d，22d，23d灌胃；

生理盐水对照组：用生理盐水在第0d，1d，2d，3d，11d，12d，13d，21d，22d，23d灌胃；

疫苗免疫组：用上述枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-VP1重组载体口服活疫苗在第0d，1d，2d，3d，11d，12d，13d，21d，22d，23d灌胃。

第28d后检测VP1特异性抗体和ELISA-POT检测针对VP1特异性细胞免疫反应水平。

3.实验结果：

疫苗免疫组10只(100％)小鼠VP1抗体均为阳性，而无重组载体的枯草芽孢杆菌对照组和生理盐水对照组均为阴性；细胞免疫试验中疫苗免疫组10只(100％)小鼠均产生对VP1特异性细胞免疫，而无重组载体的枯草芽孢杆菌对照组和生理盐水对照组均为阴性。上述结果证明本发明重组口服疫苗对EV71感染有较强的免疫效应。

Claims (9)

1.重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体，其特征在于：载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有EV71病毒的衣壳蛋白VP1的编码基因。

2.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及编码序列；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体，测序；

(c)将测序正确的CotB片段双酶切后连接到相同双酶切的pDG1662上，得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)PCR方法扩增肠道病毒71型衣壳蛋白VP1抗原序列；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体，测序；

(c)将测序正确的VP1片段双酶切后连接到相同双酶切的步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-VP1，即为重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及编码序列：

PCR扩增的上游引物序列为：5’GAATCCGAGTTTCGCAAGTCCT3’；

下游引物序列为：5’CAAGCTTGGATGATTGATCATCTGAAGATTTT3’；

位置：两端酶切位点分别为EcoR I、HindIII；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、53℃30Sec、75℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体：PCR扩增产物测序正确后分别用EcoR I和HindIII双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR既双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)PCR方法扩增肠道病毒71型衣壳蛋白VP1抗原序列：

上游引物序列为：5’CATACAAAGCTTGATAGGGTGGCAGATGTAAT3’；

下游引物序列为：5’CGCAACGGATCCTCAGTTGGCTTTGAATAGGTAGTT3’；

位置：两端酶切位点分别为HindIII、BamH I；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、52℃30Sec、72℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR产物连接到步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上：PCR产物测序正确后分别用HindIII和BamH I双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR既双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB-VP1，即为重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体；

(3)验证枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体：

(a)扩增上述阳性克隆的大肠杆菌DH5α，试剂盒提取质粒pDG1662-CotB-VP1，Nde I、Xba I双酶切线性化后，电转化枯草芽孢杆菌，转化方法为：

①挑取一环孢子接种于生长培养基中，过夜培养种子液；

②将种子以1/16的接种量接种于生长培养基中，37℃摇床震荡培养，至OD600在0.85～0.95；

③冰水浴冷却培养物10min，4℃，5000×g，离心5min收集菌体；

④反复用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞收集物4次；

⑤用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，使得细胞浓度在1～1.3×1010cfu/ml，-80℃保存；

⑥转化：转化条件为：60μl感受态细胞+1μl DNA混匀并转移到冰冷的电转化杯中，冰浴1～1.5min后，电击一次；

⑦电击完毕之后，立即加入1ml复苏培养基，7℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂氯霉素抗性平板筛选阳性克隆；

(b)提取枯草芽孢杆菌基因组，进行PCR鉴定，以及应用抗生素抗性鉴定质粒与枯草芽孢杆菌基因组是否重组；取PCR鉴定为阳性，且质粒与枯草芽孢杆菌基因组重组者，进行下一步操作；

(c)取上述转化成功的枯草芽孢杆菌，摇菌发酵，37℃培养96h，待枯草芽孢杆菌绝大部分转变成芽孢后，收集芽孢，提取芽孢衣壳蛋白，Western-Blot鉴定目的蛋白是否有效表达。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述提取芽孢衣壳蛋白的方法为：

①10000g离心10min收集菌体，用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次；

②用10mL SET buffer重悬沉淀，加10mg/mL溶菌酶1mL，37℃孵育1h，10000g离心得沉淀；

③用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次，用decoating buffer重悬沉淀，300rpm 70℃孵育1h；

④12000g离心10min，上清即为衣壳蛋白。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述Western-Blot鉴定目的蛋白是否得到有效表达的方法为：

①50uL蛋白上清加50uL 2×上样缓冲液煮沸5min；

②常规方法制备15％聚丙烯酰胺凝胶后上样，10uL/道；

③80V 20min后120V 45min；

④转硝酸纤维素膜，条件为100mA 3h；

⑤将硝酸纤维素膜用TBST洗3次，5min/次，加1∶100稀释的阳性小鼠血清10mL，37℃孵育1h，轻轻震动；

⑥TBST洗膜3次，5min/次，加1∶5000稀释的酶标二抗10mL，37℃孵育1h，轻轻震动；

⑦TBST洗膜3次，5min/次，加ECL发光底物显色。

6.一种含有权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的宿主细胞，其特征在于：宿主为枯草芽孢杆菌。

7.权利要求6所述的宿主细胞在制备预防或治疗EV71引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂中的用途。

8.一种预防或治疗EV71引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，其特征在于：是由重组枯草芽孢杆菌EV71-VP1表达载体的宿主细胞培养液添加药学上可以接受的辅料或辅助性成分制备而成的。

9.根据权利要求9所述的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，其特征在于：所述口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂的剂型为口服液、片剂或胶囊剂。

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