KR20220046513A - 유아 바텐병의 치료를 위한 척수강내 및 정맥내 조합 유전자 요법 - Google Patents
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Abstract
IBD 또는 IBD 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 방법으로서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 척수강내 투여와 상기 폴리뉴클레오타이드의 정맥내 투여를 병용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 야생형 CLN1 폴리뉴클레오타이드이다. 또 다른 양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 이 폴리뉴클레오타이드의 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고 인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된다.
Description
관련 출원의 교차참조
본원은 2019년 4월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/840,360호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 이 출원의 내용은 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
서열목록의 포함
본원과 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 사본(파일명: ABEO_004_01WO_SeqList_ST25.TXT, 생성일: 2020년 4월 27일, 파일 크기: 약 5.6 킬로바이트).
유아 신경 리포푸신증(유아 바텐병 또는 "IBD") 또는 유아 신경 세로이드 리포푸신증(INCL)은 CLN1 유전자 내의 돌연변이에 의해 야기되고 상염색체 열성 장애이다. 1p32에 위치된 CLN1 유전자는 팔미토일 단백질 티오에스터라제 1(PPT1)로서 지칭되는 라이소좀 효소를 코딩한다. PPT1 결핍 세포는 자가형광 저장 물질을 축적하고 기능장애를 갖게 됨으로써, 신경염증, 신경 손실 및 신경퇴행을 유발한다. CLN1 내에 돌연변이를 가진 일부 아동들은 증상의 더 늦은 발병 및 더 느린 질환 진행을 갖는데, 이것은 청소년 발병 질환과 유사하고 보다 전형적으로 CLN3 유전자 내의 돌연변이와 관련되어 있다. 종래 치료는 효소 대체 요법, 유전자 요법 및 신경 줄기 세포의 투여를 포함한다.
본원은 IBD 또는 IBD 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 방법으로서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 척수강내 투여 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 후속 정맥내 투여로 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 단계를 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 단계로 구성된 방법을 제공한다. 한 양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 야생형 CLN1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 이 폴리뉴클레오타이드의 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고 인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된다. 한 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들 각각 또는 이들의 상보체와 적어도 약 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 등가물은 코돈 최적화된 뉴클레오타이드에서 동일하다.
도 1은 예시적 CLN1 발현 카세트의 맵을 보여준다.
도 2는 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 마우스에서 PPT1의 혈청 효소 활성을 보여준다. IT = 요추 척수강내 주사; IV = 정맥내 주사; Het = 이종; KO = 넉아웃(knock-out).
도 3a는 4주령 또는 12주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다. 도 3b는 20주령 또는 26주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 4a는 4주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내 또는 척수강내+정맥내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코흐트에 대한 생존 곡선을 보여준다. 도 4b는 20주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내, 정맥내, 또는 척수강내+정맥내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코흐트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 5a는 상이한 용량으로 상이한 투여 경로를 통해 증상 발병 전에 CLN1 AAV 벡터를 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스에 대한 생존 곡선을 보여준다. 도 5b는 상이한 용량으로 상이한 투여 경로를 통해 증상 발병 후에 CLN1 AAV 벡터를 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 6a 및 6b는 모리스 수중 미로에서의 수영 속도 평가를 보여준다.
도 7a 및 7b는 와이어 거꾸로 매달리기로부터 떨어지는 시간을 보여준다.
도 8은 다양한 마우스 치료군들에 대한 정규화된 신체 능력 점수(PSC) 대 상대적 생존 시간을 보여준다.
도 9a는 신생아로서 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 이종 마우스에서의 혈청 PPT1 수준을 보여준다. 도 9b는 신생아로서 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 이종 마우스의 수영 속도를 보여준다.
도 10은 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트의 상이한 조직에서 측정된 PPT1 효소 활성을 보여준다.
도 11은 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트의 AAV9에 대한 중화 항체의 수준을 보여준다.
도 12는 상이한 시점에서 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 마우스의 IBD 증상 발생의 도표를 도시한다.
도 2는 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 마우스에서 PPT1의 혈청 효소 활성을 보여준다. IT = 요추 척수강내 주사; IV = 정맥내 주사; Het = 이종; KO = 넉아웃(knock-out).
도 3a는 4주령 또는 12주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다. 도 3b는 20주령 또는 26주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 4a는 4주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내 또는 척수강내+정맥내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코흐트에 대한 생존 곡선을 보여준다. 도 4b는 20주령에서 CLN1 AAV 벡터를 척수강내, 정맥내, 또는 척수강내+정맥내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 코흐트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 5a는 상이한 용량으로 상이한 투여 경로를 통해 증상 발병 전에 CLN1 AAV 벡터를 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스에 대한 생존 곡선을 보여준다. 도 5b는 상이한 용량으로 상이한 투여 경로를 통해 증상 발병 후에 CLN1 AAV 벡터를 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 6a 및 6b는 모리스 수중 미로에서의 수영 속도 평가를 보여준다.
도 7a 및 7b는 와이어 거꾸로 매달리기로부터 떨어지는 시간을 보여준다.
도 8은 다양한 마우스 치료군들에 대한 정규화된 신체 능력 점수(PSC) 대 상대적 생존 시간을 보여준다.
도 9a는 신생아로서 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 이종 마우스에서의 혈청 PPT1 수준을 보여준다. 도 9b는 신생아로서 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 이종 마우스의 수영 속도를 보여준다.
도 10은 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트의 상이한 조직에서 측정된 PPT1 효소 활성을 보여준다.
도 11은 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트의 AAV9에 대한 중화 항체의 수준을 보여준다.
도 12는 상이한 시점에서 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 마우스의 IBD 증상 발생의 도표를 도시한다.
정의
이 개시 전체에 걸쳐, 다양한 간행물들, 특허들 및 공개된 특허 명세서들이 식별 인용 또는 아라비아 숫자로 참조된다. 아라비아 숫자에 의해 식별된 간행물에 대한 전체 인용은 청구범위 바로 앞에서 확인된다. 본 발명이 속하는 분야의 최신기술을 더 완전히 설명하기 위해 이 간행물들, 특허들 및 공개된 특허 명세서들의 개시는 전체적으로 본 개시에 참고로 포함된다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 본 기술의 실시는 당분야의 기술 내에 있는, 유기화학, 약학, 면역학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))]을 참조한다.
본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형도 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하나, 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하기 위한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 전환 어구 "본질적으로 구성된"(및 문법적 파생어)는 언급된 물질 또는 단계, 및 언급된 실시양태의 기본 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 포괄하는 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "본질적으로 구성된"은 "포함하는"과 동등한 것으로서 해석되어서는 안 된다. "구성된"은 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위해 미량 원소보다 더 많은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 배제함을 의미할 것이다. 이 전환 용어들 각각에 의해 정의된 양태는 본 개시의 범위 내에 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 특정된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 편차를 포괄하기 위한 것이다.
본원에 개시된 임의의 성분, 범위, 제형 등의 선택을 기술하기 위해 사용될 때 용어 "허용 가능한", "효과적인" 또는 "충분한"은 상기 성분, 범위, 제형 등이 개시된 목적에 적합하다는 것을 의미한다.
마찬가지로, 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 관련된 나열 항목들 중 하나 이상의 항목의 임의의 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안적으로("또는") 해석될 때 조합의 결여도 의미하고 포괄한다.
본원에서 사용된 용어 "아데노 관련 바이러스" 또는 "AAV"는 이 명칭과 관련되어 있고 파보비리대(Parvoviridae) 과의 데펜도파보바이러스(dependoparvovirus) 속에 속하는 바이러스의 부류의 구성원을 지칭한다. 이 바이러스의 다수의 혈청형들은 유전자 전달에 적합한 것으로 공지되어 있고; 모든 공지된 혈청형들은 다양한 조직 유형들로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 적어도 11개의 순차적으로 넘버링된 AAV 혈청형들이 당분야에서 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법에 유용한 비제한적 예시적 혈청형은 11개의 혈청형들 중 임의의 혈청형, 예를 들면, AAV2, AAV8, AAV9, 또는 변이체 혈청형, 예를 들면, AAV-DJ 및 AAV PHP.B를 포함한다. AAV 입자는 3개의 주요 바이러스 단백질들인 VP1, VP2 및 VP3을 포함하거나, 대안적으로 이 단백질들로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이 단백질들로 구성된다. 한 실시양태에서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV PHP.B, 또는 AAV rh74를 지칭한다. AAV는 자가 상보적 AAV(scAAV)일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "세포"는 대상체 또는 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 임의로 수득된 원핵 또는 진핵 세포를 지칭할 수 있다.
"진핵 세포"는 모네라(monera)를 제외한 모든 생명계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 생명계로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 생명계로 구성된다. 진핵 세포는 막 결합 핵을 통해 용이하게 식별될 수 있다. 동물, 식물, 진균 및 원생생물은 내부 막 및 세포골격에 의해 복잡한 구조로 조직화된 세포를 가진 진핵생물 또는 유기체이다. 가장 특징적인 막 결합 구조는 핵이다. 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 용어 "숙주"는 예를 들면, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함하는 진핵 숙주를 포함한다. 진핵 세포 또는 숙주의 비제한적 예는 원숭이, 소, 돼지, 뮤린, 래트, 조류, 파충류 및 인간, 예를 들면, HEK293 세포 및 293T 세포를 포함한다.
"원핵 세포"는 핵 또는 임의의 다른 막 결합 세포소기관을 통상적으로 결여하고 2개의 도메인들, 즉 세균과 고세균으로 나누어진다. 염색체 DNA 이외에, 이 세포는 에피좀으로서 지칭되는 원형 루프 내에 유전 정보도 함유할 수 있다. 세균 세포는 대략 동물 미토콘드리아(직경 약 1 내지 2 ㎛ 및 길이 10 ㎛)의 크기로 매우 작다. 원핵 세포는 3개의 주요 모양을 특징으로 한다: 막대 모양, 구형, 및 나선형. 세균 세포는 진핵생물처럼 정교한 복제 과정을 거치는 대신에 이분법으로 분열한다. 예는 바실러스(Bacillus) 세균, 이. 콜라이(E. coli) 세균 및 살모넬라(Salmonella) 세균을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "코딩한다"는 핵산 서열에 적용될 때 그의 천연 상태로 존재하거나 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지된 방법에 의해 조작될 때 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 생성하도록 전사될 수 있고/있거나 번역될 수 있는 경우 상기 폴리펩타이드를 "코딩한다"고 기재되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이로부터 유추될 수 있다.
용어 "등가물" 또는 "생물학적 등가물"은 특정 분자, 생물학적 또는 세포 물질을 지칭할 때 교환 가능하게 사용되고 원하는 구조 또는 기능을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 가진 물질을 의미한다. 등가물 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 적어도 60%, 또는 대안적으로 적어도 65%, 또는 대안적으로 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%의 동일성을 가진 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 또는 고엄격도 조건 하에서 이러한 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보체에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 포함한다. 고엄격도 조건은 본원에 기재되어 있고 참고로 본원에 포함된다. 대안적으로, 이의 등가물은 기준 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 야생형 폴리뉴클레오타이드에 대한 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95% 또는 적어도 97% 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보체에 의해 코딩된 폴리펩타이드이다. 최적화된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질에 관한 실시양태에서, 생물학적 등가물은 기준 뉴클레오타이드(들) 또는 아미노산(들)의 뉴클레오타이드(들) 또는 아미노산(들)을 변화되지 않은 상태로 유지하면서 원하는 퍼센트 동일성을 갖거나(예를 들면, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 적어도 60%, 또는 대안적으로 적어도 65%, 또는 대안적으로 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 85%의 동일성을 갖거나), 고엄격도 조건 하에서 이러한 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보체에 의해 코딩된 폴리펩타이드이다.
또 다른 서열에 대한 특정 퍼센트(예를 들면, 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 동일성"을 가진 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역(또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 정렬될 때 2개의 서열의 비교 시 그 퍼센트의 염기(또는 아미노산)이 동일함을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 소프트웨어 프로그램을 이용함으로써 측정될 수 있다. 디폴트 파라미터가 정렬을 위해 사용된다. 비제한적 예시적 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 구체적으로, 예시적 프로그램은 하기 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP를 포함한다: 유전 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 기대치=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 분류=높은 점수; 데이터베이스=비중복, 진뱅크(GenBank)+EMBL+DDBJ+PDB+진뱅크 CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR. 이 프로그램들의 세부사항은 하기 인터넷 주소에서 확인될 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. 서열 동일성 및 퍼센트 동일성은 이들을 clustalW(웹 주소 genome.jp/tools/clustalw/에서 이용될 수 있음, 2017년 1월 13 마지막 접속) 내로 혼입함으로써 측정될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩타이드들 사이 또는 2개의 핵산 분자들 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열에서 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교된 서열에서 한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 상동하다. 서열들 사이의 상동성의 정도는 서열들에 의해 공유된 일치하거나 상동한 위치들의 수의 함수이다. "관련 없는" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시의 서열들 중 한 서열과 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 나중에 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"유전자"는 전사되고 번역된 후 특정 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. "유전자 생성물" 또는 대안적으로 "유전자 발현 생성물"은 유전자가 전사되고 번역될 때 생성된 아미노산(예를 들면, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)을 지칭한다.
"전사 조절 하에서"는 당분야에서 잘 이해되는 용어이고, 폴리뉴클레오타이드 서열, 통상적으로 DNA 서열의 전사가 전사의 시작에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 작동 가능하게 연결되는 것에 의해 좌우됨을 시사한다. "작동 가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오타이드가 세포에서 작용하게 하는 방식으로 정렬됨을 의미한다. 한 양태에서, 본 발명은 다운스트림 서열, 예를 들면, 자살 유전자, VEGF, 165A VEGF, tet 활성화제 등에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 제공한다.
용어 "코딩한다"는 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때 그의 천연 상태로 존재하거나 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지된 방법에 의해 조작될 때 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 생성하도록 전사될 수 있고/있거나 번역될 수 있는 경우 폴리펩타이드를 "코딩한다"고 기재되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이로부터 유추될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단리된"은 다른 물질을 실질적으로 갖지 않는 분자, 또는 생물학적 또는 세포 물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능적"은 구체적인 특정된 효과를 달성함을 의미하기 위해 임의의 분자, 생물학적 또는 세포 물질을 수식하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용된다. 따라서, 이 용어는 푸린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적 또는 생물학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하거나, 대안적으로 이러한 염기들로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 염기들로 구성된 단일, 이중 또는 다중 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 중합체를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "프로모터"는 유전자와 같은 코딩 서열의 발현을 조절하는 임의의 서열을 지칭한다. 프로모터는 예를 들면, 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 억제 가능한 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. "프로모터"는 전사의 시작 및 속도를 제어하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역인 제어 서열이다. 프로모터는 조절 단백질 및 분자, 예컨대, RNA 중합효소 및 다른 전사 요소가 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 비제한적 예시적 프로모터는 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, U6 프로모터 또는 EF1 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 β-액틴("CBA") 프로모터이다.
본원은 이하에서 CMV, EF1a, SV40, PGK1(인간 또는 마우스), P5, Ubc, 인간 베타 액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, 폴리헤드린(Polyhedrin), CaMKIIa, Gal1, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6 및 알파-1-항트립신을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 특정 표적 특이성을 가진 추가 비제한적 예시적 프로모터를 제공한다. 합성에 의해 유도된 프로모터는 편재적 또는 조직 특이적 발현을 위해 사용될 수 있다. 추가로, 바이러스 유래 프로모터, 예를 들면, CMV, HIV, 아데노바이러스 및 AAV 프로모터는 본원에 개시된 방법에 유용할 수 있고, 이의 일부는 앞서 언급되어 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 전사 효율을 증가시키기 위해 인핸서에 커플링된다. 인핸서의 비제한적 예는 RSV 인핸서 또는 CMV 인핸서를 포함한다.
인핸서는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소이다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 기능 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부는 프로모터 기능 및 인핸서 기능 둘 다를 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내생성", 또는 "외생성" 또는 "이종" 인핸서/프로모터일 수 있다. "내생성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 소정의 유전자와 천연적으로 연결되어 있는 인핸서/프로모터이다. "외생성" 또는 "이종" 인핸서/프로모터는 그 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 유도되도록 유전자 조작(즉, 분자생물학적 기법)에 의해 유전자에 병치되어 있는 인핸서/프로모터이다.
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드 모방 물질(peptidomimetic)의 2개 이상의 서브유닛들의 화합물을 지칭하기 위해 교환 가능하게 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. 상기 서브유닛들은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 서브유닛은 다른 결합, 예를 들면, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산들을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있거나, 대안적으로 이러한 서열로 본질적으로 구성될 수 있거나, 추가로 이러한 서열로 구성될 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신, 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방 물질을 포함하는, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 벡터가 예를 들면, 형질전환 과정에 의해 세포 내부에 놓일 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하거나, 대안적으로 온전한 레플리콘으로 본질적으로 구성되거나, 추가로 온전한 레플리콘으로 구성된 비-염색체 핵산을 지칭한다. 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 바큘로바이러스(bacculovirus), 변형된 바큘로바이러스(bacculovirus), 파보바이러스(papovirus), AAV 벡터, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 알파바이러스(alphavirus) 벡터 등을 포함한다. 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 기반 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스 기반 벡터와 같은 알파바이러스 벡터는 유전자 요법 및 면역요법에도 사용되도록 개발되었다. 문헌[Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 and Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827]을 참조한다. 핵산을 전달하기 위한 예시적 비-바이러스 벡터는 네이키드(naked) DNA; 단독으로 또는 양이온성 중합체와 함께 양이온성 지질과 복합체를 형성한 DNA; 음이온성 리포좀 및 양이온성 리포좀; 일부 경우 리포좀에 함유된, 양이온성 중합체, 예컨대, 불균질한 폴리라이신, 소정의 길이의 올리고펩타이드 및 폴리에틸렌 이민과 축합된 DNA를 포함하거나, 대안적으로 이러한 DNA로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 DNA로 구성된 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리라이신-DNA를 포함하거나, 대안적으로 바이러스 및 폴리라이신-DNA로 본질적으로 구성되거나, 추가로 바이러스 및 폴리라이신-DNA로 구성된 삼원 복합체의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
실시양태에서, 벡터는 유도성 프로모터를 포함한다. 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도성 테트라사이클린 프로모터이다. Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템은 문헌[Gossen & Bujard (1992; Tet-Off) and Gossen et al. (1995; Tet-On)]에 기재된 조절된 고수준 유전자 발현 시스템에의 용이한 접근을 연구원에게 제공한다. Tet-Off 시스템에서, 유전자 발현은 테트라사이클린(Tc) 또는 독시사이클린(Dox; Tc 유도체)이 배양 배지로부터 제거될 때 켜진다. 대조적으로, 발현은 Dox의 첨가에 의해 Tet-On 시스템에서 켜진다. 상기 두 시스템들은 유전자 발현이 다양한 농도의 Tc 또는 Dox에 반응하여 엄격히 조절될 수 있게 한다. Tet 시스템에서의 최대 발현 수준은 매우 높고 CMV와 같은 강한 항시적 포유류 프로모터로부터 수득될 수 있는 최대 수준과 유리하게 비교된다(Yin et al., 1996). 다른 유도성 포유류 발현 시스템과 달리, Tet 시스템에서의 유전자 조절은 매우 특이적이므로, 결과의 해석은 다면발현 효과 또는 비특이적 유도에 의해 복잡해지지 않는다. 이. 콜라이에서, Tet 리프레서(repressor) 단백질(TetR)은 Tn10 트랜스포존 상의 테트라사이클린 내성 오페론의 유전자를 음성적으로 조절한다. TetR은 Tc의 부재 하에서 tet 오퍼레이터(operator) 서열(tetO)에 결합함으로써 이 유전자의 전사를 차단한다. TetR 및 tetO는 포유류 실험 시스템에 사용되기 위한 조절 및 유도의 기반을 제공한다. Tet-On 시스템에서, 조절 단백질은 TetR의 4개의 아미노산 변화에 의해 생성된 "역" Tet 리프레서(rTetR)에 기반한다(Hillen & Berens, 1994; Gossen et al., 1995). 생성된 단백질인 rtTA(테트라사이클린 활성화제 단백질로서도 지칭되는 역 tTA)는 pTet-On 조절제 플라스미드에 의해 코딩된다. 이 유전자는 치료 유전자로서 별도의 벡터에 존재할 수 있거나 동일한 유전자에 코딩될 수 있다.
관련 실시양태에서, 벡터는 테트라사이클린 활성화제 단백질을 코딩하는 핵산; 및 테트라사이클린 활성화제 단백질의 발현을 조절하는 프로모터도 포함하거나, 대안적으로 이러한 핵산 및 프로모터로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 핵산 및 프로모터로 구성된다.
본원에 기재된 벡터, 단리된 세포, 바이러스 팩키징 시스템 및 방법에 유용한 다른 유도성 시스템은 엑디손(ecdysone), 에스트로겐, 프로게스테론, 화학적 이량체화 유도제, 및 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노사이드(EPTG)에 의한 조절을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 발현 시스템" 또는 "재조합 벡터"는 재조합에 의해 형성된 특정 유전 물질의 발현을 위한 유전 구축물 또는 구축물들을 지칭한다.
세포 집단은 표현형 및/또는 유전형이 동일하거나(클론) 동일하지 않은 하나 초과의 세포의 집합체를 의미한다. 실질적으로 균질한 세포 집단은 미리 선택된 마커에 의해 측정될 때 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 동일한 표현형을 가진 집단이다.
"유전자 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 전달할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예는 리포좀; 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함하는 마이셀 생체적합성 중합체; 지단백질; 폴리펩타이드; 폴리사카라이드; 리포폴리사카라이드; 인공 바이러스 외피; 금속 입자; 및 다양한 진핵 숙주들 및 원핵 숙주들에서의 발현용으로 기재되어 있고 간단한 단백질 발현을 위해 사용될 수 있을뿐만 아니라 유전자 요법에도 사용될 수 있는 세균 또는 바이러스, 예컨대, 바큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및 당분야에서 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클이다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 전달 비히클의 사용을 통해 세포 또는 조직에게 전달될 수 있다. 본원에서 사용된 "유전자 전달", "유전자 수송", "형질도입" 등은 도입을 위해 이용된 방법과 관계없이 숙주 세포 내로의 외생성 폴리뉴클레오타이드(종종 "형질전이유전자"로서 지칭됨)의 도입을 지칭하는 용어이다. 이러한 방법은 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드의 전달을 용이하게 하는 기법(예컨대, 전기천공, "유전자 총" 전달 및 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위해 이용되는 다양한 다른 기법들)뿐만 아니라 (예를 들면, 바이러스 감염/형질감염, 또는 다양한 다른 단백질 기반 또는 지질 기반 유전자 전달 복합체들에 의한) 벡터 매개 유전자 전달과 같은 다양한 잘 공지된 기법들도 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정한 유지는 전형적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에 적합한 복제 기점을 함유하거나 숙주 세포의 레플리콘, 예컨대, 염색체외 레플리콘(예를 들면, 플라스미드), 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체 내로 통합될 것을 요구한다. 다수의 벡터들은 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 바와 같이 포유류 세포에게의 유전자의 전달을 매개할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "코돈 최적화된"은 코딩 서열에 정상적으로 존재하는 하나 이상의 코돈을 동일한(동일한 의미의) 아미노산에 대한 코돈으로 치환시킴으로써 코딩 서열의 발현을 증가시키기 위해 야생형 코딩 서열(예를 들면, PPT1에 대한 코딩 서열)에 비해 최적화된 코딩 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치환은 희귀 코돈(예를 들면, 인간 코돈)을 최소화하고/하거나, 총 GC 함량을 증가시키고/시키거나, CpG 함량을 감소시키고/시키거나, 숨은 스플라이스 공여자 또는 수용자 부위를 제거하고/하거나, 리보좀 진입 부위, 예컨대, 코작(Kozak) 서열을 추가하거나 제거한다. 2017년 12월 21일에 공개된 국제 PCT 공개 제WO 2017/218450호(본원에 참고로 포함됨)는 코돈 최적화된 CLN1 유전자 서열, 코돈 최적화된 CLN1 유전자를 제조하는 방법, 및 코돈 최적화된 CLN1 유전자를 사용하는 단일요법을 전달하는 일반적인 방법을 개시한다.
"플라스미드"는 염색체 DNA와 관계없이 복제할 수 있는, 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우, 플라스미드는 원형 이중 가닥이다. 플라스미드는 미생물 집단 내에서의 수평적 유전자 전달을 위한 기작을 제공하고 전형적으로 소정의 환경 상태 하에서 선택적 이점을 제공한다. 플라스미드는 경쟁 환경 적소에서 천연 생성 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자를 전달할 수 있거나, 대안적으로 생성된 단백질은 유사한 환경 하에서 독소로서 작용할 수 있다.
유전자 조작에 사용되는 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터"로서 지칭된다. 많은 플라스미드들은 이러한 사용을 위해 상업적으로 입수될 수 있다. 복제되는 유전자는 세포가 특정 항생제에 대한 내성을 갖게 만드는 유전자, 및 여러 통상적으로 사용되는 제한 부위들을 함유하여 이 위치에서의 DNA 단편의 용이한 삽입을 가능하게 하는 짧은 영역인 다중 클로닝 부위(MCS, 또는 폴리링커)를 함유하는 플라스미드의 카피 내로 삽입된다. 플라스미드의 또 다른 주요 용도는 다량의 단백질을 만드는 것이다. 이 경우, 연구원은 관심 있는 유전자를 가진 플라스미드를 함유하는 세균을 생장시킨다. 세균이 그의 항생제 내성을 부여하기 위해 단백질을 생성하는 것처럼, 세균은 삽입된 유전자로부터 다량의 단백질을 생성하도록 유도될 수도 있다.
유전자 전달이 DNA 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스(Ad) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에 의해 매개되는 양태에서, 벡터 구축물은 바이러스 게놈 또는 이의 일부 및 형질전이유전자를 포함하거나, 대안적으로 바이러스 게놈 또는 이의 일부 및 형질전이유전자로 본질적으로 구성되거나, 추가로 바이러스 게놈 또는 이의 일부 및 형질전이유전자로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 아데노바이러스(Ad)는 50개 이상의 혈청형을 포함하는, 상대적으로 잘 특징규명된 균질한 바이러스 군이다. Ad는 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 요구하지 않는다. 재조합 Ad 유래 벡터, 특히 야생형 바이러스의 재조합 및 생성 잠재력을 감소시키는 Ad 유래 벡터도 구축되었다. 이러한 벡터는 타카라 바이오 유에스에이(Takara Bio USA)(캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 벡터 바이오랩스(Vector Biolabs)(펜실배니아주 필라델피아 소재) 및 크리에이티브 바이오진(Creative Biogene)(뉴욕주 셜리 소재)과 같은 공급원들로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 야생형 AAV는 높은 감염성 및 특이성을 가지므로, 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 문헌[Wold and Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, and Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996]을 참조한다.
프로모터, 및 폴리뉴클레오타이드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위 둘 다를 함유하는 벡터는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있고, 아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)(캘리포니아주 산타 클라라 소재) 및 프로메가 바이오텍(Promega Biotech)(위스콘신주 매디슨 소재)과 같은 공급원으로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해, 클론의 5' 및/또는 3' 비번역 부분을 제거하거나, 추가하거나 변경시켜, 전사 또는 번역의 수준에서 가외의 잠재적 부적절한 대안적 번역 시작 코돈 또는 발현을 방해할 수 있거나 감소시킬 수 있는 다른 서열을 제거할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 컨센서스 리보좀 결합 부위를 시작 코돈의 바로 5'에 삽입하여 발현을 향상시킬 수 있다.
유전자 전달 비히클은 DNA/리포좀 복합체, 마이셀 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체도 포함한다. 표적화 항체 또는 이의 단편도 포함하거나, 대안적으로 표적화 항체 또는 이의 단편으로 본질적으로 구성되거나, 추가로 표적화 항체 또는 이의 단편으로 구성된 리포좀은 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 세포 또는 세포 집단에게 전달하는 것 이외에, 본원에 기재된 단백질을 세포 또는 세포 집단에 직접 도입하는 것은 비제한적 단백질 형질감염 기법에 의해 수행될 수 있고, 대안적으로 본원에 개시된 단백질의 발현을 향상시킬 수 있고/있거나 이 단백질의 활성을 촉진할 수 있는 배양 조건은 다른 비제한적 기법이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신호 펩타이드" 또는 "신호 폴리펩타이드"는 새로 합성된 분비 또는 막 폴리펩타이드 또는 단백질의 N-말단에 통상적으로 존재하는 아미노산 서열을 의미한다. 이것은 폴리펩타이드를 특정 세포 위치로, 예를 들면, 세포막을 가로질러, 세포막 내로, 또는 핵 내로 향하게 하도록 작용한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 국소화 후 제거된다. 신호 펩타이드의 예는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 비제한적 예는 미국 특허 제8,853,381호, 제5,958,736호 및 제8,795,965호에 기재된 신호 펩타이드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 입자의 단백질성 껍질 또는 외피를 지칭한다. 캡시드는 바이러스 게놈을 캡시드화하고 보호하고 수송하고 숙주 세포 내로 방출하도록 작용한다. 캡시드는 일반적으로 단백질("캡시드 단백질")의 올리고머성 구조적 서브유닛으로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "캡시드화된"은 바이러스 캡시드 내에 봉입됨을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스 또는 플라스미드의 언급에서 용어 "헬퍼"는 바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자, 예컨대, 본원에 개시된 변형된 AAV의 복제 및 팩키징에 필요한 추가 성분을 제공하기 위해 사용된 바이러스 또는 플라스미드를 지칭한다. 헬퍼 바이러스에 의해 코딩된 성분은 비리온 조립, 캡시드화, 게놈 복제 및/또는 팩키징을 위해 요구된 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 헬퍼 바이러스는 바이러스 게놈의 복제에 필요한 효소를 코딩할 수 있다. AAV 구축물과 함께 사용되기에 적합한 헬퍼 바이러스 및 플라스미드의 비제한적 예는 pHELP(플라스미드), 아데노바이러스(바이러스) 또는 헤르페스바이러스(바이러스)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "AAV"는 아데노 관련 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노 관련 바이러스는 공감염 헬퍼 바이러스에 의해 특정 기능이 제공된 세포에서만 생장하는 단일 가닥 DNA 파보바이러스이다. AAV의 일반적인 정보 및 검토는 예를 들면, 문헌[Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228, and Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)]에서 발견될 수 있다. 다양한 혈청형들이 심지어 유전자 수준에서도 구조적 및 기능적으로 꽤 밀접히 관련되어 있음이 잘 공지되어 있기 때문에, 이 문헌들에 기재된 동일한 원리는 문헌들의 공개일 후 특징규명된 추가 AAV 혈청형에 적용될 것임이 충분히 예상된다(예를 들면, 문헌[Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)] 참조). 예를 들면, 모든 AAV 혈청형들은 동종 rep 유전자에 의해 매개된 매우 유사한 복제 성질을 명확히 나타내고; 3개의 관련 캡시드 단백질들, 예컨대, AAV2에서 발현된 캡시드 단백질들을 모두 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형들 사이의 광범위한 교차 하이브리드화; 및 "역위 말단 반복부 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서의 유사한 자가 어닐링 분절의 존재를 보여주는 이종이중체 분석에 의해 더 암시된다. 유사한 감염성 패턴도 각각의 혈청형에서의 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있음을 암시한다.
본원에서 사용된 "AAV 벡터"는 하나 이상의 이종 핵산(HNA) 서열 및 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부 서열(ITR)을 포함하거나, 이러한 서열들로 본질적으로 구성되거나, 이러한 서열들로 구성된 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 예를 들면, 숙주 세포의 형질감염에 의해 rep 및 cap 유전자 생성물의 기능성을 제공하는 숙주 세포에 존재할 때 복제될 수 있고 감염성 바이러스 입자로 팩키징될 수 있다. 실시양태에서, AAV 벡터는 프로모터, 적어도 하나의 단백질 또는 RNA를 코딩할 수 있는 적어도 하나의 핵산, 및/또는 감염성 AAV 입자로 팩키징된 플랭킹 ITR 내의 인핸서 및/또는 터미네이터를 함유한다. 캡시드화된 핵산 부분은 AAV 벡터 게놈으로서 지칭될 수 있다. AAV 벡터를 함유하는 플라스미드는 제조 목적을 위한 요소, 예를 들면, 항생제 내성 유전자 등도 함유할 수 있으나, 이들은 캡시드화되지 않으므로, AAV 입자의 일부를 형성하지 않는다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생성은 반드시 AAV 벡터의 생성을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 함유되기 때문이다.
일부 실시양태에서, AAV는 복제 결핍 파보바이러스이고, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 2개의 145 뉴클레오타이드 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는 길이 약 4.7 kb이다. AAV의 다수의 혈청형들이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다. 예를 들면, AAV-1의 완전한 게놈은 진뱅크 등록번호 NC_002077로 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 진뱅크 등록번호 NC_001401로 문헌[Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에서 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 진뱅크 등록번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 진뱅크 등록번호 NC_001829로 제공되고; AAV-5 게놈은 진뱅크 등록번호 AF085716으로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 진뱅크 등록번호 NC_00 1862로 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 진뱅크 등록번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고; AAV-9 게놈은 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에서 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌[Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에서 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌[Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에서 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제9,434,928호에서 제공된다. 미국 특허 제9,434,928호는 캡시드 단백질 및 자가 상보적 게놈의 서열도 제공한다. 한 양태에서, 게놈은 자가 상보적 게놈이다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/팩키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 유도하는 시스 작용 서열은 AAV ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터들(이들의 상대적 맵 위치로 인해 p5, p19 및 p40으로서 명명됨)은 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 유도한다. (뉴클레오타이드 2107 및 2227에서) 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 커플링된 2개의 rep 프로모터들(p5 및 pi 9)은 rep 유전자로부터의 4개의 rep 단백질들(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생성을 야기한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈의 복제를 담당하는 다수의 효소 성질들을 가진다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 3개의 캡시드 단백질들 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 대안적 스플라이싱 및 비-콘센서스 번역 시작 부위는 상기 3개의 관련 캡시드 단백질들의 생성을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치된다. AAV의 생명 주기 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에 검토되어 있다.
AAV는 예를 들면, 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에게 전달하는 벡터로서 흥미를 끄는 독특한 특징을 가진다. 배양물 중의 세포의 AAV 감염은 비세포변성 감염이고, 인간 및 다른 동물의 천연 감염은 조용한 무증상 감염이다. 더욱이, AAV는 많은 포유류 세포들을 감염시켜, 생체내에서 많은 상이한 조직들을 표적화할 가능성을 허용한다. 나아가, AAV는 느리게 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 본질적으로 이 세포들의 수명 동안 전사 활성 핵 에피좀(염색체외 요소)으로서 지속될 수 있다. AAV 전구바이러스 게놈은 플라스미드 내에 클로닝된 DNA로서 삽입되고, 이것은 재조합 게놈의 구축을 실행 가능하게 만든다. 더욱이, AAV 복제 및 게놈 캡시드화를 유도하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되어 있기 때문에, (복제 및 구조적 캡시드 단백질, 즉 rep-cap를 코딩하는) 게놈의 내부 대략 4.3 kb의 일부 또는 전부는 외래 DNA로 대체될 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위해, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 AAV가 매우 안정하고 왕성한 바이러스라는 점이다. 이 바이러스는 아데노바이러스를 불활성화시키는 데 사용되는 조건(수 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 용이하게 견딤으로써, AAV의 냉온 보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV 감염 세포는 수퍼감염에 대한 내성을 갖지 않는다.
다수의 연구들은 근육에서의 장기간(> 1.5년) 재조합 AAV 매개 단백질 발현을 입증하였다. 문헌[Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); and Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). See also, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) and Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001)]을 참조한다. 더욱이, 문헌[Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) and Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997)]에 기재된 바와 같이 많은 혈관들이 근육에 있기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 근육내 주사 후 전신 순환계에서의 형질전이유전자 생성물의 출현을 야기하였다. 나아가, 문헌[Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)]은 골격 근섬유가 정확한 항체 글리코실화, 폴딩 및 분비에 필요한 세포 인자를 가진다는 것을 입증하였는데, 이는 근육이 분비된 단백질 치료제를 안정하게 발현할 수 있음을 시사한다. rAAV 게놈 내의 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV PHP.B 및 AAV rh74를 포함하나 이들로 제한되지 않는, 재조합 바이러스가 유도될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. 슈도타이핑된 rAAV의 생성은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 01/83692호에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들면, 캡시드 돌연변이를 가진 rAAV도 고려된다. 예를 들면, 문헌[Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]을 참조한다. 다양한 AAV 혈청형들의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당분야에서 공지되어 있다. 다른 적합한 AAV 입자는 전체적으로, 그러나 특히 AAV 입자 및 AAV 캡시드 단백질에 대해 본원에 참고로 포함된, 2019년 12월 4일에 출원된 국제 특허출원 제PCT/US2019/064396호에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지"는 "표지부착된" 조성물을 생성하도록 검출될 조성물, 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 상기 용어는 삽입된 서열의 발현 시 신호, 예컨대, 녹색 형광 단백질(GFP) 등을 제공할, 폴리뉴클레오타이드 접합된 서열도 포함한다. 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나(예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉진할 수 있다. 표지는 소규모 검출에 적합할 수 있거나 고처리율 스크리닝에 더 적합할 수 있다. 따라서, 적합한 표지는 방사성동위원소, 플루오로크롬, 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 비롯한 단백질을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 표지는 간단히 검출될 수 있거나 정량될 수 있다. 간단히 검출되는 반응은 일반적으로 존재만이 확인되는 반응을 포함하거나, 대안적으로 이러한 반응으로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 반응으로 구성되는 반면, 정량되는 반응은 일반적으로 정량 가능한(예를 들면, 수치적으로 보고될 수 있는) 값, 예컨대, 강도, 편광 및/또는 다른 성질을 가진 반응을 포함하거나, 대안적으로 이러한 반응으로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 반응으로 구성된다. 발광 또는 형광 어세이에서, 검출 가능한 반응은 결합에 실제로 관여하는 어세이 성분과 회합된 발광단 또는 형광단을 사용함으로써 직접적으로 생성될 수 있거나, 또 다른(예를 들면, 리포터 또는 지표) 성분과 회합된 발광단 또는 형광단을 사용함으로써 간접적으로 생성될 수 있다.
신호를 생성하는 발광 표지의 예는 생체발광 및 화학발광을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 검출 가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호의 변화 또는 생성을 포함하거나, 대안적으로 이러한 변화 또는 생성으로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 변화 또는 생성으로 구성된다. 어세이 성분을 발광 표지부착시키기에 적합한 방법 및 발광단은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)]에 기재되어 있다. 발광 프로브의 예는 에쿠오린(aequorin) 및 루시퍼라제(luciferase)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 형광 표지의 예는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리쓰로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린(Malacite green), 스틸벤(stilbene), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루(Cascade Blue).TM. 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 다른 적합한 광학 염료는 문헌[Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)]에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 형광 표지는 세포 또는 조직의 표면에 존재하는 세포 성분, 예컨대, 세포 표면 마커에의 공유 부착을 용이하게 하도록 작용화된다. 이소티오시아네이트 기, 아미노 기, 할로아세틸 기, 말레이미드, 석신이미딜 에스테르 및 설포닐 할라이드를 포함하나 이들로 제한되지 않는 적합한 작용기는 모두 형광 표지를 제2 분자에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 형광 표지의 작용기의 선택은 링커, 작용제, 마커 또는 제2 표지부착제에의 부착 부위에 의해 좌우될 것이다.
형광 표지는 세포 성분 또는 화합물에 직접적으로 부착될 수 있거나, 대안적으로 링커를 통해 부착될 수 있다. 형광 표지를 중간체에 간접적으로 연결하는 데 사용되기에 적합한 결합 쌍은 항원/항체, 예를 들면, 로다민/항-로다민, 바이오틴/아비딘 및 바이오틴/스트렙타비딘을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
"조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와 또 다른 불활성(예를 들면, 검출 가능한 표지) 또는 활성(예를 들면, 유전자 전달 비히클) 화합물 또는 조성물의 조합물을 의미하기 위한 것이다.
"약학 조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와, 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서의 진단 또는 치료 사용에 적합하게 만드는 불활성 또는 활성 담체, 예컨대, 고체 지지체의 조합물을 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 표준 약학 담체들 중 임의의 표준 약학 담체, 예컨대, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 및 유화액, 예컨대, 유/수 또는 수/유 에멀전, 및 다양한 유형의 습윤화제를 포괄한다. 조성물은 안정화제 및 보존제도 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해서는 문헌[Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)]을 참조한다.
진단 또는 치료의 "대상체"는 세포 또는 동물, 예컨대, 포유류 또는 인간이다. 대상체는 특정 종으로 제한되지 않고, 진단 또는 치료 대상 비인간 동물, 및 감염 대상 비인간 동물 또는 동물 모델, 예를 들면, 원숭이, 뮤린, 예컨대, 래트, 마우스, 친칠라, 갯과 동물, 예컨대, 개, 토끼과 동물, 예컨대, 토끼, 가축, 스포츠 동물 및 반려동물을 포함한다. 인간 환자도 상기 용어에 포함된다.
용어 "조직"은 살아있거나 죽은 유기체의 조직, 또는 살아있거나 죽은 유기체로부터 유래하거나 이러한 유기체를 모방하도록 디자인된 임의의 조직을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 조직은 건강할 수 있고/있거나, 병들 수 있고/있거나, 유전자 돌연변이를 가질 수 있다. 생물학적 조직은 임의의 단일 조직(예를 들면, 상호연결될 수 있는 세포의 집합체), 또는 유기체의 신체의 장기 또는 부분 또는 영역을 구성하는 조직 군을 포함할 수 있다. 조직은 균질한 세포 물질을 포함할 수 있거나, 대안적으로 균질한 세포 물질로 본질적으로 구성될 수 있거나, 추가로 균질한 세포 물질로 구성될 수 있거나, 조직은 예를 들면, 폐 조직, 골격 조직 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있는, 흉부를 비롯한 신체의 영역에서 발견된 복합 구조물과 같은 복합 구조물일 수 있다. 예시적 조직은 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담도, 십이지장, 복부 대동맥, 장골 정맥, 심장 및 장(이들의 임의의 조합을 포함함)으로부터 유래한 조직들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "IBD 관련 장애"는 정상 대상체, 증상을 나타내지 않는 대상체 또는 집단에서의 발현 수준 또는 활성에 비해 대상체에서의 CLN1 유전자의 감소된 또는 변경된 발현에 의해 야기된 질환, 장애, 증후군 또는 병태, 또는 이러한 발현의 증상을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에서 질환을 "치료하는" 또는 질환의 "치료"는 (1) 질환의 소인을 갖거나 질환의 증상을 아직 표시하지 않은 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (2) 질환을 억제하거나 그의 발생을 정지시키는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 호전시키거나, 질환 또는 질환의 증상의 퇴행을 야기하는 것을 지칭한다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 비롯한 유리한 또는 원하는 결과를 수득하는 접근법이다. 본 기술의 목적을 위해, 유리한 또는 원하는 결과는 검출 가능한 또는 검출 불가능한 하나 이상의 증상의 완화 또는 호전, (질환을 포함하는) 병태의 정도의 감소, (질환을 포함하는) 병태의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, (질환을 포함하는) 병태 진행의 지연 또는 늦춤, (질환을 포함하는) 병태 상태의 호전 또는 경감, 및 (부분적 또는 전체적) 관해를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 달성하기에 충분한 양을 의미하기 위한 것이다. 치료적 또는 예방적 적용 상황에서, 유효량은 문제가 되는 병태의 유형 및 중증도, 및 개별 대상체의 특성, 예컨대, 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약학 조성물에 대한 내성에 의해 좌우될 것이다. 유전자 요법의 상황에서, 일부 실시양태에서 유효량은 대상체에 결여된 유전자의 일부 또는 전체 기능의 회복을 야기하기에 충분한 양이다. 다른 실시양태에서, AAV 바이러스 입자의 유효량은 대상체에서 유전자의 발현을 야기하기에 충분한 양이다. 숙련된 당업자는 이 요인들 및 다른 요인들에 따라 적절한 양을 결정할 수 있을 것이다.
용어 "vg"는 유전자 요법을 위해 제공된 바이러스 유닛을 지칭하고 전형적으로 대상체 kg당 vg로서 표시된다. 본원에 기재된 실험은 마우스를 치료하는 데 사용된 양이고, 치료받는 대상체가 마우스가 아닐 때 상기 양은 치료받는 대상체, 예를 들면, 인간, 유아 또는 신생아에 적절한 양으로 전환된다는 것이 추론된다. 한 양태에서, 투여되는 양은 vg/kg이므로, 치료받는 대상체의 크기 및 체중의 차이를 설명한다.
실시양태에서, 유효량은 해당 적용의 크기 및 성질에 의해 좌우될 것이다. 유효량은 표적 대상체의 성질 및 민감도, 및 사용 방법에 의해서도 좌우될 것이다. 숙련된 당업자는 이 고려사항들 및 다른 고려사항들을 기반으로 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 유효량은 실시양태에 따라 조성물의 1회 이상의 투여를 포함할 수 있거나, 대안적으로 이러한 투여로 본질적으로 구성될 수 있거나, 추가로 이러한 투여로 구성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여한다" 또는 "투여"는 물질을 동물 또는 인간과 같은 대상체에게 전달하는 것을 의미하기 위한 것이다. 투여는 치료 과정 전체에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 1회 용량으로 달성될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 용량을 결정하는 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있고, 치료에 사용된 조성물, 치료의 목적, 및 치료받는 대상체의 연령, 건강 또는 성별에 따라 달라질 것이다. 단회 또는 다회 투여는 치료 의사, 또는 반려동물 및 동물의 경우 치료 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적합한 용량 제제 및 작용제 투여 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 투여 경로도 결정될 수 있고, 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있고 치료에 사용된 조성물, 치료의 목적, 치료받는 대상체의 건강 상태 또는 질환 단계 및 표적 세포 또는 조직에 따라 달라질 것이다. 투여 경로의 비제한적 예는 정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수강내, 뇌실하, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 망막하, 유리체내, 관절내, 안내, 복강내, 자궁내, 피내, 피하, 경피, 경점막 및 흡입을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 적용될 때 용어 "변형된"은 하나 이상의 결실, 추가, 치환 또는 이들의 임의의 조합으로 인한 야생형 서열과 상이한 서열을 지칭한다.
본 개시를 수행하는 방식
본원은 IBD 또는 IBD 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 방법으로서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 척수강내 투여 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 후속 정맥내 투여로 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 단계를 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이러한 단계로 구성된 방법을 제공한다. 임의로, 정맥내 투여는 척수강내 투여보다 앞설 수 있다.
한 양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 게놈의 일부이고, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전달은 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 투여함으로써 달성된다. 따라서, 한 양태에서, 본원은 대상체에서 유아 바텐병(IBD) 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 바이러스 입자의 조합된 척수강내 및 정맥내 투여를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 사용되는 AAV 벡터 입자, AAV 벡터 및 캡시드 단백질도 제공한다. 바이러스 입자는 AAV 바이러스 입자, 예를 들면, AAV9 바이러스 입자일 수 있다.
한 양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 야생형 CLN1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 CLN1의 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고, 인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된다. 한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들 각각 또는 이들의 상보체에 대한 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 등가물은 코돈 최적화된 뉴클레오타이드에서 동일하다. 한 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 대한 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 가진 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
서열번호 1: 인간 코돈 최적화된 CLN1 오픈 리딩 프레임(추가된 정지 코돈은 밑줄로 표시됨)
서열번호 2(야생형 CLN1)는 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 웹 주소(genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/HGNC:9325)(2019년 4월 29일 마지막 접속)에 의해 제공된, 하기 표시된 서열로서 개시된다:
적합한 CLN1 유전자는 하기 서열번호 3에 대한 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%의 동일성, 적어도 약 99%의 동일성 또는 100%의 동일성을 가진 PPT1 단백질을 코딩한다:
PPT1 단백질은 서열번호 3과 상이한 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산을 가질 수 있다. PPT1 단백질은 서열번호 3으로부터 결실된 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산을 가질 수 있다.
대상체는 포유류, 예를 들면, 인간일 수 있다. 인간은 유아 인간, 예를 들면, 약 2개월 내지 약 24개월, 약 2세 내지 12세, 약 2세 내지 5세, 또는 2세 내지 5세의 유아 인간일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 추가 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 예를 들면, 이때 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결되고/되거나; 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터이고/이거나; 폴리뉴클레오타이드는 인핸서에 작동 가능하게 연결되고/되거나; 인핸서는 사이토메갈로바이러스 인핸서이고/이거나; 폴리뉴클레오타이드는 인트론에 작동 가능하게 연결되고/되거나; 인트론은 하이브리드/변형된 MVM 인트론이고/이거나; 폴리뉴클레오타이드는 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결되고/되거나; 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다.
폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위한 벡터 게놈의 일부일 수 있고, 임의로 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 게놈은 야생형 캡시드 단백질, 돌연변이된 캡시드 단백질, 조직 향성 캡시드 단백질, 및 야생형 캡시드 단백질에 비해 변경된 향성을 가진 변형된 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함하는 바이러스 입자 내로 팩키징되고, 이때 변형된 캡시드 단백질은 임의로 간에 의해 탈표적화된다.
벡터는 적어도 하나의 아데노 관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있고, 예를 들면, 벡터는 2개의 AAV ITR을 포함하고; 이때 2개의 AAV ITR은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖고/갖거나; 2개의 AAV ITR은 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖고/갖거나; AAV ITR은 AAV2 ITR이고/이거나; 바이러스 벡터는 자가 상보적 AAV 게놈이다.
한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 게놈은 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 AAV ITR, 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 폴리아데닐화 부위 및 AAV ITR을 포함한다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이체 AAV ITR, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위 및 야생형 AAV ITR을 포함한다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 2, 또는 이들 각각의 등가물을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자는 대상체에서 기능적 CLN1(즉, PPT1 단백질)을 발현시킬 양으로 투여된다. 투여된 양은 대상체에서의 기능적 CLN1(즉, PPT1 단백질)의 일시적 또는 연장된 발현을 위한 것일 수 있다.
한 양태에서, 척수강내로 투여된 양은 정맥내로 전달된 양과 동일하거나 상이하다.
추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자는 증상 발병 전 또는 증상 발병 후에 대상체에게 척수강내 및 정맥내로 투여된다. IBD를 가진 아동은 일반적으로 2개월 내지 24개월 사이에 증상을 발생시키고, 종종 약 18개월까지 증상을 발생시킨다.
전달되는 양은 대상체 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것이다. 한 양태에서, 양은 중간 용량 또는 고용량으로서 간주된다. 단지 예시 목적으로, 전달되는 양(일례로서 마우스를 사용함)은 약 2.0x1011 vg 내지 약 8.0x1011 vg 또는 2.0x1011 vg/kg 내지 약 8.0x1011 vg/kg이다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 약 7.0x1010 vg 내지 약 8.0x1011 vg 또는 7.0x1010 vg/kg 내지 약 8.0x1011 vg/kg의 양으로 전달된다. 추가 양태에서, 투여는 증상 발병 전에 약 7.0x1010 vg(또는 vg/kg) 내지 약 8.0x1011 vg(또는 vg/kg)의 양으로 전달된다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 약 7.0x1011 vg(또는 vg/kg) 내지 약 8.0x1011 vg(또는 vg/kg)의 양으로 투여된다.
한 양태에서, 인간의 척수강내 투여를 위한 바이러스 입자의 양은 약 1.0x1012 vg 내지 약 1.0x1017 vg이다. 실시양태에서, 인간의 척수강내 투여를 위한 양은 약 1.0x1012 vg 내지 약 1.0x1014 vg, 약 1.0x1013 vg 내지 약 1.0x1015 vg, 약 1.0x1014 vg 내지 약 1.0x1016 vg, 약 1.0x1015 vg 내지 약 1.0x1017 vg, 약 1.0x1013 vg 내지 약 1.0x1014 vg, 약 1.0x1014 vg 내지 약 1.0x1015 vg, 또는 약 1.0x1015 vg 내지 약 1.0x1016 vg이다.
한 양태에서, 인간의 정맥내 투여를 위한 바이러스 입자의 양은 약 1.0x1011 vg/kg 내지 약 2.0x1016 vg/kg이다. 실시양태에서, 인간의 정맥내 투여를 양은 약 1.0x1011 vg/kg 내지 약 2.0x1013 vg/kg, 약 1.0x1012 vg/kg 내지 약 2.0x1014 vg/kg, 약 1.0x1013 vg/kg 내지 약 2.0x1015 vg/kg, 약 1.0x1014 vg/kg 내지 약 2.0x1016 vg/kg, 약 1.0x1012 vg/kg 내지 약 2.0x1013 vg/kg, 약 1.0x1013 vg/kg 내지 약 2.0x1014 vg/kg, 약 1.0x1014 vg/kg 내지 약 2.0x1015 vg/kg이다.
IBD의 치료 이외에, 상기 방법은 CLN1 유전자의 발현과 관련된 임의의 장애, 예컨대, 유아기, 후기 유아기, 청소년기 또는 성인기 발병 신경 세로이드 리포푸신증을 치료하는 데 이용될 수 있다. 상기 방법은 CLN1의 낮은 또는 비정상적인 발현으로부터 비롯된 다른 IBD 관련 장애를 위해 이용될 수 있고, 상기 다른 IBD 관련 장애의 일부는 본원에 참고로 포함된 국제 특허출원 공개 제WO 2017/218450호에 기재되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체 내에 CLN1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 및 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트도 제공한다.
AAV 바이러스 입자를 제조하는 방법
다양한 접근법들을 이용하여 AAV 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 실시양태에서, 팩키징은 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드 및 세포주를 사용함으로써 달성된다. 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 바이러스 벡터 생성을 용이하게 하는 요소 및 서열을 함유한다. 또 다른 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 팩키징 세포주가 헬퍼 플라스미드를 사용한 추가 형질감염을 요구하지 않도록 팩키징 세포주의 게놈 내로 안정하게 혼입된다.
실시양태에서, 세포는 팩키징 또는 헬퍼 세포주이다. 실시양태에서, 헬퍼 세포주는 진핵 세포, 예를 들면, HEK 293 세포 또는 293T 세포이다. 실시양태에서, 헬퍼 세포는 효모 세포 또는 곤충 세포이다.
실시양태에서, 세포는 테트라사이클린 활성화제 단백질을 코딩하는 핵산; 및 테트라사이클린 활성화제 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 포함한다. 실시양태에서, 테트라사이클린 활성화제 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 항시적 프로모터이다. 실시양태에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(PGK) 또는 CMV 프로모터이다.
헬퍼 플라스미드는 예를 들면, 복제 능력 AAV를 생성하지 않으면서, 복제 불능 AAV를 팩키징하는 데 요구된 모든 비리온 단백질들을 트랜스로 코딩하고 고역가에서 복제 불능 AAV를 팩키징할 수 있는 비리온 단백질을 생성하는 복제 불능 바이러스 게놈으로부터 유래한 적어도 하나의 바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함할 수 있다.
AAV를 팩키징하는 헬퍼 플라스미드는 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2004/0235174 A1호 참조). 본원에서 언급된 바와 같이, AAV 헬퍼 플라스미드는 비제한적 예로써, 그들 각각의 원래의 프로모터 또는 이종 프로모터에 의해 제어되는 Ad5 유전자 E2A, E4 및 VA를 헬퍼 바이러스 DNA 서열로서 함유할 수 있다. AAV 헬퍼 플라스미드는 원하는 표적 세포의 형질감염의 간단한 검출을 허용하기 위해 형광 단백질과 같은 마커 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 추가로 함유할 수 있다.
본 개시는 본원에 개시된 AAV 헬퍼 플라스미드들 중 어느 한 AAV 헬퍼 플라스미드 및 본원에 개시된 AAV 벡터들 중 어느 한 AAV 벡터로 팩키징 세포주를 형질감염시키는 단계를 포함하는 AAV 입자 제조 방법을 제공한다. 실시양태에서, AAV 헬퍼 플라스미드 및 AAV 벡터는 팩키징 세포주 내로 공형질감염된다. 실시양태에서, 세포주는 포유류 세포주, 예를 들면, 인간 배아 신장(HEK) 293 세포주이다. 본 개시는 본원에 개시된 AAV 벡터들 및/또는 AAV 입자들 중 어느 한 AAV 벡터 및/또는 AAV 입자를 포함하는 세포를 제공한다.
약학 조성물
본 개시는 본원에 기재된 AAV 벡터들, AAV 캡시드들 및/또는 AAV 입자들 중 어느 한 AAV 벡터, AAV 캡시드 및/또는 AAV 입자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 전형적으로, AAV 입자는 치료를 위해 투여된다.
본원에 기재된 바와 같이, 약학 조성물은 활성 성분(예를 들면, 바이러스 입자 또는 재조합 벡터)을 부형제 또는 다른 보조 성분과 접촉시키는 단계, 생성물을 용량 유닛으로 나누거나 팩키징하는 단계를 포함하나 이들로 제한되지 않는, 약학 분야에서 공지되어 있거나 개발된 임의의 방법에 의해 제제화될 수 있다. 본 개시의 바이러스 입자는 바람직한 특징, 예를 들면, 증가된 안정성, 증가된 세포 형질감염, 지속된 또는 지연된 방출, 생체분포 또는 향성, 생체내에서의 코딩된 단백질의 조절된 또는 향상된 번역, 및 생체내에서의 코딩된 단백질의 방출 프로파일을 갖도록 제제화될 수 있다.
따라서, 약학 조성물은 식염수, 리피도이드(lipidoid), 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스(lipoplex), 코어-쉘 나노입자, 펩타이드, 단백질, (예를 들면, 대상체 내로의 이식을 위해) 바이러스 벡터로 형질감염된 세포, 나노입자 모방 물질 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 실시양태에서, 약학 조성물은 나노입자로서 제제화된다. 실시양태에서, 나노입자는 자가 조립된 핵산 나노입자이다.
본 개시에 따른 약학 조성물은 단일 유닛 용량 및/또는 복수의 단일 유닛 용량으로서 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량, 및/또는 이러한 용량의 편리한 분획, 예를 들면, 이러한 용량의 2분의 1 또는 3분의 1과 동등하다. 본 발명의 제제는 함께 바이러스 벡터의 안정성을 증가시키고/시키거나, 바이러스 벡터에 의한 세포 형질감염 또는 형질도입을 증가시키고/시키거나, 바이러스 벡터 코딩된 단백질의 발현을 증가시키고/시키거나, 바이러스 벡터 코딩된 단백질의 방출 프로파일을 변경시키는 양으로 각각 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 약학 조성물은 부형제를 포함한다. 부형제의 비제한적 예는 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
실시양태에서, 약학 조성물은 냉동보호제를 포함한다. 용어 "냉동보호제"는 냉동 동안 물질에 대한 손상을 감소시킬 수 있거나 제거할 수 있는 작용제를 지칭한다. 냉동보호제의 비제한적 예는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 글리세롤, 덱스트로스, 라피노스 및/또는 만니톨을 포함한다.
추가 넘버링된 실시양태
본 개시의 추가 넘버링된 실시양태는 다음과 같이 제공된다:
실시양태 1. 유아 바텐병(IBD) 또는 IBD 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 방법으로서, CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드의 척수강내 투여 및 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드의 정맥내 투여로 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 척수강내 투여는 정맥내 투여보다 앞서는 것인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 야생형 CLN1 폴리뉴클레오타이드, 코돈 최적화된 서열, 또는 이들 각각에 대한 적어도 약 90%의 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 코돈 최적화된 서열은 서열번호 1인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 서열번호 3에 대한 적어도 약 90%의 동일성을 가진 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 것인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체는 인간 환자인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
실시양태 8. 실시양태 7에 있어서, 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 인핸서에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 인핸서는 사이토메갈로바이러스 인핸서인 방법.
실시양태 11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 인트론에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 인트론은 하이브리드/변형된 MVM 인트론인 방법.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 방법.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드의 투여는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 투여를 포함하는 것인 방법.
실시양태 16. 실시양태 15에 있어서, 벡터는 야생형 캡시드 단백질, 돌연변이된 캡시드 단백질, 조직 향성 캡시드 단백질 또는 변형된 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함하는 바이러스 입자 내로 팩키징되고, 이때 변형된 캡시드 단백질은 야생형 캡시드 단백질에 비해 변경된 향성을 가진 것인 방법.
실시양태 17. 실시양태 15에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 아데노 관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서, 벡터는 2개의 AAV ITR을 포함하는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 2개의 AAV ITR은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 18에 있어서, 2개의 AAV ITR은 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가진 것인 방법.
실시양태 21. 실시양태 19 및 20에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인 방법.
실시양태 22. 실시양태 16 내지 21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 자가 상보적 AAV 게놈인 방법.
실시양태 23. 실시양태 15 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터는 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 24. 실시양태 15 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터는 AAV ITR, 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 폴리아데닐화 부위 및 AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 15 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터는 CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 26. 실시양태 15 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터는 돌연변이체 AAV ITR, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위 및 야생형 AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체에서 기능적 CLN1을 발현시키기 위한 양으로 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 대상체에서 기능적 CLN1의 연장된 발현을 위한 양으로 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것인 방법.
실시양태 29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 척수강내로 투여된 양은 정맥내로 전달된 양과 동일하거나 상이한 것인 방법.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증상 전에 폴리뉴클레오타이드를 대상체에게 척수강내로 투여하는 것인 방법.
실시양태 31. 실시양태 15 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 척수강내 투여를 위한 벡터의 양은 약 1.0x1014 vg 내지 약 1.0x1015 vg인 방법.
실시양태 32. 실시양태 15 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 정맥내 투여를 위한 벡터의 양은 약 1.0x1013 vg/kg 내지 약 2.0x1014 vg/kg인 방법.
실시양태 33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 척수강내 투여 및 정맥내 투여를 증상 발병 후에 수행하는 것인 방법.
실시양태 34. 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 척수강내 투여 및 정맥내 투여를 증상 발병 전에 수행하는 것인 방법.
실시양태 35. 실시양태 1 내지 34 중 어느 한 실시양태에 있어서, 장애는 유아기, 후기 유아기, 청소년기 또는 성인기 발병 신경 세로이드 리포푸신증인 방법.
실시양태 36. 실시양태 15 내지 35 중 어느 한 실시양태에 있어서, 벡터는 AAV 벡터인 방법.
실시양태 37. 실시양태 37에 있어서, AAV 벡터는 AAV9 벡터인 방법.
실시양태 38. 실시양태 36 또는 37에 있어서, AAV 벡터는 야생형 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 것인 방법.
실시양태 39. 실시양태 36 또는 37에 있어서, AAV 벡터는 야생형 캡시드 단백질에 비해 변경된 향성을 가진 변형된 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 것인 벡터.
실시양태 40. 실시양태 49에 있어서, 변형된 캡시드 단백질은 간에 의해 탈표적화된 것인 방법.
실시양태 41. 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 CLN 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 및 실시양태 1 내지 40 중 어느 한 실시양태의 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
실시예
실시예 1
PPT1 단백질을 발현하는 AAV의 척수강내 및 정맥내 투여
CLN1 ORF에 의해 코딩된 PPT1 단백질을 발현시키기 위해 AAV 벡터 게놈 카세트를 개발하였다. 이 카세트는 다수의 AAV 캡시드들 내에 팩키징될 자가 상보적 AAV 게놈으로부터 최대 발현을 제공하도록 디자인되었다. 상기 카세트는 5'에서 3' 방향으로 돌연변이체 AAV2 ITR, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 코돈 최적화된 인간 CLN1 ORF, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위 및 야생형(WT) AAV2 ITR을 포함한다(도 1). 발현 카세트를 HEK293 세포 내로 형질감염시킴으로써 CLN1의 발현을 검증하였고, 웨스턴 블롯으로 세포 및 배지에서 발현된 단백질을 검출하였다.
CLN1 발현 카세트를 야생형 AAV9 캡시드 내에 팩키징하였고, 생성된 AAV 바이러스 입자를 사용하여 척수강내 및/또는 정맥내로 CLN1 넉아웃 마우스에게 투약하였다.
도 2는 scAAV9/CLN1 요법을 투여받은 마우스에서 PPT1의 혈청 효소 활성을 보여준다. 벡터를 7x1010 또는 7x1011 벡터 게놈의 용량으로 척수강내로, 또는 7x1011 벡터 게놈의 용량으로 정맥내로 야생형 마우스, 이종 마우스 및 CLN1 넉아웃 마우스에게 주사하였다. 벡터를 20주에 투여하였다. PPT1 혈청 효소 활성을 치료 후 4주, 8주, 및 17주 내지 37주에 측정하였다. 초생리학적 PPT1 혈청 효소 활성 수준을 모든 시점들 및 용량에서 관측하였다.
실시예 2
PPT1 단백질을 발현하는 AAV의 조합된 척수강내 및 정맥내 투여는 CLN1 넉아웃 마우스의 수명을 개선한다.
PPT1 단백질을 발현하는 AAV 바이러스 입자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였고 척수강내 및/또는 정맥내로 투여되었을 때 CLN1 넉아웃 마우스의 수명에 대한 그의 효과에 대해 검사하였다.
도 3a 및 3b는 scAAV9/CLN1을 척수강내로 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스의 수명을 보여준다. 음영 영역은 비치료 이종 마우스에 대한 생존 범위를 보여준다. 도 3a에서, 다양한 용량의 벡터 게놈을 증상 발병 전에 1주, 4주 및 12주에서 투여하였다. 결과는 scAAV9/CLN1의 척수강내 투여가 어린 연령에서 제공되었을 때 생존을 용량 의존적으로 연장시킴을 보여주었다. 도 3b에서, 벡터를 증상 발병 후에 20주 또는 26주에서 7x1010 또는 7x1011 벡터 게놈의 용량으로 CLN1 넉아웃 마우스에게 척수강내로 주사하였다. 결과는 증상 발병 후 투여된 보다 높은 용량의 scAAV9/CLN1이 CLN1 넉아웃 마우스의 생존을 연장시켰으나, 생존 이익이 증상 발병 전 scAAV9/CLN1 투여의 생존 이익에 비해 훨씬 더 작았음을 보여주었다.
도 4a 내지 5b는 척수강내, 정맥내, 또는 조합된 척수강내 및 정맥내 투여를 통해 다양한 용량의 scAAV9/CLN1을 제공받은 CLN1 넉아웃 마우스의 수명을 보여준다. 음영 영역은 비치료 이종 마우스에 대한 생존 범위를 보여준다. 특히, 도 4b 및 5b는 (증상 발병 후) 20주에서 scAAV9/CLN1을 제공받은 CLN1 넉아웃 마우스의 경우, 조합된 척수강내 및 정맥내 투여가 척수강내 또는 정맥내 투여 단독에 비해 유의미하게 더 큰 생존 이익을 제공하였음을 보여준다.
실시예 3
PPT1 단백질을 발현하는 AAV의 조합된 척수강내 및 정맥내 투여는 행동 어세이에서 CLN1 넉아웃 마우스의 수행능력을 개선한다.
PPT1 단백질을 발현하는 AAV 바이러스 입자의 척수강내 및/또는 정맥내 투여 후 행동의 개선을 검출하기 위해 치료받은 마우스에 대해 행동 어세이를 수행하였다. AAV 바이러스 입자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
수영 능력의 검사에서, 마우스(이종 비치료, 넉아웃 비치료, 4주 또는 20주에서 다양한 용량의 벡터로 치료받은 넉아웃)를, 많은 시각적 단서를 가진 실내에 위치된 45 cm 깊이 물로 채워진 122 cm 직경 풀로 구성된 모리스 수중 미로에 넣었다. 각각의 마우스는 단서가 물의 표면 위로 뻗어 있는 패턴화된 실린더인 탈출 플랫폼까지 수영하도록 2일 내지 3일에 걸쳐 하루에 4회 시험을 부여받았다. 각각의 시험을 위해, 마우스를 (무작위로 순서가 매겨진) 4개의 가능한 위치들 중 1개의 위치에서 풀에 넣은 후, 보이는 플랫폼을 찾도록 60초를 제공하였다. 마우스가 플랫폼을 찾은 경우, 시험을 종결하였고, 다음 시험이 시작되기 전에 동물이 플랫폼 상에서 10초 동안 머무르게 하였다. 플랫폼을 발견하지 못한 경우, 마우스를 10초 동안 플랫폼 상에 놓은 후 다음 시험을 제공하였다. 검사를 상이한 연령에서 수행하였고 수영 속도를 측정하였다. 도 6a 및 6b는 결과를 보여준다. 놀랍게도, 20주에서 벡터로 치료받은 넉아웃 마우스들 중에서 벡터의 조합된 척수강내 및 정맥내 투여를 제공받은 넉아웃 마우스들은 유의미하게 더 느린 질환 진행을 표시하였고, 벡터의 척수강내 또는 정맥내 투여만을 제공받은 넉아웃 마우스들의 대다수가 사망한 시점인 52주령을 넘는 연령에서 수영 속도를 거의 유지하였다(도 6b).
악력 검사에서, 마우스(이종 비치료, 넉아웃 비치료, 4주 또는 20주에서 다양한 용량의 벡터로 치료받은 넉아웃)를 큰 금속 우리 덮개 위에 놓았다. 상기 덮개를 약하게 흔들어 마우스가 금속 격자를 잡도록 유도하였다. 이어서, 우리 상단을 뒤집고 마우스가 덮개로부터 떨어지는 대기시간을 기록하였다. 최대 시험 시간은 60초이었다. 상이한 연령에서 검사를 수행하였다. 떨어지는 시간을 측정하였다. 도 7a 및 7b는 결과를 보여준다. 특히, 20주에서 벡터로 치료받은 넉아웃 마우스들 중에서 벡터의 조합된 척수강내 및 정맥내 투여를 제공받은 마우스들은 유의미하게 더 느린 강도 손실을 표시하였고 벡터의 척수강내 또는 정맥내 투여만을 제공받은 넉아웃 마우스보다 이 과제를 더 잘 수행하였다(도 7b).
도 8은 다양한 마우스 치료군들에 대한 정규화된 신체 능력 점수(PSC) 대 상대적 생존 시간을 보여준다. PSC는 1에서 이종 마우스로 정규화된, 시간에 따른 치료내 평균에 대한 곡선하면적(스플라인 근사치)으로부터 유도되었다. PSC는 체중 가속 로타로드(rotarod)와 와이어 매달리기로부터 데이터를 조합하였다. 이종 마우스에 대한 중앙값 생존을 712일째 날로 설정하였다. 결과는 마우스의 상대적 생존 시간과 상대적 신체 능력 사이의 강한 상관관계를 보여주었다.
실시예 4
PPT1 단백질을 발현하는 AAV 바이러스 입자를 투여받은 CLN1 넉아웃 마우스에서 PPT1 수준 및 그의 생리학적 효과의 분석
신생아에서 scAAV9/CLN1 요법의 효과를 검사하였다. 벡터(2.8 x 1011 vg)를 신생아인 이종 마우스에게 정맥내로 투여하였다. 상이한 연령에서 혈청 PPT1 수준(도 9a) 및 수영 속도(도 9b)를 검사하였다. 결과는 초생리학적 수준의 혈청 PPT1 효소 활성의 장기간 발현에도 불구하고 벡터로 치료받은 이종 마우스에 대한 유해한 효과를 보여주지 않는다.
scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트의 상이한 조직들에서도 PPT1 효소 활성을 측정하였다. 도 10에 표시된 용량 및 투여 경로에 따라 래트를 비히클 대조군 또는 scAAV9/CLN1 벡터로 치료하였다. 결과는 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트가 조직들에 걸쳐 지속된 초생리학적 수준의 PPT1 효소 활성을 표시하였음을 보여준다.
scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 래트에서 AAV9에 대한 중화 항체의 생성도 검사하였다. 도 11에 표시된 용량 및 투여 경로에 따라 래트를 비히클 대조군 또는 scAAV9/CLN1 벡터로 치료하였고, 4주 및 12주에서 항-AAV9 중화 항체의 역가를 측정하였다. 결과는 래트가 벡터의 투여 경로(정맥내, 척수강내, 또는 조합된 정맥내 및 척수강내)와 관계없이 AAV9에 대한 중화 항체를 생성하였음을 보여준다.
실시예 5
AAV 바이러스 입자의 조합된 척수강내 및 정맥내 투여는 증상 발생을 지연시키고 CLN1 넉아웃 마우스에서 수명을 개선한다.
도 12는 상이한 시점(1주, 4주, 12주, 20주 및 26주)에서 상이한 투여 경로(척수강내 또는 척수강내+정맥내 조합)를 통해 scAAV9/CLN1 벡터로 치료받은 마우스에서 증상 발생의 도표를 보여준다. 음영 영역은 비치료 이종 마우스에 대한 생존 범위를 보여준다. 종합하건대, scAAV9/CLN1 벡터를 사용한 초기 치료는 더 높은 이익을 제공하였으나, 조합된 척수강내 및 정맥내 투여는 치료가 더 늦은 시점(예를 들면, 20주)에서 투여되었을 때 척수강내 투여 단독보다 유의미하게 더 높은 이익을 제공하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Universtiy of North Carolina at Chapel Hill
Abeona Therapeutics Inc.
<120> INTRATHECAL AND INTRAVENOUS COMBINATION GENE THERAPY FOR THE
TREATMENT OF INFANTILE BATTEN DISEASE
<130> ABEO-004/01WO 337067-2051
<150> US 62/840,360
<151> 2019-04-29
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human codon-optimized CLN1 open reading frame
<400> 1
atggcttctc cggggtgtct gtggctgctg gcagtggcac tccttccctg gacttgcgcc 60
agccgggctc tgcagcacct cgaccctcca gcccctcttc cactggtgat ttggcacgga 120
atgggtgatt cctgctgtaa tcccctgtca atgggagcca tcaagaagat ggtggagaag 180
aagatccctg gaatctacgt gctgtcactg gagattggaa agaccctgat ggaggacgtc 240
gagaactcct tcttcctcaa tgtcaactct caagtgacca ccgtctgcca ggccctggcc 300
aaggacccga agctgcagca ggggtataat gctatggggt tcagccaggg aggacagttc 360
cttcgggctg tggcccaacg ctgccctagc ccacccatga tcaacctgat ctcagtgggt 420
ggccagcatc agggcgtgtt cggacttccc cggtgtcccg gggaatcctc tcatatctgc 480
gacttcatcc gcaaaactct caatgcaggc gcttattcaa aggtcgtcca agagaggctg 540
gtgcaagccg agtactggca cgatcccatt aaggaggacg tgtacagaaa tcactcaatc 600
tttctggccg acattaacca ggagagggga attaacgaat catataagaa gaatctcatg 660
gccctcaaaa agttcgtcat ggtgaagttc cttaacgata gcattgtgga cccagtggac 720
agcgaatggt tcggatttta ccgctcaggc caggcaaaag aaaccatccc tctccaagag 780
acttctcttt acacccaaga cagacttggg cttaaggaaa tggataacgc tggtcagctg 840
gtgttcctcg ccaccgaagg tgaccatctg cagctcagcg aagagtggtt ctacgctcat 900
atcatcccgt ttcttggttg ataa 924
<210> 2
<211> 921
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggcgtcgc ccggctgcct gtggctcttg gctgtggctc tcctgccatg gacctgcgct 60
tctcgggcgc tgcagcatct ggacccgccg gcgccgctgc cgttggtgat ctggcatggg 120
atgggagaca gctgttgcaa tcccttaagc atgggtgcta ttaaaaaaat ggtggagaag 180
aaaatacctg gaatttacgt cttatcttta gagattggga agaccctgat ggaggacgtg 240
gagaacagct tcttcttgaa tgtcaattcc caagtaacaa cagtgtgtca ggcacttgct 300
aaggatccta aattgcagca aggctacaat gctatgggat tctcccaggg aggccaattt 360
ctgagggcag tggctcagag atgcccttca cctcccatga tcaatctgat ctcggttggg 420
ggacaacatc aaggtgtttt tggactccct cgatgcccag gagagagctc tcacatctgt 480
gacttcatcc gaaaaacact gaatgctggg gcgtactcca aagttgttca ggaacgcctc 540
gtgcaagccg aatactggca tgaccccata aaggaggatg tgtatcgcaa ccacagcatc 600
ttcttggcag atataaatca ggagcggggt atcaatgagt cctacaagaa aaacctgatg 660
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atcataccat tccttggatg a 921
<210> 3
<211> 306
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Ser Pro Gly Cys Leu Trp Leu Leu Ala Val Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Trp Thr Cys Ala Ser Arg Ala Leu Gln His Leu Asp Pro Pro Ala Pro
20 25 30
Leu Pro Leu Val Ile Trp His Gly Met Gly Asp Ser Cys Cys Asn Pro
35 40 45
Leu Ser Met Gly Ala Ile Lys Lys Met Val Glu Lys Lys Ile Pro Gly
50 55 60
Ile Tyr Val Leu Ser Leu Glu Ile Gly Lys Thr Leu Met Glu Asp Val
65 70 75 80
Glu Asn Ser Phe Phe Leu Asn Val Asn Ser Gln Val Thr Thr Val Cys
85 90 95
Gln Ala Leu Ala Lys Asp Pro Lys Leu Gln Gln Gly Tyr Asn Ala Met
100 105 110
Gly Phe Ser Gln Gly Gly Gln Phe Leu Arg Ala Val Ala Gln Arg Cys
115 120 125
Pro Ser Pro Pro Met Ile Asn Leu Ile Ser Val Gly Gly Gln His Gln
130 135 140
Gly Val Phe Gly Leu Pro Arg Cys Pro Gly Glu Ser Ser His Ile Cys
145 150 155 160
Asp Phe Ile Arg Lys Thr Leu Asn Ala Gly Ala Tyr Ser Lys Val Val
165 170 175
Gln Glu Arg Leu Val Gln Ala Glu Tyr Trp His Asp Pro Ile Lys Glu
180 185 190
Asp Val Tyr Arg Asn His Ser Ile Phe Leu Ala Asp Ile Asn Gln Glu
195 200 205
Arg Gly Ile Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Asn Leu Met Ala Leu Lys Lys
210 215 220
Phe Val Met Val Lys Phe Leu Asn Asp Ser Ile Val Asp Pro Val Asp
225 230 235 240
Ser Glu Trp Phe Gly Phe Tyr Arg Ser Gly Gln Ala Lys Glu Thr Ile
245 250 255
Pro Leu Gln Glu Thr Ser Leu Tyr Thr Gln Asp Arg Leu Gly Leu Lys
260 265 270
Glu Met Asp Asn Ala Gly Gln Leu Val Phe Leu Ala Thr Glu Gly Asp
275 280 285
His Leu Gln Leu Ser Glu Glu Trp Phe Tyr Ala His Ile Ile Pro Phe
290 295 300
Leu Gly
305
Claims (22)
- 유아 바텐병(IBD) 또는 IBD 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 방법으로서, CLN1 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 제1 AAV 바이러스 입자의 척수강내 투여 및 CLN1 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유효량의 제2 AAV 바이러스 입자의 정맥내 투여로 IBD 또는 IBD 관련 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 척수강내 투여는 정맥내 투여보다 앞서는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 AAV 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 AAV 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 야생형 CLN1 유전자 서열 또는 코돈 최적화된 CLN1 유전자 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 제1 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1에 대한 적어도 90%의 동일성, 임의로 서열번호 1에 대한 100%의 동일성을 가진 코돈 최적화된 CLN1 유전자 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 대한 적어도 약 90%의 동일성, 임의로 서열번호 3에 대한 100%의 동일성을 가진 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 환자인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 척수강내 투여 및 정맥내 투여를 증상 발병 후에 수행하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 척수강내 투여 및 정맥내 투여를 증상 발병 전에 수행하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자 및 제2 바이러스 입자는 AAV2, AAV8, AAV6, AAV8 및 AAV9 바이러스 입자로부터 독립적으로 선택된 것인 방법.
- 제9항에 있어서, AAV 바이러스 입자는 야생형 캡시드 단백질, 돌연변이된 캡시드 단백질, 조직 향성 캡시드 단백질, 또는 야생형 캡시드 단백질에 비해 변경된 향성을 가진 변형된 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, AAV 바이러스 입자는 AAV9 바이러스 입자인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 척수강내 투여를 위한 유효량은 약 1.0x1013 vg/kg 내지 약 1.0x1016 vg/kg, 바람직하게는 1.0x1014 vg/kg 내지 1.0x1015 vg/kg인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 투여를 위한 유효량은 약 1.0x1012 vg/kg 내지 약 2.0x1015 vg/kg, 바람직하게는 1.0x1013 vg/kg 내지 2.0x1014 vg/kg인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 인핸서에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 인트론에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제2 바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드는 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자 및/또는 제2 바이러스 입자는 5'에서 3' 방향으로 AAV ITR, 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리아데닐화 부위 및 AAV ITR을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 인핸서는 CMV 인핸서이고/이거나, 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터이고/이거나, 인트론은 하이브리드/변형된 MVM 인트론이고/이거나, 폴리아데닐화 부위는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바이러스 입자 및 제2 바이러스 입자는 동일한 벡터 게놈을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 장애는 유아기, 후기 유아기, 청소년기 또는 성인기 발병 신경 세로이드 리포푸신증인 방법.
- 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 제1 바이러스 입자 및/또는 제2 바이러스 입자를 포함하는 약학 조성물, 및 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
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