CN102703369A - 一种制备ev71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种制备ev71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。所述重组双歧杆菌为转化入含VP1蛋白的载体的重组双歧杆菌，是通过(1)、对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体进行酶切后连接得到pBAD/S载体；(2)、将双链EXS-(His)6-VP1基因插入双酶切后的pBAD/S载体中，转化大肠杆菌后获得阳性克隆pBAD-VP1载体；(3)、将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌，筛选pBAD-VP1转化阳性的双岐杆菌，即得制备治疗EV71疫苗的重组双歧杆菌。本发明制备的益生菌口服疫苗既不需要注射给药，也较为经济，是一种新的预防EV71病毒感染的方式。

Description

一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及重组双歧杆菌，具体涉及一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
手足口病是一种由肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71)引起的常见传染病,被喻于二十一世纪的“脊髓灰质炎”，手足口病主要传染源是带病毒者和轻型散发病例，患者咽喉分泌物、唾液，疱疹液、粪便中均含有病毒，可通过人的消化道、呼吸道和分泌物密切接触等途径传播，其多种的传播途径及目前尚无有效的疫苗预防决定了EV71病毒容易引起暴发性流行，因此开发有效的疫苗是手足口病防治中最为紧迫的问题之一。
EV71病毒是小RNA病毒科肠道属的成员，流行范围遍及全球，1974年Schmidt等首次报道从美国加利福尼亚爆发的神经系统疾病患者中分离得到EV71。EV71核酸为单股正链RNA，基因组编码4个外壳蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4，4个蛋白通过拼装呈原聚体和亚单位，最终形成病毒外壳，VP1、VP2、VP3暴露在病毒表面，VP4则包埋在病毒外壳内侧起连接作用。EV71病毒抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上，其中VP1蛋白集中了重要的T细胞和B细胞免疫表位，具有重要的功能特点，该蛋白是目前疫苗研究的主要靶蛋白。综合多项研究表明VP1蛋白在肠道能够诱导EV71的特异性保护免疫作用，这一结果提示肠道制剂表达VP1蛋白可能能用于EV71感染的免疫预防。
近年通过非致病细菌表达蛋白制备口服疫苗已成为热点研究方向之一。但在EV71上的研究却没有先例。
发明内容
为了解决目前手足口病防治中的问题，本发明公开了一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌。
本发明的第二个目的在于公开了由所述重组双歧杆菌组成的治疗EV71的疫苗。
本发明的第三个目的在于公开了所述重组双歧杆菌的制备方法。
本发明的第四个目的在于公开了所述重组双歧杆菌在制备治疗EV71药物中的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌，其中，所述重组双歧杆菌为转化入外源载体的双歧杆菌，所述外源载体为含VP1蛋白编码序列的载体；本技术方案中的VP1 蛋白编码序列如序列表4所示，所编码的VP1蛋白如序列表5所示。
上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述含VP1蛋白编码序列的载体为pBAD-VP1载体。
上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述pBAD-VP1载体由pBAD/S载体和EXS-(His)6-VP1基因连接组成。
上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述pBAD/S载体由pBAD/gIII和重组双链E.SOD序列连接组成。
上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述重组双链E.SOD序列由T7启动子和双链E.SOD序列的编码序列组成，其序列如序列表1所示。
一种治疗EV71的疫苗，所述疫苗包括活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述活性成分为上述技术方案中任一技术方案所述的重组双歧杆菌。
一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌的制备方法，包括下述步骤：
(1)、对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体分别进行酶切，用连接酶将重组双链E.SOD序列连接入双酶切后的pBAD/gIII载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，测序鉴定，得到pBAD/S载体；所述重组双链E.SOD序列由T7启动子和双链E.SOD序列的编码序列组成；
(2)、人工合成双链EXS-(His)6-VP1基因，对pBAD/S载体进行双酶切，将双链EXS-(His)6-VP1基因插入双酶切后的pBAD/S载体中，转化大肠杆菌后获得阳性克隆pBAD-VP1载体；
(3)、将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌，筛选pBAD-VP1转化阳性的双岐杆菌，即得制备治疗EV71疫苗的重组双歧杆菌。
上述技术方案中所述的制备方法，其中，步骤(1)中对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体分别用BstI1071酶进行酶切，用T4连接酶进行连接；步骤(2)中对pBAD/S载体用BpiI酶和XbaI酶进行双酶切，用T4连接酶进行连接。
上述技术方案中所述的制备方法，其中，将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌后用含氨苄西林的MRS 固体培养基进行筛选。
上述技术方案中所述的重组双歧杆菌在制备治疗EV71药物中的应用。
本发明中，在构建的载体中加入E.SOD基因，使双歧杆菌能够较好的耐受一定程度的缺氧，增加其体外生存期；在表达蛋白前面插入了EXS基因序列，该序列不但自身能够在双歧杆菌中启动转录，而且因为含有信号肽序列可使蛋白更好的分泌到胞外，有利于细菌产生的靶蛋白更好的产生生物学效应。
本发明具有的有益效果为：本发明提示以肠道作为生物反应器，以双岐杆菌为携带VP1蛋白表达载体，构建双岐杆菌表达VP1蛋白的EV71口服疫苗，通过口服该益生菌疫苗在肠道内生长繁殖的同时高效表达VP1蛋白，肠道内VP1蛋白的局部累积刺激和吸收有望能够诱导宿主体内产生针对VP1特异的免疫反应，从而产生EV 71型的中和抗体保护宿主从而发挥预防EV71感染的作用。这一方法制备的益生菌口服疫苗既不需要注射给药，也较为经济，是一种新的预防EV71病毒感染的方式。
附图说明
图1为pBAD-VP1载体构建过程示意图。
图2为本发明构建的pBAD-VP1载体结构示意图。
图3为木聚糖酶启动子核心序列分析。
图4为EXS包含的双歧杆菌糖苷酶信号肽序列氨基酸生物信息学分析图。
图5为Western blot 分析0.2%木糖诱导pBAD-VP1转化双歧杆菌VP1蛋白表达情况。
图6为小鼠脾脏中分离单个核细胞VP1蛋白刺激后IFN-γ浓度。
图7为小鼠脾脏中分离单个核细胞VP1蛋白刺激后TNF-α浓度。
图8为小鼠肠道prey’s pathes中分离单个核细胞VP1蛋白刺激后IFN-γ浓度。
图9为小鼠肠道prey’s pathes中分离单个核细胞VP1蛋白刺激后TNF-α浓度。
图10为pBAD/S载体构建酶切鉴定图。
图11为pBAD-VP1载体构建酶切鉴定图。
图12为pBAD-VP1载体转化双歧杆菌阳性克隆提取质粒酶切鉴定结果。
具体实施方式
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
以下实施例和试验例中除特别说明外，所用试剂和实验方法均为本领域常用技术方法和材料。
实施例一： 制备EV71疫苗的重组双歧杆菌的制备：
如图1和图2所示的本发明具体的方法为：
(1)、构建双歧杆菌内高效表达质粒：
以pBAD/gIIIA载体(购于Invitrogen公司) 为骨架基础，人工合成重组E. SOD (大肠杆菌过氧化酶歧化酶的基因序列[E.SOD: 序列为E.coli Mn-superoxide dismutase gene (GenBank: X03951.1)])序列的正链和负链(上海英俊公司合成)，合成的E.SOD正链和负链双侧带有BstI1071酶切位(正链序列见如序列表1 所示)，在PCR仪（ABI9700）中进行“94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，30秒”一个循环变为含BstI1071酶切位的双链E.SOD基因；
采用BstI1071酶切位点酶切pBAD/gIII载体，37℃水浴箱酶切5h，1%琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购于大连宝生物公司）回收BstI1071酶切后的pBAD/gIII基因片段；
采用T4连接酶（购于大连宝生物公司）在16℃的水浴箱中孵育4h将含BstI1071酶切位点的重组双链E.SOD序列连接入BstI1071酶切后的pBAD/gIII基因片段，即将连接产物转化大肠杆菌DH5α（购于大连宝生物），连接产物加入DH5α后冰上放置0.5h，42℃的水浴箱中30秒，冰上放置15秒,加入1mlLB培养液震荡培养1h，取200ul培养液涂于LB培养板，37度过夜培养后挑取阳性克隆入1ml的LB培养液中震荡培养4h，待菌液混浊后采用Qiagen质粒小提试剂盒提取质粒进一步酶切鉴定(酶切结果见后图10，图10为pBAD/S载体构建酶切鉴定图，pBAD/S载体采用BstI1071酶切后琼脂糖电泳鉴定，左侧为pBAD/S载体酶切后结果，右侧为Marker)和测序鉴定(送上海英俊公司测序)获得的pBAD/S载体(在pBAD/gIII载体中插入双链E.SOD序列)；插入E.SOD序列的pBAD/S载体转化双歧杆菌后可表达E.SOD,该蛋白可提高双歧杆菌的抗氧能力,有利于细菌在微厌氧的环境下生长和定植；
(2)、对获得的pBAD/S载体采用BpiI和XbaI双酶切，37℃，4h水浴箱孵育，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购于大连宝生物公司）回收BpiI和XbaI双酶切后的pBAD/S载体备用；
在上海英俊生物公司人工合成带有双酶切位点BpiI和XbaI的 EXS-(His)6-VP1基因正链和负链序列，EXS序列如序列表3所示包含有胞外外切木聚糖酶启动子核心序列(第575—624位)和双歧杆菌糖苷酶信号肽对应的核苷酸序列，VP1蛋白的编码序列来源于GENBANK (NO. FJ607334.1)，对应的序列如后序列表4所示，编码的蛋白序列如需列表5所示；(His)6对应的核苷酸序列为CACCACCACCACCACCAC。对合成的EXS-(His)6-VP1基因正链和负链基因在PCR仪（ABI9700）中进行“94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，30秒”一个循环的反应变为含双酶切位点BpiI和XbaI的双链 EXS-(His)6-VP1基因；
采用T4连接酶（购于大连宝生物公司）在16℃的水浴箱中孵育4h将含含双酶切位点BpiI和XbaI的双链 EXS-(His)6-VP1基因连接入BpiI和XbaI双酶切后的pBAD/S载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α（购于大连宝生物公司），即连接产物加入DH5α后冰上放置0.5h，42℃的水浴箱中30秒，冰上放置15秒,加入1mlLB培养液震荡培养1h，取200ul培养液涂于LB培养板，37度过夜培养后挑取阳性克隆加入1ml的LB培养液中震荡培养4h，待菌液混浊后采用Qiagen质粒小提试剂盒提取质粒进一步酶切鉴定(酶切结果见后图11，图11为pBAD-VP1载体构建酶切鉴定图，pBAD-VP1载体采用BpiI和XbaI双酶切后琼脂糖电泳鉴定，左侧lane1,2为pBAD-VP1载体酶切后结果，右侧lane3为Marker)和测序鉴定(送上海英俊公司测序)获得的pBAD-VP1载体(在pBAD/S载体中插入双链EXS-(His)6-VP1基因序列)；
EXS序列包含有胞外外切木聚糖酶启动子核心序列和双歧杆菌糖苷酶信号肽对应的核苷酸序列（如序列表3）。胞外外切木聚糖酶启动子（pubmed编号：GenBank: AY263380.1），采用NNPPversion2.2（http://www.fruitfly.org/seq tools/ promoter. html）进行分析，分析结果见后图3，其中nt575-624为启动子核心功能区域，因此EXS片段包含的胞外外切木聚糖酶启动子核心序列为该片段(序列表3中第1-50位)；载体的开放读码框插入木聚糖启动子核心片段有利于靶基因在木聚糖的刺激下表达靶蛋白，因为木糖为可食用的糖类，这样我们在制备口服制剂的时候在双歧杆菌混悬液中可加入木糖口服有利于增加双歧杆菌蛋白的表达量。如图4所示的双歧杆菌糖苷酶信号肽生物信息学分析结果，双歧杆菌糖苷酶的氨基酸序列（GenBank AAN24037.1），采用生物信息学分析软件SignalIP-NN prediction分析该序列提示其信号肽为AA1-30, 双歧杆菌糖苷酶信号肽是来源于双歧杆菌中的蛋白序列，该分析同时提示这一信号肽可介导靶蛋白从双歧杆菌内分泌到胞外发挥生理学效应，信号肽对应的核苷酸序列如序列表3中第51-140位。
(3)双歧杆菌BZWZO306感受态细胞的制备:
a.将鉴定保存的双歧杆菌BZWZO306单菌落菌种约 50μl加入5ml改良MRS液体培养基(含0.05%Cysteine·HCl)中，放入厌氧盒；
b.在厌氧盒中放入厌氧发生剂和厌氧指示条，密封厌氧盒，然后把厌氧盒置于37℃恒温箱中过夜培养72小时；
c.菌液变混浊，估计0D696值达0.6时，吸取菌液 50μl加入5ml MRS培养基(含0.05%Cysteine·HCI和 0.5MSucrose)中，置于厌氧盒中37℃过夜培养24小时；
d.上述培养菌以1:25稀释在新鲜的MRS培养基(含0.05%Cysteine·HCl和 0.5MSucrose中，在37℃厌氧箱中摇菌至OD696值为0.2；
e.细菌培养液冰上放置10分钟，于4℃，10000转/分钟离心1分钟，弃去上清夜，保留沉淀；
f.用0.5M浓度的无菌蔗糖（buffered surose）溶液清洗沉淀2次；
g.用原始体积(步骤2中的体积)的1/250的冰预冷 的0.5M buffered surose重悬细胞，置于4℃冰箱保存备用；
(4)双歧杆菌BZWZ0306的电转化: 
a.把约0.5-1.5μg的质粒pBAD-VP1载体加入上述预冷的含有 80μl双歧杆菌BZWZ0306感受态细胞悬液中；
b.置于冰上5分钟，然后转移到电击杯中；
c.电击条件:电压 2.5kV,电容 25pF,电阻200Q持续时间3-4秒；
d.电击完后，迅速将上述菌液稀释在 800μl新鲜的改良MRSs培养基(含 0.05%Cysteine·HCl和 0.5MSuerose)中；
e.置于厌氧盒中，放在37℃恒温箱内厌氧培养2.5小时，使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗性基因；
f.然后涂在改良MRSS琼脂培养基平板 (1.5%，WIV，含0.05%eysteine·HCl+100mg/ml氨苄青霉素)上，置于厌氧盒内，放在37℃恒温箱内厌氧培养48-72小时，挑取乳白色、圆形边缘光滑完整的菌落，接种于液体MRS 培养基中，37 ℃厌氧培养。细菌密度6×106 时，做革兰氏染色，显微镜下观察。筛选pBAD-VP1转化阳性的双岐杆菌克隆，采用MRS液体培养基扩增培养阳性克隆；
(5)、对MRS扩增培养阳性的细菌培养液采用质粒提取试剂盒（购于Qiagen公司）提取质粒，采用BpiI和XbaI双酶切鉴定pBAD-VP1转化双岐杆菌后的阳性克隆(酶切结果见后图12，图12为pBAD-VP1载体转化双歧杆菌阳性克隆提取质粒酶切鉴定结果。pBAD-VP1载体采用BpiI和XbaI双酶切后琼脂糖电泳鉴定，左侧5,2为pBAD-VP1载体酶切后结果，右侧L为Marker)，获得pBAD-VP1转化阳性的双岐杆菌克隆。
（6）将pBAD-VP1转化双岐杆菌后的阳性克隆加入到体外含MRS培养基中厌氧箱中培养，在MRS 培养基OD696值为0.5时加入0.2%木糖诱导蛋白表达，采用常规Western blot检测双歧杆菌细胞裂解液中的VP1蛋白。筛选具有较好VP1蛋白表达的重组双岐杆菌即为表达VP1蛋白的重组双岐杆菌，该重组菌口服后可在肠道表达VP1蛋白，刺激小鼠产生VP1抗体，从而保护小鼠被EV71感染，是一种潜在的EV71口服疫苗。
以下通过具体试验例来说明本发明重组双岐杆菌表达VP1蛋白制备的EV71疫苗在小鼠体内产生较好的应用效果。
试验例一： 重组双岐杆菌表达VP1蛋白制备的EV71疫苗在小鼠体内产生较好的应用效果
(1)、体外扩增pBAD-VP1重组双歧杆菌(将pBAD-VP1转化入双歧杆菌后的产物)，木糖诱导靶蛋白VP1蛋白表达，0.2%木糖可较好的诱导该重组菌表达靶蛋白，如附图5所示，图5为pBAD-VP1重组双歧杆菌VP1蛋白表达Western blot检测结果。0.2木糖诱导该重组菌表达靶蛋白，其中lanes 1-5 代表诱导6 h, 12 h ，18h，24h，48h后VP1蛋白表达情况，lanes 6为阴性对照。
将pBAD-VP1重组双歧杆菌厌氧37℃环境置于改良Briggs肉汤培养至生长对数期，继续孵化6h后转移至MRS液体培养基中培养24-48h。4℃ 4000转/min离心，收集沉淀并用含有0.2%L-木糖的MRS溶解并稀释至2.5×107 - 3.0×107/mL。取10μL菌悬浊液接种至含有100μg/L氨苄西林的BL琼脂平板上厌氧环境培养24h后计菌落数，以证明MRS中活菌数量、对照组采用转化pBAD-GFP载体的重组双岐杆菌，另设口服Saline组；另重组表达VP1蛋白，与佐剂同时肌注小鼠，比较口服重组双岐杆菌和肌注VP1蛋白后小鼠的免疫指标变化。 
(2)、重组双歧杆菌的免疫小鼠方法和标本获取：
将按实验室标准喂养的4-6周的Balb/c小鼠随机分成四组，10只/组。BVP1组口服pBAD-VP1重组双岐杆菌，GFP组口服pBAD-GFP重组双岐杆菌，Saline组口服生理盐水，VP1组予肌注大肠杆菌纯化的VP1蛋白(0.5μg/只)和福氏佐剂。小鼠喂药通过连接有钢饲管并有精确刻度的注射器，喂药时均通过小鼠食管。分别在首次免疫后第2周和第4周加强免疫一次，在对2周、4周、8周和12周剪尾取血，用于检测中和抗体滴度和VP1特异性抗体滴度；首次免疫后第12周处死小鼠，收集小鼠脾脏和肠道Prey’s pathes淋巴结（PPs），分离单个核细胞，VP1蛋白刺激小鼠脾脏单个核淋巴细胞，检测上清细胞因子IFN-γ和TNF-α滴度，比较各组之间Th1（IFN-γ和TNF-α）细胞因子之间表达差别。
(3)、重组长双歧杆菌的免疫小鼠方法和标本结果分析：
分析表达VP1蛋白重组双岐杆菌对小鼠的免疫反应均表明这一重组菌具备制备EV71疫苗的潜力：
①、BVP1组的血清EV71病毒中和抗体滴度明显，仅略差于肌注VP1蛋白组(表1和表2中的VP1)，结果见表1，提示这一重组菌可刺激宿主产生EV71中和抗体保护宿主免于感染；
表1    各组免疫小鼠中和抗体滴度检测结果
Figure 418026DEST_PATH_IMAGE002
 注： 括号中为每组对应的滴度的小鼠比例；检测方法为CPE（cytopathogenic effect）
②、BVP1组的血清VP1中和抗体滴度明显，结果见附表2，提示这一重组菌可刺激宿主产生EV71VP1抗体保护宿主免于感染；
表2   各组免疫小鼠VP1中和抗体滴度检测结果(OD450) 
  2W 4W 8W 12W
VP1 0.20±0.06 0.34±0.07 0.45±0.10 0.33±0.12
BVP1 0.14±0.05 0.30±0.05 0.39±0.09 0.30±0.07
 ③ BVP1组脾脏和肠道淋巴结单个核细胞在VP1蛋白刺激下均能明显表达Th1细胞因子，BVP1组脾脏和肠道单个核细胞中Th1细胞因子显著高于GFP组和Saline组，提示该重组菌可刺激宿主保持Th1细胞因子的优势表达，有利于抵御病毒感染；其中肠道淋巴结Th1细胞因子水平高于肌注VP1组，提示可能对于肠道来源的病原体EV71高于肌注的效果。结果见图6、图7、图8和图9，其中图6-9中**表示versus B-VP1 group, P<0.01，提示这一重组菌可刺激宿主产生保护宿主免于感染的免疫因子；其中图6为脾脏单个核细胞在VP1蛋白刺激IFN-γ表达情况，该图提示BVP1组脾脏单个核细胞培养IFN-γ表达水平高于对照组（GFP组合Saline组），低于肌注VP1组。**表示versus B-VP1 group, P<0.01；图7为脾脏单个核细胞在VP1蛋白刺激TNF-α表达情况，该图提示BVP1组脾脏单个核细胞培养TNF-α表达水平高于对照组（GFP组合Saline组），低于肌注VP1组。**表示versus B-VP1 group, P<0.01；图8为肠道淋巴结（PPs）单个核细胞在VP1蛋白刺激IFN-γ表达情况，该图提示BVP1组脾脏单个核细胞培养IFN-γ表达水平高于对照组（GFP组合Saline组）和肌注VP1组，提示对于肠道的刺激可能口服双歧杆菌免疫效果更佳。**表示versus B-VP1 group, P<0.01；图9为肠道淋巴结（PPs）单个核细胞在VP1蛋白刺激TNF-α表达情况，该图提示BVP1组脾脏单个核细胞培养TNF-α表达水平高于对照组（GFP组合Saline组）和肌注VP1组，提示对于肠道的刺激可能口服双歧杆菌效果更佳。**表示versus B-VP1 group, P<0.01。
(4)、表达VP1蛋白的重组双歧杆菌保护幼鼠免于EV71病毒感染的结果：
对Babl/c母鼠口服表达VP1蛋白的重组双岐杆菌(pBAD-VP1重组双歧杆菌)，2周时对母鼠进行交配，怀孕后在第2周和第4周再次增强免疫母鼠，新生的幼鼠给予EV71病毒感染，可以观察到与对照组相比，第1周和第2周感染EV71病毒的对照组(口服pBAD载体转化重组双岐杆菌组)存活率为0，而口服表达VP1蛋白的重组双岐杆菌组母鼠出生的小鼠生存率为83%和89%，提示新生小鼠对EV71具有较好的抵抗力，结果见表3。
表3   表达VP1双歧杆菌对幼鼠EV71感染保护实验结果。
Figure 2012101719751100002DEST_PATH_IMAGE004
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
  SEQUENCE LISTING
 
<110> 邓启文 余治健 曾位森
 
<120>  一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用
 
<130> 
 
<160>  5    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  640
<212>  DNA
<213>  重组双链E.SOD序列
 
 
<220>
<221>  CDS
<222>  (20)..(640)
 
<400>  1
taatacgact cactatagg atg agc tat acc ctg cca tcc ctg ccg tat gct        52
                     Met Ser Tyr Thr Leu Pro Ser Leu Pro Tyr Ala         
                     1               5                   10              
 
tac gat gcc ctg gaa ccg cac ttc gat aag cag acc atg gaa atc cac        100
Tyr Asp Ala Leu Glu Pro His Phe Asp Lys Gln Thr Met Glu Ile His          
            15                  20                  25                   
 
cac acc aaa cac cat cag acc tac gta aac aac gcc aac gcg gcg ctg        148
His Thr Lys His His Gln Thr Tyr Val Asn Asn Ala Asn Ala Ala Leu          
        30                  35                  40                       
 
gaa agc ctg cca gaa ttt gcc aac ctg ccg gtt gaa gag ctg att acc        196
Glu Ser Leu Pro Glu Phe Ala Asn Leu Pro Val Glu Glu Leu Ile Thr          
    45                  50                  55                           
 
aaa ctg gac cag ctg cca gca gac aag aaa acc gta ctg cgc aac aac        244
Lys Leu Asp Gln Leu Pro Ala Asp Lys Lys Thr Val Leu Arg Asn Asn          
60                  65                  70                  75           
 
gct ggc ggt cac gct aac cac agc ctg ttc tgg aaa ggt ctg aaa aaa        292
Ala Gly Gly His Ala Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Gly Leu Lys Lys          
                80                  85                  90               
 
ggc acc acc ctg cag ggt gac ctg aaa gcg gct atc gaa cgt gac ttc        340
Gly Thr Thr Leu Gln Gly Asp Leu Lys Ala Ala Ile Glu Arg Asp Phe          
            95                  100                 105                   
 
ggc tcc gtt gat aac ttc aaa gca gaa ttt gaa aaa gcg gca gct tcc        388
Gly Ser Val Asp Asn Phe Lys Ala Glu Phe Glu Lys Ala Ala Ala Ser          
        110                 115                 120                      
 
cgc ttt ggt tcc ggc tgg gca tgg ctg gtg ctg aaa ggc gat aaa ctg        436
Arg Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Leu Lys Gly Asp Lys Leu          
    125                 130                 135                          
 
gcg gtg gtt tct act gct aac cag gat tct ccg ctg atg ggt gaa gct        484
Ala Val Val Ser Thr Ala Asn Gln Asp Ser Pro Leu Met Gly Glu Ala          
140                 145                 150                 155          
 
att tct ggc gct tcc ggc ttc ccg att atg ggc ctg gat gtg tgg gaa        532
Ile Ser Gly Ala Ser Gly Phe Pro Ile Met Gly Leu Asp Val Trp Glu          
                160                 165                 170              
 
cat gct tac tac ctg aaa ttc cag aac cgc cgt ccg gac tac att aaa        580
His Ala Tyr Tyr Leu Lys Phe Gln Asn Arg Arg Pro Asp Tyr Ile Lys          
            175                 180                 185                  
 
gag ttc tgg aac gtg gtg aac tgg gac gaa gca gcg gca cgt ttt gcg        628
Glu Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Asp Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala          
        190                 195                 200                      
 
gcg aaa aaa taa                                                        640
Ala Lys Lys                                                              
    205                                                                   
 
 
<210>  2
<211>  206
<212>  PRT
<213>  重组双链E.SOD序列
 
<400>  2
 
Met Ser Tyr Thr Leu Pro Ser Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu
1               5                   10                  15     
 
Pro His Phe Asp Lys Gln Thr Met Glu Ile His His Thr Lys His His
            20                  25                  30         
 
Gln Thr Tyr Val Asn Asn Ala Asn Ala Ala Leu Glu Ser Leu Pro Glu
        35                  40                  45              
 
Phe Ala Asn Leu Pro Val Glu Glu Leu Ile Thr Lys Leu Asp Gln Leu
    50                  55                  60                 
 
Pro Ala Asp Lys Lys Thr Val Leu Arg Asn Asn Ala Gly Gly His Ala
65                  70                  75                  80 
 
Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Gly Leu Lys Lys Gly Thr Thr Leu Gln
                85                  90                  95     
 
Gly Asp Leu Lys Ala Ala Ile Glu Arg Asp Phe Gly Ser Val Asp Asn
            100                 105                 110        
 
Phe Lys Ala Glu Phe Glu Lys Ala Ala Ala Ser Arg Phe Gly Ser Gly
        115                 120                 125            
 
Trp Ala Trp Leu Val Leu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Val Val Ser Thr
    130                 135                 140                
 
Ala Asn Gln Asp Ser Pro Leu Met Gly Glu Ala Ile Ser Gly Ala Ser
145                 150                 155                 160
 
Gly Phe Pro Ile Met Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu
                165                 170                 175    
 
Lys Phe Gln Asn Arg Arg Pro Asp Tyr Ile Lys Glu Phe Trp Asn Val
            180                 185                 190        
 
Val Asn Trp Asp Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala Ala Lys Lys
        195                 200                 205    
 
 
<210>  3
<211>  140
<212>  DNA
<213>  EXS序列
 
<220>
<221>  sig_peptide
<222>  (51)..(140)
 
<400>  3
agaaacgtcg aatcggttgt acactcggag cattttgggg taacttgttg atgactttaa       60
 
ccggtacatt gcgtaaagct tttgccatga ctcttgcagc ggctatgctc attggcaccc      120
 
tagccggatg ttcttcggca                                                  140
 
 
<210>  4
<211>  891
<212>  DNA
<213>  VP1蛋白编码序列
 
 
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(891)
 
<400>  4
gga gat agg gtg gca gat gta att gaa agt tcc ata gga gac agt gtg         48
Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val          
1               5                   10                  15               
 
agt aga gcc ctc act caa gct cta ccg gca ccc aca ggt cag aac aca         96
Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr          
            20                  25                  30                   
 
cag gtg agc agt cat cga ttg gac aca ggt aag gtt cca gca ctc caa        144
Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu Gln          
        35                  40                  45                       
 
gct gct gaa att gga gca tca tca aat gct agt gat gag agc atg att        192
Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile          
    50                  55                  60                           
 
gag aca cgc tgt gtt ctt aac tcg cac agc aca gct gag acc acc ctc        240
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu          
65                  70                  75                  80           
 
gat agc ttc ttc agc aga gcg gga tta gtt gga gag ata gat ctc cct        288
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro          
                85                  90                  95                
 
ctt gaa ggc aca act aac cca aat ggt tat gct aac tgg gac ata gat        336
Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp          
            100                 105                 110                  
 
ata aca ggt tac gcg caa atg cgc aga aag gtg gag cta ttc acc tac        384
Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr          
        115                 120                 125                      
 
atg cgc ttt gat gca gag ttc act ttt gtt gcg tgc aca ccc acc ggg        432
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly          
    130                 135                 140                          
 
gaa gtt gtc cct caa ttg ctc caa tat atg ttt gtc cca cct ggg gcc        480
Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala          
145                 150                 155                 160          
 
ccc aag cca gat tcc agg gaa tcc ctc gca tgg caa act gcc acc aac        528
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn          
                165                 170                 175              
 
ccc tca gtt ttt gtt aag ctg tca gac cct cca gca cag gtt tca gta        576
Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val           
            180                 185                 190                  
 
cca ttc atg tca cct gcg agt gct tat caa tgg ttt tat gac gga tat        624
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr          
        195                 200                 205                      
 
ccc aca ttc ggg gaa cac aaa cag gag aaa gat ctt gaa tat ggg gca        672
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala          
    210                 215                 220                           
 
tgt cct aac aac atg atg ggc acg ttc tca gtg cgg act gta gga acc        720
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr          
225                 230                 235                 240          
 
tcc aag tcc aag tac cct tta gtg gtt agg att tac atg aga atg aag        768
Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys          
                245                 250                 255              
 
cac gtc agg gcg tgg ata cct cgc ccg atg cgc aac caa aac tac ttg        816
His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu          
            260                 265                 270                  
 
ttc aaa gcc aac cca aat tat gct ggc aac tcc att aag cca act ggt        864
Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly          
        275                 280                 285                      
 
gcc agt cgc acg gcg atc act act ctt                                    891
Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu                                      
    290                 295                                              
 
 
<210>  5
<211>  297
<212>  PRT
<213>  VP1蛋白编码序列
 
<400>  5
 
Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val
1               5                   10                  15     
 
Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr
            20                  25                  30         
 
Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu Gln
        35                  40                  45             
 
Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile
    50                  55                  60                 
 
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu
65                  70                  75                  80 
 
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro
                85                  90                  95     
 
Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp
            100                 105                 110        
 
Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr
        115                 120                 125            
 
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly
    130                 135                 140                
 
Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala
145                 150                 155                 160
 
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn
                165                 170                 175    
 
Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val
            180                 185                 190        
 
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr
        195                 200                 205            
 
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala
    210                 215                 220                 
 
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Thr
225                 230                 235                 240
 
Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys
                245                 250                 255    
 
His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu
            260                 265                 270        
 
Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly
        275                 280                 285            
 
Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu
    290                 295        

Claims (10)

1.一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌，其特征在于：所述重组双歧杆菌为转化入外源载体的双歧杆菌，所述外源载体为含VP1蛋白编码序列的载体。
2.根据权利要求1所述的重组双歧杆菌，其特征在于：所述含VP1蛋白编码序列的载体为pBAD-VP1载体。
3.根据权利要求2所述的重组双歧杆菌，其特征在于：所述pBAD-VP1载体由pBAD/S载体和EXS-(His)6-VP1基因连接组成。
4.根据权利要求3所述的重组双歧杆菌，其特征在于：所述pBAD/S载体由pBAD/gIII和重组双链E.SOD序列连接组成。
5.根据权利要求4所述的重组双歧杆菌，其特征在于：所述重组双链E.SOD序列由T7启动子和双链E.SOD序列的编码序列组成，其序列如序列表1所示。
6.一种治疗EV71的疫苗，所述疫苗包括活性成分和药学上可接受的载体，其特征在于：所述活性成分为权利要求1～5中任一权利要求所述的重组双歧杆菌。
7.一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌的制备方法，包括下述步骤：
(1)、对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体分别进行酶切，用连接酶将双链E.SOD序列连接入双酶切后的pBAD/gIII载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，测序鉴定，得到pBAD/S载体；所述重组双链E.SOD序列由T7启动子和双链E.SOD序列的编码序列组成；
(2)、人工合成双链EXS-(His)6-VP1基因，对pBAD/S载体进行双酶切，将双链EXS-(His)6-VP1基因插入双酶切后的pBAD/S载体中，转化大肠杆菌后获得阳性克隆pBAD-VP1载体；
(3)、将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌，筛选pBAD-VP1转化阳性的双岐杆菌，即得制备治疗EV71疫苗的重组双歧杆菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体分别用BstI1071酶进行酶切，用T4连接酶进行连接；步骤(2)中对pBAD/S载体用BpiI酶和XbaI酶进行双酶切，用T4连接酶进行连接。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌后用含氨苄西林的MRS 固体培养基进行筛选。
10.权利要求1-5中任一权利要求所述的重组双歧杆菌在制备治疗EV71药物中的应用。
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