CN101237778A - 编码超氧化物歧化酶的aav载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码超氧化物歧化酶(SOD)的腺相关病毒(AAV)载体，所述编码SOD的AAV载体(AAV－SOD)可能用于传递SOD基因到目标细胞。目标细胞可能位于患有疾病或状况的个体中，SOD传递到目标细胞在这些个体上提供了治疗的益处和/或治疗效果。在另一方面，本发明涉及筛选有效治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)症的化合物的模型系统。所述模型系统可能包含用编码SOD基因的AAV载体转导的多个细胞；被转导的细胞可能显示ALS相关的表型变化。本发明的模型系统可能会用来筛选能有效治疗ALS的化合物。

Description

编码超氧化物歧化酶的AAV载体

根据35U.S.C.§119(e)规定，本申请要求申请日期为2005年7月7日的美国临时申请No.60/697,450的优先权，该申请的内容引入本文作为文献。

技术领域

本发明涉及用于筛选能有效治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的化合物的体外模型。本发明也涉及基因治疗载体和方法。

背景技术

神经退行性疾病呈现了主要的公共健康问题。例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)是涉及运动神经元选择性灭绝的无情的进行性致死疾病。关于ALS的进一步的情况能在Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)进入号#105400和Rowland and Shneider(2001)Amyotrophiclateral sclerosis，New Eng.J.Med.344：1688-1700中找到，其全部内容引入本文作为文献。

编码超氧化物歧化酶(SOD)基因的突变同ALS相关。已知在哺乳动物中存在3种SOD突变体。胞质SOD是被SOD1编码的铜锌酶(Cu/Zn SOD)(Weisiger and Fridovich(1973)J.Biol.Chem.248，4793-4796)。正如下文讨论的，SOD1遗传缺陷同家族性肌萎缩性侧索硬化(fALS)相关。线粒体SOD(MnSOD)同锰元素相关并被SOD2编码。Li et al((1995)Nature Genetics 11，376-381)描述了编码SOD2的基因被灭活的突变小鼠。被SOD3编码(Carlsson et al.(1995)Proc.Natl.Acad.ScL USA 92，6264-6268)并且也含有铜和锌的第三种哺乳动物SOD主要位于胞外。该基因的灭活导致不明显的表型。

大约20％的fALS同SOD1基因的突变有关(Julien，J.P.，Cell(2001)104：581-591)。过表达突变SOD1基因(甘氨酸93突变成丙氨酸(G93A))的转基因鼠产生了具有许多fALS临床和病理特征的显性遗传的成年麻痹紊乱症(Gurney et al.，Science(1994)264：1772-1775)。然而，截至目前，导致ALS和大多数运动神经元疾病的运动神经元退化的分子机制依然所知甚少，并且，当前并没有能用来预防或治疗ALS的方法。

筛选能有效治疗ALS的化合物的方法是无效率和费力的，这妨碍了药物的发现。尽管上面讨论的ALS转基因鼠代表了评价候选化合物功效的有用的体内方法，但是用小鼠进行的试验相对昂贵、耗时并且不能很好适用于高通量筛选。其他实验依赖于不充足且不易受受控实验操作控制的死后人类标本中基因表达的研究。

ALS有效的体外模型将促进潜在治疗性化合物的快速筛选。证明在体外具有有益效果的化合物然后能用附加实验进一步进行验证，例如使用上面讨论的转基因鼠。然而，现存的体外方法不适合高通量筛选。例如，在一个方法中，原代培养物中的单个细胞用编码突变SOD1基因(例如G93A)的质粒进行微注射来模拟ALS中相同突变基因过表达造成的效应。这样的细胞然后能用目标化合物处理来确定该化合物能否逆转与SOD1过表达相关的诸如聚集物或包涵体形成的表型效应。然而，微注射是费力的并且仅能在有限数目的细胞上进行操作，这使获得统计学上稳健的结果变得困难。

对筛选能有效逆转或改善ALS效应的化合物的模型系统的需求是存在，所述模型应该能用于高通量筛选并且支持具有统计学显著数目的细胞的评价来确定目的化合物的功效。

野生型SOD(非突变体)可能是有效的治疗性试剂。大量的紊乱是氧化性应激，即细胞中诸如超氧化物等有害活性氧存在的结果。参见例如，Cash et al.(2004)Med.CheO.Rev.1：19-23。超氧化物歧化酶催化超氧化物到过氧化氢和分子氧的转变。被SOD产生的过氧化氢随后被过氧化氢酶转变成分子氧和水，完成了超氧化物到更低反应性并因此具有更少伤害性的氧形式的转变。

诸如维生素A、维生素C、谷胱甘肽、维生素E、胡萝卜素、硫辛酸和辅酶Q₁₀的抗氧化剂能被给予来降低这样的活性氧的产生和积累，但是，当全身性给予的时候，这样的试剂在细胞中可能不会积累到有效水平。作为另一种选择，酶SOD到这样的细胞的持久的传递可能会帮助降低超氧化物聚集的有害效应。

对能传递SOD基因到能受益于SOD活性的受治者细胞的治疗载体和方法的需求是存在的。这样的受治者包括那些遭受引起超氧化物过量产生或积累的紊乱症的痛苦的人，那些暴露于引起过量超氧化物产生或积累的的环境中的人，甚至是那些暴露于正常老化相关的蓄积性氧化损伤的个体。

发明内容

在一个方面，本发明涉及编码超氧化物歧化酶(SOD)的腺相关病毒(AAV)载体。在一个实施方案中，所述SOD是SOD1。在另一个实施方案中，所述SOD1基因含有ALS相关的诸如Gly93Ala的突变。

在一个实施方案中，所述编码SOD的AAV载体(AAV-SOD)用于传递所述SOD基因到目标细胞。在一个实施方案中，目标细胞位于患有疾病或状态的受治者内，对这些受治者，SOD到目标细胞的传递提供了治疗的益处。在某些实施方案中，SOD的传递在受治者上产生了治疗性效果。在其他实施方案中，疾病或病态选自帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、退化性眼疾病(例如黄斑变性、色素性视网膜炎)、阿尔茨海默氏症、风湿性关节炎、局限性肠炎、佩罗尼氏病、溃疡性结肠炎、脑缺血症(中风)、心肌梗塞(心脏病发作)、脑和/或脊髓损伤、重灌流损伤、ALS、唐氏综合症、白内障、精神分裂症、癫痫症、人白血病和其他癌症或糖尿病。

在另一个方面，本发明涉及筛选有效治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的化合物的模型系统，该模型系统包含多个用编码含有ALS相关的诸如Gly93Ala突变的SOD1基因的AAV载体转导的细胞。在各个实施方案中，本发明的AAV载体衍生自AAV-2、AAV-5或AAV-6。

在一个实施方案中，用所述AAV载体转导的细胞的多数包含在它们被发现的群体中至少80％的细胞，例如来源于啮齿类动物脊髓的细胞原代培养物。

在某些实施方案中，所述转导细胞显示了ALS相关的表型变化。在其他实施方案中，一种或多种筛选出的化合物降低或改善了这个表型变化。

在另一个方面，本发明涉及使用本发明模型系统筛选有效治疗ALS的化合物的方法。

附图说明

图1是传递命名为pVm-G93ASOD的hSOD1-Gly93Ala的AAV载体的原理图。hSOD1-Gly93Ala的表达被鸡β肌动蛋白启动子驱动。表达框位于两个AAV-2ITR序列之间。SOD1-Gly93Ala在本文中也称为“突变”SOD。

图2是传递称为pVm-WTSOD的野生型人SOD1的rAAV载体的原理图。wtSOD1的表达被鸡β-肌动蛋白启动子驱动。表达框位于两个AAV-2ITR序列之间。

具体实施方式

除非另外指明，本发明的实施将使用本领域技术中的病毒学、微生物学、细胞和分子生物学以及重组DNA技术等传统方法。这样的技术已经在文献中得到了全面的阐述。参见例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Current Edition)；DNA Cloning：A Practical Approach，Vol.I & II(D.Glover，ed.)；OligonucleotideSynthesis(N.Gait，ed.，Current Edition)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，eds.，Current Edition)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，eds.，Current Edition)；CRC Handbook ofParvoviruses，vol.I & II(P.Tijssen，ed.)；Fundamental Virology，2ndEdition，vol.I & II(BN.Fields and D.M.Knipe，eds.)；Freshney，Culture ofAnimal Cells，AManual ofBasic Technique(Wiley-Liss，Third Edition)；和Ausubel et al.(1991)Current Protocols in Molecular Biology(WileyInterscience，NY).

本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和数据库登入号(包括OMIM登入号)均全文引入本文作为参考。

本发明涉及能被用于创造ALS的体外模型或作为治疗剂的编码SOD的AAV载体。

ALS相关的SOD1突变

在本发明涉及到ALS模型系统的方面，被AAV载体编码的SOD基因包含ALS相关的突变。如本文所用，术语“ALS相关的突变”是指在患有ALS的个体中比不患有ALS的个体中更频繁发生的SOD基因中的突变。wtSOD1的氨基酸序列在表1中列出。SOD1中已知的突变包括Ala4Ser，Ala4Thr，Ala4Val(A4V；147450.0012)，Cys6Gly，Cys6Phe，Val7Glu，Leu8Val，Leu8Gln，Gly10Val，Gly12Arg，Val14Met，Val14Gly，Gly16Ala，Gly16Ser，Asn19Ser，Phe20Cys，Glu21Gly，Glu21Lys，Gln22Leu，Gly37Arg(G37R；147450.0001)，Leu38Arg，Leu38Val(L38V；147450.0002)，Gly41Asp(G41D；147450.0004)，Gly41Ser，His43Arg，Phe45Cys，His46Arg(H46R；147450.0013)，Val47Phe，His48Arg，His48Gln，Glu49Lys，Thr54Arg，Cys57Arg，Ser59Ile，Asn65Ser，Leu67Arg，Gly72Cys，Gly72Ser，Asp76Tyr，Asp76Val，His80Ala，His80Arg，Leu84Val，Gly85Arg，Asn86Asp，Asn86Ser，Val87Met，Val87Ala，Ala89Thr，Ala89Val，Asp90Ala，Asp90Val，Gly93Ala(G93A；147450.0008)，Gly93Arg，Gly93Asp，Gly93Cys(G93C；147450.0007)，Gly93Ser，Gly93Val，Ala95Thr，Asp96Asn，Val97Met，Glu100Gly，Glu100Lys，Asp101Asn，Asp101Gly，Asp101His，Ile104Phe，Leu106Val，Ile113Thr(I113T；147450.0011)，Leu126Ter，Ser134Asn，Leu144Ser和Ala145Thr。突变后的编号在出现时代表那些突变的OMIM文献编号。SOD1突变也在Rosen et al.(1993)Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familialamyotrophic lateral sclerosis，Nature362：59-62；Cudkowic et al.(1997)Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in amyotrophic lateralsclerosis，Ann.Neurol.41：210-221；Belleroche et al.(1995).Familialamyotrophic lateral sclerosis/motor neuron disease(FALS)：a review ofcurrent developments，J.Med.Genet.32：841-847中披露。。尽管本文披露了大量的SOD1突变，但并不是所有这些突变在创建ALS的疾病模型中均有用。

表1：wtSOD1的氨基酸序列

1   ATKAVCVLKG DGPVQGIINF EQKESNGPVK VWGSIKGLTEGLHGFHVHEF51  GDNTAGCTSA GPHFNPLSRK HGGPKDEERH VGDLGNVTADKDGVADVSIE101 DSVISLSGDH CIIGRTLVVH EKADDLGKGG NEESTKTGNAGSRLACGVIG151 IAQ(SEQIDNO.1)

腺相关病毒载体

腺相关病毒(AAV)已经成功用来为基因治疗传递基因，并且人类临床实验已经证明其具有巨大的希望(参见例如，Kay et al.，Nat.Genet.(2000)24：257-261)。作为唯一的基于非致病和复制缺陷病毒的病毒载体系统，重组AAV病毒体已经成功地用于建立在多种组织中的增殖和末端分化细胞的有效且持久的基因转移而没有检测到免疫反应或毒性(Bueler，H.，Biol.Chem.(1999)380：613-622)。

AAV基因组是包含大约4681个核苷酸的线性单链DNA分子。AAV基因组通常包含两端具有反向末端重复序列(ITRs)的内部非重复基因序列。ITRs的长度大约为145个碱基对(bp)。ITRs具有包括作为DNA复制起点和病毒基因组包装信号在内的多个功能。基因组的内部非重复部分包括已知为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因的两段巨大开放阅读框。rep和cap基因编码支持病毒复制和包装入病毒粒的病毒蛋白。特别地，至少四种病毒蛋白的族从AAV rep区域表达，根据它们表观的分子量分别命名为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV cap区域编码至少三种蛋白，分别为VP1、VP2和VP3。

通过删除AAV基因组的内部非重复序列(即rep和cap基因)并在ITRs间插入异源基因，AAV已经被工程化来传递目的基因。异源基因被典型性地功能性地连接到能在合适条件下驱动病人目标细胞中的基因表达的异源启动子(组成型的、细胞特异的或可诱导的)上。诸如多腺苷酸位点的末端信号也能被包括进来。

AAV是依赖帮助者病毒的病毒；即，为了在野生环境中形成AAV病毒粒，它需要同帮助者病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)共转染。在缺少同帮助者病毒共转染的情况下，AAV建立了病毒基因组插入宿主细胞染色体但具有侵染性的病毒粒未被生产的潜伏状态。随后的帮助者病毒的感染“拯救”了被整合的基因组，支持它复制并将它的基因组包装入侵染性的AAV病毒粒。虽然AAV能侵染不同物种的细胞，但所述帮助者病毒必须同宿主细胞属于同一个物种。这样，例如，人AAV将在同犬腺病毒共转染的犬细胞中复制。

在本发明的优先实施方案中，三重转染方法(在美国专利NO.6,001,650中进行了详细地公开，将其全文引入本文作为文献)被用于生产rAAV病毒粒，因为这种方法不需要使用侵染性的帮助者病毒，这使被生产的rAAV病毒粒不含任何可检测到的帮助者病毒成为可能。rAAV病毒粒的生产通过使用三种载体可以实现：AAV帮助者功能载体，附属功能载体和rAAV表达载体。本领域的技术人员将使被这些载体编码的核酸序列能以各种组合提供在两个或更多个载体上。

AAV帮助者功能载体编码反式调控生产的AAV复制和衣壳化的AAV帮助者功能序列(即rep和cap)。优选地，AAV帮助者功能载体支持有效的AAV载体生产而不产生含有功能性rep和cap基因的任何可检测到的AAV病毒粒。这种载体的一个例子，pHLP19在美国专利NO.6,001,650中得到了详细的公开，将其全文引入本文作为参考。如上面解释的，AAV帮助者功能载体的rep和cap基因能衍生自任何已知的AAV血清型。例如，AAV帮助者功能载体可能会具有衍生自AAV-2的rep基因和衍生自AAV-6的cap基因。本领域的技术人员将识别，其它rep和cap基因的组合是可能的，其明显的特征是能支持rAAV病毒粒的生产。

附属功能载体编码AAV的复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞的功能的核苷酸序列，本文以附属功能提及。附属功能包括那些AAV复制所需要的功能，包括但不限于那些在AAV基因转录激活、期特异AAV mRNA拼接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装中涉及到部分。基于病毒的附属功能能衍生自诸如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒类型-1)和牛痘病毒的任何为人们所熟知的帮助者病毒。在优先的实施例中，使用了附属功能质粒pLadeno5。关于pLadeno5质粒的详情在美国专利NO.6,004,797中进行了描述，将其全文引入本文作为参考。该质粒为AAV载体生产提供了整套腺病毒附属功能，但是缺少形成能复制的腺病毒所需的组件。

重组AAV表达载体

使用已知的技术构建了重组AAV(rAAV)表达载体来提供包括控制元件(包括转录起始区域)、编码目的SOD的多核苷酸和转录终止区域在内的有效连接的组件。产生的构建物含有同功能性AAV ITR序列结合的(5’和3’)有效连接的组件。

在针对用于ALS研究的模型系统的实施方案中，被选择的控制元件能在哺乳动物神经元细胞中起作用。在针对治疗使用的AAV-SOD的实施方案中，被选择的控制元件能在目的细胞或组织中起作用。尽管组织特异的和可调控的控制元件在本发明的某些实施方案中是令人希望的，但其它实施方案包括了组成型启动子的使用。

AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。参见例如，Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Berns，K.I.″Parvoviridae and theirReplication″in Fundamental Virology，2nd Edition，(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.)中关于AAV-2序列的部分。在本发明的载体中使用的AAVITRs不需要具有野生型核苷酸序列，并且可能会被改变，例如，通过核苷酸的插入、删除或替换。此外，AAV ITRs可能会衍生自几种AAV血清型中的任何一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8等。AAV ITRs也可能会衍生自，例如，从鼠、羊或牛源分离而来的AAV变种。此外，位于AAV表达载体中选定的核酸序列两端的5’和3’ITRs不必是相同的或衍生自相同的AAV血清型或分离物，只要它们以所预期的方式起作用，即支持目的序列从宿主细胞基因组或载体中切除和拯救，并且当AAV Rep基因产物在细胞中出现时支持DNA分子整合入受体细胞基因组。

不同的AAV血清型能用来特定地针对不同细胞类型。例如，在各种实施方案中，本发明的载体衍生自AAV-2、AAV-5和AAV-6。例如，在原代鼠运动神经元培养物中，衍生自AAV-6的载体定向SOD的表达使其主要在神经元中表达；衍生自AAV-2的载体定向SOD的表达使其既在神经元中也在神经胶质中表达；和衍生自AAV-5的载体定向SOD的表达使其主要在神经胶质中表达。当使用AAV-2起源的载体进行传递时，hSOD1-Gly93Ala引起病理相关的运动神经元形态改变，但是当使用AAV-5起源的载体进行传递时并不能引起运动神经元的病理。

AAV-SOD的治疗性用途

在本发明涉及到rAAV-SOD治疗性用途的各个实施方案中，rAAV载体被用来传递SOD1、SOD2或SOD3基因，或其组合。在一个具体的实施方案中，SOD1被传递。

一般地，本文公开的载体可能会用于治疗或预防与不良水平的ROS和自由基，或氧化应激相关的疾病或状态。ROS也作为某些治疗性药物的有害副作用而产生。参见例如，Chan et al.(1996)Adv.Neurol71：271-279；DiGuiseppi and Fridovich(1984)Crit.Rev.Toxicol.12：315-342。可能通过使用本发明的AAV-SOD载体治疗的状态包括帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、退化性眼疾病(例如黄斑变性，色素性视网膜炎)、阿尔茨海默氏症、风湿性关节炎、局限性肠炎、佩罗尼氏病、溃疡性结肠炎、脑缺血症(中风)、心肌梗塞(心脏病发作)、脑和/或脊髓损伤、重灌流损伤、ALS、唐氏综合症、白内障、精神分裂症、癫痫症、人白血病和其他癌症和糖尿病。

甚至是那些仅遭受年龄增长相关的正常氧化损伤的人也能从本发明的载体和方法中获益。如被大鼠组织中(Erdincler，D.S.，et al.(1997)Clin.Chim.Acta，265：77-84)和老年病人的血细胞中(Congi，F.，et al.(1995)Presse.Med.，24：1115-1118)脂质过氧化物形成的增长所证明的，由于ROS和自由基的形成而导致的氧化应激的累积性上升在老化过程中发生(参见例如，Mecocci，P.et al.(2000)Free Radio.Biol.Med，28：1243-1248)。近期的综述(Niki，E.，Intern.Med.(2000)39：324-326)报道，被ROS和自由基增加的组织损伤能归因于老化过程中发生的抗氧化酶SOD和CAT水平的降低。例如，通过插入额外的SOD基因到小鼠基因组而产生的转基因鼠被发现具有降低的ROS和自由基损伤水平。这样的动物也具有延长的寿命。更近的证据表明，模拟SOD活性的小卟啉锰化合物的给予导致秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的寿命延长44％(S.Melow，et al.(2000)Science，289：1567-1569)。相应地，本发明的载体和方法可能会预防和/或抵消老化过程相关的ROS和自由基的水平升高导致的组织损伤增加和预期寿命减少。

如本文中所用，术语ALS的“治疗”包括预成损伤的逆转、进一步损伤的预防和延缓损伤的进展，它们的每一种都是所期望的结果。被认为治疗有效的治疗性rAAV-SOD载体或通过使用本发明的体外ALS模型系统发现的化合物不必逆转预成损伤。任何至少延缓了受治者ALS进展的治疗均可以被认为是治疗有效的。

筛选治疗性化合物的ALS体外模型系统

如在实施例中更详细公开的，本发明的AAV-SOD载体能用于创建ALS的体外模型系统，该模型系统能被用来筛选有效治疗或预防ALS的化合物。在一个实施方案中，ALS相关的已知的突变SOD1(SOD1-Gly93Ala)被克隆入AAV载体并且重组病毒粒(rAAV-SOD1-Gly93Ala)被生产。rAAV-SOD1-Gly93Ala然后被用于转导从诸如大鼠脊髓或大鼠大脑等代表性组织而来的原代培养物。转染后3-5天用探针检测培养物来确定培养物中的某些神经元显示了ALS相关的诸如SOD聚集物或空泡化形成等形态改变。这样的细胞在本文中称为“ALS样细胞”。这样的聚集物可能能通过免疫细胞化学进行观测。在优先的实施方案中，培养物中ALS样细胞的百分比是高的，例如20、30、40、50、60、70、80、90或95％或更高。在使用该培养物的细胞时，培养物中ALS样细胞百分比越高能被筛选的化合物的数目越大，或每一种化合物重复的数目更高。

通过将ALS样细胞暴露于一种或更多种目的化合物中进行筛选，然后确定诸如SOD聚集物减少等反映ALS特征改善的ALS样细胞的表型是否发生改变。在某些实施方案中，化合物被分别加入到诸如在单个的细胞瓶、细胞皿、细胞板或多孔细胞板的孔中的ALS样细胞的单独培养物中。在其它实施方案中，化合物以几种化合物的混合物的方式加入。在某些实施方案中，化合物以化合物组合库或子库的形式加入。在某些实施方案中，化合物混合物中活性化合物的鉴定通过用化合物重叠子库获得的数据重叠进行测定。在其它实施方案中，活性化合物的鉴定通过个别地筛选活性混合物中或小组中的个别化合物进行测定。化合物混合物中或库中的活性化合物的检测方法不是本发明的关键方面。

如在实施例1中证明的，作为突变SOD基因的SOD1-Gly93Ala的使用导致了转染的大鼠脊髓运动神经元和神经胶质细胞中SOD聚集物的形成，和大鼠大脑纹状体神经元和神经胶质细胞的空泡化。如当转导细胞用潜在治疗性试剂或治疗方法治疗时这样的形态特征的任何逆转均能被观察一样，形态特征能通过免疫细胞化学进行可视化观察。在其它实施方案中，ALS样表型的观察被自动化，例如，通过能在没有人干涉情况下检测聚集和空泡化的计算机辅助图像分析。这样的计算机辅助图像分析在大量潜在治疗性试剂或疗法的筛选中是特别首选的。在另一个实施方案中，不是Gly93Ala的SOD1突变体被使用，用这些其它突变SOD1基因转导的细胞的表型可能同SOD1-Gly93Ala转导的相关表型不同。任何突变SOD转导相关的可检测的表型改变均能用于评价细胞是否被转导成ALS样表型和评价潜在治疗性试剂或疗法在逆转ALS样表型方面是否有效。

能被筛选的化合物包括那些能在ALS样细胞培养物中提供的任何化合物。这些化合物包括但不限于天然产物(粗混合物或高度纯化的成份)、合成化合物、组合库和已知具有药理活性化合物的库。通过使用合理的药物设计，用于治疗ALS的合成化合物能被任意地选择或特别合成。组合库能衍生自小分子的组合合成或通过诸如寡核苷酸、寡糖或多肽等聚合分子的组合合成获得。通过使用本发明的ALS体外模型系统被筛选的库可能会含有包括10、50、100、500、1000、10,000、100,000到1,000,000或更多化合物的任何数目的单体化合物。如本文中所用，术语“高通量筛选”是指在单位时间内(例如每天)筛选比通过使用诸如所述转基因小鼠SOD1-Gly93Ala模型并用相同的时间和努力消耗筛选的化合物更多的化合物。在各种实施方案中，高通量筛选指每天筛选10、20、50、100、500、1000、2000、5000或更多个化合物。本发明的模型系统也能用来筛选那些不涉及试剂加入的逆转或预防ALS样表型的治疗方法的能力的疗法。

在本发明的体外实验中显示出功效的化合物能被进一步地进行研究，例如，在其它体外实验、体内实验(例如前面描述的ALS小鼠)或临床实验中。这样的后续试验与本发明的体外模型系统相比是相对更费力、耗时和昂贵的，因此，通过使用这样的费力的实验进行大量化合物的筛选是不实际的。通过使用本发明的体外ALS模型来充分减少候选化合物的数量来使这样的费力的试验变得可行是可能的。以这种方式，本发明的体外实验使筛选比通过使用本领域先前的筛选方法能实际筛选的化合物更多的化合物变得可能，这样就增加了发现能治疗或预防ALS的有效先导化合物的几率。

ALS体外模型系统的基础研究用途

本发明的ALS模型系统不仅能提供有效的高通量筛选方法，它们也能为研究疾病发病机理和定义ALS中运动神经元的选择性易损性的基础提供有价值的实验模型。例如，原代培养物中的细胞能用编码ALS相关的突变SOD1的AAV病毒粒转导，在转导后4小时到4天的时候能从转导细胞中收获RNA。RNA也能从用编码wtSOD1的AAV病毒粒转导的或未用任何病毒粒转导的对照细胞中获得。RNA样品然后用于在Affymetrix Gene Chip^TM上进行的基因表达分析来测定ALS模型细胞与对照细胞相比，哪种基因过表达、哪种基因欠表达。显示出差异表达的基因可能代表了干预治疗的有吸引力的途径。

筛选治疗性化合物的ALS体内(动物)模型系统

编码SOD突变形式的重组AAV载体也能用来创建ALS新的动物模型。动物能被给予编码突变SOD1基因的rAAV载体(例如rAAV病毒粒)来产生ALS样表型。显示出包括模拟ALS症状表型在内的改变的表型的动物然后用于实验来检测潜在治疗性化合物或疗法的功效。为了研制成为治疗性试剂，产生ALS样表型逆转的化合物然后能被进一步研究。能用于这样的ALS模型的动物包括但不限于小鼠、大鼠和非人灵长类动物。

本发明特定的具体化的实施例在下面提供。所述实施例仅供用于说明的目的，并不意味着对本发明的限制。

实施例1

原代大鼠运动神经元培养物中的ALS体外模型

ALS体外模型系统可按下述方法建立。通过将人SOD1野生型基因(hSOD1wt)或突变SOD1基因(hSOD1-Gly93Ala)克隆入衍生自AAV-2的含有两个使得SOD基因表达被鸡β-肌动蛋白启动子所定向的AAV反向末端重复序列(ITRs)的载体来创立两个AAV载体。

产生的rAAV2-SOD1-Gly93Ala载体然后被包装入AAV-2病毒粒(参见例如，美国专利Nos.6,001.650和6,004,797)并用于转导原代大鼠运动神经元培养物。转导后3-5天的荧光显微术揭示，转导细胞展示了诸如在多数表达突变SOD的运动神经元中的细孔状聚集物中突变SOD蛋白的异常分布、胞体(perikaryal)细胞质的扩散和运动神经元进程(processes)的膨胀、运动神经元的程序性死亡和星形细胞的激活等ALS的病理改变特征。由于用rAAV2-SODwt载体进行的转导在目标细胞中不产生任何ALS相关的表型改变，将该载体用作本发明ALS模型的对照。

用编码pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV2载体分别转导后大约3-5天，来源于大鼠脊髓的原代培养物中的运动神经元中SOD的存在通过免疫组化进行观察。免疫组化用小鼠抗SOD1IgG第一抗体和Alexa-594标记的山羊抗小鼠IgG第二抗体进行。用pVm-G93ASOD转导的神经元显示了聚集的SOD1，而在用pVm-WTSOD转导的神经元中未观察到。

用编码pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV2载体分别转导后大约3-5天，来源于大鼠脊髓的原代培养物中的神经胶质细胞中SOD的存在通过免疫组化进行观察。用pVm-G93ASOD转导的神经胶质细胞显示了聚集的SOD1，而在用pVm-WTSOD转导的神经胶质细胞中未观察到。

个别的实验按照类似那些上面描述的方法进行，但是使用的是衍生自AAV-5和AAV-6的AAV载体，即AAV载体的ITRs分别衍生自AAV-5和AAV-6。rAAV-5和rAAV-6病毒粒然后通过分别使用AAV-5或AAV-6衣壳蛋白基因的包装系统进行生产。

用编码pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV-6载体转导后大约3-5天，来源于大鼠脊髓的原代培养物中的神经元中SOD的存在通过免疫组化进行观察。用pVm-G93ASOD转导的神经元显示了聚集的SOD1，而在用pVm-WTSOD转导的神经元中未观察到。

结果显示，使用rAAV-6病毒粒传递的基因主要在神经元中表达，而用rAAV-2病毒粒传递的基因在神经元和神经胶质细胞(如前面所讨论的)均有表达。用rAAV-5病毒粒传递的基因仅在神经胶质细胞中表达，并且rAAV-5病毒粒转导未在运动神经元中产生病理。

在运动神经元上的rAAV2-SOD转导的表型效应在转导后第6-7天和第12天再次进行测量。结果显示，长期的聚集物的发展导致细胞在转导12天后死亡。用编码pVm-G93ASOD的AAV-2载体转导后大约6-7天，来源于大鼠脊髓的原代培养物中的神经元中SOD的存在通过免疫组化进行观察。用pVm-G93ASOD转导的神经元中的SOD1聚集物比它在转导后3-5天的SOD1聚集物更广泛，这说明损伤随时间而发展。用编码pVm-G93ASOD的AAV-2载体转导后大约12天，来源于大鼠脊髓的原代培养物中的神经元中SOD的存在通过免疫组化进行观察。结果显示，SOD1-Gly93Ala对细胞是有毒的，并且它最终杀死了这些细胞。

用rAAV-SOD1-G93A转导后6-7天，运动神经元的形态学被评价并同来源于ALS病人的运动神经元的形态学相比较。用编码pVm-G93ASOD的AAV-2载体转导后大约6-7天，来源于大鼠脊髓的原代培养物中的神经元中SOD的存在通过免疫组化进行观察。培养物中用rAAV-SOD1-G93A转导的细胞展示了同ALS运动神经元相同的局部轴突膨胀特征，这表明，本发明的体外ALS模型系统模拟了疾病的状态。用pVm-G93ASOD转导的神经元在转导后第6-7天显示了胞体(perikaryal)细胞质的扩散和运动神经元过程(processes)的膨胀，这一点同在来自于ALS病人的运动神经元中看到的那些现象相似。

同用于转导大鼠脊髓培养物(前述的)相同的病毒粒也用于转导原代大鼠大脑培养物的纹状体神经元。当用表达SOD1-G93A的载体转导后3-5天，转导细胞的免疫细胞化学显示，纹状体神经元显示出空泡化。当来源于大鼠大脑的原代培养物的神经胶质细胞用表达SOD1-G93A的AAV载体转导时，可以观察到类似的表型。当用pVm-G93ASOD转导时，来源于大脑的神经胶质细胞显示了空泡化，与此相比较，脊髓神经胶质细胞(前面讨论的)用相似处理方法处理后观测到的是聚集物形成。在大脑细胞中观察到的表型同在转导的脊髓运动神经元和神经胶质细胞中观察到的SOD1聚集物形成不同。

实验证实表达SOD1-G93A的细胞实际上是运动神经元。免疫细胞化学在用rAAV-SOD1wt或rAAV-SOD1-G93A转导大约5-6天后在大鼠脊髓的原代培养物中的细胞上进行。第一个实验包括SOD和神经元纤维素(NF-L)的免疫细胞化学检测。在用编码pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV-2载体分别转导大约3-5天后，SOD和神经元纤维素(NF-L)在来源于大鼠脊髓的原代培养物中大的运动神经元中检测到。NF-L是特异的神经标记。在同样细胞中SOD和NF-L的同时染色证实，该细胞是神经元。第二个实验包括SOD和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的免疫细胞化学检测。在用编码pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV-2载体分别转导大约3-5天后，SOD和胆碱乙酰转移酶(ChAT)在来源于大鼠脊髓的原代培养物中大的运动神经元中检测到。ChAT是运动神经元的特异的标记。在相同细胞中SOD和ChAT的同时染色证实，该细胞是一个运动神经元。这些实验证实了在表达作为运动神经元特征的蛋白的细胞中的SOD表达。

荧光显微术表明，原代大鼠运动神经元培养物中所有细胞的大约90％被转导。通过使用rAAV-SOD1-Gly93Ala获得的高效率的转导提供了大量适用于所述实验的细胞，该转导具有相对少的劳动量，通过加入适当数量的病毒颗粒和孵育即可轻易实现。在本实施例中，细胞用每细胞100,000个rAAV-SOD1-Gly93Ala病毒颗粒进行转导，即，感染复数(MOI)是105。其他实验(未列出)显示，低至1000的感染复数在提供最大(90％)转导上是等效的。大量转导细胞使观察任何给定的目的化合物在统计学上显著数目的不同细胞中的效果成为可能，从而能得到统计上稳健的结论。这同先前涉及显微注射编码突变SOD的质粒到单个细胞的方法是不同的，作为一个实质问题，这种涉及显微注射的方法不能为高通量筛选提供统计学上有意义数量的细胞。

这个使用病毒载体同时转导大量运动神经元和其他细胞的后生模型可能会推进ALS分子病理的研究、ALS新动物模型的产生和ALS药物的筛选。

实施例1的材料和方法如下。

pVm-wtSOD和pVm-G93ASOD质粒的构建

人野生型和G93A突变SOD基因用含有整合的HindIII位点的正向引物和含有整合的NotI位点的反向引物通过PCR进行扩增。

5′-AGCTAAGCTTCCACCATGGCGACGAAGGCCGTGTG-3′_(HC#146)(SEQ ID NO.2)

5′-ATATGCGGCCGCTTATTGGGCGATCCCAATIACACCA-3′(HC#147)(SEQ ID NO.3)

PCR产物用HindIII和NotI限制酶进行消化并克隆入质粒F101的HindIII和NotI位点，并且基因被置于鸡β-肌动蛋白启动子的控制下并位于两个AAVITRs间来创建质粒F101-wtSOD和F101-G93A。wtSOD和G93A连同鸡β-肌动蛋白启动子被用BglII和NotI切离质粒F101-wtSOD和F101-G93A并通过使用SphI-BglII和NotI-NcoI接头克隆入pVm-LacZ的SphI和NcoI位点。构建物通过测序分析进行确证并被命名为pVm-wtSOD(图2)和pVm-G93ASOD(图1)。所述质粒然后进行扩增并用于转染293细胞来产生AAV载体。

原代神经培养物

裂解的脊髓或大脑的原代培养物从第15天的斯普拉格-道利大鼠胚胎制备而来。切开的纹状体或脊髓组织被切成小片并用胰蛋白酶孵育30分钟。裂解后，所述组织用巴斯德吸管进行研磨，然后细胞以每孔350,000个(纹状体神经元)或700,000个(脊髓神经元)的密度铺在含有用聚-D-赖氨酸(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)包被的圆的18mm玻璃盖玻片(Fisher Scientific，Chicago，IL)的12孔培养板(Fisher Scientific，Chicago，IL)上。对于纹状体培养物，所用培养基是补充了2％B-27，0.5mM L-谷氨酰胺和25mM L-谷氨酸的神经基质培养基(neurobasal medium)(lnvitrogen，Chicago，IL)。为了维持细胞，培养物每周加一次营养物。对于脊髓培养物，所用培养基是用2.5g D-葡萄糖丰富并补充2％马血清、5％胎牛血清、1％青链霉素和生长因子的Eagle最小必需培养基(EMEM)(ATCC，Manassas，Virginia)。为了获得最佳的细胞生长和稳定状态，培养物每周加入两次营养物。通过在第4-6天时用1.4μg/ml胞嘧啶-B-D-阿糖胞苷(Calbiochem)处理培养物，非神经元细胞被降到最低。培养物维持在37℃5％CO₂的环境中。为了允许运动神经元生长并从其它神经元分化而来，裂解后2-3周，这些细胞被用于实验。

培养物处理

纹状体培养物和脊髓培养物用AAV-hSODwt或AAV-hG93A(每个细胞10⁵个载体基因组(vg))孵育来获得最大的载体表达。

免疫细胞化学

生长在玻璃盖玻片上的纹状体和脊髓细胞用4％多聚甲醛固定并用0.05％NP-4O进行通透化处理。含有IX PBS、3％BSA和2％山羊血清的封闭液被使用。免疫细胞化学用下列抗体进行：神经微丝-L(NF-L；AB1983，1∶100，Chemicon Inc)、胆碱乙酰转移酶(ChAT；AB143和MAB305，1∶10，Chemicon Inc)、超氧化物歧化酶(SOD；521∶300，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP；AB5804，1∶500，Chemicon Inc)。所有的抗体都稀释在封闭液中。用二抗(共轭连接Alexa Fluor 488(绿色)或Alexa Fluor 594(红色)并以1∶200稀释的抗小鼠/抗兔/抗大鼠IgG(Molecular Probes))孵育后，通过落射荧光显微镜观察抗体的分布。

实施例2

IL-10肽作为候选ALS治疗药物的评价

本发明实施例1的体外ALS模型系统的价值通过评价IL-10衍生肽在ALS上的效果的实验来进行阐释。

寡肽制造通过本领域技术人员所熟知的固相合成方法获得。合成寡肽的分析包括电喷射质谱、高效液相色谱和提纯产物的视觉表现。用于注射的寡肽以1mg/ml的浓度制备在水中。适当的衍生自IL-10的肽的范例(美国专利No.6,159,937)和“乱序”对照肽在表2中提供。肽的序列以传统的N→C末端方向提供。氨基酸用三字母命名法命名。

表2

人IL-10肽   Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn(SEQ ID NO.4)‘乱序’肽   Arg-Ile-Lys-Asn-Met-Ala-Thr-Tyr-Met(SEQ ID NO.5)

尽管在表2中提供了范例性的肽序列，本领域的技术人员很清楚，能对所列的序列进行各种修饰或取代而仍能保持和可能提高该肽在神经病痛或神经变性疾病治疗方面的功效，或提高它的药理学性质。这样的序列变种能在下述实施例中的一个或多个模型中进行检验来评价它们的治疗功效。

例如，从非人物种而来的IL-10序列能用来获得不同于人源IL-10肽的衍生自IL-10的肽序列，衍生自非人源IL-10的肽与衍生自人源的序列相比较可能会表现出提高的性质。可选地，治疗性肽的变种能通过使用本领域技术人员所熟悉的已知经验参数的检验进行设计。另外，合理的药物设计能用来设计期望表现出增强功效的序列变种，该合理的药物设计能基于IL-10、IL-10受体或IL-10同受体复合物的三维结构的分析。

大鼠脊髓原代培养物用rAAV2-SOD1-G93A病毒粒孵育来生产包含表达SOD1-G93A的一个或多个转导运动神经元细胞的细胞培养物。在转导后的各个时间，上面描述的IL-10和乱序肽被加入到(重复三次)含有用rAAV2-SOD1-G93A转导的细胞的组织培养平板中。转导细胞的对照平板未用任何肽进行处理。作为肽加入后的时间函数，进行SOD免疫细胞化学来测定IL-10肽、乱序肽或二者是否改善了SOD1-G93A表达的表型效应(即胞内SOD聚集物形成或细胞死亡)。

假如在用一种或两种肽处理的培养物中观察到聚集物降低或细胞死亡，在本发明体外实验中给出阳性结果的肽然后被给予更广泛的研究(即在ALS小鼠中进行体内研究)。本发明体外实验的阳性结果包括SOD聚集物形成的减少或细胞死亡减少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、98％或更多。ALS治疗或预防功效最终通过人类临床实验进行确认。

在其他实验中，上面所示的IL-10的500个序列变体被合成并实验其在用rAAV-SOD1-G93A转导的运动神经元中减少ALS样表型的活性。显示出最大活性的肽被进一步研究其治疗或预防ALS的功效。

本发明使用的代表性的、非限制性的其它IL-10序列的例子包括在下述NCBI登入号中描述的序列：NM000572、U63015、AF418271、AF247603、AF247604、AF247606、AF247605、AY029171、UL16720(所有的人类序列)、NM012854、L02926、X60675(大鼠)；NM010548、AF307012、M37897、M84340(全部的小鼠序列)、U38200(马)；U39569、AF060520(猫序列)；U00799(牛)；U11421、Z29362(羊序列)；L26031、L26029(恒河猴序列)；AF294758(猴)；U33843(犬)；AF088887、AF068058(兔序列)；AF012909、AF120030(旱獭序列)；AF026277(负鼠)；AF097510(荷兰猪)；U11767(鹿)；L37781(沙鼠)；AB107649(骆马和骆驼)。

实施例3

GDNF肽作为候选ALS治疗药物的评价

本发明实施例1的体外ALS模型系统的价值通过评价神经胶质细胞起源的神经营养因子(GDNF)肽对ALS的作用效果的实验来进行进一步的阐释。除了从GDNF起源的肽外，本实验基本按照实施例2中描述的方法进行，并提供它的不是IL-10肽的乱序版本。假如在实验中GDNF肽显示出阳性结果(即，假如用所述肽处理后发生了转导运动神经元的ALS样表型特征的降低)，该肽能被进一步研究来确认它在ALS治疗或预防上的功效。

在其他实验中，500个不同的GDNF的衍生肽被合成并实验其在用rAAV-SOD1-G93A转导的运动神经元中减少ALS样表型的活性。显示出最大活性的肽被进一步研究其治疗或预防ALS的功效。

本发明使用的GDNF肽可能衍生自大量已知的GDNF序列，包括在美国专利NO.6,221,376和6,363,319中披露的序列，将其全文引入本文作为文献，和Lin et al.，Science(1993)260：1130-1132中披露的大鼠和人的序列，以及NCBI登入号AY052832、AJ001896、AF053748、AF063586和L19063中记录的人的序列；NCBI登入号AF184922、AF497634、X92495、NM019139中记录的大鼠的序列；NCBI登入号AF516767中记录的大熊猫的序列；NCBI登入号XM122804、NM010275、D88351S1、D49921、U36449、U37459、U66195中记录的小鼠的序列；NCBI登入号AF469665中记录的朱鹮的序列；NCBI登入号AF106678中记录的恒河猴的序列；和NCBI登入号NM131732和AF329853中记录的斑马鱼的序列。GDNF序列也在美国专利申请No.2003/0161814中进行了披露。

根据本文披露的内容，本领域的技术人员能容易地实施本发明的这些以及其它实施方案。尽管本发明的优选实施方案已经以某些细节进行了公开，但应该明白，在没有离开本文定义的本发明的精神和范围的情况下，变化仍然能被做出。本文引用的所有的出版物、专利和专利申请均将其全文引入本文作为参考。

序列表

<110>建新公司

     M·D·道罗德奇

<120>编码超氧化物歧化酶的AAV载体

<130>1054

<140>60/697,450

<141>2005-07-07

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>153

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Ala  Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly

1                5                   10                  15

Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp

            20                  25                  30

Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His

        35                  40                  45

Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe

    50                  55                  60

Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His

65                  70                  75                  80

Val Gly Asp Leu Gly Asn ValThr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp

                85                 90                  95

Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile

            100                 105                 110

Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys

        115                 120                 125

Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu

    130                 135                 140

Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

145                 150

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>2

agctaagctt ccaccatggc gacgaaggcc gtgtg    35

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>3

atatgcggcc gcttattggg cgatcccaat tacacca    37

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>乱序的人IL-10肽

<400>5

Arg Ile Lys Asn Met Ala Thr Tyr Met

1               5

Claims (15)

1. 重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：至少一个AAV反向末端重复(ITR)序列和编码超氧化物歧化酶(SOD)的基因。

2. 权利要求1所述的载体，其中的SOD是SOD1。

3. 权利要求2所述的载体，其中的SOD1包含ALS相关的突变。

4. 权利要求3所述的载体，其中的SOD1包含Gly93Ala突变。

5. 权利要求1所述的载体，其中的AAV载体是质粒。

6. 权利要求1所述的载体，其中的AAV载体是AAV病毒粒。

7. 权利要求6所述的载体，其中的AAV病毒粒衍生自AAV-2。

8. 权利要求6所述的载体，其中的AAV病毒粒衍生自AAV-5。

9. 权利要求6所述的载体，其中的AAV病毒粒衍生自AAV-6。

10. 治疗受治者的方法，其包含：给予所述受治者编码SOD的AAV载体。

11. 权利要求10所述的方法，其中所述受治者患有选自ALS、帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、风湿性关节炎、局限性肠炎、佩罗尼氏病、溃疡性结肠炎、黄斑变性、色素性视网膜炎、白内障、脑缺血症、心肌梗塞、脑损伤、脊髓损伤、重灌流损伤、精神分裂症、癫痫症、人白血病或糖尿病的失调症。

12. 筛选有效治疗或预防肌萎缩性侧索硬化(ALS)症的化合物的方法，其包含：

用编码含有ALS相关突变的SOD1的AAV载体转导细胞来产生转导细胞，其中所述的转导细胞显示了ALS相关的表型特征；

暴露所述转导细胞到目的化合物；

测定暴露到目的化合物的转导细胞是否显示出ALS相关的表型特征的降低。

13. 筛选有效治疗ALS的化合物的体外模型，其包含：

用编码含ALS相关突变的SOD的AAV载体转导的多个细胞。

14. 权利要求12或权利要求13所述的模型，其中的突变是Gly93Ala。

15. 权利要求13所述的模型，其中用AAV载体转导的多个细胞包含培养物细胞群体中的所有细胞的至少80％。

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