TWI688395B - 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途 - Google Patents

條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途 Download PDF

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查理斯 瑞德
布蘭登 卡斯柏森
桑尼爾 查達
威廉 佛克勒
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Abstract

本發明關於治療劑之領域。最具體而言，本發明提供產製條件性表現載體之方法及在動物體內供治療目的之用途，該等載體在活化配體存在之基因表現調節系統之控制下表現一或多種免疫調節劑或治療性蛋白質。該等載體可經由直接注射或經由活體外工程化細胞(諸如樹突細胞)提供以治療各種疾病，例如腫瘤疾病、感染性疾病、眼疾病、溶酶體貯積病或肝疾病。

Description

條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途
本發明關於以基因療法治療疾病和疾患(例如癌、溶酶體貯積病、眼疾病、肝疾病或感染性疾病)之領域。在一實施態樣中，本發明提供經工程化之免疫細胞或治療支持細胞(TSC)以表現一或多種免疫調節劑及該等細胞作為治療劑之用途。在另一實施態樣中，本發明包括條件性表現此處所揭示之免疫調節劑例如IL-12、TNF-α之載體例如腺病毒，及使用該等載體之方法。
介白素-12(IL-12)係第一型細胞介素家族之成員，其涉及造成多種生物程序，包括但不限於保護性免疫反應及抑制腫瘤發生(Abdi et al.,2006；Adorini,1999；Adorini,2001；Adorini et al.,2002；Adorini et al.,1996；Akhtar et al.,2004；Akiyama et al.,2000；Al-Mohanna et al.,2002；Aliberti et al.,1996；Allavena et al.,1994；Alli and Khar, 2004；Alzona et al.,1996；Amemiya et al.,2006；Araujo et al.,2001；Arulanandam et al.,1999；Athie et al.,2000；Athie-Morales et al.,2004；Bertagnolli et al.,1992；Bhardwaj et al.,1996；Biedermann et al.,2006；Brunda and Gately,1994；Buchanan et al.,1995；Romani et al.,1997；Rothe et al.,1996；Satoskar et al.,2000；Schopf et al.,1999；Thomas et al.,2000；Tsung et al.,1997；Wolf et al.,1994；Yuminamochi et al.,2007)。越來越多證據顯示IL-12可能是控制人疾病(例如癌)之有效目標。
雖然IL-12可能是有效之癌治療劑因為對第1型抗腫瘤NK細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞具有強效之支持活性(Trinchieri,2003)，但是重組人IL-12(rhIL-12)在病患之報告毒性(Atkins et al.,1997)，連同供臨床應用之GMP級rhIL-12之有限來源使得以IL-12為基底之治療方法無法成功。因此認為基因療法代表更安全、更可行之治療選擇似乎是合理的。事實上，在腫瘤內或腫瘤周圍遞送以病毒(Sangro et al.,2004；Triozzi et al.,2005)或質體為基底之重組IL-12 cDNA(Heinzerling et al.,2005)或經IL-12基因改質之自體纖維母細胞(Kang et al.,2001)之第一期臨床試驗已被認為係安全的且耐受性佳。
然而，在接受這些基因療法之黑色素瘤病患或罹患不同癌之病患中很少出現客觀之臨床反應，或臨床反應不一致或為短暫的，且大部分之臨床反應侷限於治療部位(Heinzerling et al.,2005；Kang et al.,2001；Sangro et al., 2004；Triozzi et al.,2005)。在疾病部分或完全緩解之病例中，注意到腫瘤浸潤性淋巴細胞之數量增加(Heinzerling et al.,2005；Sangro et al.,2004)及循環中腫瘤特異性CD8+ T細胞之量增加(Heinzerling et al.,2005)，這些發現與病患體內之抗原特異性T細胞之交叉敏化增加一致。
由於作為IL-12之天然但經調節之來源的樹突細胞(DC)最能交叉敏化特異性T細胞(Berard et al.,2000)，因此最近以DC為基底之IL-12基因療法之優異的臨床前療效之報告已引起高度關注(Satoh et al.,2002；Tatsumi et al.,2003；Yamanaka et al.,2002)。舉例來說，研究顯示在鼠模型中經腫瘤內(i.t.)注射經工程化以產製IL-12p70之DC(經由重組腺病毒感染)導致顯著增加廣泛反應性、腫瘤特異性CD8+ T細胞貯庫之交叉敏化與腫瘤排斥(Tatsumi et al.,2003)。考慮先前使用在CMV啟動子之控制下編碼mIL-12之重組腺病毒(rAd.cIL12,(Tatsumi et al.,2003))，經工程化之DC所產製之IL-12係組成性的，因此就治療結果而言，此細胞介素在腫瘤病灶內之早期免疫影響及在腫瘤引流淋巴結內之晚期免疫影響問題無法被解決。因此，我們需要經工程化以條件性表現IL-12之DC，以達調節轉基因表現之量及適時活化轉基因之目的。本發明提供使用該等細胞之有希望之治療結果。
許多目前在臨床前或臨床試驗中研究之治療性蛋白質在該核酸序列被病患之宿主細胞或在適當生理背景中表現之前以不展現有害不良反應地存在於病患體內。然而有些 蛋白質當在正常生理組織或背景之外(例如暴露於非標靶組織)表現時造成不良反應，諸如腫瘤壞死因子(TNF)。系統性或甚至局部投予此蛋白質對許多非腫瘤細胞類型極具毒性，可能造成過敏性反應及惡病質。此外，長期暴露於TNF-α相較於急性刺激可能產生顯著不同之細胞反應。因為這些原因，安全及有效之TNF-α抗癌療法仍難以實現。
有鑑於與透過包含由感興趣之核酸序列所編碼之蛋白質的載體組成物進行基因之基因表現有關之問題，仍然需要經改善之轉運載體組成物以用於直接注射或用於細胞基底療法。
溶酶體貯積病(LSD)代表一類遺傳性基因疾病，該類疾病目前僅能用酶取代療法形式之蛋白質治療劑治療。
LSD包含49種基因遺傳性疾病，其特徵為一或多種溶酶體酶之缺陷，導致未經消化之大分子累積在溶酶體中。這些廢棄產物之累積造成細胞中之溶酶體擴大，導致細胞受損及退化。在器官及組織中累積之傷害造成生理及/或心智狀態之進行性惡化，最後導致死亡。診斷通常在嬰兒期確立。個別疾病之嚴重性不同，此與缺陷基因所產生之殘餘酶活性之量有關。
LSD之發病率約為每5000人中一人(全世界有130,000個病例)。嚴重性各有不同，與缺陷基因所產生之殘餘酶活性之量有關。病情嚴重之病患可能無法存活超過青少年時期，較不嚴重之病患可能存活至成人期。
酶取代療法是唯一可用於治療LSD之方法。療法包 括系統性輸注以溶酶體為目標及分解累積廢棄分子之活性蛋白質。LSD蛋白質治療劑之實例包括治療法布瑞(Fabry)氏症之Fabrazyme(健贊(Genzyme)公司)、治療MPSII之Elaprase(夏爾(Shire)公司)、治療龐貝(Pompe)氏症之Myozome(健贊(Genzyme)公司)及治療高歇(Gaucher)氏病之Cerezyme(健贊(Genzyme)公司)。
酶取代療法具有某些缺點，像是需要後轉譯地蛋白質修飾、該取代酶在活體內之半衰期過短及病患對該取代酶產生免疫反應。因此，該領域仍有治療溶酶體貯積病之酶取代療法及其替代療法之需求。
本發明提供一種重組載體，該載體在一或多個啟動子之控制下編碼具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質。在一實施態樣中，該一或多個啟動子係條件性啟動子。在另一實施態樣中，該一或多個啟動子係組成性啟動子。在另一實施態樣中，該載體係編碼關閉啟動子之蛋白質的腺病毒載體，該啟動子可藉由提供可溶性小分子配體如二醯基肼(例如RG-115819、RG-115830或RG-115932)加以條件性活化。此載體允許控制來自免疫細胞、TSC及來自直接注射包含免疫調節劑之載體之蛋白質的表現。
在一實施態樣中，本發明提供一種條件性表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該編碼基因開關之多核苷酸 包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。在一實施態樣中，該免疫調節劑係選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL10R DN或彼之次單位、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防禦素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、生存素、p53-生存素融合體、MAGE3、PSA或PSMA。
在另一實施態樣中，本發明提供一種表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子、(2)編碼該具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，及(3)編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸；其中(2)及(3)之至少一種多核苷酸係與經由 該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在一些實施態樣中，本發明之載體條件性表現TNF-α。在某些實施態樣中，該條件性表現一或多種具有免疫調節劑例如TNF-α之功能的蛋白質之載體例如腺病毒載體另包含編碼信號肽之核酸序列。該信號肽可經密碼子最佳化。在其他實施態樣中，該載體另包含5'非轉譯區(UTR)、3'調節區或二區，且增進蛋白質表現及/或整體產量。
本發明另提供一種產製細胞群例如免疫細胞或TSC群之方法，該細胞群表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質，該方法藉由使用條件性表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之重組載體改質(例如轉染、電穿孔等)該等細胞，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在另一實施態樣中，本發明提供一種產製細胞群例如免疫細胞或TSC群之方法，該細胞群表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，該方法藉由使用包含編碼基因開關之多核苷酸的重組載體改質該等細胞，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉 錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子、(2)編碼該具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，及(3)編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸；其中(2)及(3)之至少一種多核苷酸係與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在一些實施態樣中，本發明提供一種增加免疫調節劑例如TNF-α之表現、mRNA表現或蛋白質表現之方法，該方法包含產製條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及一或多個調節序列之載體，其中該一或多個調節序列增進該免疫調節劑例如TNF-α之表現。
本發明另提供一種表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之細胞群例如免疫細胞或TSC群，該細胞群係經條件性表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之重組載體改質(例如轉染、電穿孔等)，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在另一實施態樣中，本發明提供一種表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質之細胞群例如免疫細胞或TSC群，該細胞群係經包含編碼基因開關之多核苷酸的重組載體改質，其中該多核苷 酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子、(2)編碼該具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，及(3)編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸；其中(2)及(3)之至少一種多核苷酸係與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在另一實施態樣中，本發明提供一種包含本發明之二或多種細胞(例如免疫細胞或TSC)群之組成物，其中該組成物中之各細胞群表現一或多種與該組成物中之其他細胞群所表現之一或多種免疫調節劑不同之免疫調節劑。在一實施態樣中，該組成物包含二種細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含超過二種細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含三種細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含四種細胞群。
在另一實施態樣中，本發明提供一種包含載體之經活體外工程化之細胞，例如免疫細胞或TSC，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。在另一實施態樣中，本發明提供一種包含載體之經活體外工程化之細胞，例如免疫細胞或TSC，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可 操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子、(2)編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，及(3)編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸；其中(2)及(3)之至少一種多核苷酸係與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在另一實施態樣中，本發明提供一種包含本發明之二或多種經活體外工程化之細胞(例如免疫細胞或TSC)群之組成物，其中該組成物中之各種經活體外工程化之細胞群包含載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接，且其中該組成物中之各種經活體外工程化之細胞群表現一或多種與該組成物中之其他經活體外工程化之細胞群所表現之一或多種免疫調節劑不同之免疫調節劑。在一實施態樣中，本發明提供一種包含二或多種經活體外工程化之細胞(例如免疫細胞或TSC)群之組成物，各個該等細胞群包含載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子、(2)編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，及(3)編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸；其中(2)及(3)之至少一種多核苷酸係與經 由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。在一實施態樣中，該組成物包含二種經活體外工程化之細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含超過二種經活體外工程化之細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含三種經活體外工程化之細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含四種經活體外工程化之細胞群。
本發明亦提供一種包含如此處所述之細胞群例如免疫細胞或TSC群之醫藥組成物，或一種適用於直接注射無細胞群之表現載體即經直接注射之組成物。
在一實施態樣中，該編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸係在基因開關之啟動子的控制下且該編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸係在組成性啟動子之控制下。在另一實施態樣中，編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸及編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸皆在該基因開關之多順反子啟動子之控制下。在另一實施態樣中，該編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸係由基因開關之啟動子控制且該編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸係由與基因開關啟動子不同之條件性啟動子控制。在其他實施態樣中，該編碼具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸的基因調節系統與具有IL-12之功能之多核苷酸的基因調節系統係正交的。在其他實施態樣中，編碼各蛋白質之各個多核苷酸的基因調節系統係正交的。
在一實施態樣中，本發明亦提供癌之治療，諸如但不 限於黑色素瘤、神經膠質瘤、腎癌、前列腺癌及表1所列之癌。IL-12基因療法已在動物模型試驗中證實當以重組cDNA載體施予時之抗腫瘤療效(Faure et al.,1998；Sangro et al.,2005)，更尤甚者當以經基因改質之DC施予時之抗腫瘤療效(Satoh et al.,2002；Svane et al.,1999；Tatsumi et al.,2003；Yamanaka et al.,2002)。然而到目前為止，使用質體或病毒性載體之IL-12基因療法的第一期人臨床試驗無法在癌環境中達成持久、客觀之臨床反應(Heinzerling et al.,2005；Kang et al.,2001；Sangro et al.,2004；Triozzi et al.,2005)，此處描述之基因療法提供有希望之治療方式。
在一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之腫瘤之方法，該方法包含下列步驟：(a)經腫瘤內投予至腫瘤微環境、腫瘤周圍之區域或系統性投予本發明之免疫細胞群、TSC群或載體(或彼等之組合)，該等細胞或載體係經活體外工程化以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之腫瘤之方法，該方法包含下列步驟：(a)經腫瘤內投予免疫細胞或TSC群至腫瘤微環境，該等細胞係經活體外工程化以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質；及 (b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之腫瘤之方法，該方法包含下列步驟：(a)經腫瘤內投予二或多種免疫細胞或TSC群至腫瘤微環境，該等細胞係經活體外工程化以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質，其中各種免疫細胞或TSC群表現不同組之一或多種免疫調節劑；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之腫瘤之方法，該方法包含下列步驟：(a)經腫瘤內投予免疫細胞或TSC群至腫瘤微環境，該等細胞係經活體外工程化以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，其中至少一種具有免疫調節劑或IL-12之功能的蛋白質受到經配體活化之條件性啟動子之控制；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質及/或具有IL-12之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之腫瘤 之方法，該方法包含下列步驟：(a)經腫瘤內投予二或多種免疫細胞或TSC群至腫瘤微環境，該等細胞係經活體外工程化以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，其中各種免疫細胞或TSC群表現不同組之一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質，其中至少一種具有免疫調節劑或IL-12之功能的蛋白質受到經配體活化之條件性啟動子之控制；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質及/或具有IL-12之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或疾患之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予經改質之細胞群，該細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療該疾病或疾患。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或疾患之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予二或多種經改質之細胞群，該等細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之 功能的蛋白質，其中各種經改質之細胞群表現不同組之一或多種免疫調節劑；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療該疾病或疾患。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或疾患之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予經改質之細胞群，該細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，其中至少一種具有免疫調節劑或IL-12之功能的蛋白質受到經配體活化之條件性啟動子之控制；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質及/或具有IL-12之功能的蛋白質表現以治療該疾病或疾患。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或疾患之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予二或多種經改質之細胞群，該等細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，其中各種經改質之細胞群表現不同組之一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質，其中至少一種具有免疫調節劑或IL-12之功能的蛋白質受到經配體活化之條件性啟動子之控制；及 (b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質及/或具有IL-12之功能的蛋白質表現以治療該疾病或疾患。
本發明亦提供測定以經工程化之細胞例如免疫細胞或TSC為基底之療法的療效之方法，該方法藉由測量治療開始之前病患體內之IFN-γ之表現量或活性量，藉此產生對照量，接著投予經工程化以表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及可任意選擇地具有IL-12之功能的蛋白質之細胞，投予有效量之活化配體，接著測量IFN-γ之表現量以產生檢測量，及比較對照量與檢測量以決定該治療配方是否有效。
另包含在有需要之哺乳動物中治療腫瘤、減少腫瘤大小或防止腫瘤生成之方法，該方法包含(a)投予治療有效量之於該哺乳動物體內條件性表現至少一種免疫調節劑例如IL-12、TNF-α之載體、(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體，其中該活化配體活化具有免疫調節劑之功能的蛋白質之表現，藉此誘發具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在一實施態樣中，本發明提供測定以經活體外工程化之細胞例如免疫細胞或TSC為基底之治療配方對病患之療效之方法，該方法包含：(a)測量第一生物性樣本中干擾素γ(IFN-γ)之表現量或活性量或二者之量，該第一生物性樣本係於投予該經活體 外工程化之細胞之前自該需要測量之病患獲得，藉此產生對照量；(b)對該需要測量之病患投予該經活體外工程化之細胞，該等細胞係經工程化以條件性表現一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及可任意選擇地具有IL-12之功能的蛋白質；(c)對該需要測量之病患投予有效量之活化配體；(d)測量第二生物性樣本中IFN-γ之表現量或活性量或二者之量，該第二生物性樣本係於投予該經活體外工程化之免疫細胞及活化配體之後自該需要測量之病患獲得，藉此產生檢測量；及(e)比較IFN-γ之對照量與檢測量，其中IFN-γ之表現量、活性量或二者之檢測量相較於對照量增加即表示該治療配方對該需要治療之病患係有效的。
在一實施態樣中，本發明提供在有需要之哺乳動物中治療腫瘤、減少腫瘤大小或防止腫瘤生成之方法，該方法包含：(a)經腫瘤內投予條件性表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之載體至腫瘤微環境，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由配體依賴性轉錄因子活化之啟動子可操作性連接，其中該一或多種免疫調節劑係選自IL-1、IL-2、IL- 3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL10R DN或彼之次單位、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α 1、IFN α 2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防禦素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、OX40L、p53、生存素、p53-生存素融合體、MAGE3、PSA或PSMA，其中該載體係不包含於細胞中；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發該一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質表現以治療腫瘤。
本發明亦提供治療有需要之非人動物的疾病之方法，該方法包含：(a)對該非人動物投予載體以條件性表現蛋白質，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子可操作性連接，其中該載體係不包含於細胞中；及(b)對該非人動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發該一或多 種蛋白質表現以治療該疾病。
本發明亦提供治療有需要之非人動物的溶酶體貯積病之方法，該方法包含：(a)對該非人動物投予載體以條件性表現一或多種蛋白質，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子可操作性連接，其中該載體係不包含於細胞中；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發該一或多種蛋白質表現以治療該溶酶體貯積病。
本發明亦提供治療有需要之非人動物的肝疾病之方法，該方法包含：(a)對該非人動物投予載體以條件性表現蛋白質，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子可操作性連接，其中該載體係不包含於細胞中；及(b)對該非人動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發該一或多種蛋白質表現以治療該肝疾病。
序列之詳細說明
免疫調節劑
細胞介素
介白素1(IL-1)在對抗感染之發炎反應中係重要之細胞介素，彼等之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號M28983(人IL-1α)、M15330(人IL-1β)、AF201830(人IL-1δ)、AF201831(人IL-1ε)、AF201832(人1L-1ζ)、AF201833(人IL-1η)、NM_010554(小鼠IL-1α)、NM_008361(小鼠IL-1β)、NM_019451(小鼠IL-1δ)、NM_019450(小鼠IL-1f6)、NM_027163(小鼠IL-1f8)、NM_153511(小鼠IL-1f9)、NM_204524(雞IL-1β)、NM_017019(大鼠IL-1α)及NM_031512(大鼠IL-1β)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素1(IL-1)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAA59134(人IL-1α)、AAA59135(人IL-1β)、AAF25210(人IL-1δ)、AAF25211(人IL-1ε)、AAF25212(人1L-1ζ)、AAF25213(人IL-1η)、NP_034684(小鼠IL-1α)、NP_032387(小鼠IL-1β)、NP_062324(小鼠IL-1δ)、NP_062323(小鼠IL-1f6)、NP_081439(小鼠IL-1f8)、NP_705731(小鼠IL-1f9)、NP_989855(雞IL-1β)、NP_058715(大鼠IL-1α)及NP_113700(大鼠IL-1β)，彼等之序列以參照方式納入此處。Laurent et al.,Psychiatr.Genet.7：103(1997)辨識於人介白素-1β基因中之多形性突變。
介白素2(IL-2)屬於包括IL-4、IL-7、IL-9、IL-15及IL-21之介白素家族，IL-2之多核苷酸序列可得自公眾資 料庫，如登記號U25676(人)、NM_008366(小鼠)、NM_204153(雞)及NM_053836(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素2(IL-2)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAA70092(人)、NP_032392(小鼠)、NP_989484(雞)及NP_446288(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
Liu et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.133：77(2006)產製突變人IL-2，及Lorberboum et al.,J.Biol.Chem.265：16311(1990)描述嵌合性IL-2之產製。
介白素4(IL-4)係誘發初始(naive)T輔助細胞分化成Th2細胞之細胞介素，IL-4之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號M23442(人)、NM_021283(小鼠)、NM_001007079(雞)及NM_201270(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素4(IL-4)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAA59150(人)、NP_067258(小鼠)、NP_001007080(雞)及NP_958427(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
Kawashima et al.,J.Med.Genet.35：502(1998)描述IL-4基因中與異位性皮膚炎有關之多形性。
介白素7(IL-7)係重要之B及T細胞發展之細胞介素。IL-7之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號J04156(人)、NM_008371(小鼠)、NM_001037833(雞)及 NM_013110(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素7(IL-7)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAA59156(人)、NP_032397(小鼠)、NP_001032922(雞)及NP_037242(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
Feng et al.,Genetics 175：545(2007)已辨識IL-7中導致功能性缺陷之點突變。
介白素9(IL-9)係由T細胞產製之細胞介素，其為造血細胞之調節劑。IL-9之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_000590(人)、NM_008373(小鼠)、NM_001037825(雞)及NM_001105747(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素9(IL-9)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_000581(人)、NP_032399(小鼠)、NP_001032914(雞)及NP_001099217(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
IL-12係一種細胞介素，其可作為經活化之T及NK細胞之生長因子，增進NK/經淋巴介素活化之殺手細胞之溶解活性及刺激休止週邊血液單核細胞(PBMC)產製IFN-γ。IL-12之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_000882(人IL12A)、NM_002187(人IL12B)、NM_008351(小鼠IL12a)、NM_008352(小鼠IL12b)、NM_213588(雞IL12A)、NM_213571(雞IL12B)、NM_053390(大鼠IL12a)及NM_022611(大鼠IL12b)，彼等 之序列以參照方式納入此處。
介白素12(IL-12)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_000873(人IL12A)、NP_002178(人IL12B)、NP_032377(小鼠IL12a)、NP_032378(小鼠IL12b)、NP_998753(雞IL12A)、NP_998736(雞IL12B)、NP_445842(大鼠IL12a)及NP_072133(大鼠IL12b)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素15(IL-15)係一細胞介素，其調節T及自然殺手細胞之活化及增生。IL-15之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號U14407(人)、NM_008357(小鼠)、EU334509(雞)及AF015719(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素15(IL-15)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAA21551(人)、NP_032383(小鼠)、ABY55312(雞)及AAB94536(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素18(IL-18)是一種由巨噬細胞產製之細胞介素，其與介白素12一起在微生物性產物感染後誘發細胞媒介性免疫反應。IL-18之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號U90434(人)、NM_008360(小鼠)、EU747333(雞)及AY258448(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素18(IL-18)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAB50010(人)、NP_032386(小鼠)、 ACE79188(雞)及AAP14669(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素21(IL-21)是一種藉由誘發細胞增生以對免疫系統之細胞包括自然殺手細胞及細胞毒性T細胞具有強效調節效應之細胞介素，其多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AF254069(人)、NM_021782(小鼠)、NM_001024835(雞)及NM_001108943(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素21(IL-21)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAG29348(人)、NP_068554(小鼠)、NP_001020006(雞)及NP_001102413(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素27(IL-27)是一種在調節B及T淋巴細胞之活性上扮演重要功能之細胞介素。IL-27之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AY099296(人)、NM_145636(小鼠)及XM_344962(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素27(IL-27)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAM34498(人)、NP_663611(小鼠)及XP_344963(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
干擾素β1(IFNB1)是與特定細胞表面受體(IFNAR)結合之干擾素蛋白質之家族成員，其刺激巨噬細胞及自然殺手(NK)細胞二者以誘發抗病毒反應，IFNB1之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_002176(人)、 NM_010510(小鼠)、NM_001024836(雞)及NM_019127(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
干擾素β1(IFNB1)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_002167(人)、NP_034640(小鼠)、NP_00102007(雞)及NP_062000(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
干擾素γ(IFN-γ)係可溶性細胞介素，此為唯一的第II型干擾素，具有抗病毒、免疫調節及抗腫瘤活性。IFN-γ之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_000619(人)、NM_008337(小鼠)及NM_138880(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
干擾素γ(IFN-γ)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_000610(人)、NP_032363(小鼠)及NP_620235(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種主要由單核球/巨噬細胞分泌之多功能性促發炎細胞介素，其影響脂肪代謝、凝血、胰島素抗性及內皮細胞功能，TNF-α之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號X02910(人)、NM_013693(小鼠)及BC107671(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
TNF-α之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號CAA26669(人)、NP_038721(小鼠)及AAI07672(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
人TNF-α(此處縮寫為hTNF-α或簡單地hTNF)是一種 人細胞介素，其以17千道爾頓之可溶性形式(sTNF-α)及26千道爾頓之膜相關形式(tmTNF-α)存在，彼之生物活性形式係由非共價結合之17千道爾頓分子之三體組成。hTNF-α之結構係描述於例如Pennica,D.,et al.(1984)Nature 312：724-729、Davis,J.M.,et al.(1987)Biochemistry 26：1322-1326及Jones,E.Y.,et al.(1989)Nature 338：225-228。TNF-α可能與TNF受體1型(TNFR-1)或TNF受體2型(TNFR-2)結合，其涉及調節免疫細胞、誘發細胞凋亡或發炎，或抑制腫瘤發生或病毒複製。由TNF/TNFR結合所產生之細胞傳訊梯瀑係描述於例如Wajant,H.,et al.(2003)Cell Death Differ.10(1)：45-65或Chen,G.,et al.(2002)Science 296：1634-5。
全長人TNF-α多肽係由細胞質結構域、跨膜結構域及胞外結構域組成。233個胺基酸之多肽序列被報告為人TNF-α多肽序列，此處命名為SEQ ID NO：37，其具有SEQ ID NO：37之胺基酸1至35之細胞質結構域、SEQ ID NO：37之胺基酸36至56之跨膜結構域及SEQ ID NO：37之胺基酸57至233之胞外結構域。SEQ ID NO：37係編碼SEQ ID NO：35或36之核苷酸序列。人TNF-α之變異體包括但不限於具有下列一或多種突變之多肽：L105S、R108W、L112F、A160V、S162F、V167A、E222K、F63S、PSD84-86VNR或E183R。
趨化激素
趨化激素(C模體)配體1(XCL1，又名淋巴細胞趨化因子)趨化CD4+及CD8+ T細胞但不趨化單核球，且誘發週邊血液淋巴細胞中細胞內鈣之上升。XCL1之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_002995(人)、NM_008510(小鼠)及NM_134361(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
XCL1之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_002986(人)、NP_032536(小鼠)及NP_599188(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。美國第6,022,534號專利揭示淋巴細胞趨化因子及彼用於吸引細胞毒性T細胞及/或NK細胞及/或誘發固有細胞增生之用途。分離及使用抗淋巴細胞趨化因子抗體及XCL1融和蛋白之方法亦經揭示。
CC趨化激素配體3(CCL3)又名巨噬細胞發炎蛋白質1(MIP-1)，係所謂的與集結及活化多形核白血球之急性發炎狀態有關之單核因子(一種主要由單核球及巨噬細胞產製之細胞介素)，CCL3之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_002983(人)、NM_011337(小鼠)及NM_013025(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL3之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_002974(人)、NP_035467(小鼠)及NP_037157(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL5(RANTES)係與發炎及氣喘有關之促發炎細胞介素，CCL5之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號 AF043341(人)、NM_013653(小鼠)及NM_031116(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL5之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAC03541(人)、NP_038681(小鼠)及NP_112378(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CC趨化激素配體7(CCL7)係在發炎及癌侵入期間與巨噬細胞集結有關之趨化激素，CCL7之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_006273(人)、NM_013654(小鼠)及NM_001007612(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL7之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_006264(人)、NP_038682(小鼠)及NP_001007613(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
趨化激素(CXC模體)配體9(CXCL9，又名MIG)係一種可經干擾素γ誘發之T細胞趨化因子。CXCL9之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_002416(人)、NM_0108599(小鼠)及NM_145672(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CXCL9之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_002407(人)、NP_032625(小鼠)及NP_663705(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
趨化激素(C-X-C模體)配體10(CXCL10)是一種小型細胞介素，其具有趨化免疫系統細胞、黏附T細胞至內皮細胞、抗腫瘤活性及血管生成之功能。CXCL10之多核苷酸 序列可得自公眾資料庫，如登記號X02530(人)、NM_021274(小鼠)及BC058444(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
趨化激素(C-X-C模體)配體10(CXCL10)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號CAA26370(人)、NP_067249(小鼠)及AAH58444(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
趨化激素(C-X-C模體)配體12(CXCL12)又名基質細胞衍生因子1(SDF-1)，是一種屬於互泌素家族之小型細胞介素，互泌素家族之成員活化白血球且通常由促發炎刺激諸如LPS、TNF或IL1所誘發。CXCL12之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_000609(人)、NM_001012477(小鼠)、NM_204510(雞)及NM_001033883(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CXCL12之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_000600(人)、NP_001012495(小鼠)、NP_989841(雞)及NP_001029055(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
Hansson et al.,Microbes and Infection 8：841(2006)討論趨化激素(C-C模體)受體7(CCR7)與趨化激素(C-C模體)配體19(CCL19，又名MIP-3β)之間的交互作用對於產生初級免疫反應至關重要。CCR7之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_001838(人)及NM_007719(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCR7之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_001829(人)及NP_031745(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL19之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_006274(人)及NM_011888(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL19之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_006265(人)及NP_036018(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CC趨化激素配體21(CCL21)係CCR7清楚建立之配體，其為CD4+但非CD8+ T細胞達成彼等之穩定狀態「設定點(set point)」所必須，CCL21之表現中的擾動可能改變自體免疫之易感性，CCL21之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AB002409(人)、NM_011335(小鼠CCL21a)、NM_011124(小鼠CCL21b)及NM_023052(小鼠CCL21c)；彼等之序列以參照方式納入此處。
CCL21之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號BAA21817(人)、NP_035456(小鼠CCL21a)、NP_35254(小鼠CCL21b)及NP_075539(小鼠CCL21c)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素8(IL-8)是一種趨化激素，又名嗜中性球活化肽1或SCYB8，其為由數種細胞類型因應發炎刺激所分泌之組織衍生性肽。美國第6,133,426及6,177,980號專利揭示人化抗IL-8抗體之胺基酸及多核苷酸序列。人IL- 8之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_000584，彼之序列以參照方式納入此處。
人IL-8之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_000575，彼之序列以參照方式納入此處。
生長因子
顆粒球/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種細胞介素，其作為白血球生長因子以刺激幹細胞產生顆粒球(嗜中性球、嗜酸性球及嗜鹼性球)及單核球。GM-CSF之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號M11734(人)、NM_009969(小鼠)、EU520303(雞)、NM_001037660(大鼠Csf2ra)及NM_133555(大鼠Csf2rb)，彼等之序列以參照方式納入此處。
顆粒球/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAA52122(人)、NP_034099(小鼠)、ACB11534(雞)、NP_001032749(大鼠Csf2ra)及NP_598239(Csf2rb)，彼等之序列以參照方式納入此處。
FMS相關酪胺酸激酶配體(FLT3/FLK2配體，Flt3L)可作為在造血幹細胞或祖細胞或二者上之生長因子受體，彼等之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號U04806(人)及NM_013520(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
FLT3/FLK2配體(Flt3L)之胺基酸序列可得自公眾資料 庫，如登記號AAA17999(人)及NP_038548(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
在某些人癌症中經上調之轉形生長因子α(TGF-α)可反向授予該經轉型之表型至培養細胞，其多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_001099691(人)、NM_031199(小鼠)、NM_001001614(雞)及NM_012671(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
TGF-α之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_001093161(人)、NP_112476(小鼠)、NP_001001614(雞)及NP_036803(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
佐劑
β-防禦素係涉及對抗許多革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌、真菌及病毒之先天免疫反應之抗微生物性肽類。β-防禦素之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號X92744(人hBD-1)、AJ000152(人hBD-2)、AF217245(人β防禦素3)、AJ314835(人β防禦素4)、AB089180(人hBD-5)、AY122466(人防禦素β 106，DEFB106)、AF540979(人β防禦素107，DEFB107)、AF529416(人β防禦素，DEFB108)、DQ012014(人β防禦素110，DEFB110)、DQ012015(人β防禦素111，DEFB111)、DQ012016(人β防禦素112，DEFB112)、DQ012017(人β防禦素113，DEFB113)、DQ012018(人β防禦素114，DEFB114)、 DQ012019(人β防禦素115，DEFB115)、DQ012020(人β防禦素116，DEFB116)、DQ012021(人β防禦素117，DEFB117)、NM_007843(小鼠防禦素β 1)、NM_010030(小鼠防禦素β 2，Defb2)、NM_013756(小鼠防禦素β 3，Defb3)、NM_019728(小鼠防禦素β 4，Defb4)、NM_030734(小鼠防禦素β 5，Defb5)、NM_054074(小鼠防禦素β 6，Defb6)、NM_139220(小鼠防禦素β 7)、NM_153108(小鼠防禦素β 8，Defb8)、NM_139219(小鼠防禦素β 9，Defb9)及NM_139225(小鼠防禦素β 10，Defb10)；彼等之序列以參照方式納入此處。
β-防禦素之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號CAA63405(人hBD-1)、CAB65126(人hBD-2)、AAF73853(人β防禦素3)、CAC85520(人β防禦素4)、BAC10630(人hBD-5)、AAM93908(人防禦素β 106，DEFB106)、AAN33115(人β防禦素107，DEFB107)、AAQ09525(人β防禦素，DEFB108)、AAY59750(人β防禦素110，DEFB110)、AAY59751(人β防禦素111，DEFB111)、AAY59752(人β防禦素112，DEFB112)、AAY59753(人β防禦素113，DEFB113)、AAY59754(人β防禦素114，DEFB114)、AAY59755(人β防禦素115，DEFB115)、AAY59756(人β防禦素116，DEFB116)、AAY59757(人β防禦素117，DEFB117)、NP_031869(小鼠防禦素β 1)、NP_034160(小鼠防禦素β 2，Defb2)、NP_038784(小鼠防禦素β 3，Defb3)、NP_062702(小鼠防 禦素β 4，Defb4)、NP_109659(小鼠防禦素β 5，Defb5)、NP_473415(小鼠防禦素β 6，Defb6)、NP_631966(小鼠防禦素β 7)、NP_694748(小鼠防禦素β 8，Defb8)、NP_631965(小鼠防禦素β 9，Defb9)及NP_631971(小鼠防禦素β 10，Defb10)；彼等之序列以參照方式納入此處。亦見美國第5,242,902號專利以獲得額外之人及大鼠防禦素肽序列。
高移動群組-1(HMGB1)蛋白質係作為細胞介素之非組蛋白染色體蛋白質，彼等媒介對壞死性細胞死亡及癌、病原體入侵、外傷及敗血症之局部及系統性反應。HMGB1蛋白質之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_002128(人)、NM_010439(小鼠)、NM_204902(雞)及NM_012963(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
高移動群組-1(HMGB1)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_002119(人)、NP_034569(小鼠)、NP_990233(雞)及NP_037095(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
吞噬細胞性S100蛋白質媒介發炎反應及吸引發炎細胞至組織損傷部位，是先天免疫中重要之損傷相關分子模式(DAMP)分子。見Foell et al.,J.Leukocyte Biol.81：1(2006)。S100蛋白質之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號BC014392(人S100 A1)、BC002829(人S100 A2)、BC012893(人S100 A3)、BC016300(人S100 A4)、Z18954(人S100D)、BC001431(人S100 A6)、BC 034687(人S100 A7)、BC005928(人S100 A8)、BC047681(人S100 A9)、BC015973(人S100 A10)、D38583(人鈣結合蛋白(calgizzarin))、NM_011309(小鼠S100a1)、NM_009115(小鼠S100b)、NM_013650(小鼠S100a8)、NM_009114(小鼠S100a9)、NM_011310(小鼠S100a3)、NM_011311(小鼠S100a4)及NM_011312(小鼠S100a5)，彼等之序列以參照方式納入此處。
S100蛋白質之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAH14392(人S100 A1)、AAH02829(人S100 A2)、AAH12893(人S100 A3)、AAH16300(人S100 A4)、CAA79479(人S100D)、AAH01431(人S100 A6)、AAH34687(人S100 A7)、AAH05928(人S100 A8)、AAH47681(人S100 A9)、AAH15973(人S100 A10)、BAA07597(人鈣結合蛋白)、NP_035439(小鼠S100a1)、NP_033141(小鼠S100b)、NP_038678(小鼠S100a8)、NP_033140(小鼠S100a9)、NP_035440(小鼠S100a3)、NP_035441(小鼠S100a4)及NP_035442(小鼠S100a5)，彼等之序列以參照方式納入此處。
甘露聚糖(一種植物多醣，即甘露糖之聚合物)可用於產生免疫反應。美國第5,807,559號專利揭示甘露聚糖之免疫原性共軛物，其可能被用於產生T細胞免疫性以拮抗腫瘤相關性碳水化合物結構或在感染劑及/或在經感染之宿主細胞表面上所表現之碳水化合物結構。美國第5,773,425號專利揭示甘露聚糖用於緩解症狀及/或治療病 毒性疾病及增強免疫反應之用途。
卡介苗(BCG)(經減毒之活分枝桿菌菌種)被用來作為預防嚴重及致命性結核病之疫苗。美國第7,393,541號專利揭示產製佐劑疫苗以於哺乳動物個體體內產生抗分枝桿菌之活體內T細胞媒介性免疫反應。亦見Hubbard and Collins,Infect.Immun.59(2)：570。美國第5,292,513號專利揭示於有需要增強殺細菌及抗病毒活性之病患活體內以熱殺滅之BCG初免巨噬細胞之方法。BCG之完整基因組序列可得自公眾資料庫，如登記號NC_008769(牛分枝桿菌(M.bovis)BCG巴斯德株(str.Pasteur)1173P2，完整基因組)。
細菌性脂多醣(LPS)係內毒素，當感染革蘭氏陰性細菌時，該等內毒素可誘發強烈之免疫反應。美國第4,148,877號專利揭示源自細菌培養之LPS分餾物及使用該組分作為藥物以誘發對細菌感染之抵抗性。美國第5,292,513號專利揭示於有需要增強殺細菌及抗病毒活性之病患活體內以LPS初免巨噬細胞之方法。
共同刺激分子(正向)
OX40配體(OX40L)屬於腫瘤壞死因子(配體)超家族成員4(Tnfsf4)，其表現於樹突細胞上以促進Th2細胞分化。OX40配體之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號X79929(人)、U12763(小鼠)及AF037067(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
OX40配體(OX40L)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號CAA56284(人)、AAA21871(小鼠)及AAC67236(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
4-1BB配體(4-1BBL)屬於腫瘤壞死因子(配體)超家族成員9(Tnfsf9)，其係第2型跨膜糖蛋白並表現於經活化之T淋巴細胞上。4-1BBL之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_003811(人)、NM_009404(小鼠)及AY332409(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
4-1BB配體(4-1BBL)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_003802(人)、NP_033430(小鼠)及AAQ01228(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CD40蛋白質屬於腫瘤壞死因子受體超家族成員5，在媒介廣泛類型之免疫及發炎反應上至關重要，包括T細胞依賴性免疫球蛋白類別轉換、記憶性B細胞發育及生發中心形成。CD40蛋白質之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號X60592(人)、NM_170701(小鼠)、NM_204665(雞)及NM_134360(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CD40蛋白質之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號CAA43045(人)、NP_733802(小鼠)、NP_989996(雞)及NP_599187(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CD40L(CD40配體或CD154)主要表現於經活化之T細胞，是TNF分子超家族之成員。其與抗原表現細胞上之CD40結合。CD40L扮演共同刺激分子之角色並藉由抗 原呈現細胞上之MHC分子誘發抗原呈現細胞之活化與T細胞受體之刺激。CD40L有三個結合伴：CD40、α5β1整合素及αIIbβ3。CD40L序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_000074及MP_000065(人)和NM_011616及NP_035746(小鼠)。
糖皮質素誘發之腫瘤壞死因子受體家族相關蛋白質(GITR)可經由T細胞刺激引起有效之腫瘤免疫性。投予抗GITR單株抗體(mAb)可引發強烈之腫瘤特異性免疫性及清除已建立之腫瘤而不誘發明顯之自體免疫疾病。見Ko et al.,J.Exp.Med.7：885(2005)。美國第6,503,184 B1號專利揭示抗GITR抗體。
GITR配體(GITRL)之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AY358868(人)及AY359852(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
GITR配體(GITRL)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號AAQ89227(人)及AAQ55265(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
皰疹病毒進入媒介因子(HVEM)結合配體(HSVgD)又名p30或LIGHT，係與T細胞共同刺激有關之TNF家族成員。LIGHT有二個受體，皰疹病毒進入媒介因子(HVEM)及淋巴毒素-β受體(LT-βR)。以HVEM之配體而言，HSVgD藉由作為T細胞之共同刺激因子以活化T細胞，導致T細胞增生及細胞介素分泌。LIGHT之多核苷酸及胺基酸序列見美國第7,118,742號專利。美國第 5,654,174號專利描述刪除羧基端殘基之變異gD蛋白質。
CD70係與CD27結合之細胞介素。其影響T細胞活化。誘發經共刺激之T細胞的增生及增進溶細胞性T細胞之產生。CD70之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_001252(人)、NM_011617(小鼠)及NM_001106878(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
CD70之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_001243(人)、NP_035747(小鼠)及NP_001100348(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
ICOS-L係T細胞特異性細胞表面受體ICOS之配體，作為T細胞增生及細胞介素分泌之共同刺激信號。ICOS-L亦誘發B細胞增生及分化成漿細胞。ICOS-L可在媒介對發炎狀況之局部組織反應上扮演重要角色，亦可藉由共同刺激記憶性T細胞之功能調節繼發性免疫反應。ICOS-L之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_015259(人)及NM_015790(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
ICOS-L之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_056074(人)及NP_056605(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
PD-L1(又名CD274)蛋白係於經活化之單核球、T細胞及B細胞中表現。當以IFN-γ處理時單核球中之PD-L1係經上調，當以IFN-γ連同其他活化物處理時樹突細胞及 角質細胞中之PD-L1亦經上調。PD-L1蛋白之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NM_014143(人)及NM_021893(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
PD-L1蛋白之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如登記號NP_054862(人)及NP_068693(小鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。
共同刺激分子(負向)
細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)係免疫球蛋白超家族之成員及在經活化之T細胞中表現之共同刺激分子。美國第7,034,121及6,984,720號專利揭示製備及使用拮抗CTLA4之抗體的方法。美國第6,984,720號專利亦揭示抗CTLA4抗體之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。
PD-1分子係免疫球蛋白基因超家族之成員，其與PD-1配體(PD-L1)結合。PD-L1與在T細胞上之PD-1受體之結合傳送共同刺激信號至該細胞，以防止該細胞繼續細胞週期及增加T細胞增生。以抗PD-L1抗體抑制PD-L1及T細胞上之受體間的交互作用導致下調免疫反應，稱為免疫細胞失效。美國第7,029,674號專利揭示製備及定序抗PD-L1抗體之方法。
PD-L2主要已知為PD-1(或人同源物PDCD1)之配體。然而，PD-L2已被報告與PDCD1非依賴性方式之T淋巴細胞增生及IFN-γ產生所必須之共同刺激信號有關。與PDCD1之交互作用藉由阻斷細胞週期進行以抑制T細 胞增生及細胞介素產生。Yamazaki et al.,J.of Immunol.169：5538(2002)及Ansari et al.,J.Exp.Med.198：63(2003)描述抗PD-L2單株抗體之製備。
反向免疫抑制劑(耐受性抑制劑)
轉形生長因子-β(TGF-β)係藉由與二個跨膜絲胺酸/蘇胺酸激酶受體I型及II型中之一者交互作用以調節細胞增生及分化之多功能性蛋白質。見Chen et al.,Science 28：1335(1993)。TGF受體II型(TGFR2)磷酸化及活化I型受體而使I型受體自體磷酸化，接著與SMAD轉錄調節物結合及活化。Lynch MA et al.,Cancer Res.58：4227(1998)描述與人卵巢癌有關之轉形生長因子β受體II型基因(TGFBR2)之突變。Brand et al.,J.Biol.Chem.268：11500-11503(1993)描述刪除預期之絲胺酸/蘇胺酸激酶細胞質結構域(TGFβR2 cDNA H2-3FF之核苷酸1172至2036，可得自公眾資料庫如登記號M85079及如登記號AAA61164之胺基酸序列)損害所有三個TGF-β(1、2及3)依賴性基因表現。TGF-β係於大部分人腫瘤中產生，其抑制腫瘤抗原特異性細胞性免疫。Foster et al.,J.Immunother.31：500(2008)描述顯性負向TGFβR2於細胞毒性T淋巴細胞之表現導致對TGF-β抑制效應之抗性。
TGFβ在誘發轉形上與TGFα協同作用。其亦作為負向自分泌生長因子。TGFβ活化及傳訊之調節異常可能導致細胞凋亡。Ziyadeh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.97： 8015(2000)描述在db/db小鼠中投予抗-TGFβ抗體可預防腎不全及腎小球硬化，此為發展明顯腎病之第II型糖尿病模型。產製及使用TGFβ單株抗體之方法係描述於美國第6,419,928號專利。Barcellos-Hoff et al.,Am J.Pathol.147：5(1995)亦描述產製TGFβ抗體之方法。TGFβ融合蛋白建構體之胺基酸及核苷酸序列係描述於美國第6,756,215號專利。
IL-10係由經活化之Th2細胞、B細胞、角質細胞、單核球及巨噬細胞所產生之細胞介素。IL-10抑制多種細胞介素之合成，包括由經活化之巨噬細胞及T輔助細胞產生之IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF及GM-CSF。IL-10可用於促進經活化之人B細胞之生長及分化、抑制Th1反應以防止移植排斥及T細胞媒介性自體免疫疾病。O'Farrell et al.,EMBO J.17：1006(1998)、Kanbayashi et al.,Cell Immunol.171：153(1996)、Fukushima et al.,Br.J.Ophthalmol.90：1535(2006)及van Lent et al.,Ann.Rheum.Dis.66：334(2007)描述抗-IL10抗體之製備。美國第7,326,567號專利揭示IL-10抗體之多核苷酸序列。美國第5,837,232號專利揭示一種利用抗-IL-10抗體治療B細胞媒介性自體免疫疾病之方法。
細胞介素傳訊抑制因子(SOCS)家族之蛋白質形成典型負向回饋系統之一部分，該系統調節細胞介素信號傳導。Alexander et al.Cell 98：597(1999)描述細胞介素傳訊抑制因子1(SOCS1)係干擾素γ傳訊之重要抑制劑，其可防止 此細胞介素可能致命之新生兒作用。Hilton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：114(1999)討論SOCS1係與負向調節經JAK/STAT3途徑傳訊之細胞介素有關。Ohya et al.J.Biol.Chern.272：27178(1997)描述SOCS蛋白似乎是由介白素6(IL-6)及白血病抑制因子(LIF)進行之傳訊的重要調節因子。美國第6,534,277號專利揭示一種製備及使用抗-SOCS1抗體之方法，其中編碼SOCS1抗體之核酸序列被導入細胞以致使該細胞或彼等之子代細胞表現該抗體，且該重組細胞接著被投予至活體內以達治療效應。美國第6,323,317及7,049,418號專利亦揭示抗-SOCS1抗體。
TGF-α係致裂性多肽，其可與EGF受體結合，並與TGF-β協同作用以促進軟洋菜膠中之非貼壁依賴性細胞增生。Ellis et al.,N.Engl.J.Med.317：158(1987)描述TGF-α與黑色素瘤之某些腫瘤伴生表徵有關。美國第4,742,003號專利及Xian et al.,The J.of Histochem.& Cytochem.47：949(1999)描述製備抗-TGF-α抗體之方法。
腫瘤壞死因子受體(TNFR1)及Fas兩者均含有細胞質Fas-相關死亡結構域蛋白(FADD)，該蛋白係Fas及TNF誘發之計畫性細胞死亡(細胞凋亡)及受體寡聚化傳訊所必須。以哺乳動物蛋白命名之具有與Fas受體之細胞質區域或結構域結合及抑制FAS媒介性細胞凋亡之能力的FADD已被識別。FADD之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如登記號U24231，其胺基酸序列之登記號為AAA86517，彼等係以參考方式納入此處。美國第6,562,797 B1號專利描 述FADD片段或編碼彼之核酸，該片段或彼之核酸係功能完整之天然FADD的顯性負向抑制物。
p53(又名蛋白53或腫瘤蛋白53)係腫瘤抑制蛋白，該蛋白在人係由TP53基因編碼。p53對多細胞生物是重要的，其可調節細胞週期，因此具有與預防癌症有關之腫瘤抑制因子之功能。p53之胺基酸及多核苷酸序列已可獲得，如登記號NM_00546及NP_000537(人)及NM_011640及NP_035770(小鼠)。
生存素係細胞凋亡抑制因子家族之成員。生存素蛋白之功能為抑制胱冬酶活化，藉此導致細胞凋亡或計劃性細胞死亡之負向調節。此功能已藉由中斷生存素誘導途徑導致細胞凋亡增加及腫瘤生長減少加以證實。生存素蛋白高度表現於大部分人腫瘤及胎兒組織，但完全不存於終末分化細胞。因此此項事實使生存素成為癌治療之理想標靶，因為當癌細胞被標靶時，正常細胞則被放過。生存素之表現亦受細胞週期之高度調節，其僅表現於G2-M期。已知生存素藉由在有絲分裂期間與微管蛋白交互作用以局限於有絲分裂紡錘體，且可能在調節有絲分裂上扮演貢獻角色。生存素之調節似乎與p53蛋白相關。p53之胺基酸及多核苷酸序列已可獲得，如登記號NM_001012270及NP_001012270(人)及NM_001012273及NP_001012273(小鼠)。
黑色素瘤相關抗原3(MAGE3)之胺基酸序列係如登記號P43357-1(UniParc)所示。
前列腺特異性抗原(PSA)係一種由前列腺之細胞所產生之蛋白。PSA係以少量存在於前列腺健康之人的血清，但在有前列腺癌及其他前列腺疾病之人則通常上升。
前列腺特異性膜抗原(PSMA)係在前列腺組織及一些其他組織發現之第2型整合膜糖蛋白。此為前列腺癌之可能的治療性標靶。
序列表說明
SEQ ID NO：1係編碼mIL-12及m-IL21之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2係編碼hIL-12及h-IL21之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：3係編碼mIL-21及m-IL15之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：4係編碼mIL-12之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：5係編碼hIL-21及hIL-15之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：6係編碼hIL-21之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：7係編碼mIL-21之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：8係編碼hIL-21之建構體之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：9係編碼mIL-21之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：10係mIL-21之胺基酸序列。
SEQ ID NO：11係編碼mIL-15之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：12係mIL-15之胺基酸序列。
SEQ ID NO：13係編碼mIL-12之mp40之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：14係mIL-12之mp40之胺基酸序列。
SEQ ID NO：15係編碼mIL-12之mp35之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：16係mIL-12之m35之胺基酸序列。
SEQ ID NO：17係編碼hIL-21之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：18係hIL-21之胺基酸序列。
SEQ ID NO：19係編碼hIL-15之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：20係hIL-15之胺基酸序列。
SEQ ID NO：21係編碼hIL-12之p40之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：22係hIL-12之p40之胺基酸序列。
SEQ ID NO：23係編碼hIL-12之p35之多核苷酸序列。
SEQ ID NO：24係hIL-12之p35之胺基酸序列。
SEQ ID NO：25係於果蠅(Drosophila)中發現之蛻皮激素反應元件之核酸序列。
SEQ ID NO：26係於黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發現之蛻皮激素反應元件之核酸序列。
SEQ ID NO：27係於黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發現之蛻皮激素反應元件之核酸序列。
SEQ ID NO：28係歸巢內核酸酶(HE)酵素(I-SceI)之限制位點。
SEQ ID NO：29係包含人IL-12編碼序列：Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)之腺病毒載體之DNA序列。
SEQ ID NO：30係人TNF野生型5'UTR之核酸序列。
SEQ ID NO：31係5U2 5'UTR之核酸序列。
SEQ ID NO：32係編碼IL-2信號肽之經密碼子最佳化之核酸序列。
SEQ ID NO：33係編碼人TNF-α信號肽之野生型核酸序列。
SEQ ID NO：34係編碼人TNF-α信號肽之經密碼子最佳化之核苷酸序列。
SEQ ID NO：35係編碼人TNF-α之野生型核酸序列。
SEQ ID NO：36係編碼人TNF-α之經密碼子最佳化核酸序列。
SEQ ID NO：37係人TNF-α之胺基酸序列。
SEQ ID NO：38係3'調節區之核酸序列，其包含編碼SV40聚腺苷酸化信號之核苷酸序列。
SEQ ID NO：39係3'調節區之核酸序列，其包含編碼人生長荷爾蒙聚腺苷酸化信號之核苷酸序列。
SEQ ID NO：40係包含野生型人TNF-α 3'UTR之核酸序列。
SEQ ID NO：41係人TNF-α 3'UTR AtoC突變物之核酸序列。
SEQ ID NO：42係人GAST 3'UTR之核酸序列。
SEQ ID NO：43係合成性3'調節區之核酸序列。
SEQ ID NO：44係人GAPDH 5'UTR之核酸序列。
SEQ ID NO：45係胰島素SP之野生型核酸序列。
SEQ ID NO：46係編碼人FGF-19信號肽之野生型核酸序列。
SEQ ID NO：47係載體43318之核酸序列。
SEQ ID NO：48係載體43319之核酸序列。
SEQ ID NO：49係載體43320之核酸序列。
SEQ ID NO：50係載體43321之核酸序列。
SEQ ID NO：51係載體43322之核酸序列。
SEQ ID NO：52係載體43323之核酸序列。
SEQ ID NO：53係載體43324之核酸序列。
SEQ ID NO：54係載體43325之核酸序列。
SEQ ID NO：55係載體43326之核酸序列。
SEQ ID NO：56係載體43327之核酸序列。
SEQ ID NO：57係載體43328之核酸序列。
SEQ ID NO：58係載體43329之核酸序列。
SEQ ID NO：59係載體43533之核酸序列。
SEQ ID NO：60係載體43534之核酸序列。
SEQ ID NO：61係載體VVN2823(Ad-RTS-hIL-12)之核酸序列。
SEQ ID NO：62係載體VVN2539(Ad-RTS-mIL-12)之核酸序列。
本發明之詳細說明
定義
除非另外定義，此處所使用之所有技術用語、說明及其他科學用語或詞彙係意圖具有本發明之相關領域之技藝人士所通常了解之意義。在許多情況下，具有通常了解之意義之用語係於此處定義以供清楚及/或輕易地參照及了解，且在此處納入該等定義不應被視為代表與該領域所通常瞭解者之實質差異。分子生物學之用語及/或方法及/或方案之通常了解之定義可見Rieger et al.,Glossary of Genetics：Classical and Molecular,5th edition,Springer-Verlag：New York,1991、Lewin,GenesV,Oxford University Press：New York,1994、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3d ed.2001)及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1994)。當適當時，涉及使用自商業途徑獲得之套組及/或試劑之方法通常根據廠商說明及/或方案及/或參數進行，除非另外說明。
以本發明之目的而言，用語「經分離」代表已自生物性物質(細胞、核酸或蛋白質)之原始環境(在該環境中該物質係天然存在)移除之物質。舉例來說，以天然狀態存在於植物或動物體內之多核苷酸係未經分離，然而與該多核苷 酸天然存在之環境中的鄰近核酸分開之相同多核苷酸被認為是「經分離」的。
當用於指稱生物性物質時，用語「經純化」不要求該物質以展現絕對純粹、排除其他化合物存在之形式存在。其反而為相對性定義。
「核酸」、「核酸分子」、「寡核苷酸」、「核苷酸」及「多核苷酸」可交換使用，這些用語係指呈單股形式或雙股螺旋之核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子))或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧尿苷或去氧胞苷；「DNA分子))之磷酸酯聚合形式，或彼等之任何磷酯類似物，諸如磷硫代酯及硫酯。雙股DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋均有可能。用語核酸分子特別是DNA或RNA分子僅指該分子之一級和二級結構，並不限制彼呈任何特定之三級形式。因此，此用語包括特別是在線性或環狀DNA分子(例如限制片段)、質體、超螺旋DNA及染色體內被發現之雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子之結構時，可能根據通常習慣之僅給予該DNA之非轉錄股之5'至3'方向之序列(即具有和mRNA同源之序列之股)以描述此處之序列。「重組DNA分子」係指遭受分子生物操縱之DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因組DNA、質體DNA、合成性DNA及半合成性DNA。
用語「片段」當用於指稱多核苷酸序列時，係指相對於參照核酸長度經減少之核苷酸序列，且除共同部分以外包 含與該參照核酸一致之核苷酸序列。就本發明而言，當適當時，該核酸片段可能為更大之多核苷酸之組分而被包括於該更大之多核苷酸以內。該等片段包含本發明之核酸之至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多個連續核苷酸長度之寡核苷酸，或由該等寡核苷酸組成。
此處所使用之「經分離之核酸片段」係指單股或雙股RNA或DNA之聚合物，該聚合物可任意選擇地包含合成性、非天然或經改變之核苷酸鹼基。呈DNA聚合物形式之經分離之核酸片段可能包含一或多個cDNA、基因組DNA或合成性DNA之區段。
「基因」係指包含編碼功能性分子之核苷酸之多核苷酸，該功能性分子包括僅由轉錄產生者(例如生物活性RNA物種)或由轉錄及轉譯產生者(例如多肽)。用語「基因」包含cDNA及基因組DNA核酸。「基因」亦指表現特定RNA、蛋白質或多肽之核酸片段，包括在該編碼序列之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)之調節序列。「天然基因」係指在天然中發現具有其本身之調節序列之基因。「嵌合基因」係指非天然基因之任何基因，其包含不在天然中一起發現之調節及/或編碼序列。因此，嵌合基因可能包含源自不同來源之調節序列及編碼序列，或源自相同來 源但以不同於在天然中發現之方式排列之調節序列及編碼序列。嵌合基因可能包含源自不同來源之編碼序列及/或源自不同來源之調節序列。「內源性基因」係指彼之天然位置係位於有機體之基因組內之天然基因。「外來」基因或「異源性」基因係指正常不在宿主有機體內發現，但藉由基因轉移被導入宿主有機體內之基因。外來基因可包含被插入非天然有機體內之天然基因，或嵌合基因。「轉基因」係經由轉形程序被導入基因組內之基因。舉例來說，介白素-12(IL-12)基因編碼IL-12蛋白質。IL-12係35千道爾頓次單位(p35)及40千道爾頓次單位(p40)之異二聚體，該二個次單位經由雙硫鍵連接以形成完整功能性IL-12p70。IL-12基因編碼p35及p40二個次單位。
「異源性DNA」係指非天然存在於細胞內或細胞內之染色體部位之DNA。異源性DNA可能包含對細胞而言為外來之基因。
用語「基因組」不只包括染色體DNA或RNA，還包括粒線體、葉綠體及病毒DNA或RNA。
當單股形式之核酸分子諸如cDNA、基因組DNA或RNA可在適當之溫度及溶液離子強度之條件下與其他核酸分子黏合時，該核酸分子可與另一核酸分子「雜交」。雜交及清洗條件係廣為周知，並於Sambrook et al.in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)中舉例說明，特別是其中的第11章及表 11.1。溫度及離子強度之條件決定雜交之「嚴謹度」。
嚴謹度條件可經調整以篩選類似程度不同之片段，自勉強類似之片段(諸如源自相關性遙遠之有機體之同源性序列)至高度類似之片段(諸如源自密切相關之有機體複製功能性酶之基因)。以同源性核酸之初步篩選而言，可使用對應Tm 55℃之低嚴謹度雜交條件，例如5倍SSC、0.1% SDS、0.25%乳及不含甲醯胺；或30%甲醯胺、5倍SSC、0.5% SDS。中度嚴謹度雜交條件對應更高之Tm，例如40%甲醯胺及5倍或6倍SSC。高度嚴謹度雜交條件對應最高之Tm，例如50%甲醯胺及5倍或6倍SSC。
雜交要求二個核酸必須包含互補序列，但是依雜交之嚴謹度不同，鹼基之間可能有錯誤配對之情形。用語「互補」係用來描述核苷酸鹼基之間能彼此雜交之關係。舉例來說，以DNA而言，腺嘌呤係與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶係與鳥嘌呤互補。因此，本發明亦包括與此處所揭示或使用之完整序列互補之經分離之核酸片段，以及該些實質上類似之核酸序列。
在本發明之一個實施態樣中，多核苷酸係藉由採用雜交條件加以檢測，該等雜交條件包含於Tm 55℃之雜交步驟及利用如上述之條件。在其他實施態樣中，該Tm係60℃、63℃或65℃。
雜交後之清洗亦決定嚴謹度之條件。一組條件使用一系列清洗步驟，一開始在室溫下以6倍SSC、0.5% SDS清洗15分鐘(min)，接著在45℃下以2倍SSC、0.5% SDS重複清洗30分鐘，再於50℃下以0.2倍SSC、0.5% SDS重複清洗30分鐘二次。一組嚴謹度條件使用較高之溫度，其中各個清洗步驟與上述相同，除了最後二次以0.2倍SSC、0.5% SDS清洗30分鐘之溫度增加至60℃。另一組高度嚴謹度條件的最後二次清洗於65℃下以0.1倍SSC、0.1% SDS清洗。
核酸雜交之適當嚴謹度取決於該等核酸之長度及互補之程度，這些是該領域眾所周知之變異。二個核苷酸序列之間的類似性或同源性程度越高，具有該些序列之核酸的雜交物具有越高之Tm值。核酸雜交之相對穩定性(對應較高之Tm)依下列順序遞減：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。以長度超過100個核苷酸之雜交物而言，計算Tm之方程式已被發展(見Sambrook et al.，同上，9.50-0.51)。以較短核酸(即寡核苷酸)之雜交而言，錯誤配對之位置更顯重要，且寡核苷酸之長度決定彼之特異性(見Sambrook et al.，同上，11.7-11.8)。
在本發明之一個實施態樣中，多核苷酸係藉由採用雜交條件加以檢測，該等條件包含在低於500毫莫耳鹽濃度及至少37℃下之雜交步驟，及在至少63℃之溫度下使用2倍SSPE之清洗步驟。在另一實施態樣中，該等雜交條件包含低於200毫莫耳鹽濃度及至少37℃下之雜交步驟。在其他實施態樣中，該等雜交條件包含2倍SSPE及在63℃下之雜交及清洗步驟。
在另一實施態樣中，可雜交之核酸之長度係至少約 10個核苷酸。較佳地，可雜交之核酸之最短長度係至少約15個核苷酸，例如至少約20個核苷酸，例如至少30個核苷酸。另外，該領域之技藝人士將瞭解該溫度及清洗溶液鹽濃度可根據各種因素諸如探針長度而視需要調整。
用語「探針」係指可與互補性單股標靶核酸鹼基配對以形成雙股分子之單股核酸分子。
此處所使用之用語「寡核苷酸」係指可與基因組DNA分子、cDNA分子、質體DNA或mRNA分子雜交之短核酸。寡核苷酸可利用例如32P-核苷酸或經標記(諸如生物素)共價共軛之核苷酸加以標示。經標示之寡核苷酸可被用來作為探針以檢測核酸之存在。寡核苷酸(其一或二者可經標示)可被用來作為PCR引子，以用於克隆(clone)核酸之全長或片段以供DNA定序，或用於檢測核酸之存在。寡核苷酸亦可被用來與DNA分子形成三螺旋體。通常，寡核苷酸係經合成製備，較佳地在核酸合成儀上合成。因此，經製備之寡核苷酸可具有非天然發生之磷酯鍵類似物，諸如硫酯鍵等。
「引子」係指與標靶核酸序列雜交以產生雙股核酸區之寡核苷酸，該雙股核酸區可在適當之條件下作為DNA合成之起始點。該等引子可被用於聚合酶連鎖反應或DNA定序。
「聚合酶連鎖反應」之縮寫為PCR，係指經酶之作用擴增特定核酸序列之活體外方法。PCR涉及溫度週期之重複循環，每個週期包含三個階段：使模板核酸變性以分開標 靶分子之股、使單股PCR寡核苷酸引子與模板核酸黏合及藉由DNA聚合酶使黏合引子延伸。PCR提供檢測標靶分子存在與否，以及在定量或半定量條件下測定該標靶分子在核酸起始池內之相對量之方法。
「逆轉錄聚合酶連鎖反應」之縮寫為RT-PCR，係指經酶之作用自RNA分子產製標靶cDNA分子，接著如上所述經酶之作用擴增在該標靶cDNA分子內之特定核酸序列之活體外方法。RT-PCR亦提供檢測標靶分子存在與否，及在定量或半定量條件下測定該標靶分子在核酸起始池內之相對量之方法。
DNA「編碼序列」或「編碼區」係指編碼多肽之雙股DNA序列，且當「編碼序列」被置於適當調節序列之控制下，其可在細胞內、活體外(ex vivo)、試管內(in vitro)或活體內(in vivo)被轉錄及轉譯成多肽。「適當之調節序列」係指位於編碼序列上游(5'非編碼序列)、編碼序列之內或編碼序列下游(3'非編碼序列)之核苷酸序列，該序列影響該相關編碼序列之轉錄、RNA處理或穩定性或轉譯。調節序列可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化辨識序列、RNA處理位點、效應子結合位點及莖環結構。編碼序列之邊界定義為在5'(胺基)端之起始密碼子及在3'(羧基)端之轉譯終止密碼子。編碼序列可包括但不限於原核序列、來自mRNA之cDNA、基因組DNA序列及甚至合成性DNA序列。若該編碼序列係意圖用於真核細胞內表現，通常在該編碼序列之3'端將有聚腺苷酸化信號 及轉錄終止序列。
「開放閱讀框」之縮寫為ORF，係指一段核酸序列(不論是DNA、cDNA或RNA)，其包含轉譯起始信號或起始密碼子(諸如ATG或AUG)及終止密碼子，且可能可被轉譯成多肽序列。
此處使用之用語「頭對頭」描述二個多核苷酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的5'端係與另一多核苷酸之編碼股的5'端相鄰，該二個多核苷酸係以頭對頭之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著遠離另一多核苷酸之5'端前進。用語「頭對頭」可簡寫為(5')-對-(5')，亦可以符號(←→)或(3'←5'5'→3')表示。
此處使用之用語「尾對尾」描述二個多核苷酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的3'端係與另一多核苷酸之編碼股的3'端相鄰，該二個多核苷酸係以尾對尾之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著另一多核苷酸前進。用語「尾對尾」可簡寫為(3')-對-(3')，亦可以符號(→←)或(5'→3'3'←5')表示。
此處使用之用語「頭對尾」描述二個多核苷酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的5'端係與另一多核苷酸之編碼股的3'端相鄰，該二個多核苷酸係以頭對尾之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著與另一多核苷酸相同之方向前進。用語「頭對尾」可簡寫為(5')-對-(3')，亦可以符號(→→)或(5'→3'5'→3')表示。
用語「下游」係指位於參考核苷酸序列3'之核苷酸序 列。特別是，下游核苷酸序列通常與在轉錄起始點之後的序列相關。舉例來說，基因之轉譯起始密碼子係位於轉錄起始位點之下游。
用語「上游」係指位於參考核苷酸序列5'之核苷酸序列。特別是，上游核苷酸序列通常與位於編碼序列之5'側或轉錄起始點之序列相關。舉例來說，大部分啟動子係位於轉錄起始點之上游。
用語「限制內核酸酶」及「限制酶」可交換使用，係指在雙股DNA之內與特定核苷酸序列結合且在該特定核苷酸序列之內切割之酶。
「同源性重組」係指將外來DNA序列插入另一DNA分子內，例如將載體插入染色體內。較佳地，該載體以特定染色體位點為標靶以進行同源性重組。以特定同源性重組而言，該載體將包含足夠長度之與染色體序列同源之區，以允許互補結合及使載體納入染色體內。同源性之區域越長及序列類似性之程度越高可增加同源重組之效率。
該領域中已知之一些方法可被用於增殖本發明之多核苷酸。一旦適當之宿主系統及生長條件被建立後，重組表現載體可被大量增殖及製備。如此處所述，可使用之表現載體包括但不限於下列載體或彼等之衍生物：人或動物病毒諸如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒諸如桿狀病毒；酵母菌載體；噬菌體載體(例如λ)及質體及黏質體DNA載體等。
「載體」係指任何用於克隆及/或轉移核酸至宿主細胞 內之載具。載體可為複製子，該複製子可與另一DNA片段附著以促成該附著區段之複製。「複製子」係指任何功能為活體內DNA複製之自主單位(即可自行控制複製)之基因元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。用語「載體」包括在試管內、活體外或活體內用於將核酸導入細胞內之病毒及非病毒載具。許多該領域中已知之載體可被用於操縱核酸、將反應元件及啟動子納入基因內等。可能的載體包括例如質體或經改質之病毒包括例如噬菌體諸如λ衍生物，或質體諸如pBR322或pUC質體衍生物，或Bluescript載體。另一可用於本發明之載體實例係如WO 2007/038276中所述之UltraVectorTM產製系統(維吉尼亞州布萊克斯堡(Blacksburg,VA)英創松(Intrexon)公司)。舉例來說，欲將對應反應元件及啟動子之DNA片段插入適當之載體中，可藉由使適當之DNA片段與具有互補黏性端之選擇載體連接加以完成。另外，該等DNA分子之末端可能經酶修飾或可能藉由連接核苷酸序列(連接子)至該DNA末端以產生任何位點。該等載體可能經工程化以包含可選擇之標誌基因，藉此篩選已將該標誌納入細胞基因組內之細胞。該等標誌允許辨識及/或篩選該納入及表現由該標誌所編碼之蛋白質之宿主細胞。
病毒載體(特別是反轉錄病毒載體)已被用於各種細胞內之基因遞送應用，另外也被用於活動物個體。可被使用之病毒載體包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒相關病毒、痘病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、 EB(Epstein-Barr)病毒、腺病毒、雙生病毒及花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電脂質(細胞轉染素)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。除了核酸之外，載體亦可包含一或多個調節區，及/或可用於選擇、測量及監測核酸轉移結果(轉移至何種組織、表現期間等)之可選擇標誌。
用語「質體」係指通常攜帶並非細胞中心代謝之部分的基因之染色體外元件，且通常呈環狀雙股DNA分子之形式。該等元件可自主性地複製源自任何來源之序列、基因組嵌入序列、噬菌體或核苷酸序列、線性、環狀或超螺旋之單股或雙股DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已被接合或重組成獨特之建構體，該建構體能將經選擇之基因產物的啟動子片段及DNA序列與適當之3'非轉譯序列導入細胞內。
「克隆(cloning)載體」係指「複製子」，其為依序複製且包含複製起點之單位長度之核酸(較佳為DNA)，諸如質體、噬菌體或黏質體，克隆載體可與另一核酸區段附著以促成該附著區段之複製。克隆載體可於一種細胞類型中複製，並於另一種細胞類型中表現(「穿梭載體」)。克隆載體可包含一或多個可被用於篩選包含該載體之細胞之序列，及/或一或多個供插入受關注之序列之多重克隆位點。
用語「表現載體」係指經設計而能夠表現被插入之核酸序列之載體、質體或載具。經克隆之基因即經插入之核酸序列通常被置於控制元件之控制下，諸如啟動子、最小啟 動子、增強子或該類似元件。可用於驅動核酸於所欲宿主細胞內之表現之起始控制區或啟動子為數眾多，且為該領域之技藝人士所熟悉。幾乎任何能驅動這些基因表現之啟動子可被用於表現載體，包括但不限於病毒啟動子、細菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成性啟動子、組成性啟動子、組織特異性啟動子、致病機轉或疾病相關啟動子、發展特異性啟動子、誘導性啟動子、光調節性啟動子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、鹼性磷酸酶啟動子(可用於啤酒釀母菌內表現)；AOX1啟動子(可用於畢赤酵母內表現)；β-內醯胺酶、lac、ara、tet、trp、lP L 、lP R 、T7、tac及trc啟動子(可用於在大腸桿菌(Escherichia coli)內表現)；光調節性-、種子特異性-、花粉特異性-、卵巢特異性-、花菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)35S、最小CMV 35S、木薯葉脈嵌紋病毒(cassava vein mosaic virus)(CsVMV)、葉綠素a/b結合蛋白、核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶、莖特異性、根特異性、幾丁質酶、壓力誘導性、水稻東格魯(tungro)桿狀病毒、植物超啟動子、馬鈴薯白胺酸胺肽酶、硝酸還原酶、甘露鹼合成酶、胭脂胺酸合成酶、泛素、玉米蛋白及花青素啟動子(可用於在植物細胞內表現)；該領域已知之動物及哺乳動物啟動子包括但不限於SV40早期(SV40e)啟動子區、勞斯肉瘤病毒(RSV)之3'長終端重複(LTR)所包含之啟動子、腺病毒(Ad)之E1A或主要晚期啟動子(MLP)基 因之啟動子、巨細胞病毒(CMV)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IE1啟動子、延長因子1α(EF1)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、泛素(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、鼠啟動子之調節序列及轉錄控制區、金屬硫蛋白-L啟動子及轉錄控制區、普遍型啟動子(HPRT、波形蛋白、α-肌動蛋白、微管蛋白及該類似物)、中間絲(肌間線蛋白、神經絲、角質素、GFAP及該類似物)之啟動子、(MDR、CFTR或因子VIII型及該類似物之)治療基因之啟動子、致病機轉或疾病相關啟動子，及展現組織特異性且已被用於基因轉殖動物之啟動子，諸如在胰腺泡細胞內具活性之彈性蛋白酶I基因控制區；在胰β細胞內具活性之胰島素基因控制區、在淋巴樣細胞內具活性之免疫球蛋白基因控制區、在睪丸、乳房、淋巴樣及肥胖細胞內具活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區；在肝臟中具活性之白蛋白基因、Apo AI及Apo AII控制區、在肝臟中具活性之α-胎兒蛋白基因控制區、在肝臟中具活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區、在骨髓細胞內具活性之β-球蛋白基因控制區、在腦之寡突細胞內具活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區、在骨骼肌中具活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區及在下視丘中具活性之促性腺釋放激素基因控制區、丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、脂肪酸結合小腸蛋白之啟動子、平滑肌細胞α-肌動蛋白之啟動子及該類似物。此外，這些表現序列可能藉由加入增強子或調節序列及該類似物加以修飾。
載體可經由該領域已知之方法導入所欲之宿主細胞內，例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白(見例如Wu et al.,J Biol.Chem.267：963(1992)、Wu et al.,J Biol.Chem.263：14621(1988)及Hartmut et al.，加拿大第2,012,311號專利申請案)。
本發明之多核苷酸亦可經由脂質體轉染被導入活體內。在過去十年內，越來越常使用脂質體於試管內包封及轉染核酸。經過設計以減少脂質體媒介性轉染所遭遇之困難及危險的合成性陽離子脂質可被用於製備脂質體，以供活體內轉染編碼標誌之基因(FeIgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413(1987)、Mackey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027(1988)及Ulmer et al.,Science 259：1745(1993))。使用陽離子脂質可增進帶負電核酸之包封，亦可促進與帶負電細胞膜之融合(FeIgner et al.,Science 337：387(1989))。特別適用於轉移核酸之脂質化合物及組成物係描述於WO95/18863、WO96/17823及美國第5,459,127號專利。利用脂質體轉染以導入外源性基因至活體內之特定器官具有某些實際好處。一部分之優點在於脂質體對於特定細胞之分子靶向性。很明顯的，引導對特定細胞類型之轉染將特別適用於具有細胞異質性之組織，諸如胰、肝、腎及腦。脂質可與其他分子化學偶合以達標靶之目的(Mackey et al.1988，同上)。經標靶之肽(例如荷 爾蒙或神經傳遞物)及蛋白質諸如抗體或非肽分子可與脂質體化學偶合。
其他分子亦可用於促進核酸於活體內之轉染，諸如陽離子寡肽(例如WO95/21931)、衍生自DNA結合蛋白之肽(例如WO96/25508)或陽離子聚合物(例如WO95/21931)。
也可能於活體內導入呈裸DNA質體之載體(見美國第5,693,622、5,589,466及5,580,859號專利)。受體媒介性DNA遞送方法亦可被使用(Curiel et al.,Hum.Gene Ther.3：147(1992)及Wu et al.,J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
用語「轉染」係指細胞之攝取外源性或異源性RNA或DNA。當外源性或異源性RNA或DNA被導入細胞內時，該細胞係經該等RNA或DNA之「轉染」。當該經轉染之RNA或DNA導致細胞之表型改變，該細胞被外源性或異源性RNA或DNA「轉形」。轉形RNA或DNA可被整合(共價連接)至組成細胞之基因組之染色體DNA。
「轉形」係指將核酸片段轉移至宿主有機體之基因組內，導致基因穩定性繼承。包含該轉形核酸片段之宿主有機體被稱為「基因轉殖」或「重組」或「轉形」有機體。
此外，包含本發明之多核苷酸之重組載體可包括一或多個在細胞性宿主內擴增或表現時所尋找之複製起點、標誌或可選擇之標誌。
用語「可選擇之標誌」係指識別因子，通常為抗生素或化學抗藥性基因，該標誌能根據該標誌基因之效應被選擇，即對抗生素之抗藥性、對除草劑之抗藥性、比色標 誌、酶、螢光標誌及該類似物，其中該效應係用於追蹤感興趣之核酸的繼承性及/或識別已繼承感興趣之核酸的細胞或有機體。該領域已知及使用之可選擇之標誌基因實例包括：提供對安比西林、鏈黴素、健他黴素、卡那黴素、潮黴素、雙丙氨磷除草劑、磺醯胺及該類似物之抗藥性的基因；及用來作為表型標誌之基因，即花青素調節基因、異戊烯轉移酶基因及該類似物。
用語「報告基因」係指編碼識別因子之核酸，該識別因子能根據該報告基因之效應被識別，其中該效應係用於追蹤感興趣之核酸的繼承性、識別已繼承感興趣之核酸的細胞或有機體，及/或測量基因表現誘導或轉錄。該領域已知及使用之報告基因實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-尿苷酸酶(Gus)及該類似物。可選擇之標誌基因亦可被認為是報告基因。
「啟動子」及「啟動子序列」可交換使用，係指能控制編碼序列或功能性RNA之表現的DNA序列。一般來說，編碼序列係位於啟動子序列之3'端。啟動子可整體衍生自天然基因，或可由源自天然中所發現之不同啟動子的不同元件所組成，或甚至包含合成性DNA區段。該領域之技藝人士了解，不同的啟動子可能引導基因在不同的組織或細胞類型中表現，或在不同的發展階段表現，或因應不同的環境或生理條件表現。造成基因在大部分時間及大部分細胞類型中表現之啟動子通常被稱為「組成性啟動子」。造成 基因在特定細胞類型中表現之啟動子通常被稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。造成基因在特定發展或細胞分化階段表現之啟動子通常被稱為「發展特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。在以劑、生物性分子、化學物、配體、光線或可誘導啟動子之類似物暴露或處理細胞之後被誘導且造成基因表現之啟動子通常被稱為「誘導性啟動子」或「調節性啟動子」。另外知道的是，由於在大部分情況中，調節序列之確切邊界並未被完全定義，因此不同長度之DNA片段可能具有相同之啟動子活性。
在本發明之任何載體中，該載體可任意選擇地包含此處所揭示之啟動子。在一實施態樣中，該啟動子係列示於此處之表1之啟動子。
在本發明之任何載體中，該載體可任意選擇地包含組織特異性啟動子。在一實施態樣中，該組織特異性啟動子係此處所揭示之組織特異性啟動子。在另一實施態樣中，該組織特異性啟動子係列示於此處之表2之組織特異性啟動子。
啟動子序列通常以彼之3'端的轉錄起始位點為界，延伸至上游(5'方向)以包括啟動在背景值以上可偵測之量之轉錄所需之最小數量之鹼基或元件。在該啟動子序列之內可發現轉錄起始位點(方便地以例如核酸酶S1之定位定義)，和負責與RNA聚合酶結合之蛋白質結合結構域(一致序列)。
「治療性開關啟動子」(「TSP」)係指控制基因開關成份 之表現的啟動子。基因開關及彼等之各種成份係詳細描述於本說明書之其他地方。在某些實施態樣中，TSP係組成性的，即具連續活性。組成性TSP可能為全面組成性(即在任何組織或細胞中不需額外之因子或調節物而普遍地具有功能)或組織或細胞特異性組成性(即在特定組織類型或細胞類型中不需額外之因子或調節物而普遍地具有功能)。在某些實施態樣中，本發明之TSP在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化。在本發明之某些涉及二或多種TSP之實施態樣中，該等啟動子可為組成性及活化性啟動子之組合。如此處所使用，「在疾病、疾患或狀況相關性條件下被活化之啟動子」包括但不限於疾病特異性啟動子、對特定生理性、發展性、分化性或病理性條件有反應之啟動子、對特定生物性分子有反應之啟動子，及對特定疾病、疾患或狀況相關性組織或細胞類型(例如腫瘤組織或惡性細胞)具特異性之啟動子。TSP可包含天然發生之啟動子之序列、衍生自天然發生之啟動子的經修飾之序列，或合成性序列(例如將反應元件插入最小啟動子序列以改變該啟動子之反應性)。
當RNA聚合酶將細胞內之編碼序列轉錄成mRNA時，該編碼序列係在轉錄及轉譯控制序列之「控制下」，該mRNA接著經RNA反式剪切(若該編碼序列包含內含子)及轉譯成為由該編碼序列所編碼之蛋白質。
「轉錄及轉譯控制序列」係指DNA調節序列，諸如啟動子、增強子、終止子及該類似序列，其用以在宿主細胞 內表現編碼序列。在真核細胞中，聚腺苷酸化信號係控制序列。
用語「反應元件」係指一或多種順式作用之DNA元件，該元件授予經由與轉錄因子之DNA-結合結構域交互作用所媒介之啟動子的反應性。此DNA元件在彼之序列中可為迴文(完美或不完美)或由序列模體或被不等數量之核苷酸分開之半位點組成。該等半位點可為類似或相同的，經排列為正向或反向重複，或為單一半位點或串聯鄰近半位點之多聚體。依將納入反應元件之細胞或有機體之性質而定，該反應元件可包含分離自不同有機體之最小啟動子。在配體存在或不存在時，轉錄因子之DNA結合結構域與反應元件之DNA序列結合，以在此反應元件之調節下啟動或抑制下游基因之轉錄。天然蛻皮激素受體之反應元件的DNA序列實例包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO：25)(見Cherbas et.al.,Genes Dev.5：120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可為一或多種間隔子核苷酸(SEQ ID NO：26)(見D'Avino et al.,Mol.Cell.Endocrinol.113：1(1995))；及GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO：27)(見Antoniewski et al.,Mol.Cell BioI.14：4465(1994))。
用語「可操作性連接」係指核酸序列與單一核酸片段相連以致使一者之功能受到另一者之影響。舉例來說，當啟動子能影響編碼序列之表現時(即編碼序列係在啟動子之轉錄控之下)，該啟動子係與該編碼序列可操作性連接。 編碼序列可與調節序列以同義或反義之方向可操作性連接。
此處所使用之用語「表現」係指轉錄及穩定累積源自核酸或多核苷酸之同義(mRNA)或反義RNA。表現亦可指將mRNA轉譯成蛋白質或多肽。
用語「卡匣」、「表現卡匣」及「基因表現卡匣」係指可在特定限制位點或藉由同源重組被插入核酸或多核苷酸之內的DNA區段。該DNA區段包含編碼感興趣多肽之多核苷酸，且該卡匣及限制位點係經設計以確保該卡匣被插入適當之閱讀框以供轉錄及轉譯。「轉形卡匣」係指特定載體，其包含編碼感興趣之多肽的多核苷酸，且除了該多核苷酸以外還具有促進特定宿主細胞轉形之元件。本發明之卡匣、表現卡匣、基因表現卡匣及轉形卡匣亦可包含允許編碼感興趣之多肽的多核苷酸於宿主細胞內增進表現之元件。這些元件包括但不限於：啟動子、最小啟動子、增強子、反應元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列及該類似序列。
為達本發明之目的，用語「基因開關」係指與啟動子相關之反應元件與以配體依賴性轉錄因子為基底之系統的組合，該以配體依賴性轉錄因子為基底之系統在一或多種配體存在時，可調控基因表現為該反應元件及啟動子係經納入。用語「編碼基因開關之多核苷酸」係指與啟動子相關之反應元件與編碼以配體依賴性轉錄因子為基底之系統的多核苷酸之組合，該以配體依賴性轉錄因子為基底之系統在 一或多種配體存在時，可調控基因表現為該反應元件及啟動子係經納入。
本發明之治療性開關啟動子可為任何可用於治療、改善或預防特定疾病、疾患或狀況之啟動子。實例包括但不限於只在特定疾病、疾患或狀況期間展現增加表現之基因的啟動子及在特定細胞狀況下(例如增生、細胞凋亡、pH值改變、氧化狀態改變、氧氣量改變)展現增加表現之基因的啟動子。在基因開關包含超過一種轉錄因子序列之一些實施態樣中，該治療性方法之特異性可藉由組合疾病或狀況特異性啟動子與組織或細胞類型特異性啟動子而增加，藉以限制該治療性產物在其中表現之組織。因此，組織或細胞類型特異性啟動子係包含於治療性開關啟動子之定義內。
以疾病特異性啟動子為例，可用於治療癌之啟動子包括致癌基因之啟動子。致癌基因之類別實例包括但不限於生長因子、生長因子受體、蛋白質激酶、計畫性細胞死亡調節物及轉錄因子。致癌基因之特定實例包括但不限於sis、erb B、erb B-2、ras、abl、myc及bcl-2及TERT。其他癌相關基因之實例包括腫瘤相關性抗原基因及其他在腫瘤細胞中過度表現之基因(例如MAGE-1、癌胚胎抗原、酪胺酸酶、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn及湯姆森-佛登斯列(Thompson-Friedenreich)抗原(TF))。
該領域已知且可用來作為本發明之治療性開關啟動子之啟動子序列及其他調節元件(例如增強子)之實例係揭示於表1及2所列示之參考文獻，同時列出與各啟動子相關之疾病/疾患(表1)或組織特異性(表2)。在這些參考文獻中揭示之啟動子序列在此處以參照方式整體納入。
編碼表1所列之任何蛋白質之多核苷酸亦可利用本發明之具有非治療性啟動子之啟動子的載體表現。
Figure 106128457-A0101-12-0072-508
Figure 106128457-A0101-12-0073-3
Figure 106128457-A0101-12-0074-4
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在特定疾病或疾患期間展現改變之表現量且因此可提供可用於本發明之啟動子的其他基因包括但不限於表3所列之基因(亦列出相關疾病/疾患)。
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Figure 106128457-A0101-12-0077-7
Figure 106128457-A0101-12-0078-8
Figure 106128457-A0101-12-0079-9
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Figure 106128457-A0101-12-0084-14
一旦辨識出在疾病、疾患或狀況過程中經調節之具表現模式之基因，該基因之啟動子可被用於本發明之基因開關。許多基因之序列包括啟動子區係該領域所知，可自公眾資料庫例如GenBank基因資料庫取得。因此，一旦識別出適當基因，該啟動子序列可被輕易地識別及取得。本發明之另一態樣關於識別彼之啟動子可被分離以放置於基因開關內之適當基因。因此，該基因之特性對本發明之特定實施態樣無關重要，只要該啟動子可被分離以用於後續設定或環境。本發明因此包括使用來自尚未被識別之基因的啟動子。一旦找出適當之基因，測定啟動子功能所需之基因序列係屬例行技藝或實驗。事實上，有多種商用程序可用於協助測定感興趣之基因的啟動子區域。舉例來說，丁(Ding)等人最近藉由逐步刪除人Sprouty4基因之5'-側翼序列以闡明新穎之Sprouty4基因的啟動子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L52(2004)，以參照方式納入此處)。簡言之，當決定轉錄起始位點後，利用共同PCR引子產生PCR片段以在單一方向選殖5'-側翼區段之區段。該產生之區段被選殖至螢光素酶受體載體，測量螢光素酶之活性以決定人Sprouty4基因之啟動子區域。
另一獲得及驗證基因啟動子之程序實例包括下列步驟：(1)取得類似/相同組織類型之疾病及非疾病細胞/組織樣本；(2)自該等樣本分離全RNA或mRNA；(3)進行疾病及非疾病RNA之差異微陣列分析；(4)找出候選疾病特異 性轉錄物；(5)找出與疾病特異性轉錄物有關之基因組序列；(6)取得或合成該疾病特異性轉錄物之預測轉錄起始位點上游及下游的DNA序列；(7)利用得自步驟6之不同長度之DNA設計及產製啟動子報告子載體；及(8)在疾病及非疾病細胞/組織及不相關細胞/組織中測試啟動子報告子載體。
被插入基因開關中之啟動子的來源可為天然或合成性，該啟動子之來源不應限制此處所述之本發明之範圍。換言之，該啟動子可能直接自細胞選殖，或該啟動子可能自不同來源選殖，或該啟動子可能為合成性。
基因開關系統
基因開關可能為藉由添加或移除特定配體以調節基因表現之任何基因開關。在一實施態樣中，該基因開關係一種其中基因表現之量取決於配體之存在量的基因開關。可用於本發明之基因開關之配體依賴性轉錄因子複合物之實例包括但不限於由彼等之個別配體(例如糖皮質素、雌激素、黃體激素、類視色素、蛻皮激素及彼等之類似物或擬似物)所活化之核受體超家族之成員及由四環素活化之rTTA。在本發明之一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。該等系統之實例包括但不限於美國第6,258,603號專利、美國第7,045,315號專利、美國公開專利申請案第2006/0014711、2007/0161086號及國際公開申請案第WO 01/70816號中所述之系統。嵌合性蛻皮激素受體系統 之實例係描述於美國第7,091,038號專利、美國公開專利申請案第2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457及2006/0100416號及國際公開申請案第WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075及WO 2005/108617號，以上各以參照方式整體納入此處。非固醇性蛻皮激素促效劑調節系統之實例係RheoSwitch®哺乳動物誘導性表現系統(麻州伊普斯維奇(Ipswich,MA)新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司)。在本發明之另一態樣中，該基因開關係以FK506結合蛋白(FKBP)與FKBP雷帕黴素相關蛋白(FRAP)之異二聚化為基底，且由雷帕黴素或彼之非免疫抑制性類似物調節。該等系統之實例包括但不限於ARGENTTM轉錄技術(麻州劍橋市ARIAD藥廠)及美國第6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757及6,649,595號專利所描述之系統。
在一實施態樣中，該基因開關包含在治療性開關啟動子之控制下編碼配體依賴性轉錄因子複合物之單一轉錄因子序列。該轉錄因子序列可能編碼天然發生或人工之配體依賴性轉錄因子複合物。人工轉錄因子係其中該轉錄因子之天然序列已被改變之轉錄因子，例如藉由序列突變或藉由組合來自不同轉錄因子之結構域。在一實施態樣中，該轉錄因子包含H組核受體配體結合結構域。在一實施態樣中，H組核受體配體結合結構域係來自蛻皮激素受體、遍在受體(UR)、孤兒受體1(OR-1)、類固醇激素核受體 1(NER-1)、類視色素X受體交互作用蛋白-15(RIP-15)、肝X受體β(LXRβ)、類固醇激素受體樣蛋白(RLD-1)、肝X受體(LXR)、肝X受體α(LXRα)、類法尼醇X受體(FXR)、受體交互作用蛋白14(RIP-14)或法尼醇受體(HRR-1)。在另一實施態樣中，H組核受體LBD係源自蛻皮激素受體。
A.蛻皮激素基底基因開關
EcR及其他H組核受體係核受體超家族之成員，其中所有成員之一般特徵為具備可任意選擇地與異二聚體伴(HP)融合以形成共活化蛋白(CAP)之胺基端反式活化結構域(AD，亦可互換地稱為「TA」或「TD」)、DNA結合結構域(DBD)及經由鉸鏈區與DBD融合之LBD以形成配體依賴性轉錄因子(LTF)。此處所使用之用語「DNA結合結構域」包含自最小多肽序列之DNA結合蛋白至全長DNA結合蛋白，只要該DNA結合結構域之功能為與特定反應元件相連。核受體超家族成員之特徵亦包括具備四或五個結構域：A/B、C、D、E，有些成員具備F結構域(見美國第4,981,784號專利及Evans,Science 240：889(1988))。該「A/B」結構域對應反式活化結構域，「C」對應DNA結合結構域，「D」對應鉸鏈區，及「E」對應配體結合結構域。有些家族成員亦在對應「F」之LBD的羧基端側具有另一反式活化結構域。
下列多肽序列係經報告為蛻皮激素受體(蛻皮類固醇 受體)之多肽序列(20-羥基-蛻皮激素受體)(20E受體)(EcRH)(核受體子家族1之H組成員1)，Genbank之登記號為P34021。
來自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)之蛻皮激素受體(878個胺基酸)(SEQ ID NO：5)
Figure 106128457-A0101-12-0089-15
DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經修飾之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。EcR如同核受體家族之亞群，亦具備定義較不明確之造成異二聚化性質之區域。由於核受體之結構域在天然中係經模塊化，因此LBD、DBD及AD可能可互相交換。
在另一實施態樣中，該轉錄因子包含AD、DBD及H組核受體LBD，該DBD辨識與治療性蛋白質或治療性多核苷酸相連之反應元件以調節該治療性蛋白質或治療性多核苷酸之表現。在某些實施態樣中，該H組核受體LBD包含取代突變。
在另一實施態樣中，基因開關包含在第一治療性開關 啟動子(TSP-1)控制下之第一轉錄因子序列例如CAP，及在第二治療性開關啟動子(TSP-2)控制下之第二轉錄因子序列例如LTF，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成蛋白質複合物(LDTFC)，即以「雙重開關」或「雙雜交物」為基底之基因開關。第一及第二TSP可為相同或不同。在此實施態樣中，在表現治療性分子所需之基因開關中存有二種不同的TSP增進治療性方法之特異性(見圖2)。圖2亦顯示藉由單純地插入適當之TSP以改質治療性基因開關以治療任何疾病、疾患或狀況之能力。
在另一實施態樣中，該第一及第二轉錄因子序列例如CAP或LTF皆在單一治療性開關啟動子之控制下(例如圖1中之TSP-1)。活化此啟動子將在單一開放閱讀框內產製CAP及LTF。此可藉由使用轉錄連接子諸如IRES(內部核糖體進入位點)達成。在此實施態樣中，該配體依賴性轉錄因子複合物之兩部分在TSP-1活化時合成。TSP-1可為組成性啟動子或僅在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化。
在另一實施態樣中，一轉錄因子序列例如LTF係在治療性開關啟動子之控制下，該啟動子僅在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化(例如圖4中之TSP-2或TSP-3)，另一轉錄因子序列例如CAP係在組成性治療性開關啟動子(例如圖4中之TSP-1)之控制下。在此實施態樣中，該配體依賴性轉錄因子複合物之一部分係組成性存 在，然而該第二部分將僅在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被合成。
在另一實施態樣中，一轉錄因子序列例如CAP係在第一TSP(例如圖3中之TSP-1)之控制下，而二或多種不同的第二轉錄因子序列例如LTF-1及LTF-2係在不同的TSP(例如圖3中之TSP-2及TSP-3)之控制下。在此實施態樣中，各種LTF可能具有辨識不同因子調節性啟動子序列之不同DBD，例如DBD-A與因子調節性啟動子-1(FRP-1)相關性反應元件結合，DBD-B與因子調節性啟動子-2(FRP-2)相關性反應元件結合。各種因子調節性啟動子可與不同的治療性基因可操作性連接。以此方式，可同時提供多重治療。
在一實施態樣中，第一轉錄因子序列編碼包含AD、DBD及H組核受體LBD之多肽，該DBD辨識與治療性產物序列相連之反應元件以調節該治療性產物序列之表現，第二轉錄因子序列編碼包含核受體LBD之轉錄因子，該LBD選自脊椎動物類視色素X受體(RXR)、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白(USP)或包含至少二種不同之選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR或USP之核受體配體結合結構域多肽片段之嵌合性核受體(見WO 01/70816 A2及US 2004/0096942 A1)。「伴」核受體配體結合結構域可另包含截短突變、刪除突變、取代突變或其他修飾。
在另一實施態樣中，基因開關包含編碼第一多肽之第一轉錄因子序列及編碼第二多肽之第二轉錄因子序列，該 第一多肽包含核受體LBD及DBD，該DBD辨識與治療性產物序列相連之反應元件以調節該治療性產物序列之表現，該第二多肽包含AD及核受體LBD，其中核受體LBD之一係H組核受體LBD。在一實施態樣中，該第一多肽係實質上不含AD，該第二多肽係實質上不含DBD。就本發明之目的而言，「實質上不含」係指有問題之蛋白質不包含有問題之結構域的足夠序列來提供活化或結合活性。
在本發明之另一態樣中，該第一轉錄因子序列編碼包含異二聚體伴及AD之蛋白質(「CAP」)，該第二轉錄因子序列編碼包含DBD及LBD之蛋白質(「LTF」)。
當只有一個核受體LBD係H組LBD時，另一核受體LBD可能來自任何其他核受體以與H組LBD形成二聚體。舉例來說，當H組核受體LBD係EcR LBD時，其他核受體LBD「伴」可能來自EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白(USP)或包含至少二種不同之選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR或USP之核受體LBD多肽片段之嵌合性核受體(見WO 01/70816 A2、國際專利申請案PCT/US02/05235及US 2004/0096942 A1，以參照方式整體納入此處)。「伴」核受體配體結合結構域可另包含截短突變、刪除突變、取代突變或其他修飾。
在一實施態樣中，脊椎動物RXR LBD係來自人智人(Homo sapiens)、小鼠家鼷鼠(Mus musculus)、大鼠溝鼠(Rattus norvegicus)、雞原雞(Gallus gallus)、豬家豬(Sus scrofa domestica)、青蛙非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬 魚斑馬魚(Danio rerio)、被囊動物三崎海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)或水母箱型水母(Tripedalia cysophora)之RXR。
在一實施態樣中，無脊椎動物RXR配體結合結構域係來自蝗蟲飛蝗(Locusta migratoria)之超氣門多肽(「LmUSP」)、硬蜱美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum)之RXR同源物1(「AmaRXR1」)、硬蜱美洲鈍眼蜱之RXR同源物2(「AmaRXR2」)、招潮蟹大西洋砂招潮蟹(Celuca pugilator)之RXR同源物(「CpRXR」)、甲蟲黃粉蟲(Tenebrio molitor)之RXR同源物(「TmRXR」)、蜜蜂義大利蜂(Apis mellifera)之RXR同源物(「AmRXR」)、蚜蟲桃蚜(Myzus persicae)之RXR同源物(「MpRXR」)或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之RXR同源物。
在一實施態樣中，嵌合性RXR LBD包含至少二種選自脊椎動物物種RXR多肽片段、非脊椎動物物種RXR多肽片段或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段之多肽片段。用於本發明之嵌合性RXR配體結合結構域可能包含至少二種不同物種之RXR多肽片段，或當物種係相同時，該二或多種多肽片段可來自該物種RXR多肽片段之二或多種不同的異構體。該等嵌合性RXR LBD係揭示於例如WO 2002/066614。
在一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種無脊椎動物物種RXR多肽片段。
在另一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段。
當配體與核受體之LBD組合且轉而與治療性產物序列相關性FRP之反應元件結合時，該配體提供外部時態調控治療性產物序列之表現。本發明之各種成份間互相結合即例如配體與LBD結合、DBD與反應元件結合、AD與啟動子結合等之結合機轉或順序並不重要。
在特定實施例中，配體與H組核受體之LBD及彼之核受體LBD伴結合使治療性產物序列得以表現。此機轉不排除配體與H組核受體(GHNR)或彼之伴結合且導致形成活性同型二聚體複合物(例如GHNR+GHNR或伴+伴)之可能性。較佳地，以一或多種不同的受體結構域產生雜交基因開關。通常，該三種結構域DBD、LBD及AD中之一或多種可自不同於其他結構域來源之來源選擇，以使該雜交基因及該形成之雜交蛋白質在經選擇之宿主細胞或有機體內之反式活化活性、與配體之互補結合及對特定反應元件之辨識係經最佳化。此外，該反應元件本身可經其他DNA結合蛋白質結構域之反應元件改質或取代，諸如來自酵母菌之GAL-4蛋白質(見Sadowski et al.,Nature 335：563(1988))或來自大腸桿菌之LexA蛋白質(見Brent et al.,Cell 43：729(1985))，或專門與經設計、改質及選擇以進行特定交互作用之蛋白質進行該等標靶交互作用之合成 性反應元件(見例如Kim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94：3616(1997))，以適應雜交受體。雙雜交系統之另一好處在於它們能夠根據所欲之終結果選擇用於驅使基因表現之啟動子。該等雙重控制在基因治療之領域中特別重要，尤其是當細胞毒性蛋白質被產生時，因為表現時機及表現發生之細胞皆可被控制。當與適當之啟動子可操作性連接之基因被導入個體之細胞內時，該等外源性基因之表現係受到本發明之系統的存在所控制。啟動子可能經組成性或誘導性調節，或可能具組織特異性(即僅在特定細胞類型中表現)或對有機體之某些發展階段具特異性。
在配體存在或不存在時，該第一雜交蛋白質之DNA結合結構域與反應元件之DNA序列結合，以在此反應元件之調節下啟動或抑制下游基因之轉錄。
功能性LDTFC，例如EcR複合物，亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38或βFTZ-1)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR、USP及/或RXR之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。此外，可能需要其他輔因子，諸如通常被稱為輔活化子(亦稱為適應子或媒介子)之蛋白質。這些蛋白質不與DNA序列特異性結合，且不參與基礎轉錄。它們可能經由各種機轉展現它們對轉錄活化之影響，包括刺激與活化子之DNA結合、影響染色質結構，或媒介活化子起始複合物交互作用。該等輔活化子之實例包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、 TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混雜輔活化子C反應元件B結合蛋白CBP/p300(見回顧文獻Glass et al.,Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。另外，通常被稱為輔抑制子(又名抑制子、靜默子或靜默媒介子)之蛋白質輔因子可能為缺乏配體時有效抑制轉錄活化所需。這些輔抑制子可與無配體之EcR交互作用以靜默反應元件之活性。目前的證據顯示，配體結合改變受體之構型，導致釋放輔抑制子及吸引上述輔活化子，藉此取消彼等之靜默活性。輔抑制子之實例包括N-CoR及SMRT(見回顧文獻Horwitz et al.,Mol Endocrinol.10：1167(1996))。這些輔因子可能為在細胞或有機體內之內源性因子，或可能為外源性添加之轉基因以經調節或未調節之方式表現。
B.雷帕黴素基底基因開關
本發明另提供利用FK506結合蛋白作為配體依賴性轉錄因子複合物及雷帕黴素作為配體之基因開關系統。在一實施態樣中，該編碼基因開關之建構體包含(a)編碼第一嵌合性蛋白質之第一多核苷酸，該第一多核苷酸與雷帕黴素或彼之類似物結合且包含至少一個FK506-結合蛋白(FKBP)結構域及至少一個與FKBP結構域異源之蛋白質結構域，其中該FKBP結構域包含選自下列之肽序列：(1)天然發生之FKBP， (2)天然發生之FKBP之變異體，其中最多10個胺基酸殘基被刪除、插入或被取代胺基酸取代，或(3)由與編碼(1)或(2)之FKBP的DNA序列選擇性雜交之DNA序列所編碼之FKBP；(b)編碼第二嵌合性蛋白質之第二多核苷酸，該第二多核苷酸與(a)雷帕黴素或雷帕黴素類似物及(b)第一嵌合性蛋白質形成複合物，且包含至少一個FKBP：雷帕黴素結合(FRB)結構域及至少一個與FRB結構域異源之蛋白質結構域，其中該FRB結構域包含選自下列之肽序列：(4)天然發生之FRB結構域，(5)天然發生之FRB結構域之變異體，其中最多10個胺基酸殘基被刪除、插入或被取代胺基酸取代，或(6)由與編碼(4)或(5)之FRB的DNA序列選擇性雜交之DNA序列所編碼之FRB結構域。
在此基因開關系統中，該第一多核苷酸及該第二多核苷酸各在本說明書他處所述之一或多種治療性開關啟動子之控制下。另外，在某些實施態樣中，至少一種與該第一及第二嵌合性蛋白質中之FKBP及/或FRB結構域異源之蛋白質結構域可為一或多種「活性」或「效應」結構域。效應結構域可選自各式各樣之蛋白質結構域，包括DNA結合結構域、轉錄活化結構域、細胞定位結構域及傳訊結構域(即當群集或多聚化時可引發細胞生長、增生、分化、細胞凋亡、基因轉錄等之結構域)。
在某些實施態樣中，一種融合蛋白質包含至少一種 DNA結合結構域(例如GAL4或ZFHD1 DNA結合結構域)，另一種融合蛋白質包含至少一種轉錄活化結構域(例如VP16或p65轉錄活化結構域)。融合蛋白質之配體媒介性連接代表形成轉錄因子複合體及導致開始轉錄與由該融合蛋白質之一的DNA結合結構域所辨識(即能夠結合)之DNA序列連接之標靶基因。有關基因表現系統及配體之資訊係揭示於美國第6,187,757 B1、6,649,595 B1、6,509,152 B1、6,479,653 B1及6,117,680 B1號專利。
在其他實施態樣中，本發明提供包含編碼二種融合蛋白之多核苷酸的基因開關系統，該二種融合蛋白在無配體存在時會自行聚集，其中(a)該第一融合蛋白包含條件性聚集結構域，該結構域與經選擇之配體及轉錄活化結構域結合，及(b)該第二融合蛋白包含條件性聚集結構域，該結構域與經選擇之配體及DNA結合結構域結合，及(c)在無配體存在時，該等細胞表現與該DNA結合結構域結合之調節性DNA所可操作性連接之基因。包含該基因開關系統之經改質之細胞在足以抑制該基因之量的配體存在時擴增。配體移除誘發造成細胞死亡之編碼蛋白之表現。編碼該二種融合蛋白之核酸係在至少一個條件性啟動子之控制下。利用條件性聚集結構域之基因表現系統係揭示於美國專利公開號2002/0048792。
C.原核性抑制子/操作子基底基因開關系統
在一實施態樣中，本發明提供基因開關系統，該系統 包含(a)編碼反式活化融合蛋白之第一多核苷酸，該反式活化融合蛋白包含原核性四環素(「tet」)抑制子及真核性轉錄活化子蛋白結構域；及(b)編碼治療性蛋白質或治療性多肽之第二多核苷酸，其中該第二多核苷酸係與最小啟動子及至少一種tet操作子序列可操作性連接。該編碼反式活化子融合蛋白之第一多核苷酸可包含如本發明他處所述之治療性開關啟動子。該致死蛋白質之表現在四環素不存在時係經上調(見例如Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：5547-5551、Gossen et al.(1993)TIBS 18：471-475、Furth et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：9302-9306及Shockett et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：6522-6526)。TetO表現系統係揭示於美國第5,464,758 B1號專利。
在另一實施態樣中，基因開關系統包含來自細菌大腸桿菌之乳糖(「Lac」)抑制子-操作子系統。本發明之基因開關系統亦可包含(a)編碼反式活化融合蛋白之第一多核苷酸，該反式活化融合蛋白包含原核lac I抑制子及真核轉錄活化子蛋白結構域；及(b)編碼治療性蛋白質或治療性多肽之第二多核苷酸，其中該第二多核苷酸係與治療性開關啟動子可操作性連接。在Lac系統中，當無乳糖或合成性類似物諸如異丙基-b-D-硫代半乳糖苷存在時，lac操縱子被不活化。
其他基因開關系統包括該些於下列描述者：美國第7,091,038號專利、WO2004078924、EP1266015、 US20010044151、US20020110861、US20020119521、US20040033600、US20040197861、US20040235097、US20060020146、US20040049437、US20040096942、US20050228016、US20050266457、US20060100416、WO2001/70816、WO2002/29075、WO2002/066612、WO2002/066613、WO2002/066614、WO2002/066615、WO2005/108617、美國第6,258,603號專利、US20050209283、US20050228016、US20060020146、EP0965644、美國第7,304,162號專利、美國第7,304,161號專利、MX234742、KR10-0563143、AU765306、AU2002-248500及AU2002-306550。
D.基因開關系統之組合
本發明提供包含二或多種基因開關系統之核酸組成物、經改質之細胞及生物反應器，該等基因開關系統包含可被有效量之一或多種配體活化之不同的配體依賴性轉錄因子複合物，其中該二或多種基因開關系統包含第一基因開關及第二基因開關，當與一或多種配體結合時，二者皆選擇性誘發一或多種治療性多肽或治療性多核苷酸之表現。本發明之範圍包含任何數量及/或組合之基因開關系統。
在一實施態樣中，本發明提供核酸組成物，其包含：a.第一基因開關系統，其包含：i.第一基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第一雜交多 肽之多核苷酸，該第一雜交多肽包含：1.反式活化結構域，其活化與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.異二聚體伴結構域，ii.第二基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第二雜交多肽之多核苷酸，該第二雜交多肽包含：1. DNA結合結構域，其辨識與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.配體結合結構域；及iii.第三基因表現卡匣，該卡匣包含編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸包含：1.因子調節性啟動子，其經由第二雜交多肽之反式活化結構域活化；及2.編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸，及b.第二基因表現系統，其包含：i.第一基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第一雜交多肽之多核苷酸，該第一雜交多肽包含：1.反式活化結構域，其活化與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.異二聚體伴結構域， ii.第二基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第二雜交多肽之多核苷酸，該第二雜交多肽包含：1. DNA結合結構域，其辨識與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.配體結合結構域；及iii.第三基因表現卡匣，該卡匣包含編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸包含：1.因子調節性啟動子，其經由第二雜交多肽之反式活化結構域活化；及2.編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸。
多重誘導性基因表現系統提供給定治療性多核苷酸或治療性多肽在與不同疾病、疾患或狀況相關之條件下表現，或在與相同疾病、疾患或狀況相關之相同條件下，或在與不同疾病、疾患或狀況相關之不同條件下表現多種治療性多肽或治療性多核苷酸。
在某些實施態樣中，該二或多種基因開關系統之組合可為(1)雙重開關蛻皮激素受體基底基因表現系統，及(2)單一開關蛻皮激素受體基底基因開關。在其他實施態樣中，該組合可為(1)單一或雙重開關蛻皮激素受體基底基因開關及(2)雷帕黴素基底基因開關。另外，基因開關系統之組合可為二個相同之上述揭示之雷帕黴素基底基因開關系統。任何可能之基因開關系統之組合均在本發明之範 圍內。雙重開關蛻皮激素系統之實例可見於例如WO 2002/29075及US 2002/0110861。
配體
此處之用語「配體」當應用於LDTFC-基底基因開關，例如EcD複合物基底基因開關時，描述能活化基因開關以刺激其中編碼之多肽之表現的小型及可溶性分子。本發明之配體依賴性轉錄因子複合物之配體與包含一或多個配體結合結構域、異二聚體伴結構域、DNA結合結構域及反式活化結構域之蛋白質複合物結合。活化配體依賴性轉錄因子複合物之配體的選擇依所利用之基因開關的類型決定。
配體之實例包括但不限於蛻皮類固醇，諸如蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、松甾酮A、米樂甾酮A及該類似物、9-順-視黃酸、視黃酸之合成性類似物、N,N'-二醯基肼諸如該些於美國第6,013,836、5,117,057、5,530,028及5,378,726號及美國公開申請案2005/0209283及2006/0020146號中所揭示者；美國公開申請案2004/0171651所描述之噁二唑啉；二苯甲醯基烷基氰基肼，諸如歐洲申請案461,809所揭示者；N-烷基-N,N'-二芳醯基肼，諸如美國第5,225,443號所揭示者；N-醯基-N-烷基羰基肼，諸如歐洲申請案第234,994號所揭示者；N-芳醯基-N-烷基-N'-芳醯基肼，諸如美國第4,985,461號所描述者；醯胺基酮，諸如美國公開申請案2004/0049037 所描述者；各以參照方式納入此處，其他類似物質包括3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯哈帕甙、氧基固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-環氧基膽固醇、T0901317、5-α-6-α-環氧基膽固醇-3-硫酸鹽(ECHS)、7-酮膽固醇-3-硫酸鹽、法尼醇、膽汁酸、1,1-雙膦酸酯、青春激素III及該類似物。可用於本發明之二醯基肼配體之實例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)及RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)。見例如美國專利申請案系列號12/155,111及PCT申請案PCT/US2008/006757，二案皆以參照方式整體納入此處。
舉例來說，蛻皮激素受體基底基因開關之配體可能選自任何適當之配體。天然發生之蛻皮激素或蛻皮激素類似物(例如20-羥基蛻皮激素、米樂甾酮A、松甾酮A、松甾酮B、松甾酮C、26-碘松甾酮A、牛膝甾酮或26-甲基磺醯牛膝甾酮)及非固醇類誘導物二者均可被用來作為本發明之基因開關之配體。美國第6,379,945 B1號專利描述自綠棉夜蛾(Heliothis virescens)分離之昆蟲類固醇受體(「HEcR」)，該受體能作為對類固醇及某些非固醇類誘導物有反應之基因開關。在本系統及許多其他對類固醇及非固醇類誘導物均有反應之系統中，非固醇類誘導物相較於類 固醇具有明顯之優勢，原因包括例如：較低之製造成本、代謝穩定性、不存在於昆蟲、植物或哺乳動物及環境接受性。美國第6,379,945 B1號專利描述使用二種二苯甲醯基肼即1,2-二苯甲醯基-1-三級丁基-肼及得芬諾(tebufenozide)(N-(4-乙基苯甲醯基)-N'-(3,5-二甲基苯甲醯基)-N'-三級丁基-肼)作為蛻皮激素基底基因開關之配體。本發明之配體亦包括其他二苯甲醯基肼，諸如該些於美國第5,117,057 B1號專利所揭示者。使用得芬諾(tebufenozide)作為黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)之蛻皮激素受體之化學配體亦揭示於美國第6,147,282號專利。此外，蛻皮激素配體之非限制性實例係3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯基哈帕甙、1,2-二醯基肼、N'-取代-N,N'-二取代肼、二苯甲醯基烷基氰基肼、N-取代-N-烷基-N,N-二芳醯基肼、N-取代-N-醯基-N-烷基羰基肼或N-芳醯基-N'-烷基-N'-芳醯基肼(見美國第6,723,531號專利)。
在一實施態樣中，蛻皮激素基底基因開關系統之配體係二醯基肼配體或手性二醯基肼配體。用於基因開關系統之配體可為式I之化合物
Figure 106128457-A0101-12-0105-16
其中A係烷氧基、芳基烷基氧基或芳基氧基； B係可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；且R1及R2各為可經任意取代之烷基、芳基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、可經任意取代之環烷基、可經任意取代之烯基、可經任意取代之炔基、可經任意取代之雜環基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
在另一實施態樣中，該配體可為鏡像異構性富集之式II化合物
Figure 106128457-A0101-12-0106-17
其中A係烷氧基、芳基烷基氧基、芳基氧基、芳基烷基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；B係可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；且R1及R2各為可經任意取代之烷基、芳基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、可經任意取代之環烷基、可經任意取代之烯基、可經任意取代之炔基、可經任意取代之雜環基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；前提為R1不等於R2；其中攜帶R1及R2之不對稱碳原子的絕對構型主要為 S型；或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
在某些實施態樣中，該配體可為鏡像異構性富集之式III化合物
Figure 106128457-A0101-12-0107-18
其中A係烷氧基、芳基烷基氧基、芳基氧基、芳基烷基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；B係可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；且R1及R2各為可經任意取代之烷基、芳基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、可經任意取代之環烷基、可經任意取代之烯基、可經任意取代之炔基、可經任意取代之雜環基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；前提為R1不等於R2；其中攜帶R1及R2之不對稱碳原子的絕對構型主要為R型；或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
在一實施態樣中，配體可為鏡像過量值至少95%之(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基- 3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼，或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
式I之二醯基肼配體及式II或III之手性二醯基肼配體用於蛻皮激素基底基因開關系統時，提供自外部時態調控本發明之治療性多肽或治療性多核苷酸之表現的方式。見2008年5月29日提出之美國專利申請案12/155,111，其以參照方式完全納入此處。
本發明使用之配體可形成鹽。此處所使用之用語「鹽」表示與無機及/或有機酸及鹼形成之酸性及/或鹼性鹽。此外，當式I、II或III之化合物同時包含鹼性基團及酸性基團時可能形成兩性離子(「內鹽」)，其仍被包含於此處所使用之用語「鹽」。醫藥上可接受(即無毒性、生理上可接受)之鹽被用於例如在製備時會採用之分離或純化步驟，不過其他鹽亦可被使用。式I、II或III之化合物的鹽可藉由例如使化合物與一定量諸如等量之酸或鹼反應形成，該反應在鹽可在其中沉澱之介質或於水性介質中進行，然後冷凍乾燥。
包含鹼性基團之配體可與各種有機及無機酸形成鹽。示範性酸添加鹽包括醋酸鹽(諸如該些與醋酸或三鹵乙酸例如三氟乙酸形成者)、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、 己酸鹽、鹽酸鹽(與鹽酸形成)、氫溴酸鹽(與溴化氫形成)、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽(與順丁烯二酸形成)、甲烷磺酸鹽(與甲磺酸形成)、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果凍酸鹽、過氧硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽(諸如該些與硫酸形成者)、磺酸鹽(諸如該些此處提及者)、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽諸如甲苯磺酸鹽(tosylate)、十一酸鹽及該類似物。
包含酸性基團之配體可與各種有機及無機鹼形成鹽。示範性鹼性鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽諸如鈉鹽、鋰鹽及鉀鹽、鹼土金屬鹽諸如鈣鹽及鎂鹽、含有機鹼(例如有機胺)之鹽諸如苄星(benzathine)、二環己基胺、海巴明(與N,N-雙(去氫樅酸基)乙二胺形成)、N-甲基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-葡糖醯胺、三級丁基胺及含胺基酸諸如精胺酸、離胺酸及該類似物之鹽。
利用FK506結合結構域之誘導性基因表現系統的配體之非限制性實例為FK506、環孢素A或雷帕黴素。FK506、雷帕黴素及彼等之類似物係揭示於美國第6,649,595 B2及6,187,757號專利。亦見美國第7,276,498及7,273,874號專利。
此處所描述之配體可經單獨投予或成為包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物之一部分投予。在一實施態樣中，該醫藥組成物係呈溶液、懸浮液、錠劑、膠囊、軟 膏、酏劑或注射型組成物之形式。
在一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於表現編碼蛋白質之多核苷酸，該蛋白質包含但不限於細胞介素、免疫調節劑、凝血因子、抗體或抗體片段、腫瘤壞死因子受體(TNFR)諸如依那西普(Etanercept)、紅血球生成素、α-1抗胰蛋白酶、干擾素(IFN)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素-β-1a、干擾素-β-1b、第七因子、第八因子、第九因子、抗凝血酶III、B型肝炎病毒蛋白、荷爾蒙例如生長激素(GH)、人生長激素(hGH)、副甲狀腺素(PH)、促甲狀腺激素(TSH)、GCSF或彼之片段、GM-CSF或彼之片段。
在一實施態樣中，編碼抗體之多核苷酸編碼單株抗體。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於表現核酸以作為疫苗。本發明亦提供包含本發明之載體或表現系統之疫苗組成物。在另一實施態樣中，該疫苗組成物包含佐劑。
就基因開關而言，用語「蛻皮激素受體基底」係指包含至少一功能性部分之天然發生或合成性蛻皮激素受體配體結合結構域之基因開關，當配體與蛻皮激素受體配體結合結構域結合時該基因開關調節基因表現。蛻皮激素反應性系統之實例係描述於美國第7,091,038及6,258,603號專利。在一實施態樣中，該系統為RheoSwitch®治療性系統(RTS)，該系統包含二種融合蛋白，即與Gal4 DNA結合 結構域融合之經突變之蛻皮激素受體(EcR)之DEF結構域和與VP16轉錄活化結構域融合之嵌合性RXR之EF結構域，如圖1所示在組成性啟動子之控制下表現。
用語「調控」係指誘發、減少或抑制核酸或基因表現，分別導致誘發、減少或抑制蛋白質或多肽之產製。
本發明之多核苷酸或載體可另包含至少一種適合用於驅使基因於宿主細胞內表現之啟動子。
可用於本發明之實施態樣中之增強子包括但不限於：SV40增強子、巨細胞病毒(CMV)增強子、延長因子1(EF1)增強子、酵母菌增強子、病毒基因增強子及該類似物。
終止控制區(即終止子或聚腺苷酸化序列)亦可衍生自各種對優先宿主為天然之基因。可任意選擇地，終止位點不是必要但是最好包含。在本發明之一實施態樣中，該終止控制區可包含或衍生自合成性序列、合成性聚腺苷酸化信號、SV40晚期聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、病毒終止序列或該類似物。
用語「3'非編碼序列」或「3'非轉譯區(UTR)」係指位於編碼序列下游(3')之DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]辨認序列及其他編碼調節信號以影響mRNA處理或基因表現之序列。聚腺苷酸化信號之特徵通常為影響聚腺苷酸序列添加至mRNA前體之3'端。
「調節區」係指調節第二核酸序列表現之核酸序列。調 節區可包括本來就負責表現特定核酸(同源區)之序列，或包括不同來源但負責表現不同蛋白質或甚至合成性蛋白質(異源區)之序列。特別是，該等序列可為原核性、真核性或病毒性基因之序列或衍生序列，其以特定或非特定方式及誘導性或非誘導性方式刺激或抑制基因之轉錄。調節區包括複製起點、RNA剪切位點、啟動子、增強子、轉錄終止序列及引導該多肽進入標靶細胞之分泌途徑之信號序列。
「異源性來源」之調節區係指不是與經表現之核酸天然相連之調節區。異源性調節區包含來自不同物種之調節區、來自不同基因之調節區、雜交調節序列及不發生於天然中但由該領域之一般技藝人士所設計之調節序列。
「RNA轉錄物」係指由RNA聚合酶酶催化轉錄DNA序列所產生之產物。當RNA轉錄物係DNA序列之完美互補套時，較佳者為初級轉錄物或其可能為源自轉錄後處理該初級轉錄物之RNA序列，被稱為成熟RNA。「信使RNA(mRNA)」係指沒有內含子且可被細胞轉譯成蛋白質之RNA。「cDNA」係指與mRNA互補且源自該mRNA之雙股DNA。「同義RNA」係指包括mRNA因此可被細胞轉譯成蛋白質之RNA轉錄物。「反義RNA」係指與所有或部分之標靶原發轉錄物或mRNA互補且阻斷標靶基因之表現之RNA轉錄物。反義RNA可能與特定基因轉錄物之任何部分互補，例如5'非編碼序列、3'非編碼序列或編碼序列。「功能性RNA」係指反義RNA、核糖酵素RNA或其他不被 轉譯但對細胞程序有所影響之RNA。
「多肽」、「肽」及「蛋白質」可交換使用，係指由共價連接之胺基酸殘基組成之聚合性化合物。
「經分離之多肽」、「經分離之肽」或「經分離之蛋白質」係指實質上不含該些在彼之天然狀態下與之正常相關之化合物(例如其他蛋白質或多肽、核酸、碳水化合物、脂質)之多肽或蛋白質。「經分離」不代表排除與其他化合物之人工或合成性混合物，或不影響生物活性之雜質存在，這可能是因為例如純化不完全、添加穩定劑或化合成為醫藥上可接受之製劑。
「取代突變多肽」或「取代突變」將被了解為表示包含至少一個野生型或天然發生之胺基酸取代的突變多肽，該胺基酸與野生型或天然發生之多肽的胺基酸不同。取代突變多肽可僅包含一個野生型或天然發生之胺基酸取代，被稱為「點突變」或「單點突變」多肽。或者，取代突變多肽可包含以二或多個與野生型或天然發生多肽不同之胺基酸取代二或多個野生型或天然發生之胺基酸。根據本發明，包含取代突變之H組合受體配體結合結構域多肽包含以相較於野生型或天然發生之H組核受體配體結合結構域多肽不同之胺基酸取代至少一個野生型或天然發生之胺基酸。
當取代突變多肽包含二或多個野生型或天然發生之胺基酸的取代，該取代可包含相等數量之野生型或天然發生之胺基酸刪除以供取代，即2個野生型或天然發生之胺基酸被2個非野生型或非天然發生之胺基酸取代，或該取代 可包含不等數量之野生型胺基酸刪除以供取代，即2個野生型胺基酸被1個非野生型胺基酸取代(取代+刪除突變)或2個野生型胺基酸被3個非野生型胺基酸取代(取代+插入突變)。
取代突變可利用縮寫命名系統描述，以表示在參照多肽序列中被取代之胺基酸殘基及號碼及經取代之新的胺基酸殘基。舉例來說，多肽之第20個胺基酸殘基被取代之取代突變可被縮寫為「x20z」，其中「x」係將被取代之胺基酸，「20」係該胺基酸殘基在該多肽中之位置或號碼，及「z」係經取代之新的胺基酸。因此，可互換縮寫為「E20A」或「Glu20Ala」之取代突變表示該突變包含以丙胺酸殘基(通常縮寫為「A」或「Ala」)取代在多肽位置20之麩胺酸(通常縮寫為「E」或「Glu」)。
取代突變可利用該領域已知之任何突變形成技術進行，包括但不限於試管內定點突變形成(Hutchinson et al.,J.BioI.Chem.253：6551(1978)；Zoller et al.,DNA 3：479(1984)；Oliphant et al.,Gene 44：177(1986)；Hutchinson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：710(1986))、使用TAB®連接子(法瑪西亞(Pharmacia)公司)、限制內核酸酶消化/片段刪除及取代、PCR媒介性/寡核苷酸引導性突變形成及該類似技術。以PCR為基底之技術較適合定點突變形成(見Higuchi,1989,"Using PCR to Engineer DNA",in PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.Erlich,ed., Stockton Press，第6章61至70頁)。
應用於多肽之用語「片段」係指胺基酸序列相較於參照多肽之胺基酸序列為短之多肽，且該多肽相較於這些參照多肽之所有部分包含完全相同之胺基酸序列。當適當時，該等片段可能被包括於更大多肽之內以形成更大多肽之一部分。本發明之多肽之該等片段的長度可能為至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240或300或更多個胺基酸。
多肽或蛋白質之「變異體」係指源自多肽或蛋白質且保留該多肽或蛋白質之至少一個生物性質之任何類似物、片段、衍生物或突變。不同的多肽或蛋白質變異體可能存在於天然中。這些變異體可能是特徵為編碼蛋白質之結構基因的核苷酸序列不同之等位變異體，或可能涉及差異剪切或轉譯後修飾。技藝人士可產製具有單一或多重胺基酸取代、刪除、添加或替換之變異體。這些變異體可包括特別是：(a)其中一或多個胺基酸殘基被保守性或非保守性胺基酸取代之變異體，(b)其中一或多個胺基酸被加入該多肽或蛋白質之變異體，(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變異體，及(d)其中該多肽或蛋白質與另一多肽諸如血清白蛋白融合之變異體。獲得這些變異體之技術包括基因性(抑制、刪除、突變等)、化學性及酶技術係該領域之一般技藝人士所知。在一實施態樣中，變異體多肽包含至少約14個胺基酸。
用語「同源性」係指二個多核苷酸或二個多肽基團之間一致性之百分比。來自一基團之序列與另一序列之間的對應性可由該領域已知之技術測定。舉例來說，同源性可藉由直接比較二個多肽分子間之序列資訊加以決定，例如排比該序列資訊並利用易於使用之電腦程式進行。或者，可藉由在同源區之間形成穩定雙股之條件下使多核苷酸雜交，然後經單股特異性核酸酶消化後測定該經消化之片段的大小加以決定同源性。
此處所使用之所有文法形式及拼寫差異之用語「同源」係指具有「共同演化來源」之蛋白質之間的關係，包括來自超家族(例如免疫球蛋白超家族)之蛋白質及來自不同物種之同源蛋白(例如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck et al.,Cell 50：667(1987))。該等蛋白質(及彼等之編碼基因)具有序列同源性，因為彼等具有高度序列相似性。然而，在一般用法及本申請案中，當以諸如「高度地」之副詞修飾用語「同源」時，用語「同源」可指序列相似性而非共同演化來源。
因此，所有文法形式之用語「序列相似性」係指可能分享或不分享共同演化來源之蛋白質的核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度(見Reeck et al.,Cell 50：667(1987))。在一實施態樣中，當二個DNA序列之定義長度中至少約50%(例如至少約75%、90%或95%)的核苷酸匹配，該等DNA序列係「實質上同源」或「實質上類似」。實質上同源之序列可利用序列資料庫中可用之標準軟體比較序列加以識別，或在例如特定系統所定義之嚴謹度 條件下進行南方雜交實驗加以識別。定義適當之雜交條件係屬該領域之技藝(見例如Sambrook et al.,1989，同上)。
此處所使用之「實質上類似」係指其中一或多個核苷酸鹼基之改變導致取代一或多個胺基酸，但不影響由該DNA序列所編碼之蛋白質的功能特性之核酸片段。「實質上類似」亦指其中一或多個核苷酸鹼基之改變不影響該核酸片段藉由反義或共同抑制技術以媒介基因表現改變之能力的核酸片段。「實質上類似」亦指本發明之核酸片段之修飾，諸如刪除或插入一或多個不實質影響該形成之轉錄物之功能特性的核苷酸鹼基。因此應了解本發明不只包含該特定示範性序列。每種提議之修飾及測定該編碼產物是否保留生物活性皆在該領域之例行技藝範圍內。
另外，技藝人士知道本發明所包含之實質上類似之序列亦可由彼等在嚴謹度條件下(0.1倍SSC、0.1% SDS、65℃及以2倍SSC、0.1% SDS清洗然後以0.1倍SSC、0.1% SDS清洗)與此處示例之序列雜交之能力加以定義。本發明之實質上類似之核酸片段係該些DNA序列與此處所報告之核酸片段的DNA序列有至少約70%、80%、90%或95%一致性的核酸片段。
當二個胺基酸序列有超過約40%之胺基酸相同，或超過60%之胺基酸類似(功能一致)，該二個胺基酸序列係「實質上同源」或「實質上類似」。較佳地，該類似或同源之序列係藉由使用例如GCG(基因學電腦集團(Genetics Computer Group)公司，GCG套組程式手冊第7版，威斯 康辛州麥德遜市)排列(pileup)程式加以排比鑑識。
此處所使用之用語「對應」係指類似或同源性序列，不論確切位置是否與測量類似性或同源性之分子相同或不同。核酸或胺基酸序列排比可能包括間隔子。因此，用語「對應」係指序列類似性，而非胺基酸殘基或核苷酸鹼基之編號。
「顯著部分」之胺基酸或核苷酸序列包含足夠之多肽之胺基酸序列或基因之核苷酸序列，得以由該領域之技藝人士手動評估該序列，或藉由使用演算法諸如BLAST(基礎局部排比搜尋工具；Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403(1993)，得自ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行電腦自動化序列比較及識別以推定辨識該多肽或基因。一般來說，需要10個或超過10個連續胺基酸或30個或超過30個核苷酸之序列以推定辨識一多肽或核酸序列與已知蛋白質或基因之同源性。另外就核苷酸序列而言，包含20至30個連續核苷酸之基因特異性寡核苷酸探針可被用於基因辨識(例如南方雜交)及分離(例如細菌菌落或噬菌體噬斑之原位雜交)之序列依賴性方法。此外，含12至15個鹼基之短寡核苷酸可被用來作為PCR中之擴增引子，以獲得包含該引子之特定核酸片段。因此，「顯著部分」之核苷酸序列包含足夠序列以特異性辨識及/或分離包含該序列之核酸片段。
該領域已知之用語「一致性百分比」係指二或多個多肽序列或二或多個多核苷酸序列之間之關係，其係藉由比較 序列決定。在該領域中，「一致性」亦指多肽或多核苷酸序列之間序列相關性之程度，視情況亦可由該等序列之間的匹配狀況決定。「一致性」及「相似性」可輕易地由已知之方法計算，包括但不限於下列描述者：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,New York(1991)。測定一致性之較佳方法係經設計以給予測試序列間之最佳匹配。測定一致性及相似性之方法被編篡於公眾可用之電腦程式中。序列排比及一致性百分比計算可利用序列分析軟體進行，諸如雷斯基(Lasergene)生物資訊電腦套組之邁佳來(Megalign)程式(DNASTAR公司，威斯康辛州麥迪遜市)。序列之多重排比可利用Clustal排比方法及預設參數(缺口罰分=10，缺口長度罰分=10)進行(Higgins et al.,CABIOS.5：151(1989))。使用Clustal方法進行兩兩排比之預設參數可選自：KTUPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5及DIAGONALS SAVED=5。
用語「序列分析軟體」係指任何可用於分析核苷酸或胺 基酸序列之電腦演算法或軟體程式。「序列分析軟體」可自商業途徑獲得或自行發展。典型的序列分析軟體包括但不限於GCG程式套組(威斯康辛套組9.0版，基因學電腦集團(Genetics Computer Group)公司(GCG)，威斯康辛州麥迪遜市)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403(1990))及DNASTAR(DNASTAR公司，美國53715威斯康辛州麥迪遜市公園南街1228號)。在本案之上下文中，應了解當使用序列分析軟體進行分析時，該分析之結果將基於該參照程式之「預設數值」，除非另外說明。此處所使用之「預設數值」將代表在首次啟用該軟體時原本內建之任何數值或參數組。
就DNA之序列而言，「化學合成」指該等成份核苷酸係於試管內組成。DNA之手動化學合成可利用發展成熟之方法完成，或利用多種商用機器之一進行自動化化學合成。因此，基因可根據最佳化之核苷酸序列修剪以達最佳基因表現，以反應宿主細胞之密碼子偏性。技藝人士了解若密碼子之使用偏向宿主喜好之密碼子，將可能成功地表現基因。較佳密碼子之決定可根據可取得序列資訊之宿主細胞來源之基因調查。
此處所使用之二或多種各自可操作之基因調節系統被稱為「正交」，當a)各給定系統由彼之選擇濃度之個別配體之調控導致該系統之基因表現幅度可測量的改變，及b)該改變係統計上顯著地異於所有其他於細胞、組織或有機體中同時可操作性系統之表現的改變，不論該實際調控為同 時或依序發生。較佳地，每種各自可操作性基因調節系統之調控導致基因表現之改變相較於細胞、組織或有機體中之所有其他可操作性系統高出至少2倍，例如至少高出5倍、10倍、100倍或500倍。理想地，藉由彼之選擇濃度之個別配體調控各給定系統導致該系統之基因表現幅度可測量的改變，且該細胞、組織或有機體中之所有其他可操作性系統之表現無可測量的改變。在這種情況下，該多重誘導性基因調節系統被稱為「完全正交」。有用之正交配體及正交受體基底基因表現系統係描述於US 2002/0110861 A1。
用語「外源性基因」係指對個體為外來之基因，即經由轉形過程被導入個體體內之基因、非突變版本之內源性突變基因或突變版本之內源性非突變基因。轉形方法並不是本發明之關鍵，可為該領域人士已知之適合該個體之任何方法。外源性基因可為以DNA或RNA形式導入個體體內之天然或合成性基因，該RNA形式可經由諸如藉由反轉錄酶產生之DNA中間物作用。該等基因可被導入標靶細胞內、直接導入個體體內或藉由轉移經轉形之細胞至個體體內以間接導入。
用語「治療性產物」係指治療性多肽或治療性多核苷酸，該等產物授予有益功能至表現該等產物之宿主細胞。治療性多肽可包含但不限於長度僅三個胺基酸之肽、單鏈或多鏈蛋白質及融合蛋白質。治療性多核苷酸可包括但不限於反義寡核苷酸、小型干擾RNA、核糖酵素及RNA外 部引導序列。該治療性產物可包含天然發生之序列、合成性序列或天然及合成性序列之組合。
用語「配體依賴性轉錄因子複合物」或「LDTFC」係指包含一或多個蛋白質次單位之轉錄因子，該複合物可調節由此處所定義之「因子調節性啟動子」驅使之基因表現。LDTFC模型「蛻皮激素受體複合物」通常係指具有至少二個核受體家族成員之異二聚體蛋白質複合物，即蛻皮激素受體(「EcR」)及超氣門蛋白(「USP」)(見Yao et al.,Nature 366：476(1993))；Yao et al.,Cell 71：63(1992))。功能性LDTFC諸如EcR複合物亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38、βFTZ-1或其他昆蟲同源物)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR及/或USP之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。LDTFC諸如EcR複合物亦可為EcR蛋白與超氣門蛋白之脊椎動物同源物、視黃酸-X-受體(「RXR」)蛋白或USP及RXR之嵌合物之異二聚體。用語「LDTFC」及「EcR複合物」亦包含EcR蛋白或USP之同型二聚體複合物，以及具有相同功能之單一多肽或三聚體、四聚體及其他多聚體。
LDTFC諸如EcR複合物可被活性蛻皮類固醇或與該複合物中之一種蛋白質結合的非固醇類配體活化，該種蛋白質包含EcR但不排除該複合物之其他蛋白質。LDTFC諸如EcR複合物包括屬於核受體超家族之成員的蛋白質，其中所有成員之特徵為存在一或多種多肽次單位，包含胺基端反式活化結構域(在此處可交換使用之「AD」、「TD」或 「TA」)、DNA結合結構域(「DBD」)及配體結合結構域(「LBD」)。該AD可為與「異二聚體伴」或「HP」融合之形式存在。包含本發明之AD及HP之融合蛋白在此處被稱為「輔活化蛋白」或「CAP」。DBD及LBD可以融合蛋白之形式表現，在此處被稱為「配體誘導性轉錄因子(「LTF」)。該等融合伴可被連接子例如鉸鏈區分開。LTF家族之有些成員亦在LBD之羧基端側具有另一反式活化結構域。該DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予蛻皮激素反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經修飾之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。
組成外源性基因、反應元件及LDTFC例如EcR複合物之DNA序列可能被納入古細菌(archaebacteria)、原核細胞諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或其他腸內細菌，或真核細胞諸如植物或動物細胞。然而，由於許多由基因表現之蛋白質在細菌中被不正確地處理，因此真核細胞係為較佳。該等細胞可能呈單細胞或多細胞有機體之形式。外源性基因、反應元件及受體複合物之核苷酸序列亦可以RNA分子被納入，較佳地呈功能性病毒性RNA之形式，諸如菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)。以真核細胞來說，脊椎動物細胞係較佳，因為它們天然地缺乏授予反應至本發明之EcR的配體之分子。因此，它們對本發明之配體為「實質上不敏感」。因此，可用於本發明之配體對經轉形之細胞或整個有機體之 生理或其他效應將可被忽略。因此，細胞可生長且表現該所欲之產物，實質上不受配體本身之存在的影響。
用語「蛻皮激素受體複合物」通常係指具有至少二個核受體家族成員之異二聚體蛋白質複合物，即蛻皮激素受體(「EcR」)及超氣門蛋白(「USP」)(見Yao et al.,Nature 366：476(1993))；Yao et al.,Cell 71：63(1992))。功能性EcR複合物亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38、βFTZ-1或其他昆蟲同源物)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR及/或USP之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。該EcR複合物亦可為EcR蛋白與超氣門蛋白之脊椎動物同源物、視黃酸-X-受體(「RXR」)蛋白或USP及RXR之嵌合物之異二聚體。用語EcR複合物亦包含EcR蛋白或USP之同型二聚體複合物。
EcR複合物可被活性蛻皮類固醇或與該複合物中之一種蛋白質結合的非固醇類配體活化，該種蛋白質包含EcR但不排除該複合物之其他蛋白質。此處之用語「配體」當應用於EcR-基底基因開關時，描述能活化基因開關以刺激其中編碼之多肽之表現的小型及可溶性分子。配體之實例包括但不限於蛻皮類固醇，諸如蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、松甾酮A、米樂甾酮A及該類似物、9-順-視黃酸、視黃酸之合成性類似物、N,N'-二醯基肼諸如該些於美國第6,013,836、5,117,057、5,530,028及5,378,726號及美國公開申請案2005/0209283及2006/0020146號中所 揭示者；美國公開申請案2004/0171651所描述之噁二唑啉；二苯甲醯基烷基氰基肼，諸如歐洲申請案461,809所揭示者；N-烷基-N,N'-二芳醯基肼，諸如美國第5,225,443號所揭示者；N-醯基-N-烷基羰基肼，諸如歐洲申請案第234,994號所揭示者；N-芳醯基-N-烷基-N'-芳醯基肼，諸如美國第4,985,461號所描述者；醯胺基酮，諸如美國公開申請案2004/0049037所描述者；及其他類似物質包括3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯哈帕甙、氧基固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-環氧基膽固醇、T0901317、5-α-6-α-環氧基膽固醇-3-硫酸鹽(ECHS)、7-酮膽固醇-3-硫酸鹽、法尼醇、膽汁酸、1,1-雙膦酸酯、青春激素III及該類似物。可用於本發明之二醯基肼配體之實例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)及RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)。其他可用於實施本發明之二醯基肼見美國專利申請案12/155,111(2008年5月29日提出)及PCT/US2008/006757(2008年5月29日提出)。
EcR複合物包括屬於核受體超家族之成員的蛋白質，其中所有成員之特徵為具備胺基端反式活化結構域(「TA」)、DNA結合結構域(DBD)及被鉸鏈區分開之配體結合結 構域(LBD)。有些家族成員亦在LBD之羧基端側具有另一反式活化結構域。該DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予蛻皮激素反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經修飾之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。
組成外源性基因、反應元件及EcR複合物之DNA序列可能被納入古細菌(archaebacteria)、原核細胞諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或其他腸內細菌，或真核細胞諸如植物或動物細胞。然而，由於許多由基因表現之蛋白質在細菌中被不正確地處理，因此真核細胞係為較佳。該等細胞可能呈單細胞或多細胞有機體之形式。外源性基因、反應元件及受體複合物之核苷酸序列亦可以RNA分子被納入，較佳地呈功能性病毒性RNA之形式，諸如菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)。以真核細胞來說，脊椎動物細胞係較佳，因為它們天然地缺乏授予反應至本發明之EcR的配體之分子。因此，它們對本發明之配體為「實質上不敏感」。因此，可用於本發明之配體對經轉形之細胞或整個有機體之生理或其他效應將可被忽略。因此，細胞可生長且表現該所欲之產物，實質上不受配體本身之存在的影響。
當EcR配體與EcR複合物一起使用且轉而與連接外源性基因(例如IL-12)之反應元件結合時，該EcR配體提供外部時態調節該外源性基因之表現。各種成份彼此之間 的結合順序，即配體與受體複合物及受體複合物與反應元件之結合順序並不重要。通常，外源性基因之表現調控係因應EcR複合物與特定控制或調節性DNA元件之結合。該EcR蛋白質如同核受體家族之其他成員具有至少三個結構域，即反式活化結構域、DNA結合結構域及配體結合結構域。此受體如同核受體家族之亞群，亦具備定義較不明確之造成異二聚化性質之區域。在EcR蛋白質之配體結合結構域與USP或RXR蛋白質異二聚化之後，配體與該配體結合結構域之結合，使該呈活化形式之異二聚化蛋白質之DNA結合結構域得以與反應元件結合，因此導致外源性基因之表現或抑制。此機轉不排除配體與EcR或USP結合且導致形成活性同型二聚體複合物(例如EcR+EcR或USP+USP)之可能性。在一實施態樣中，該一或多種受體結構域可為不同以產生嵌合性基因開關。通常，該三種結構域中之一或多種可自不同於其他結構域來源之來源選擇，以使該嵌合性受體在經選擇之宿主細胞或有機體內之反式活化活性、與配體之互補結合及對特定反應元件之辨識係經最佳化。此外，該反應元件本身可經其他DNA結合蛋白質結構域之反應元件改質或取代，諸如來自酵母菌之GAL-4蛋白質(見Sadowski et al.,Nature 335：563(1988))或來自大腸桿菌之LexA蛋白質(見Brent et al.,Cell 43：729(1985))以適應嵌合性EcR複合物。嵌合性系統之另一好處在於它們能夠根據所欲之終結果選擇用於驅使外源性基因之啟動子。該等雙重控制在基因治療之領 域中特別重要，尤其是當細胞毒性蛋白質被產生時，因為表現時機及表現發生之細胞皆可被控制。當與適當之啟動子可操作性連接之外源性基因被導入個體之細胞內時，該等外源性基因之表現係受到本發明之配體的存在所控制。啟動子可能經組成性或誘導性調節，或可能具組織特異性(即僅在特定細胞類型中表現)或對有機體之某些發展階段具特異性。
在某些實施態樣中，本方法所描述之治療性開關啟動子係組成性。在某些實施態樣中，該治療性開關啟動子係在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化，例如該啟動子會被疾病、被特定生理性、發展性、分化性或病理性條件、及/或被一或多種特定生物性分子所活化；及/或該啟動子在特定組織或細胞類型中被活化。在某些實施態樣中，該疾病、疾患或狀況對治療性多肽或多核苷酸有反應。舉例來說在某些非限制性實施態樣中，該治療性多核苷酸或多肽可用於治療、預防、改善、減少症狀、預防疾病進展或治癒該疾病、疾患或狀況，但不一定需要完成任何或所有之上述功效。在某些實施態樣中，該第一及第二多核苷酸被導入以允許該配體依賴性轉錄因子複合物在與疾病、疾患或狀況有關之條件下之表現。在一實施態樣中，該治療性方法被進行以使該治療性多肽或治療性多核苷酸以足以治療、改善或預防該疾病、疾患或狀況之量被表現及散播於個體體內。此處所使用之「散播」表示該多肽係自經改質之細胞足夠地表現及釋放以在個體體內具有效 應或活性。散播可為系統性、局部性或介於系統性或局部性之任何散播。舉例來說，該治療性多肽或治療性多核苷酸可經血流或淋巴系統系統性散播。或者，該治療性多肽或治療性多核苷酸可在欲治療之組織或器官中局部性散播。
編碼各種多肽諸如轉錄因子及報告蛋白之許多基因組及cDNA核酸序列係該領域所廣為周知。該領域之技藝人士可取得幾乎所有已知基因之核酸序列資訊，且可直接自公眾存庫、發表該序列之機構獲得該核酸分子，或可實施例行方法以製備該分子。見例如以下所述之序列登記號之說明。
基因開關可能為藉由添加或移除特定配體以調節基因表現之任何基因開關系統。在一實施態樣中，該基因開關係一種其中基因表現之量取決於配體之存在量的基因開關。可用於本發明之基因開關之配體依賴性轉錄因子之實例包括但不限於由彼等之個別配體(例如糖皮質素、雌激素、黃體激素、類視色素、蛻皮激素及彼等之類似物或擬似物)所活化之核受體超家族之成員及由四環素活化之rTTA。在本發明之一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。該等系統之實例包括但不限於美國第6,258,603號專利、美國第7,045,315號專利、美國公開專利申請案第2006/0014711、2007/0161086號及國際公開申請案第WO 01/70816號中所述之系統。嵌合性蛻皮激素受體系統之實例係描述於美國第7,091,038號專利、美國公開專利 申請案第2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457及2006/0100416號及國際公開申請案第WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075及WO 2005/108617號。非固醇性蛻皮激素促效劑調節系統之實例係RheoSwitch®哺乳動物誘導性表現系統(麻州伊普斯維奇(Ipswich,MA)新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司)。
在一實施態樣中，編碼該基因開關之多核苷酸包含在啟動子之控制下編碼配體依賴性轉錄因子之單一轉錄因子序列。該轉錄因子序列可能編碼天然發生或人工轉錄因子之配體依賴性轉錄因子。人工轉錄因子係其中該轉錄因子之天然序列已被改變之轉錄因子，例如藉由序列突變或藉由組合來自不同轉錄因子之結構域。在一實施態樣中，該轉錄因子包含H組核受體配體結合結構域(LBD)。在一實施態樣中，H組核受體LBC係來自EcR、遍在受體、孤兒受體1、NER-1、類固醇激素核受體1、類視色素X受體交互作用蛋白-15、肝X受體β、類固醇激素受體樣蛋白、肝X受體、肝X受體α、類法尼醇X受體、受體交互作用蛋白14或法尼醇受體。在另一實施態樣中，H組核受體LBD係源自蛻皮激素受體。
EcR及其他H組核受體係核受體超家族之成員，其中所有成員之一般特徵為具備胺基端反式活化結構域(TD)、DNA結合結構域(DBD)及與DBD藉由鉸鏈區分開之 LBD。此處所使用之用語「DNA結合結構域」包含自最小多肽序列之DNA結合蛋白至全長DNA結合蛋白，只要該DNA結合結構域之功能為與特定反應元件相連。核受體超家族成員之特徵亦包括具備四或五個結構域：A/B、C、D、E，有些成員具備F結構域(見美國第4,981,784號專利及Evans,Science 240：889(1988))。該「A/B」結構域對應反式活化結構域，「C」對應DNA結合結構域，「D」對應鉸鏈區，及「E」對應配體結合結構域。有些家族成員亦在對應「F」之LBD的羧基端側具有另一反式活化結構域。
DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經修飾之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。EcR如同核受體家族之亞群，亦具備定義較不明確之造成異二聚化性質之區域。由於核受體之結構域在天然中係經模塊化，因此LBD、DBD及TD可能可互相交換。
在另一實施態樣中，該轉錄因子包含TD、DBD及H組核受體LBD，該DBD辨識與外源性基因相連之反應元件以調控該外源性基因之表現。在某些實施態樣中，該H組核受體LBD包含取代突變。
在另一實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為 配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物，即「雙重開關」或「雙雜交物」基底基因開關。該第一及第二啟動子可為相同或不同。
在某些實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物，即「單一基因開關」。該第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列可由內部核糖體進入位點(IRES)連接。該IRES可能是EMCV IRES。
在一實施態樣中，該第一轉錄因子序列編碼包含TD、DBD及H組核受體LBD之多肽，該DBD辨識與外源性基因相連之反應元件以調節該外源性基因之表現，該第二轉錄因子序列編碼包含核受體LBD之轉錄因子，該LBD選自脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD、超氣門蛋白LBD或包含二個多肽片段之嵌合性LBD，其中該第一多肽片段係來自脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD或超氣門蛋白LBD，且該第二多肽片段係來自不同的脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD或超氣門蛋白LBD。
在另一實施態樣中，基因開關包含編碼第一多肽之第一轉錄因子序列及編碼第二多肽之第二轉錄因子序列，該第一多肽包含核受體LBD及DBD，該DBD辨識與外源性基因相連之反應元件以調節該外源性基因之表現，該第二 多肽包含TD及核受體LBD，其中核受體LBD之一係H組核受體LBD。在一實施態樣中，該第一多肽係實質上不含TD，該第二多肽係實質上不含DBD。就本發明之目的而言，「實質上不含」係指有問題之蛋白質不包含有問題之結構域的足夠序列來提供活化或結合活性。
在本發明之另一態樣中，該第一轉錄因子序列編碼包含異二聚體伴及TD之蛋白質，該第二轉錄因子序列編碼包含DBD及LBD之蛋白質。
當只有一個核受體LBD係H組LBD時，另一核受體LBD可能來自任何其他核受體以與H組LBD形成二聚體。舉例來說，當H組核受體LBD係EcR LBD時，其他核受體LBD「伴」可能來自EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白(USP)或包含至少二種不同之選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR或USP之核受體LBD多肽片段之嵌合性核受體(見WO 01/70816 A2、國際專利申請案PCT/US02/05235及US 2004/0096942 A1)。「伴」核受體配體結合結構域可另包含截短突變、刪除突變、取代突變或其他修飾。
在一實施態樣中，脊椎動物RXR LBD係來自人智人(Homo sapiens)、小鼠家鼷鼠(Mus musculus)、大鼠溝鼠(Rattus norvegicus)、雞原雞(Gallus gallus)、豬家豬(Sus scrofa domestica)、青蛙非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬魚斑馬魚(Danio rerio)、被囊動物三崎海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)或水母箱型水母(Tripedalia cysophora)之RXR。
在一實施態樣中，無脊椎動物RXR配體結合結構域係來自蝗蟲飛蝗(Locusta migratoria)之超氣門多肽(「LmUSP」)、硬蜱美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum)之RXR同源物1(「AmaRXR1」)、硬蜱美洲鈍眼蜱之RXR同源物2(「AmaRXR2」)、招潮蟹大西洋砂招潮蟹(Celuca pugilator)之RXR同源物(「CpRXR」)、甲蟲黃粉蟲(Tenebrio molitor)之RXR同源物(「TmRXR」)、蜜蜂義大利蜂(Apis mellifera)之RXR同源物(「AmRXR」)、蚜蟲桃蚜(Myzus persicae)之RXR同源物(「MpRXR」)或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之RXR同源物。
在一實施態樣中，嵌合性RXR LBD包含至少二種選自脊椎動物物種RXR多肽片段、非脊椎動物物種RXR多肽片段或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段之多肽片段。用於本發明之嵌合性RXR配體結合結構域可能包含至少二種不同物種之RXR多肽片段，或當物種係相同時，該二或多種多肽片段可來自該物種RXR多肽片段之二或多種不同的異構體。
在一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種無脊椎動物物種RXR多肽片段。
在另一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲無脊椎動物物種RXR同源物多肽片 段。
當配體與核受體之LBD組合且轉而與和外源性基因連接之反應元件結合時，該配體提供外部時態調控外源性基因之表現。本發明之各種成份間互相結合即例如配體與LBD結合、DBD與反應元件結合、TD與啟動子結合等之結合機轉或順序並不重要。
在特定實施例中，配體與H組核受體之LBD及彼之核受體LBD伴結合使外源性基因得以表現。此機轉不排除配體與H組核受體(GHNR)或彼之伴結合且導致形成活性同型二聚體複合物(例如GHNR+GHNR或伴+伴)之可能性。較佳地，以一或多種不同的受體結構域產生雜交基因開關。通常，該三種結構域DBD、LBD及TD中之一或多種可自不同於其他結構域來源之來源選擇，以使該雜交基因及該形成之雜交蛋白質在經選擇之宿主細胞或有機體內之反式活化活性、與配體之互補結合及對特定反應元件之辨識係經最佳化。此外，該反應元件本身可經其他DNA結合蛋白質結構域之反應元件改質或取代，諸如來自酵母菌之GAL-4蛋白質(見Sadowski et al.,Nature 335：563(1988))或來自大腸桿菌之LexA蛋白質(見Brent et al.,Cell 43：729(1985))，或專門與經設計、改質及選擇以進行特定交互作用之蛋白質進行該等標靶交互作用之合成性反應元件(見例如Kim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94：3616(1997))，以適應雜交受體。
功能性EcR複合物亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫 親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38或βFTZ-1)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR、USP及/或RXR之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。此外，可能需要其他輔因子，諸如通常被稱為輔活化子(亦稱為適應子或媒介子)之蛋白質。這些蛋白質不與DNA序列特異性結合，且不參與基礎轉錄。它們可能經由各種機轉展現它們對反式活化之影響，包括刺激與活化子之DNA結合、影響染色質結構，或媒介活化子起始複合物交互作用。該等輔活化子之實例包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混雜輔活化子C反應元件B結合蛋白CBP/p300(見回顧文獻Glass et al.,Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。另外，通常被稱為輔抑制子(又名抑制子、靜默子或靜默媒介子)之蛋白質輔因子可能為缺乏配體時有效抑制轉錄活化所需。這些輔抑制子可與無配體之EcR交互作用以靜默反應元件之活性。目前的證據顯示，配體結合改變受體之構型，導致釋放輔抑制子及吸引上述輔活化子，藉此取消彼等之靜默活性。輔抑制子之實例包括N-CoR及SMRT(見回顧文獻Horwitz et al.,Mol Endocrinol.10：1167(1996))。這些輔因子可能為在細胞或有機體內之內源性因子，或可能為外源性添加之轉基因以經調節或未調節之方式表現。
該外源性基因係與啟動子可操作性連接，該啟動子包含至少一個由該基因開關所編碼之配體依賴性轉錄因子之 DBD所辨識之反應元件。在一實施態樣中，該啟動子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10套反應元件。包含該所欲之反應元件之啟動子可為天然發生之啟動子或利用該領域廣為周知之技術產生之人工啟動子，例如一或多個反應元件與最小啟動子可操作性連接。
編碼免疫調節劑例如IL-12、TNF-α、信號肽或任何此處所述之轉錄因子之基因亦可經密碼子最佳化。在一實施態樣中，免疫調節劑例如IL-12、TNF-α、信號肽或轉錄因子之編碼區係經密碼子最佳化以供人之表現。如該領域之技藝人士所了解的，不同的核酸編碼區將編碼相同多肽，因為基因密碼具有多餘性。在包含編碼任何多肽鏈之胺基酸的密碼子之核苷酸序列中的偏差允許編碼該基因之序列的變異。由於每個密碼子係由三個核苷酸組成，且組成DNA之核苷酸限制於四個特定鹼基，因此有64種可能的核苷酸組合，其中的61種編碼胺基酸(其餘3個密碼子編碼終止轉譯之信號)。顯示何種密碼子編碼何種胺基酸之「基因密碼」複製於此處表4。如表中所示，許多胺基酸由超過一種密碼子指定。舉例來說，胺基酸丙胺酸及脯胺酸係由四種三聯體密碼編碼，絲胺酸及精胺酸係由六種三聯體編碼，然而色胺酸及甲硫胺酸則僅由一種三聯體編碼。此簡併性允許DNA鹼基組成物有廣泛差異，但不至於改變由該DNA所編碼之多肽的胺基酸序列。
Figure 106128457-A0101-12-0138-19
應了解任何依照本發明所述編碼多肽之多核苷酸均屬於本發明之範圍，不論其所使用之密碼子為何。
許多有機體展現使用特定密碼子之偏性，以在成長中之多肽鏈編碼插入特定胺基酸。密碼子偏好或密碼子偏性即有機體間密碼子之使用差異係由基因密碼之簡併性提供，在許多有機體間有廣泛文獻記錄。密碼子偏性通常與信使RNA(mRNA)之轉譯效率有關，接著被認為尤其取決於被轉譯之密碼子的特性及特定轉移RNA(tRNA)分子之可得性。細胞內經選擇之tRNA之優勢通常反映在肽合成中最常所使用之密碼子。因此，基因可經修剪以在給定有機體內基於密碼子最佳化達到最佳基因表現。
多核苷酸係藉由將給定物種之基因中偏好使用之密碼 子納入DNA序列加以製備。
由於可自廣泛種類之動物、植物及微生物物種取得大量之基因序列，因此有可能計算密碼子使用之相對頻率。密碼子使用表可被輕易地取得，例如在網站http：//www.kazusa.or.jp/codon/(於2006年5月30日造訪)提供之「密碼子使用資料庫」，這些表格可經多種方式調整。見Nakamura,Y.,et al.,"Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases：status for the year 2000" Nucl.Acids Res.28：292(2000)。自GenBank Release 151.0計算得到之人密碼子使用表被複製為下列表5(來自同上之http：//www.kazusa.or.jp/codon/)。這些表格使用mRNA命名法，因此該等表格不使用在DNA中發現之胸腺嘧啶(T)，而是使用在RNA中發現之尿嘧啶(U)。該等表格係經調整，因此頻率係根據各胺基酸計算，而非根據所有64個密碼子計算。
Figure 106128457-A0101-12-0140-20
Figure 106128457-A0101-12-0141-21
藉由使用這些或類似之表格，該領域之一般技藝人士可應用這些頻率至任何給定之多肽序列，以產生經密碼子最佳化之編碼區之核酸片段，該核酸片段使用對給定物種最佳化之密碼子以編碼該多肽。
有多種方法可被用於合成由上述任何方法所設計之經密碼子最佳化之編碼區，包括該領域之一般技藝人士所廣為周知之標準及例行分子生物操作。
在一實施態樣中，本發明之載體中編碼免疫調節劑例如TNF-α之編碼區係經密碼子最佳化。在另一實施態樣中，該編碼區係經密碼子最佳化以於人表現。在特定實施態樣中，本發明中之TNF-α係由經密碼子最佳化之核酸序列編碼。
為了將多核苷酸導入活體內或活體外之細胞內，可使用載體。該載體可為例如質體載體或單股或雙股RNA或 DNA病毒載體。藉由廣為周知之導入DNA及RNA至細胞內之技術，該等載體可被導入需要該載體之個體例如哺乳動物的細胞內。病毒載體可為複製型或複製缺陷型。就複製缺陷型病毒載體而言，病毒增殖通常將僅發生於互補宿主細胞。此處所使用之用語「宿主細胞」或「宿主」係指本發明中包含本發明之一或多種多核苷酸之細胞。
因此，該載體至少必須包含本發明之多核苷酸。載體之其他成份可包括但不限於選擇性標誌、染色質修飾結構域、驅使其他亦可能存在載體中之多肽(例如致死多肽)表現之額外啟動子、基因組嵌入位點、重組位點及分子插入支點。載體可能包含任何數量之該些額外元件，不論是否位於該等多核苷酸之內，因此該載體可經剪裁以符合所欲治療性方法之特定目標。
在本發明之一實施態樣中，被導入細胞內之該等載體另包含「選擇性標誌基因」，當選擇性標誌基因表現時表示本發明之基因開關建構體已被嵌入宿主細胞之基因組內。因此，該選擇性基因可作為基因組嵌入之陽性標誌。選擇性標誌基因雖然不是本發明之方法所必須，但其存在允許實施者得以選擇載體建構體已被嵌入細胞之基因組中之活細胞群。因此，本發明之某些實施態樣包含選擇已成功嵌入載體之細胞。此處所使用之用語「選擇」或彼之變異詞當與細胞一起使用時，係意圖表示標準、廣為周知之選擇具有特定基因組成或表型之細胞之方法。典型方法包括但不限於在抗生素諸如G418、新黴素及安比西林(ampicillin) 存在時培養細胞。其他選擇性標誌基因之實例包括但不限於授予二氫葉酸還原酶、潮黴素或黴酚酸抗藥性之基因。其他選擇方法包括但不限於允許使用胸苷激酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸糖激酶或腺嘌呤轉磷酸糖激酶作為選擇劑之選擇性標誌基因。包含抗生素抗藥性基因之載體建構體的細胞將可耐受在培養中之抗生素。反之，不含抗生素抗藥性基因之載體建構體的細胞將無法耐受在培養中之抗生素。
此處所使用之「染色質修飾結構域」(CMD)係指與各種與維持及/或改變染色質結構有關之蛋白質(諸如但不限於DNA絕緣子)交互作用之核苷酸序列。見Ciavatta et aI.,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.,103：9958(2006)。CMD之實例包括但不限於雞β-球蛋白絕緣子及雞高敏感位點4(cHS4)。舉例來說，在一或多種基因計畫(即啟動子、編碼序列及3'調節區)之間使用不同的CMD序列有利於使用差別CMD DNA序列作為「最小同源臂」與各種微生物或試管內重組工程技術之組合，以「交換」在現存多重基因及單基因穿梭載體之間的基因計畫。其他染色質修飾結構域之實例係該領域已知或可被輕易識別。
在本發明之載體中之多核苷酸及核酸編碼區可與額外之編碼區相連，該額外之編碼區編碼分泌或信號肽，以引導免疫調節劑例如TNFα之分泌。根據信號假設，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，一旦生長蛋白質鏈開始被輸出通過粗糙內質網，該信號肽或分 泌前導序列會自成熟蛋白質切除。由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有與該多肽之N端融合之信號肽，該信號肽將自完整或「全長」多肽切除以產生分泌或「成熟」型多肽。
在一實施態樣中，本發明之載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸，其與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子可操作性連接，其中該編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸另包含編碼信號肽之核酸序列。在另一實施態樣中，該信號肽增加由該載體所編碼之免疫調節劑例如TNF-α之分泌，相較於包含免疫調節劑之天然信號肽基因例如TNF-α野生型信號肽基因之載體。特別是，本發明所使用之信號肽係經密碼子最佳化。在特定實施態樣中，該信號肽係由IL-2野生型信號肽基因所編碼。在另一特定實施態樣中，該信號肽係由經密碼子最佳化之IL-2信號肽基因所編碼。
本發明之載體可包含各種調節區，例如5'非轉譯區(5'UTR)、3' UTR或二者。本發明亦關於使用各種調節區以誘發增進之分泌、蛋白質轉譯、轉譯後、mRNA轉錄或轉錄後處理。此處所使用之基因之「5'非轉譯區」或「5'UTR」被瞭解為基因經轉錄為初級RNA轉錄物(前-mRNA)之部分且該部分係位於編碼序列之上游。初級轉錄物係由DNA轉錄所產生之起始RNA產物，其包含內含子及外顯 子。許多初級轉錄物必須經過RNA處理以形成具有生理活性之RNA物種。要成為成熟mRNA之處理可能包含修剪末端、移除內含子、加蓋及/或自彼等之RNA前體切除個別核糖體RNA(rRNA)分子。mRNA之5'UTR因此係為不經轉譯成為蛋白質之mRNA部分，且該部分係位於編碼序列之上游。在基因組序列中，5'UTR通常被定義為介於轉錄起始位點及起始密碼子之間的區域。脊椎動物mRNA之5'非轉譯區(5'UTR)的長度可自數十個鹼基至數百個鹼基(Crowe et al.,2006 BMC Genomics 7：16)。此處所使用之5'UTR可為天然發生或經修飾以包含一或多個在天然中不連續之核酸序列(嵌合性序列)，及/或可包含取代、插入及刪除及彼等之組合。在一實施態樣中，該5'UTR序列係源自野生型TNF-α序列或5U2序列。在另一實施態樣中，該5'UTR序列係5U2之5'UTR。在一些實施態樣中，該5'UTR誘發增進之蛋白質表現，例如mRNA轉錄、轉錄前或轉錄後。
本發明所使用之3'非轉譯區(UTR)係指位於編碼序列下游(3')之DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]辨認序列及其他編碼調節信號以影響mRNA處理或基因表現之序列。聚腺苷酸化信號之特徵通常為影響聚腺苷酸序列添加至mRNA前體之3'端。任何適當之聚腺苷酸化序列皆可被使用，包括合成性最佳化序列，以及BGH(牛生長激素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(EB病毒)及乳頭狀瘤病毒之聚腺苷酸化序列，包括人乳頭狀瘤病毒及BPV(牛乳頭 狀瘤病毒)。在特定實施態樣中，3'調節區係SV40e(人肉瘤病毒-40)聚腺苷酸化序列。在另一特定實施態樣中，3'調節區係人生長激素之聚腺苷酸化序列。
在某些實施態樣中，相較於不含信號肽及/或調節區之對照物，單獨或經組合之信號肽及/或調節區可增進至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍或500倍之蛋白質分泌、轉錄或轉譯。蛋白質例如TNF-α之分泌量可經正常化至由具有野生型基因之載體所編碼之蛋白質表現。在本發明之另一特定實施態樣中，該單獨或經組合之信號肽及/或調節區增加約5%至約10%、約11%至約20%、約21%至約30%、約31%至約40%、約41%至約50%、約51%至約60%、約61%至約70%、約71%至約80%、約81%至約90%、約91%至約100%、約101%至約149%、約150%至約199%、約200%至約299%、約300%至約499%或約500%至約1000%之免疫調節劑例如TNF-α之產量。在特定實施態樣中，本發明包含條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之載體，其中該載體包含源自5U2之5'UTR、編碼IL-2信號肽之經密碼子最佳化之核酸序列、編碼免疫調節劑例如TNF-α之經密碼子最佳化之編碼區及SV40e或人生長激素之聚腺苷酸化信號。
在其他實施態樣中，本發明之載體包含選自SEQ ID NO：47(載體43318)、SEQ ID NO：48(載體43319)、SEQ ID NO：49(載體43320)、SEQ ID NO：50(載體43321)、 SEQ ID NO：51(載體43322)、SEQ ID NO：52(載體43323)、SEQ ID NO：53(載體43324)、SEQ ID NO：54(載體43325)、SEQ ID NO：55(載體43326)、SEQ ID NO：56(載體43327)、SEQ ID NO：57(載體43328)或SEQ ID NO：58(載體43329)之多核苷酸序列。在又一特定實施態樣中，該載體包含SEQ ID NO：52(載體43323)或SEQ ID NO：58(載體43329)之多核苷酸序列。
用於本發明之特定載體係編碼蛋白質或多核苷酸之表現載體。通常，該等載體包含與所欲表現之多核苷酸可操作性連接以供宿主內之有效表現之順式作用控制區。適當之反式作用因子係由宿主提供、由互補載體提供或當導入宿主內時由載體本身提供。
多種表現載體可被用於表現蛋白質或多核苷酸。該等載體包括染色體、附加型及病毒衍生性載體，例如源自細菌性質體、噬菌體、酵母菌附加體、酵母菌染色體元件、病毒諸如腺病毒相關病毒、慢病毒、桿狀病毒、乳多泡病毒諸如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒及反轉錄病毒之載體及源自彼等之組合之載體，諸如該些源自質體及噬菌體基因元件(如黏質體及噬菌體)之載體。所有皆可被用於本發明此態樣中之表現。一般來說，任何適合在宿主內維持、增殖或表現多核苷酸或蛋白質之載體可被用於這方面之表現。
用於本發明之適當病毒載體包括但不限於腺病毒基底載體、反轉錄病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)基底載體、 小病毒基底載體，例如腺病毒相關病毒(AAV)基底載體及AAV-腺病毒嵌合性載體。這些病毒載體可利用標準重組DNA技術製備，例如於Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,N.Y.(1994)中所述之技術。
在一實施態樣中，本發明之病毒載體係腺病毒載體。腺病毒(Ad)係36kb之雙股DNA病毒，其於活體內有效地轉移DNA至各種不同之標靶細胞類型。腺病毒載體可以高力價產生，且可有效地轉移DNA至複製及非複製細胞。腺病毒載體基因組可利用任何種、系、亞型、多種種(species)之混合物、多種系之混合物、多種亞型之混合物或嵌合性腺病毒作為載體DNA之來源加以產製。可被用來作為腺病毒來源之腺病毒保存液可自腺病毒血清型1至51擴增，這些血清型目前可得自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯市)，或自任何其他來源所提供之任何其他腺病毒血清型擴增。舉例來說，腺病毒可為A亞群(例如血清型12、18及31)、B亞群(例如血清型3、7、11、14、16、21、34及35)、C亞群(例如血清型1、2、5及6)、D亞群(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22至30、32、33、36至39及42至47)、E亞群(血清型4)、F亞群 (血清型40及41)或任何其他腺病毒血清型。由於人腺病毒血清型5(Ad5)基因組已被完全定序，此處所描述之本發明之腺病毒載體係關於Ad5血清型。該腺病毒載體可為任何能在細胞內生長之腺病毒載體，該載體之某些顯著部分(雖然不見得實質上)係衍生自或基於腺病毒之基因組。該腺病毒載體可基於任何適當之野生型腺病毒之基因組。在某些實施態樣中，腺病毒載體係源自C群野生型腺病毒之基因組，尤其是血清型2或5。腺病毒載體係該領域所廣為周知，已被描述於例如美國第5,559,099、5,712,136、5,731,190、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,962,311、5,965,541、5,981,225、5,994,106、6,020,191及6,113,913號專利、國際專利申請案WO 95/34671、WO 97/21826及WO 00/00628及Virology,B.N.Fields et al.,eds.,3d ed.,Raven Press,Ltd.,New York(1996)之Thomas Shenk所著之第67章"Adenoviridae and their Replication"及M.S.Horwitz所著之第68章"Adenoviruses"。
在其他實施態樣中，該腺病毒載體係複製缺陷型載體。此處所使用之用語「複製缺陷型」係指該腺病毒載體包含缺乏至少一種複製必要基因功能之基因組。此處所使用之基因缺陷、基因功能缺陷、基因區缺陷或基因組區缺陷係定義為刪除病毒基因組中足夠之基因材料以破壞或抹煞該核酸序列被整體或部分刪除之基因的功能。複製必要之基因功能係複製缺陷型腺病毒載體複製(即增殖)所需之該些基因功能。複製必要之基因功能係由例如腺病毒早期區 (例如E1、E2及E4區)、晚期區(例如L1至L5區)、與病毒包裝有關之基因(例如IVa2基因)及病毒相關性RNA(例如VA-RNA I及/或VA-RNA II)所編碼。在其他實施態樣中，該複製缺陷型腺病毒載體包含缺乏腺病毒基因組之一或多區之至少一種複製必要性基因功能之腺病毒基因組(例如缺乏腺病毒基因組之二或多區以導致多重複製缺陷型腺病毒載體)。該腺病毒基因組之一或多區係選自E1、E2或E4區。複製缺陷型腺病毒載體可包含E1區之至少一種複製必要性基因功能之缺陷(即為E1-缺陷型腺病毒載體)，特別是腺病毒E1A區及腺病毒E1B區各區中複製必要性基因功能之缺陷。除了該種E1區之缺陷以外，該重組腺病毒亦可在主要晚期啟動子(MLP)中具有突變，如國際專利申請案WO 00/00628中之討論。在特定實施態樣中，該載體缺乏E1區之至少一種複製必要性基因功能及至少部分之非必要性E3區(例如E3區之Xba I刪除)(即為E1/E3-缺陷型腺病毒載體)。
在某些實施態樣中，該腺病毒載體係「多重缺陷」，表示該腺病毒載體缺乏腺病毒基因組之二或多區之各區中的一或多種病毒複製所需之基因功能。舉例來說，前述之E1-缺陷型或E1/E3-缺陷型腺病毒載體可另缺乏至少一種E4區之複製必要性基因功能(即為E1/E4-缺陷型腺病毒載體)。刪除整個E4區之腺病毒載體可誘發較低之宿主免疫反應。
或者，該腺病毒載體缺乏所有或部分之E1區及所有 或部分之E2區的複製必要性基因功能(即為E1/E2-缺陷型腺病毒載體)。缺乏所有或部分之E1區、所有或部分之E2區及所有或部分之E3區之複製必要性基因功能之腺病毒載體亦於此處考慮。若本發明之腺病毒載體缺乏E2A區之複製必要性基因功能，則該載體不包含完整刪除之E2A區，其長度少於約230個鹼基對。通常，腺病毒之E2A區編碼DBP(DNA結合結構域)，其為DNA複製所需之多肽。依病毒血清型而定，DBP係由473至529個胺基酸組成。一般認為DBP是呈長橢球形狀之非對稱性蛋白質，其由球狀Ct與延伸之Nt結構域組成。研究顯示，該Ct結構域負責DBP與核酸結合、與鋅結合及在DNA合成中作用於DNA鏈延長階段之能力。然而，該Nt結構域被認為作用於轉錄及轉錄後二個階段之晚期基因表現，負責蛋白質之有效核定位，且亦可能與增強彼自身之表現有關。刪除在胺基酸2至38之間的Nt結構域顯示此區是DBP功能之重要部分(Brough et al.,Virology,196,269-281(1993))。雖然刪除編碼DBP之Ct區的E2A區對病毒複製沒有影響，但刪除編碼DBP之Nt結構域的胺基酸2至38之E2A區妨礙病毒複製。在一實施態樣中，多重複製缺陷型腺病毒載體包含腺病毒基因組之此部分之E2A區。特別是，舉例來說，該所欲保留之E2A區部分係由該E2A區之5'端所定義之腺病毒基因組之E2A區部分，特別是腺病毒血清型Ad5基因組之E2A區的位置Ad5(23816)至Ad5(24032)。
該腺病毒載體可為缺乏僅腺病毒基因組早期區之複製必要性基因功能、僅腺病毒基因組晚期區之複製必要性基因功能及腺病毒基因組早期及晚期兩區之複製必要性基因功能。腺病毒載體亦可實質上移除完整之腺病毒基因組，在此情況中至少維持完整之病毒反向末端重複(ITR)及一或多種啟動子或病毒ITR及包裝信號(即腺病毒增殖子)。被移除之腺病毒基因組區域越大，可被插入基因組內之外源性核酸序列之片段越大。舉例來說，如果腺病毒基因組為36kb，保留完整之病毒ITR及一或多種啟動子，該腺病毒之外源性插入能力係約35kb。或者，僅包含ITR及包裝信號之多重缺陷腺病毒載體有效地允許插入約37至38kb之外源性核酸序列。當然，在任何或所有的缺陷型腺病毒區中包含間隔子元件將降低腺病毒載體容納大型插入序列之能力。適當之複製缺陷型腺病毒載體包括多重缺陷型腺病毒載體係揭示於美國第5,851,806及5,994,106號專利及國際專利申請案WO 95/34671及WO 97/21826。在一實施態樣中，本發明方法所使用之載體係描述於國際專利申請案PCT/US01/20536。
應了解的是，刪除腺病毒載體之不同區域可改變哺乳動物之免疫反應。特別是，刪除不同區域可減少腺病毒載體所產生之發炎反應。另外，腺病毒載體外套蛋白可經修飾以降低腺病毒載體可被或不可被針對野生型外套蛋白之中和抗體辨識之能力，如國際專利申請案WO 98/40509中所述。
當該腺病毒載體具多重複製缺陷特別是E1及E4區之複製必要性基因功能時，該載體可包括間隔子元件以提供病毒在互補細胞系中生長，類似單一複製缺陷型腺病毒載體特別是包含E1區缺陷之腺病毒載體所達成之病毒生長。該間隔子元件可包含任何所欲長度之序列。間隔子元件序列可為腺病毒基因組之編碼或非編碼及天然或非天然序列，但不恢復該缺陷區之複製必要性功能。在缺乏間隔子的情況下，多重複製缺陷型腺病毒載體之纖維蛋白產製及/或病毒生長相較於單一複製缺陷型腺病毒載體係經減少。然而，在缺陷型腺病毒區之至少一區較佳地E4區中包含間隔子可彌補此纖維蛋白產製及病毒生長之降低。在腺病毒載體中使用間隔子係描述於美國第5,851,806號專利。
腺病毒載體之建構係該領域所廣泛了解。腺病毒載體可利用前述方法建構及/或純化，例如美國第5,965,358號專利及國際專利申請案WO 98/56937、WO 99/15686及WO 99/54441中所述。腺病毒基因轉移載體之產製係該領域所廣為周知，涉及使用標準分子生物技術諸如該些於例如Sambrook et al.(同上)、Watson et al.(同上)、Ausubel et al.(同上)及此處提及之數篇其他文獻中所描述者。
複製缺陷型腺病毒載體通常在互補細胞系中產製，該細胞系提供不存在於複製缺陷型腺病毒載體但為病毒增殖所需之適當量之基因功能，以產製高力價之病毒載體保存液。在一實施態樣中，細胞系互補至少一種及/或所有不 存在於複製缺陷型腺病毒之複製必要性基因功能。該互補細胞系可互補至少一種由早期區、晚期區、病毒包裝區、病毒相關性RNA區或彼等之組合所編碼之複製必要性基因功能之缺陷，包括所有腺病毒功能(例如使包含最小腺病毒序列，諸如僅反向末端重複(ITR)及包裝信號或僅ITR及腺病毒啟動子之腺病毒增殖子得以增殖)。在另一實施態樣中，該互補細胞系互補腺病毒基因組之E1區的至少一種複製必要性基因功能之缺陷(例如二或多種複製必要性基因功能)，特別是在各E1A及E1B區之複製必要性基因功能之缺陷。此外，該互補細胞系可互補腺病毒基因組之E2(特別是腺病毒DNA聚合酶及末端蛋白質)及/或E4區之至少一種複製必要性基因功能之缺陷。刻意地，互補E4區之缺陷的細胞包含E4-ORF6基因序列及產製E4-ORF6蛋白。該細胞刻意地至少包含ORF6，但不含腺病毒基因組之E4區之其他ORF。該細胞系之較佳其他特徵為包含不與腺病毒載體重複之互補基因，如此能最小化且幾乎消除載體基因組與細胞性DNA重組之可能性。因此可將複製型腺病毒(RCA)存在之機率降到最低即使無法在載體保存液中避免，使該載體保存液得以適合某些治療性目的特別是基因療法之目的。不含RCA之載體保存液可避免腺病毒載體在非互補細胞中複製。互補細胞系之建構涉及標準分子生物學及細胞培養技術，諸如該些由Sambrook et al.(同上)及Ausubel et al.(同上)所述者。用於產製基因轉移載體(例如腺病毒載體)之互補細胞系包括但 不限於293細胞(例如Graham et al.,J.Gen.Virol.,36,59-72(1977)所述)、PER.C6細胞(例如國際專利申請案WO 97/00326及美國第5,994,128及6,033,908號專利所述)及293-ORF6細胞(例如國際專利申請案WO 95/34671及Brough et al.,J.Virol.,71,9206-9213(1997)所述)。核酸序列插入腺病毒基因組內(例如腺病毒基因組之E1區)可由已知方法達成，例如藉由在腺病毒基因組之給定位置導入獨特之限制位點。
反轉錄病毒係能感染多種宿主細胞之RNA病毒。當感染時，反轉錄病毒基因組嵌入彼之宿主細胞的基因組內，並隨宿主細胞之DNA複製，藉以持續產製病毒RNA及任何納入反轉錄病毒基因組內之核酸序列。藉此方式，當使用反轉錄病毒時可達成長期表現治療性因子。考慮用於基因療法之反轉錄病毒相對不具致病性，雖然有致病性反轉錄病毒存在。當採用致病性反轉錄病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)或人嗜T細胞病毒(HTLV)時，必須小心地改變病毒基因組以消除對宿主之毒性。反轉錄病毒載體可經其他改變以使該病毒成為複製缺陷。因此反轉錄病毒載體被認為特別適用於活體內穩定之基因轉移。慢病毒載體諸如HIV-基底載體係用於基因傳送之示範性反轉錄病毒。不像其他的反轉錄病毒，已知HIV-基底載體會將彼等之乘客基因納入非分裂細胞，因此可被用於治療持續性疾病。
HSV-基底病毒載體適合用來作為基因轉移載體以導 入核酸至各種細胞類型。成熟HSV病毒粒子之結構為有套膜之二十面體核殼以及由152kb之線性雙股DNA分子組成之病毒基因組。大部分複製缺陷型HSV載體包含刪除以移除一或多種立即早期基因以避免複製。HSV載體之優點在於彼進入可導致長期DNA表現之潛伏階段之能力，及彼之可容納至25kb之外源性DNA插入之大型病毒DNA基因組。當然，HSV啟動長期產製外源性蛋白質之能力就短期治療計劃而言可能是一項缺點。然而，該領域之一般技藝人士具備判斷特定情況下之適當載體之必備了解。HSV-基底載體係描述於例如美國第5,837,532、5,846,782、5,849,572及5,804,413號及國際專利申請案WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637及WO 99/06583。
AAV載體係特別受到關注地被用於基因療法計畫中之病毒性載體。AAV係DNA病毒，其未被發現會造成人之疾病。AAV基因組係由二個基因rep及cap組成，其兩側為包含DNA複製及病毒包裝之辨識信號之反向末端重複(ITR)。AAV需要與輔助病毒(即腺病毒或單純皰疹病毒)共感染或表現輔助基因以有效地複製。AAV可在各種宿主細胞中增殖，包括人細胞、類人猿細胞及齧齒動物細胞，依所採用之輔助病毒而定。用於投予核酸序列之AAV載體通常被刪掉大約96%之親代基因組，僅剩ITR被保留。如此可消除因為表現病毒基因所造成之免疫或毒性不良反應。若有需要，AAV rep蛋白可與AAV載體共 投以使AAV載體能夠被嵌入宿主細胞之基因組內。包含經嵌入之AAV基因組的宿主細胞在細胞生長或細胞形態上沒有變化(見例如美國第4,797,368號專利)。因此，長期表現來自AAV載體之治療性因子可被用於治療持續性及慢性疾病。
表現載體中之多核苷酸序列係與適當之表現控制序列可操作性連接，包括例如引導mRNA轉錄之啟動子。其他啟動子之代表包括但不限於組成性啟動子及組織特異性或誘導性啟動子。組成性真核啟動子之實例包括但不限於小鼠金屬硫蛋白I基因(Hamer et al.,J.Mol.Appl.Gen.1：273(1982))、皰疹病毒之TK啟動子(McKnight,Cell 31：355(1982))、SV40早期啟動子(Benoist et al.,Nature 290：304(1981))及牛痘病毒啟動子。可用於驅使蛋白質或多核苷酸表現之啟動子的其他實例包括但不限於組織特異性啟動子及其他特定蛋白質之內源性啟動子，諸如白蛋白啟動子(肝細胞)、前胰島素啟動子(胰臟β細胞)及該類似物。一般來說，表現建構體將包含供轉錄之起始及終止位點，及在經轉錄區中供轉譯之核糖體結合位點。由建構體表現之成熟轉錄物的編碼部分可包括在所欲轉譯之多肽開始處之轉譯起始密碼子AUG及大約位於尾端之終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
此外，該建構體可包含調節及引起表現之控制區。一般來說，這些區將藉由控制轉錄之方式操作，其中包括諸如抑制子結合位點及增強子。
真核載體之實例包括但不限於斯壯特基(Stratagene)公司之pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1及pSG；法瑪西亞(Amersham Pharmacia Biotech)公司之pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL；及克隆技術(Clontech)公司之pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito及pCMV-EGFP。許多其他載體係廣為周知且可自商業途徑獲得。
特別有用之載體包含分子插入支點以供快速插入及移除基因計畫之元件，該等載體係描述於美國公開專利申請案2004/0185556、美國專利申請案11/233,246及國際公開申請案WO 2005/040336及WO 2005/116231。該載體實例係如WO 2007/038276中所述之UltraVectorTM產製系統(維吉尼亞州布萊克斯堡(Blacksburg,VA)英創松(Intrexon)公司)。此處所使用之「基因計畫」係基因元件之組合，包含啟動子(P)、表現序列(E)及3'調節序列(3)，因此「PE3」即一基因計畫。在此基因計畫中之元件可被輕易地在基因計畫之各元件側翼之分子支點之間交換。此處所使用之分子支點係定義為包含至少二個以線性方式排列之非變動性罕見或少見之限制位點之多核苷酸。在一實施態樣中，該分子支點包含至少三個以線性方式排列之非變動性罕見或少見之限制位點。通常任一分子支點不包括在相同基因計畫內之任何其他分子支點之罕見或少見之限制位點。給定限制酶作用於其上之超過6個核苷酸之同源序列被稱為「罕見」限制位點。然而有些6bp之限制位點的發生頻率不 如統計預期的高，這些位點及切割彼等之內核酸酶被稱為「少見」限制位點。罕見或少見限制酶之實例包括但不限於AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、Nru I、Acl I、Cla I、Csp45 I、Age I、Bst1107 I、BstB I、Hpa I、Aat II、EcoR V、Nhe I、Spe I、Avi II、Avr II、Mfe I、Afe I、Fsp I、Kpn I、Sca I、BspE I、Nde I、Bfr I、Xho I、Pml I、ApaL I、Kas I、Xma I、BsrB I、Nsi I、Sac II、Sac I、Blp I、PspoM I、Pci I、Stu I、Sph I、BamH I、Bsu36 I、Xba I、BbvC I、Bgl II、Nco I、Hind III、EcoR I、BsrG I及Sse8781 1。
載體亦可包含第二類限制酶稱為歸巢內核酸酶(HE)之限制位點。HE酶具有大型、非對稱性限制位點(12至40個鹼基對)，彼等之限制位點在天然中並不常見。舉例來說，被稱為I-SceI之HE具有18bp之限制位點(5'TAGGGATAACAGGGTAAT3'(SEQ ID NO：28))，預計每7x1010鹼基對之隨機序列中僅出現一次。此出現頻率相當於在大小為哺乳動物基因組之20倍的基因組中僅一個位點。HE位點之罕見性大幅提高基因工程師切割基因計畫而不破壞該基因計畫之完整性的可能，若HE位點被包括於選殖載體質體之適當位置。
選擇適當載體及啟動子以於宿主細胞中表現係廣為周知之程序，而載體建構及導入宿主之必要技術以及彼於宿 主中之表現係該領域之例行技藝。
導入多核苷酸至細胞內可為過渡性轉染、穩定性轉染或可為基因座特異性插入載體。過渡性及穩定性轉染載體至宿主細胞內可由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖媒介性轉染、陽離子脂質媒介性轉染、電穿孔、轉導、感染或其他方法達成。該等方法係描述於許多標準實驗室手冊，諸如Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)、Keown et al.,1990,Methods Enzymol.185：527-37、Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.。這些穩定轉染方法導致隨機插入載體至細胞之基因組內。另外，載體之複製數及方向性通常來說亦為隨機。
在本發明之一實施態樣中，載體被插入基因組之生物中性位點。生物中性位點係指在基因組內插入多核苷酸而極少干擾(若有的話)該細胞之正常功能的位點。生物中性位點可利用可取得之生物資訊加以分析。許多生物中性位點係該領域已知，例如ROSA-相等基因座。其他生物中性位點可利用該領域廣為周知之例行技術加以辨識。基因組插入位點之特徵描述係利用該領域已知之方法進行。當導入載體至細胞內時，為了控制多核苷酸之位置、複製數及/或方向性，可使用基因座特異性插入之方法。基因座特異性插入之方法係該領域所廣為周知，包括但不限於同源性重組及重組酶媒介性基因組插入。當然，若要在本發明 之方法中使用基因座特異性插入方法，該等載體可包含輔助此基因座特異性插入之元件，諸如但不限於同源性重組。舉例來說，該等載體可能包含一、二、三、四或四個以上之基因組整合位點(GIS)。此處所使用之「基因組整合位點」被定義為載體序列之核苷酸序列與細胞內之基因組部分序列一致或幾乎一致之部分，該部分允許載體插入基因組。特別是，該載體可包含在至少多核苷酸兩側之二個基因組整合位點。當然，GIS可在其他元件或甚至存在載體上之所有元件之旁側。
在另一實施態樣中，基因座特異性插入可藉由重組酶位點特異性基因插入進行。簡言之，細菌性重組酶諸如但不限於PhiC31整合酶可作用於人基因組內之「假性」重組位點。這些假性重組位點可成為使用重組酶之基因座特異性插入之目標。重組酶位點特異性基因插入係描述於Thyagarajan et al.,Mol.Cell Biol.21：3926(2001)。可用於重組酶位點特異性基因插入之重組酶及彼等之個別位點之其他實例包括但不限於絲胺酸重組酶諸如R4及TP901-1和WO 2006/083253所描述之重組酶。
在另一實施態樣中，該載體可包含化學抗藥性基因，例如多重藥物抗藥性基因mdr1、二氫葉酸還原酶或O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶。化學抗藥性基因可在組成性(例如CMV)或誘導性(例如RheoSwitch®)啟動子之控制下。在此實施態樣中，若想要治療個體之疾病同時維持該個體體內經改質之細胞，臨床醫師可使用化學治療劑以殺 死疾病細胞，但該經改質之細胞將不受該劑之影響因為適當化學抗藥性基因之表現，且可被持續使用以治療、改善或預防疾病或疾患。藉由將化學抗藥性基因置於誘導性啟動子之控制下，可避免非必要之化學抗藥性基因表現，但若須持續治療該基因仍將可用。若經改質之細胞本身變成疾病細胞，它們仍可藉由誘導如下所述之致死性多肽之表現而被摧毀。
本發明之方法可藉由導入編碼基因開關及外源性基因之多核苷酸至個體之細胞內加以實現。可使用任何已知之用於導入多核苷酸至該領域已知之細胞內之方法，諸如上述之該些方法。
當多核苷酸是要導入活體外之細胞內時，該等細胞可藉由任何該領域已知之技術取自個體，包括但不限於生檢、刮削及手術組織移除。該經分離之細胞可經足以允許多核苷酸導入細胞內之時間的培養，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小時或更久。短時間內培養初代細胞之方法係該領域所廣為周知。舉例來說，細胞可於培養盤(例如微量孔盤)中附著或懸浮培養。
以活體外治療性方法而言，細胞係自個體分離，並在適用於導入多核苷酸至細胞內之條件下培養。一旦多核苷酸被導入細胞內，該等細胞係經足夠時間之培養以允許配體依賴性轉錄因子之表現，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18或24小時或更久。在多核苷酸被導入細胞後的某些時間點(不論是在顯著量之配體依賴 性轉錄因子被表現之前或之後)，該等細胞被導入回該個體體內。導回可藉由該領域已知之任何方法進行，例如靜脈輸注或直接注入組織或腔內。在一實施態樣中，在將細胞導回個體之前，會先測定細胞內有多核苷酸存在。在另一實施態樣中，包含多核苷酸之細胞係經篩選(例如根據多核苷酸之選擇性標誌之存在與否)，只有該些包含多核苷酸之細胞會被導回個體。在細胞被導回個體之後，配體被投予至個體以誘發該治療性多肽或治療性多核苷酸之表現。在選擇性實施態樣中，該配體甚至可在細胞被導回個體之前被加至該細胞，以使該治療性多肽或治療性多核苷酸在細胞被導回之前開始表現。該配體可經任何適當之方法投予，不論是系統性投予(例如經口、經靜脈)或局部性投予(例如腹膜內、脊椎鞘內、腦室內、直接注射至細胞被導回之組織或器官內)。每種細胞類型及疾病或疾患之理想配體投予時間可利用例行技術決定。
本發明之活體內治療性方法涉及直接活體內導入多核苷酸例如腺病毒載體至個體之細胞內。多核苷酸可經系統性或局部性(例如疾病或疾患之部位)導入個體體內。一旦多核苷酸被導入個體體內，配體可被投予以誘發該治療性多肽或治療性多核苷酸之表現。該配體可經任何適當之方法投予，不論是系統性投予(例如經口、經靜脈)或局部性投予(例如腹膜內、脊椎鞘內、腦室內、直接注射至發生疾病或疾患之組織或器官內)。每種細胞類型及疾病或疾患之理想配體投予時間可利用例行技術決定。
以活體內用途而言，此處描述之配體可包含於醫藥上可接受之載劑中，諸如溶液、懸浮液、錠劑、膠囊、軟膏、酏劑及注射型組成物。醫藥組成物可包含自0.01重量%至99重量%之配體。組成物可為單一或多重劑量形式。在任何特定醫藥組成物中之配體量將依有效劑量而定，即誘發該所欲之基因表現或抑制所需之劑量。
投予該醫藥製劑之適當途徑包括經口、經直腸、局部(包括經皮、經頰及舌下)、經陰道、非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內、腫瘤內、皮內、脊椎鞘內及硬膜外)、玻璃體內及經鼻胃管。該領域之技藝人士將了解到，投予途徑將依所欲治療之情況而定，且可能隨不同因素例如接受者之狀況而異。
此處所使用之用語「rAD.RheoIL12」係指腺病毒多核苷酸載體，其包含在RheoSwitch®治療系統(RTS)之基因開關的控制下之IL-12基因，該載體能在活化配體存在下產製IL-12蛋白。此處所使用之用語「rAd.cIL12」係指包含在組成性啟動子控制下之IL-12基因的腺病毒多核苷酸控制載體。
此處所使用之用語「IL-12p70」係指IL-12蛋白，其天然地具有二個通常被稱為p40及p35之次單位。用語IL-12p70包含由IL-12之二個次單位(p40及p35)組成之融合蛋白，其中該融合蛋白可包含在次單位之間的連接子胺基酸。[00475]此處所使用之用語「具有免疫調節劑之功能的蛋白質」係指具有至少20%(例如至少30%、40%、 50%、60%、70%、80%或90%)之免疫調節劑之任何生物活性之蛋白質，免疫調節劑係選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R或彼之次單位DN、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防禦素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1、TGFbRII DN、ICOS-L或S100。同樣地，用語「具有IL-12之功能的蛋白質」係指具有至少20%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)之人IL-12之任何生物活性之蛋白質。該等免疫調節劑之生物活性係廣為周知。見下表。
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IL-12之生物活性亦廣為周知，包括但不限於使初始T細胞分化成Th1細胞、刺激T細胞之生長及功能、使T細胞及自然殺手(NK)細胞產生干擾素γ(1FN-γ)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、減少IL-4媒介之IFN-γ抑制、增進NK細胞及CD8+細胞毒性T淋巴細胞之細胞毒性活性、刺激IL-12R-β1及IL-12R-β2之表現、促使腫瘤抗原經由MHC I及II分子之上調而表現及抗血管生成活性。用語「具有IL-12之功能的蛋白質」包含野生型IL-12序列之突變物及模擬IL-12之一或多種生物活性之非IL-12蛋白質，其中該野生型序列藉由一或多個胺基酸添加、刪除或取代而被改變。
此處所使用之用語「經活化」或「活化」係指基因開關之細胞活性的任何可測量之增加，導致受到關注之基因的表現，例如選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R或彼之次單位DN、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防禦素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L或S100。
此處所使用之用語疾病「治療」或「治療」疾病係指為了 緩和疾病之徵候或症狀而執行計畫，該計畫可能包括投予一或多種藥物或經活體外工程化之細胞至哺乳動物(人或非人)。因此，「治療」不應一定被視為需要完全緩和徵候或症狀，不要求治癒，且特別包括僅對個體具邊際效應之計畫。
此處所使用之「免疫細胞」包括樹突細胞、巨噬細胞、嗜中性球、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、自然殺手細胞及淋巴細胞(例如B細胞及T細胞)。
此處之用語「樹突細胞」及「DC」可交換使用。
此處之用語「治療支持細胞」(TSC)係可經本發明之載體改質(例如轉染、電穿孔等)之細胞，以傳遞一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質及可任意選擇地具有IL-12之功能的蛋白質至腫瘤微環境。該TSC包括但不限於幹細胞、纖維母細胞、內皮細胞及角質細胞。
此處之用語「經活體外工程化之免疫細胞」或「經活體外工程化之免疫細胞群」或「經工程化之免疫細胞群」或「表現免疫調節劑之免疫細胞」或「表現IL-12之免疫細胞」係指視情況在基因開關之控制下條件性表現免疫調節劑及/或IL-12之免疫細胞例如樹突細胞，該基因開關可由活化配體活化。
此處之用語「經活體外工程化之TSC」或「經活體外工程化之TSC群」或「經工程化之TSC群」或「表現免疫調節劑之TSC」或「表現IL-12之TSC」係指視情況在基因開關之控制下條件性表現免疫調節劑及/或IL-12之治療支持細 胞例如幹細胞、纖維母細胞、內皮細胞及角質細胞，該基因開關可由活化配體活化。
此處之用語「改質細胞」係指經一程序改變之細胞，該程序包括但不限於轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱及脂質體轉染(溶酶體融合)。
此處之用語「MOI」或「感染複數」係指在特定實驗中感染單一細胞之腺病毒顆粒平均數量(例如重組腺病毒或對照腺病毒)。
此處之用語「腫瘤」係指所有在活體內或活體外之良性或惡性細胞生長及增生，不論是癌前性或癌性細胞及/或組織。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療疾病。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療癌。可由本發明治療之癌的非限制性實例包括乳癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰癌、結腸癌、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、卵巢癌、腦癌、原發性腦癌、頭頸癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭或頸癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、小細胞肺癌、威爾姆斯氏(Wilms')腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、胰癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、泌尿生殖系統癌、甲狀腺癌、食道癌、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、腎上腺癌、腎細胞癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、惡性胰臟胰島瘤、惡性 類癌腫瘤、絨毛膜癌、蕈狀肉芽腫、惡性高鈣血症、子宮頸增生、白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、髮樣細胞白血病、神經胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西氏(Kaposi's)肉瘤、真性紅血球增多症、本態性血小板增多症、霍奇金氏(Hodgkin's)症、非霍奇金氏淋巴瘤、軟組織肉瘤、間皮瘤、骨原性肉瘤、原發性大球蛋白血症及視網膜胚細胞瘤及類似之癌。在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療代謝相關性疾病，包括但不限於選自下列之疾病：異常脂血症、動脈粥樣硬化、胰島素抗性、糖尿病(例如第I型糖尿病、第II型糖尿病、MODY及妊娠糖尿病)、肥胖、葡萄糖不耐症、動脈粥樣化疾病、高血壓、心臟病(包括但不限於冠狀動脈心臟病、中風、心功能不全、冠狀動脈功能不全及高血壓)、高脂血症、葡萄糖不耐、胰島素抗性、高血糖症、高胰島素血症、代謝症候群X(或症候群X，或胰島素抗性症候群，或雷文氏(Reaven's)症候群，或代謝性心血管風險症候群)、高血壓、慢性疲勞、加速老化、退化性疾病、老化之內分泌不足、Gm1神經節苷脂症、莫爾基奧(Morquio)氏B型疾病、克拉培(Krabbe)氏症、法布瑞(Fabry)氏症、高歇(Gaucher)氏病、戴薩克斯(Tay-Sachs)症、山德霍夫(Sandhoff)氏症、墨角藻糖苷酶缺乏病、碳水化合物代謝疾病(例如肝糖貯積症)、胺基酸代謝疾病(例如苯酮尿症、 楓糖尿症、戊二酸血症第一型)、有機酸代謝疾病(例如黑尿症)、脂肪酸氧化及粒線體代謝之疾病(例如中鏈醯基去氫酶缺乏症)、卟啉代謝疾病(例如急性間歇性紫質症)、嘌呤或嘧啶代謝疾病(例如勒-奈(Lesch-Nyhan)二氏症)、類固醇代謝疾病(例如先天性腎上腺增生)、粒線體功能疾病(例如凱-賽(Kearns-Sayre)二氏症)或過氧化物酶體功能疾病(例如澤爾韋格(Zellweger)症)。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療自體免疫性疾病，包括但不限於選自下列之疾病：胃酸缺乏自體免疫慢性活動性肝炎、急性瀰漫性腦脊髓炎、急性出血性腦白質炎、艾迪森氏(Addison's)症、γ球蛋白血症、γ球蛋白缺乏症、斑禿、肌萎縮性脊髓側索硬化、關節粘連性脊椎炎、抗-GBM/TBM腎炎、抗磷脂症候群、抗合成酶症候群、關節炎、異位性過敏、異位性皮膚炎、再生不良性貧血、自體免疫性心肌病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性內耳疾病、自體免疫性淋巴細胞增生症候群、自體免疫性週邊神經病、自體免疫性胰炎、自體免疫性多內分泌腺病症候群I、II及III型、自體免疫性助孕素皮膚炎、自體免疫性血小板減少性紫瘢症、自體免疫性葡萄膜炎、巴洛(Balo)病/巴洛同心圓性硬化、貝西氏(Bechets)症、柏格爾(Berger's)病、畢氏(Bickerstaffs)腦炎、Blau症候群、大水泡性天皰瘡樣病、卡斯托曼氏(Castleman's)病、慢性疲勞免疫功能異常症候群、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病、慢性復發性多發性 骨髓炎、史格-斯特勞斯(Churg-Strauss)症候群、斑痕性類天皰瘡、乳糜瀉、科剛氏(Cogan)症候群、冷凝集素症、補體成份2缺乏症、顱動脈炎、CREST症候群、克隆(Crohn)氏病、庫欣(Cushing)氏症候群、皮膚白細胞破碎性血管炎、迪哥氏(Dego's)病、皰疹樣皮膚炎、皮肌炎、第一型糖尿病、瀰漫性皮膚系統性硬化症、德雷斯勒(Dressler's)症候群、盤狀紅斑性狼瘡、濕疹、附著點炎相關性關節炎、嗜酸性筋膜炎、獲得性大包性表皮鬆解、結節性紅斑、本態性混合型冷球蛋白血症、伊凡氏(Evan's)症候群、進行性骨化性纖維發育不良、纖維肌炎、纖維化肺泡炎、胃炎、胃腸類天皰瘡、巨細胞動脈炎、肺出血腎炎綜合症(Goodpasture's syndrome)、葛瑞夫茲(Graves')病、格巴二氏(Guillain-Barre)症候群(GBS)、橋本氏(Hashimoto's)腦炎、橋本氏(Hashimoto's)甲狀腺炎、溶血性貧血、過敏性紫瘢症(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、休斯(Hughes)症候群(或抗磷脂症候群)、低γ球蛋白血症、自發性發炎脫髓鞘疾病、自發性肺纖維化、自發性血小板減少性紫瘢症、IgA腎病(或柏格爾(Berger's)病)、內含體肌炎、脫髓鞘性多發性神經病、幼年型自發性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力症候群、白細胞破碎性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線狀IgA病(LAD)、盧伽雷氏(Lou Gehrig's)病、類狼瘡性肝炎、紅斑性狼瘡、馬吉德(Majeed)症候群、梅尼爾氏(Meniere's)病、顯微性多血管 炎、米勒-費雪(Miller-Fisher)症候群、混合性結締組織疾病、穆夏-哈柏曼(Mucha-Habermann)病、穆-魏(Muckle-Wells)二氏症候群、多發性骨髓瘤、重症肌無力、肌炎、嗜睡症、視神經脊髓炎(又名戴維克(Devic's)氏病)、眼部斑痕性類天皰瘡、歐氏(Ord)甲狀腺炎、反覆性風濕症、PANDAS(合併鏈球菌感染之兒童自體免疫性神經精神異常)、副腫瘤性小腦變性、副腫瘤性小腦變性、帕里-榮伯(Parry Romberg)症候群、帕森-透納(Parsonnage-Turner)症候群、天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、靜脈周圍性腦脊髓炎、POEMS症候群、結節性多動脈炎、風濕性多肌痛、多肌炎、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、壞疽性膿皮病、純紅血球再生不良、羅氏(Rasmussen's)腦炎、雷諾氏(Raynaud)徵候群、復發性多軟骨炎、瑞特氏(Reiter's)症候群、後腹膜腔纖維化、類風溼性關節炎、類風濕性熱、施密特(Schmidt)症候群、施尼茨勒(Schnitzler)症候群、鞏膜炎、脊椎關節病、黏血症候群、史迪爾(Still)氏病、亞急性細菌性心內膜炎(SBE)、蘇沙茨(Susac's)症候群、史威特(Sweet)氏症候群、席登罕氏(Sydenham)舞蹈症、交感性眼炎、高安(Takayasu)氏動脈炎、顳動脈炎、托-杭(Tolosa-Hunt)二氏症候群、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、未分化結締組織病、未分化脊柱關節病、血管炎、華格納(Wegener)氏肉芽腫病、威爾森氏(Wilson's)症候群及威斯科特-奧德里奇(Wiskott-Aldrich)氏症候群。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療眼疾病，包括但不限於選自下列之疾病：青光眼包括開角型青光眼(例如原發性開角型青光眼、色素性青光眼、剝落性青光眼、低眼壓青光眼)、隅角閉鎖型青光眼(臨床上又名閉角型青光眼、狹角型青光眼、瞳孔阻滯型青光眼及睫狀肌阻滯型青光眼)(例如急性隅角閉鎖型青光眼及慢性隅角閉鎖型青光眼)、無虹膜性青光眼、先天性青光眼、少年型青光眼、水晶體引發之青光眼、新生血管性青光眼(例如使用包含血管內皮生長因子(VEGF)誘餌、色素衍生性生長因子(PDGF)、內皮抑素、血管抑素或血管生成素-1之載體)、創傷後青光眼、類固醇誘發之青光眼、史德格-韋伯(Sturge-Weber)症候群青光眼、葡萄膜炎誘發之青光眼、糖尿病視網膜病(例如使用包含VEGF誘餌、PDGF、內皮抑素、血管抑素或血管生成素-1之載體)、黃斑變性(例如包含VEGF誘餌、PDGF、內皮抑素、血管抑素、血管生成素-1、ATP結合卡匣亞家族A成員4之載體)、黃斑變性(例如使用包含VEGF誘餌、PDGF、內皮抑素、血管抑素、血管生成素-1、ATP結合卡匣亞家族A成員4之載體)、脈絡膜血管新生(例如使用包含VEGF誘餌、PDGF、內皮抑素、血管抑素或血管生成素-1之載體)、血管滲漏及/或視網膜水腫、細菌性結膜炎、真菌性結膜炎、病毒性結膜炎、葡萄膜炎、角膜後沉降物、黃斑水腫(例如使用包含VEGF誘餌、PDGF、內皮抑素、血管抑素或血管生成素-1之載體)、眼內水晶體植入後發炎反 應、葡萄膜炎症候群(例如慢性虹膜睫狀體炎或慢性眼內炎)、視網膜血管炎(例如於類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、系統性紅斑性狼瘡、進行性全身性硬化症、結節性多動脈炎、華格納(Wegener)氏肉芽腫病、顳動脈炎、貝賽特氏(Adamantiades Bechcet)症、修格連(Sjogren)氏症、復發性多軟骨炎及HLA-B27相關性脊柱炎)、類肉瘤病、伊爾斯(Eales)氏病、急性視網膜壞死、原田氏(Vogt Koyanaki Harada)症、眼弓蟲病、放射線視網膜病、增生性玻璃體視網膜病、眼內炎、眼性青光眼(例如發炎性青光眼)、視神經炎、缺血性視神經病(例如包含同素異位NADH去氫酶單位4)、甲狀腺相關性眼眶病、眼眶假性腫瘤、色素分散症候群(色素性青光眼)、鞏膜炎、表層鞏膜炎脈絡膜病(例如「白點」症候群包括但不限於急性多發性後部鱗狀細胞)、視網膜病(例如囊樣黃斑水腫、中心性漿液性脈絡膜病及疑似眼組織漿菌症候群(例如包含膠質細胞源性親神經因子周邊素-2之載體))、視網膜血管疾病(例如糖尿病性視網膜病、柯氏(Coat's)病及視網膜動脈大動脈瘤)、視網膜動脈阻塞、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變、色素性視網膜炎(例如包含視網膜色素特異性65kDa蛋白之載體)、家族滲出性玻璃體視網膜病(FEVR)、自發性息肉狀脈絡膜血管病、視網膜前黃斑膜或白內障。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療血液疾病，包括但不限於選自下列之血液疾病：貧血、 出血及凝血疾病(例如瀰漫性血管內凝血(DIC)、血友病、亨-舍(Henoch-Schonlein)二氏紫瘢症、遺傳性出血性微血管擴張症候群、血小板減少(ITP、TTP)、血栓好發症、馮威里氏(Von Willebrand's)症)、白血病(例如急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓細胞性白血病)、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)、骨髓增生性疾病(例如骨髓纖維化、真性紅血球增多症、血小板增多症(thrombocythemia))、漿細胞疾病(例如大球蛋白血症、臨床意義未知之單株球蛋白症、多發性骨髓瘤)、脾疾病、白血球疾病(例如嗜鹼性球異常、嗜酸性球異常、淋巴細胞減少、單核球異常、嗜中性球減少、嗜中性白血球增多症)、血栓形成、深靜脈血栓形成(DVT)、血色素沉著病、月經過多、鐮狀細胞病或地中海貧血。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療神經性疾病，包括但不限於選自下列之神經性疾病：高歇(Gaucher)氏病、帕金森氏症、阿茲海默(Alzheimer)氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)、多發性硬化症(MS)、亨丁頓氏病、弗來德利希氏(Fredrich's)共濟失調、輕微認知障礙、大腦澱粉樣血管病變、帕金森氏病、路易氏(Lewy)體病、額顳癡呆(FTD)、多發性系統退化症(MSA)、進行性核上眼神經麻痺、移動疾病(包括共濟失調、腦性麻痺、舞蹈指痙病、肌肉緊張不全、妥瑞氏症、核黃疸)、顫抖疾病、白質失養症(包括腎上腺白質失養 症、異染性白質失養症、腦白質海綿狀變性、亞歷山大(Alexander)症、佩梅(Pelizaeus-Merzbacher)病)、神經元蠟樣脂褐質沉著疾病、共濟失調微血管擴張症候群、雷特氏(Rett)症候群、α-共核蛋白病(例如路易氏(Lewy)體病、多發性系統退化症、哈-斯(Hallervorden-Spatz)二氏病或額顳癡呆)、尼曼-匹克(Niemann-Pick)氏C型疾病(NPCD)、脊髓小腦萎縮症第一、二及三型或齒狀核紅核蒼白球萎縮症(DRLPA)。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療肺疾病，包括但不限於選自下列之肺疾病：氣喘、肺膨脹不全、支氣管炎、COPD(慢性阻塞性肺病)、肺氣腫、肺癌、間皮瘤、肺炎、石綿沉著病、麴菌腫、麴菌病、急性侵入性麴菌病、支氣管擴張、阻塞性細支氣管炎機化性肺炎(BOOP)、嗜酸性球性肺炎、壞死性肺炎、胸膜積液、塵肺症、氣胸、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著症、肺炭疽、肺動靜脈畸形、肺纖維化、肺栓塞、肺組織細胞增多症X(嗜酸性肉芽腫)、肺高血壓、肺水腫、肺出血、肺土壤絲菌病、肺結核病、肺靜脈閉塞性疾病、類風濕性肺病、類肉瘤病、放射性纖維化、高敏感性肺炎、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、嬰兒呼吸窘迫症候群、自發性肺纖維化、自發性間質性肺炎、淋巴管平滑肌增生症、肺蘭格罕(Langerhans')細胞組織球增多症、肺泡蛋白沉著症、鼻竇炎、扁桃腺炎、中耳炎、咽炎、喉炎、肺錯構瘤、游離肺、先天囊腫性腺瘤樣畸形(CCAM)或囊腫性纖維化。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療風濕性疾病，包括但不限於選自下列之風濕性疾病：系統性紅斑性狼瘡、皮肌炎、硬皮病、系統性壞死性動脈炎、表皮壞死性小靜脈炎、類風溼性關節炎、修格連(Sjogren)氏症候群、雷諾氏(Raynaud)徵候群、瑞特氏(Reiter's)症候群、關節炎、牛皮癬性關節炎、血清陰性脊椎關節病、修格連(Sjogren)氏症候群、全身性硬化症、皮肌炎/多發性肌炎、混合型結締組織病或關節粘連性脊椎炎。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療感染性疾病，包括但不限於選自下列之感染性疾病：真菌性疾病諸如皮癬菌病(例如毛癬菌病、錢癬或圓癬感染)、香港腳、甲溝炎、變色糠疹、紅癬、擦疹、真菌性尿布疹、念珠菌外陰炎、念珠菌龜頭炎、外耳炎、念珠菌症(皮膚及黏膜皮膚)、慢性黏膜念珠菌症(例如鵝口瘡及陰道念珠菌症)、隱球菌症、地絲菌症、毛孢子菌病、麴菌病、青黴菌病、鐮菌症、接合菌病、孢子絲菌病、產色黴菌病、球黴菌症、組織漿菌症、芽生菌病、副球黴菌症、偽端盤吸蟲病、足菌腫、真菌性角膜炎、耳黴菌症、肺囊蟲症及真菌血症、不動桿菌感染、放線菌病、非洲昏睡病、AIDS(後天免疫不全症候群)、阿米巴病、邊蟲病、炭疽、溶血隱密桿菌感染、阿根廷出血熱、蛔蟲病、麴菌病、星狀病毒感染、焦蟲症、蠟樣芽孢桿菌感染、細菌性肺炎、細菌性陰道炎(BV)、桿菌感染、纖毛蟲症、拜林迴 線蟲(Baylisascaris)感染、BK病毒感染、黑色毛幹結節病、人芽囊原蟲感染、包柔氏螺旋體感染、肉毒桿菌症(及嬰兒肉毒桿菌症)、巴西出血熱、布氏桿菌症、伯克氏菌(Burkholderia)感染、布路里(Buruli)潰瘍、卡力西病毒感染(諾羅病毒(Norovirus)及沙波病毒(Sapovirus))、念珠菌症、貓抓病、蜂窩性組織炎、查加斯(Chagas)病(美洲錐蟲病)、軟下疳、水痘、衣原體感染、霍亂、著色芽生菌病、肝吸蟲病、難養芽胞梭菌(Clostridium difficile)、球黴菌症、科羅拉多蜱熱(CTF)、普通感冒(急性病毒性鼻咽炎、急性鼻炎)、庫賈氏(Creutzfeldt-Jakob)病(CJD)、隱球菌症、隱孢子蟲病、皮膚幼蟲移行症(CLM)、登革熱、脆雙核阿米巴症、白喉、裂頭絛蟲病、裂頭絛蟲病、龍線蟲病(Dracunculiasis)、伊波拉出血熱、包蟲病(Echinococcosis)、艾利希體症(Ehrlichiosis)、蟯蟲病(Enterobiasis)(蟯蟲感染)、腸球菌(Enterococcus)感染、腸病毒(Enterovirus)感染、流行性斑疹傷寒(Epidemic typhus)、傳染性紅斑(Erythema infectiosum)、幼兒急疹(Exanthem subitum)、薑片蟲病(Fasciolopsiasis)、片吸蟲病(Fasciolosis)、致死性家族性失眠症(FFI)、絲蟲病(Filariasis)、梭桿菌(Fusobacterium)感染、氣性壞疽(梭菌肌壞死)、地絲菌症(Geotrichosis)、格斯特曼(Gerstmann-Straussler-Scheinker)症候群(GSS)、梨形鞭毛蟲症(Giardiasis)、鼻疽(Glanders)、顎口蟲病(Gnathostomiasis)、淋病(Gonorrhea)、腹股溝肉芽腫 (Granuloma inguinale)(杜諾凡病(Donovanosis))、A群鏈球菌感染、B群鏈球菌感染、流感嗜血桿菌、手足口症(HFMD)、漢他病毒(Hantavirus)肺症候群(HPS)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)感染、溶血性尿毒症候群(HUS)、出血熱伴隨腎症候群(HFRS)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、單純皰疹、組織漿菌症(Histoplasmosis)、鈎蟲感染、人博卡病毒(bocavirus)感染、人尤因氏艾利希體症(ewingii ehrlichiosis)、人顆粒球性邊蟲病(granulocytic anaplasmosis)(HGA)、人顆粒球性邊蟲病(HGA)、人單核球性艾利希體症、人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染、人副流感病毒感染、膜樣絛蟲病(Hymenolepiasis)、EB病毒傳染性單核球增多症(Epstein-Barr Virus Infectious Mononucleosis)(Mono)、流行性感冒(flu)、等孢球蟲病(Isosporiasis)、川崎(Kawasaki)病、角膜炎、金格桿菌(Kingella kingae)感染、庫魯病(Kuru)、拉色熱(Lassa fever)、退伍軍人症(Legionellosis)(退伍軍人病)、退伍軍人症(龐提亞克熱(Pontiac fever))、利什曼病(Leishmaniasis)、痳瘋病(Leprosy)、鉤端螺旋體病(Leptospirosis)、李斯特菌症(Listeriosis)、萊姆病(萊姆包柔氏螺旋體病)、淋巴性絲蟲病(象皮病(Elephantiasis))、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎(Lymphocytic choriomeningitis)、瘧疾(Malaria)、馬堡病毒出血熱(Marburg hemorrhagic fever)(MHF)、麻疹、類鼻疽(Melioidosis)(惠特莫爾氏(Whitmore's)病)、腦膜炎、腦膜 炎球菌病、後殖吸蟲病(Metagonimiasis)、微孢子蟲病(Microsporidiosis)、傳染性軟疣(MC)、腮腺炎、斑疹傷寒(Murine typhus)(地方性斑疹傷寒(Endemic typhus))、黴漿菌肺炎(Mycoplasma pneumonia)、足菌腫(Mycetoma)、蠅蛆病(Myiasis)、新生兒結膜炎(新生兒眼炎)、(新)變異型庫賈氏(Creutzfeldt-Jakob)病(VCJD、nvCJD)、土壤絲菌病(Nocardiosis)、盤尾絲蟲病(Onchocerciasis)(河盲症)、副球黴菌症(Paracoccidioidomycosis)(南美芽生菌病(blastomycosis))、並殖吸蟲病(Paragonimiasis)、巴氏桿菌病(Pasteurellosis)、頭蝨病(Pediculosis capitis)(頭蝨)、體蝨病(Pediculosis corporis)(體蝨)、陰蝨病(Pediculosis pubis)(陰蝨、蟹蝨)、骨盆腔發炎(PID)、百日咳(Pertussis)(百日咳(Whooping cough))、鼠疫(Plague)、肺炎球菌感染、肺囊蟲(Pneumocystis)肺炎(PCP)、肺炎、脊髓灰白質炎(Poliomyelitis)、脊髓灰白質炎、普氏菌(Prevotella)感染、原發性阿米巴腦膜腦炎(PAM)、進行性多灶性腦白質病、鸚鵡熱(Psittacosis)、Q熱症、狂犬病、鼠咬熱(Rat-bite fever)、呼吸系融合細胞病毒感染、鼻孢子蟲病(Rhinosporidiosis)、鼻病毒(Rhinovirus)感染、立克次體(Rickettsial)感染、立克次體痘(Rickettsialpox)、瑞夫特河谷熱(Rift Valley fever)(RVF)、落磯山斑疹熱(Rocky mountain spotted fever)(RMSF)、輪狀病毒(Rotavirus)感染、風疹(Rubella)、沙門氏菌症(Salmonellosis)、SARS(嚴重急性呼吸系統症候群)、疥瘡(Scabies)、血吸蟲 病(Schistosomiasis)、敗血症、志賀桿菌病(Shigellosis)(桿菌性痢疾)、帶狀皰疹(Shingles)(Herpes zoster)、天花(Smallpox)(Variola)、孢子絲菌病(Sporotrichosis)、金黃葡萄球菌食物中毒、金黃葡萄球菌感染、類圓線蟲病(Strongyloidiasis)、梅毒(Syphilis)、絛蟲病(Taeniasis)、破傷風(tetanus)(Lockjaw)、鬚癬(Tinea barbae)(Barber's itch)、頭癬(Tinea capitis)(頭皮之錢癬)、體癬(Tinea corporis)(身體之錢癬)、股癬(Tinea cruris)(Jock itch)、手癬(Tinea manuum)(手部錢癬)、黑糠疹(Tinea nigra)、甲癬(Tinea ungumm)(甲真菌病(Onychomycosis))、花斑癬(Tinea versicolor)(變色糠疹(Pityriasis versicolor))、蛔蟲症(Toxocariasis)(內臟幼蟲移行症(VLM))、弓蟲病(Toxoplasmosis)、旋毛蟲病(Trichinellosis)、滴蟲病(Trichomoniasis)、鞭蟲病(Trichuriasis)(鞭蟲感染)、結核病、兔熱病(Tularemia)、尿素黴漿菌(Ureaplasma urealyticum)感染、委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)、委內瑞拉出血熱(Venezuelan hemorrhagic fever)、病毒性肺炎、西尼羅河熱(West Nile Fever)、白色毛幹結節病(White piedra)(白癬(Tinea blanca))、假結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)感染、耶爾森氏菌症(Yersiniosis)、黃熱病(Yellow fever)或接合菌病(Zygomycosis)。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於哺乳動物以治療一或多種疾病。在一態樣中，該哺乳動物係 人。在另一態樣中，該哺乳動物係非人動物。可輕易地考慮各種可利用本發明之揭示治療之疾病。這些疾病包括但不限於慢性腎疾病、骨關節炎、腫瘤、病毒性上呼吸道感染、貓漿細胞口腔炎、貓嗜酸性肉芽腫、貓白血病毒感染、犬瘟熱感染、系統性真菌感染、心肌病、黏多醣症VII型或感染性疾病。
在一態樣中，本發明所治療之疾病係動物之感染性疾病，該感染性疾病包括但不限於牛呼吸道疾病、豬呼吸道疾病、禽流感、雞傳染性支氣管炎、牛海綿狀腦病、犬利什曼病、慢性消耗性疾病、人免疫不全病毒(HIV)、肝炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、古典型豬瘟、包蟲病、地方性肺炎、FIP、口蹄疫、肺腺瘤病、梅迪-威司奈(Maedi-Visna)病、動物之乳房炎、犬小孢子菌症、羊傳染性口瘡(動物疾病)、小反芻獸疫、痘病、鸚鵡喙羽症、狂犬病、地中海熱(布氏桿菌病)或班格(Bang)氏病或波型熱、馬爾他熱、傳染性流產、流行性流產、沙門氏菌食物中毒、腸型副傷寒、桿菌性痢疾、假結核病、鼠疫、瘟疫性熱病、結核病、弧菌症、轉圈病、魏(Weil)氏病(鉤端螺旋體病)或犬鉤端螺旋體熱、出血性黃疸(出血性黃疸螺旋體)、乳品工人熱(哈特焦螺旋體)、回歸熱、蜱媒回歸熱、螺旋體熱、流浪熱、飢荒熱、萊姆關節炎、班沃爾夫(Bannworth)氏症候群(萊姆病)、蜱媒腦膜多發神經炎、慢性遊走性紅斑、弧菌症、大腸桿菌症、大腸桿菌毒血症、白痢、豬腸水腫、腸型副傷寒、葡萄球菌性消化道中毒、 葡萄球菌性胃腸炎、犬冠狀病毒(CCV)或犬小病毒腸炎、貓傳染性腹膜炎病毒、傳染性胃腸炎(TGE)病毒、豪(Hagerman)氏紅口病(ERMD)、傳染性造血組織壞死病(IHN)、豬放線桿菌(嗜血桿菌)胸膜肺炎、漢森(Hansen)氏病、鏈絲菌病、綿羊黴菌性皮炎、假鼻疽、惠特莫爾(Whitmore)氏病、弗朗西斯(Francis)氏病、鹿蠅熱、兔熱病、歐哈拉(O'Hara)氏病、鏈狀桿菌熱、哈弗希耳(Haverhill)熱、流行性關節紅斑、鼠咬熱、船運或運輸熱、出血性敗血症、鸚鵡病、鸚鵡熱、披衣菌症、北美芽生菌病、芝加哥病、吉爾克里斯(Gilchrist)氏病、貓抓熱、良性淋巴網狀內皮細胞增多、良性非細菌性淋巴腺炎、桿菌性血管瘤病、桿菌性紫斑性肝炎、Q熱症、巴爾幹流感(Balkan influenza)、巴爾幹流感(Balkan grippe)、屠宰場熱、蜱媒熱、肺立克次體病、美洲蜱斑疹傷寒、蜱媒斑疹傷寒熱、水泡性立克次體病、英國皇家植物園斑點熱、蚤媒斑疹傷寒熱、地方性斑疹傷寒熱、都市斑疹傷寒、錢癬、皮癬菌病、癬、髮癬菌病、小孢子菌病、股癬、香港腳、申克氏抱子絲菌、二形真菌、隱球菌症及組織漿菌症、良性表皮猴痘、BEMP、猿猴皰疹病毒、猿猴B病毒病、C型昏睡性腦炎、黃熱病、黑吐病、漢他病毒肺症候群、韓國出血熱、流行性腎病、流行性出血熱、出血性腎病腎炎、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、委內瑞拉馬腦炎、加州腦炎/拉克羅斯腦炎、非洲出血熱、綠色猴病、恐水症、狂犬病、傳染性肝炎、流行性肝炎、流行性黃 疸、紅疹、麻疹、豬流感、馬流感、雞瘟、新城病、梨漿蟲病、弓蟲病、非洲睡眠病、剛比亞錐蟲病、羅德西亞錐蟲病、查加斯氏病、查加斯-馬沙氏病、南美錐蟲病、溶組織內阿米巴、小袋蟲痢疾、隱孢子蟲病、梨形鞭毛蟲症、皮膚利什曼病：樹膠工人潰瘍、鼻咽黏膜利什曼病、pianbols、uta及buba(美洲)、東方瘡、東方癤(舊世界)、巴格達癤、新德里癤、包魯潰瘍、臟器利什曼病：黑熱病、微孢子蟲病、胃線蟲症、旋毛蟲病、血管圓線蟲病、嗜酸性腦膜炎或腦膜腦炎(廣東住血線蟲)、腹部血管圓線蟲病(哥斯大黎加住血線蟲)、鉤蟲病、板口線蟲病、鈎蟲病、毛細線蟲病、馬來絲蟲病、蛔蟲症、結節線蟲病、類圓線蟲病、毛圓線蟲病、雞蛔蟲症、裂頭絛蟲病、動裂頭條蟲症、包蟲囊病、棘球蚴病、顆粒性包蟲病(Echinococcus granulosis)、囊型包蟲病、絛蟲感染、住血吸蟲(Schistosoma)及該類似疾病。
亦考慮治療由感染性病原體造成之惡性疾病。該等疾病之實例包括但不限於骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、由EBV造成之伯奇(Burkitt)氏淋巴瘤、由勞氏(Rous)逆轉錄病毒造成之勞氏肉瘤、由第8型皰疹病毒造成之卡波西(Kaposi)肉瘤、由HTLV-I逆轉錄病毒造成之成人T細胞白血病或由HTLV-II造成之髮樣細胞白血病及許多其他由感染原及病毒造成之腫瘤及白血病。
在一實施態樣中，該一或多種用於治療上述一或多種疾病之蛋白質包括但不限於紅血球生成素、飢餓素、骨保 護因子、RANKL、RANKL誘餌、TNF-α拮抗劑、IL-1拮抗劑、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、血管抑素、內皮抑素、TNF-α、PP1DCY-LSRLOC、β-尿苷酸酶及IL-12。在另一實施態樣中，本發明之一或多種蛋白質包括但不限於IL-1、IL-2、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL10R DN或彼之次單位、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IFN-α 1、IFN α 2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、CXCL1(MGSA-α)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防禦素、HMGB1、Flt3L、IFN-β、TNF-α、dnFADD、BCG、TGF-α、PD-L1 RNAi、PD-L1反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L及S100。
在一實施態樣中，投予至罹患一或多種該揭示疾病之哺乳動物之載體係腺病毒載體。在一實施態樣中，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸。在一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。在另一實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物。在一態樣中，該配體係二醯基肼。在另一態樣中，該 配體係選自RG-115819、RG-115932或RG-115830。在又一態樣中，該配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
在另一實施態樣中，本發明可被用於哺乳動物以治療一或多種溶酶體貯積病。在一態樣中，該哺乳動物係人。在另一態樣中，該哺乳動物係非人動物。可經本發明治療之溶酶體貯積病之實例包括但不限於龐貝(Pompe)氏症/肝糖貯積症II型、高歇(Gaucher)氏病(I型、II型、III型)、法布瑞(Fabry)氏症、黏多醣症II型(韓特(Hunter)氏症候群)、黏多醣症VI型(馬-拉(Maroteaux-Lamy)二氏症候群)、黏多醣症I型、異染性白質失養症、神經元蠟樣脂褐質貯積症或CLN6病(非典型晚期嬰兒型、晚發變異型、早期少年型、芬蘭變異晚期嬰兒型CLN5、詹-比(Jansky-Bielschowsky)二氏病/晚期嬰兒型CLN2/TPP1病、庫夫斯(Kufs)/成年發生型NCL/CLN4病、北方癲癇型/變異晚期嬰兒型CLN8、聖-霍(Santavuori-Haltia)二氏/嬰兒型CLN1/PPT病、β-甘露糖症)、巴-斯-沃(Batten-Spielmeyer-Vogt)三氏/少年型NCL/CLN3病、A型聖菲利普(Sanfilippo)症候群、B型聖菲利普症候群、C型聖菲利普症候群、D型聖菲利普症候群、MPSI賀勒(Hurler)氏症候群、尼曼-匹克(Niemann-Pick)病(A型、B型、C型、D型)、活化物缺乏/GM2神經節苷脂症、α-甘露糖症、天冬胺醯基葡萄糖胺尿、膽甾烯基酯貯積症、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱胺酸病、戴南(Danon)氏病、法伯(Farber)氏病、墨角藻糖苷酶缺乏病、半乳糖唾液酸酶缺乏病(哥德 堡(Goldberg)症候群)、GM1神經節苷脂症(嬰兒型、晚期嬰兒型/少年型、成年型/慢性)、I-細胞疾病/黏脂症II型、嬰兒期游離唾液酸貯積症/ISSD、少年期己糖胺酶A缺乏症、克拉培(Krabbe)氏病(嬰兒期發生型、晚發型)、黏多醣症(假性賀勒(Hurler)氏多種營養不良症/黏脂症IlIA型、沙伊(Scheie)氏症、MPS I型賀勒-沙伊症候群、莫爾基奧(Morquio)氏症A型/MPS IVA型、莫爾基奧氏症B型/MPS IVB型、MPS IX型玻糖醛酸酶缺乏症、史萊(Sly)氏症(MPS VII型)、黏脂症I型/唾液酸沉積症、黏脂症IIIC型、黏脂症IV型)、多種硫酸脂酶缺乏症、緻密成骨不全症、山德霍夫(Sandhoff)氏症/成年發生型/GM2神經節苷脂症、山德霍夫氏症/GM2神經節苷脂症-嬰兒型、山德霍夫氏症/GM2神經節苷脂症-少年型、辛德勒(Schindler)氏症、扎拉(Salla)氏病、嬰兒型唾液酸貯積症、戴薩克斯(Tay-Sachs)症/GM2神經節苷脂症、沃爾曼(Wolman)氏症、天冬胺醯基葡萄糖胺尿及鞘脂激活蛋白原。
應了解A型聖菲利普(Sanfilippo)症候群係與A型聖菲利普症候群/MPS IlIA同義、B型聖菲利普症候群係與B型聖菲利普症候群/MPS IlIB同義、C型聖菲利普症候群係與C型聖菲利普症候群/MPS IlIC同義、D型聖菲利普症候群係與D型聖菲利普症候群/MPS IlID同義。
在一實施態樣中，由本發明之載體表現以用於治療上述一或多種溶酶體貯積病之該一或多種蛋白質包括但不限於a-半乳糖苷酶A、芳基硫酸酯酶A、a-葡萄糖苷酶、b- 葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、CLN6蛋白質、少年相關性CLN3、N-硫葡萄糖胺硫水解酶(SGSH)、a-N-乙醯葡萄糖胺酶、乙醯輔酶A-葡萄胺糖苷乙醯基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸脂酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸脂酶B、酸性神經鞘磷脂酶及艾杜糖醛酸硫酸脂酶。
在一實施態樣中，投予至罹患一或多種該揭示溶酶體貯積病之哺乳動物之載體係腺病毒載體。在一實施態樣中，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸。在一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。在另一實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物。在一態樣中，該配體係二醯基肼。在另一態樣中，該配體係選自RG-115819、RG-115932或RG-115830。在又一態樣中，該配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
在另一實施態樣中，本發明可被用於哺乳動物以治療一或多種肝臟疾病。在一態樣中，該哺乳動物係人。在另一態樣中，該哺乳動物係非人動物。在一態樣中，該肝臟疾病係B型肝炎。在另一態樣中，該肝臟疾病係C型肝炎。在一實施態樣中，由本發明之載體表現之蛋白質係IFN-α。在另一實施態樣中，由本發明之載體表現以用於治療上述一或多種肝臟疾病之蛋白質包含銅藍血漿蛋白。
用於B型及C型肝炎病毒感染及治療之人肝臟嵌合 性小鼠模型之非限制性實例係揭示於Bissig,K.D.et al.,J.Clin.Investigation 120：924(2010)。另一人肝細胞模型之非限制性實例係YecurisTM(奧勒岡州波特蘭市)之人化小鼠系統。
用於評估抗病毒/抗感染治療之腦炎模型的非限制性實例係揭示於O'Brien,L.et al.,J.General Virology 90：874-882(2009)。
用於評估抗病毒/抗感染治療之流感模型之非限制性實例係揭示於Beilharz,M.W.et al.,Biochemical Biophysical Research Communications 355：740-744(2007)及Koerner,I.et al.,J.Virology 81：2025-2030(2007)。
在一實施態樣中，投予至罹患一或多種該揭示肝臟疾病之哺乳動物之載體係腺病毒載體。在另一實施態樣中，該載體不是腺病毒載體。在另一實施態樣中，該載體係質體。在一實施態樣中，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸。在一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。在另一實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物。在一態樣中，該配體係二醯基肼。在另一態樣中，該配體係選自RG-115819、RG-115932或RG-115830。在又一態樣中，該配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
本發明提供經工程化之細胞例如免疫細胞及TSC以條件性表現具有免疫調節劑及可任意選擇地IL-12之功能的蛋白質，且該蛋白質具有用於治療癌或腫瘤或二者之治療性用途及/或應用。經活體外工程化以條件性表現具有免疫調節劑及可任意選擇地IL-12之功能的蛋白質之免疫細胞及TSC相較於組成性產製蛋白質係更為安全。此外，控制免疫調節劑及可任意選擇地IL-12之表現的時間及量之能力提供對治療效果更好的控制。因此，經活體外工程化之免疫細胞及TSC可經調製為醫藥組成物以作為治療人或非人有機體之癌或腫瘤的治療劑。或者，經活體外工程化之免疫細胞群、TSC群或彼等之子群可被用來作為載具以條件性傳遞免疫調節劑及可任意選擇地IL-12蛋白產製至人或非人有機體之身體的特定區域(正常組織、癌或腫瘤)。該免疫細胞可為自體或非自體樹突細胞。該樹突細胞可自骨髓或週邊血液循環分離。在人病患中，樹突細胞群可經白血球分離術分離，其中白血球組分係經分離及移除，其他血液成份再輸入病患體內。
在另一實施態樣中，該樹突細胞可藉由以本發明之載體轉染人造血幹細胞，該載體表現具有免疫調節劑之功能的蛋白質及可任意選擇地具有IL-12之功能的蛋白質，接著使該經轉染之幹細胞分化以產生樹突細胞加以製備。見美國第6,734,014號專利。
在一實施態樣中，本發明提供包含基因開關之核酸腺病毒載體，其中由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)序列 分開之VP16-RXR及GaI4-EcR編碼序列被插入由人泛素C啟動子控制之腺病毒穿梭載體。舉例來說，被IRES序列分開且置於合成性誘導性啟動子控制下之IL12的次單位p40及p35之編碼序列被插入泛素C啟動子之上游。在另一實例中，置於合成性誘導性啟動子控制下之TNF-α之編碼序列被插入泛素C啟動子之上游。
在另一實施態樣中，本發明提供攜帶二個融合蛋白及誘導性IL-12或TNF-α次單位之轉錄單位(VP16-RXR及Gal4-EcR)的穿梭載體，該載體與大腸桿菌(E.coli)BJ5183細胞中之腺病毒骨架(AdEasy1)重組。在確認重組克隆(recombinant clone)之後，攜帶rAd.RheoIL12基因組之質體係於XL10-Gold細胞中生長並自其純化，在消化該質體骨架後，藉由轉染至HEK 293細胞或CHO細胞加以包裝。
純化載體以提高濃度可藉由任何適當之方法完成，諸如藉由密度梯度純化(例如氯化銫(CsCl))或藉由層析技術(例如管柱或分批層析)。舉例來說，本發明之載體可進行二或三個CsCl密度梯度純化步驟。載體例如複製缺陷型腺病毒載體係刻意地自受到該複製缺陷型腺病毒載體感染之細胞純化，所採用之方法包含溶解經腺病毒感染之細胞，將溶解物加至層析樹脂，自該層析樹脂洗脫腺病毒，及收集包含腺病毒之組分。
在特定實施態樣中，該形成之原始病毒保存液係藉由再感染HEK 293細胞或CHO細胞加以擴增，及藉由CsCl 密度梯度離心加以純化。
在一實施態樣中，該免疫調節劑例如TNF-α及/或IL-12基因係野生型基因序列。在另一實施態樣中，該免疫調節劑例如TNF-α及/或IL-12基因係經修飾之基因序列，例如嵌合性序列或經修飾以使用較佳密碼子之序列。
在一實施態樣中，該免疫調節劑例如TNF-α及/或IL-12基因係人野生型序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人序列有至少85%之一致性，例如與野生型人序列有至少90%、95%或99%之一致性。在其他實施態樣中，該基因序列編碼人多肽。在另一實施態樣中，該基因編碼與野生型人多肽有至少85%一致性之多肽，例如與野生型人多肽有至少90%、95%或99%之一致性。
在一實施態樣中，該IL-12基因係野生型小鼠IL-12序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型小鼠IL-12有至少85%之一致性，例如與野生型小鼠IL-12有至少90%、95%或99%之一致性。在其他實施態樣中，該IL-12基因序列編碼小鼠IL-12多肽。在另一實施態樣中，該基因編碼與野生型小鼠IL-12有至少85%一致性之多肽，例如與野生型小鼠IL-12有至少90%、95%或99%之一致性。
DC可自人、小鼠或其他哺乳動物之骨髓分離。樹突細胞可自人、小鼠或其他哺乳動物之血液分離。在人病患中，樹突細胞群可經該領域已知之白血球分離術分離，其中白血球組分係經分離及移除，其他血液成份再輸入病患 體內。在一實施態樣中，DC係如前所述之源自鼠骨髓(Tatsumi et al.,2003)。簡言之，野生型或EGFP Tg小鼠骨髓(BM)係於添加1000單位/毫升重組鼠顆粒球/巨噬細胞集落刺激因子及重組m1L-4(Peprotech,Rocky Hill,NJ)之條件培養基(CM)中，於37℃、潮濕、5% CO2培養箱中培養7天。CD11c+ DC接著利用例如特定MACSTM珠，按照廠商說明(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)加以分離。以此方式產生之CD11c+ DC在形態學上之純度>95%，並共同表現CD11b、CD40、CD80及第I及II型MHC抗原。
本發明之一實施態樣提供條件性表現具有免疫調節劑及可任意選擇地IL-12之功能的蛋白質之經工程化之免疫細胞及TSC，該經工程化之免疫細胞及TSC適合作為治療人或非人有機體之癌或腫瘤或二者之基因療法的治療性應用。在一實施態樣中，本發明提供包含基因開關之經工程化之免疫細胞及TSC。
在另一實施態樣中，本發明提供包含至一部分之蛻皮激素受體之經工程化之免疫細胞及TSC。在另一實施態樣中，本發明提供包含蛻皮激素受體基底基因開關之經工程化之免疫細胞及TSC。在另一實施態樣中，本發明提供包含RheoSwitch之經工程化之免疫細胞及TSC。在另一實施態樣中，本發明提供包含經工程化之免疫細胞及TSC和配體之套組，該免疫細胞及TSC包含基因開關且該配體調控該基因開關。在另一實施態樣中，該套組另包含二醯基肼配體。在另一實施態樣中，該套組另包含RG- 115830或RG-115932。
在一實施態樣中，本發明提供經工程化之免疫細胞群及TSC群。在一實施態樣中，培養第7天之DC係經重組腺病毒處理，該腺病毒編碼由組成性或誘導性啟動子控制之免疫調節劑及/或IL-12，或經各種感染複數(MOI)之對照mock腺病毒載體(rAdψ5)感染。經48小時後，經感染之DC係經收集以分析表型，並利用偵測低限62.5皮克/毫升之特定ELISA套組(BD-PharMingen,San Diego,CA)分析免疫調節劑及/或IL-12之產製。
在另一實施態樣中，本發明提供經活體外工程化之免疫細胞群及TSC群，該等細胞群及TSC群包含具有能夠條件性表現具有免疫調節劑及/或IL-12之功能的蛋白質之基因開關的載體例如DNA載體，且另包含活化配體。在另一實施態樣中，本發明提供治療癌例如黑色素瘤或神經膠質瘤之方法，該方法藉由投予經工程化之DC至病患，然後投予活化配體諸如RG-115819、RG-115830或RG-115932至該病患。在某些實施態樣中，本發明係關於治療癌例如黑色素瘤或前列腺癌之方法，該方法包含投予包含多核苷酸以條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之腺病毒及投予活化配體。該病患可為罹患癌之人或動物。該治療方法及製品、經工程化之細胞、套組及配體具有在人治療及獸醫動物治療中之應用。因此，該等製品及方法被考慮用於人及獸醫動物目的。
因此，在一實施態樣中，該表現免疫調節劑例如 TNF-α之多核苷酸及活化配體被共投至罹癌之病患。該活化配體通常在數天之內投予，例如在投予多核苷酸之前及之後。若發生免疫調節劑例如TNF-α引起之系統性毒性，則該活化配體之投予可被減少或消除以減輕不良反應。
在另一實施態樣中，表現免疫調節劑例如TNF-α之多核苷酸及活化配體被共投至罹患一或多種溶酶體貯積病或一或多種肝臟疾病之病患。該活化配體通常在數天之內投予，例如在投予多核苷酸之前及之後。若出現系統性毒性，則該活化配體之投予可被減少或消除以減輕不良反應。
在某些實施態樣中，本發明提供一種減少腫瘤大小之方法，該方法包含投予腺病毒載體及投予活化配體，該載體包含條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之多核苷酸。本發明亦提供一種防止腫瘤生成之方法，該方法包含投予腺病毒載體及投予活化配體，該載體包含條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之多核苷酸。在一些實施態樣中，本發明提供一種減少或改善一或多種腫瘤疾病之症狀之方法，該方法包含投予腺病毒載體及投予活化配體，該載體包含條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之多核苷酸。特別是，包含條件性表現免疫調節劑之載體例如腺病毒載體之組成物相較於組成性表現該免疫調節劑之載體可減少、預防或改善接受治療之個體的系統性毒性。
在某些實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之一或多種疾病或一或多種溶酶體貯積病或一或多種肝臟疾病之 方法，該方法包含投予腺病毒載體及投予活化配體，該載體包含條件性表現一或多種蛋白質之多核苷酸。在一些實施態樣中，本發明提供用於哺乳動物以減少或改善一或多種疾病或一或多種溶酶體貯積病或一或多種肝臟疾病之一或多種症狀之方法，該方法包含投予腺病毒載體及投予活化配體，該載體包含條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之多核苷酸。
蛋白質基底標籤減少或消除高度特異性轉譯後修飾以供有效標靶之需要。可用之蛋白質基底標籤包括但不限於IGF2R標靶(IGF2(GILT)/IGF2工程化)、運鐵蛋白受體標靶(運鐵蛋白、TfR-標靶肽)、及Tat蛋白(其中細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)媒介Tat之內化)。
其他以溶酶體為標靶而可被用來作為標籤之蛋白質包括但不限於維生素D結合蛋白、葉酸鹽結合蛋白、乳運鐵蛋白、性激素結合球蛋白、運甲狀腺素蛋白、鞘脂激活蛋白原、視網醇結合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、泌乳素、受體相關蛋白(在一實施態樣中不含HNEL序列)、天然運鐵蛋白及突變轉移(例如K225E/R651A突變或K225E/K553A突變)。
在一實施態樣中，表現建構體亦編碼一或多種報告序列、定位標籤序列及檢測標籤序列。另外將了解的是，本發明之組成物或使用該組成物之方法可與任何消除、減少、抑制或控制活體內之腫瘤細胞或腫瘤生長之化學治療劑組合(例如以提供組合式治療方案)。此處之用語「化學 治療劑」係用來指任何經投予以治療或預防活體內腫瘤生長之治療性化合物。特別是，與本發明相容之化學治療劑包含「慣用」之化學治療劑諸如小分子及最近發展之生物劑諸如抗體、細胞介素、反義分子等，該等製劑被用來減少或延緩惡性細胞之生長。
在一態樣中，本發明提供一種適合用於投予至人或非人之醫藥組成物，該醫藥組成物包含經活體外工程化以表現具有免疫調節劑例如TNF-α及/或IL-12之功能的蛋白質之免疫細胞或TSC群或載體例如腺病毒載體，其中該調製劑係適合腫瘤內投予。在另一實施態樣中，組成物例如醫藥組成物包含條件性表現免疫調節劑例如TNF-α之載體。在一些實施態樣中，該組成物包含大約1x105或更多粒子單位(pu)之基因轉移載體。一「粒子單位」係單一載體顆粒。在某些實施態樣中，該組成物包含約1x106粒子單位之基因轉移載體(例如約1x107或更多粒子單位、約1x108或更多粒子單位，或約1x109或更多粒子單位)。在其他實施態樣中，該組成物包含約1x1010或更多pu、1x1011或更多pu、1x1012或更多pu、1x1013或更多pu、1x1014或更多pu、或1x1015或更多pu之基因轉移載體，特別是病毒載體，諸如複製缺陷型腺病毒載體。組成物中所包含之基因轉移載體之粒子單位數可利用任何已知之適當方法測定，諸如此處進一步描述之比較組成物之吸光度與基因轉移載體之標準溶液(即已知基因轉移載體濃度之溶液)的吸光度。
本發明另提供包含活化配體諸如RG-115819、RG-115830或RG-115932之醫藥組成物，其中該組成物係適合腹膜內、經口或皮下投予。
本發明之組成物例如包含經工程化之DC、載體(例如腺病毒載體)或活化配體之組成物可另包含醫藥上可接受之載劑。該載劑可為對於經工程化之樹突細胞、基因轉移載體或活化配體而言為適當之任何載劑。組成物之適當載劑係描述於美國第6,225,289號專利。該載劑通常為液體，但亦可為固體，或液體與固體成份之組合。該載劑係刻意地為醫藥上可接受(例如生理或藥學上可接受)之載劑(例如賦形劑或稀釋劑)。醫藥上可接受之載劑係廣為周知且易於使用。載劑之選擇將(至少部份)由該組成物中之特定成份及用於投予該組成物之特定方法決定。該組成物可另包含任何其他適當之成份，特別是為了增強該組成物之穩定性及/或彼之終用途。因此，本發明之組成物有各式各樣之適當調製劑。
適合用於經口投予之調製劑包括(a)液體溶液，諸如有效量之活性成分溶解於稀釋劑中，諸如水、鹽水或柳橙汁，(b)膠囊、小袋或錠劑，各包含呈固體或顆粒形式之預先決定量之活性成分，(c)在適當液體中之懸浮液，及(d)適當之乳液。錠劑形式可包括一或多種乳糖、甘露醇、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠體二氧化矽、交聯羧甲基纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、色素、稀釋劑、緩衝劑、潤濕 劑、保存劑、添味劑及藥學上相容之賦形劑。含錠形式可包含有味道之活性成分，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍，以及包含該活性成分於惰性基質(諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)之錠劑，及除活性成分之外包含該領域已知之賦形劑的乳液、膠及該類似物。
適合經吸入投予之調製劑包括氣霧調製劑。該氣霧調製劑可被置於加壓可接受之推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮及該類似物。它們亦可被調製成未經加壓之製劑，以自噴霧器或霧化器投藥。
適合非經腸投予之調製劑包括水性及非水性之等張無菌注射溶液，該溶液可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調製劑與目標接受者之血液等張之溶質，及可包括懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩定劑及保存劑之水性及非水性無菌懸浮液。該調製劑可存在於單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿及小瓶，且可被儲存於僅需在立即使用前加入無菌液體賦形劑例如水以供注射之冷凍乾燥(凍乾)狀態。臨時性之注射溶液及懸浮液可自無菌粉末、顆粒及先前描述之錠劑種類製備。
適合肛門投予之調製劑可藉由混合該活性成分與各種基質諸如乳化基質或水溶性基質以製備為栓劑。適合陰道投予之調製劑可呈現陰道栓(pessaries)、棉條、乳膏、凝膠、糊料、泡沫或噴霧製劑，該製劑除活性成分以外還包含該領域已知為適當之載劑。
此外，該組成物可包含額外之治療性或生物活性劑。 舉例來說，可包含用於治療特定適應症之治療因子。控制發炎之因子諸如異丁苯乙酸(ibuprofen)或類固醇可為該組成物之一部分，以減少與活體內投予該基因轉移載體及生理緊迫相關之腫脹及發炎。免疫系統抑制劑可與該組成物方法一起投予以減少對該基因轉移載體本身或與疾病相關之任何免疫反應。或者，免疫增強劑可被包含於該組成物中以上調身體對抗疾病之自然防禦。另外，細胞介素可與該組成物一起投予以吸引免疫效應細胞至腫瘤部位。
在此處描述之特定實施態樣中，本發明提供一種治療腫瘤之方法，該方法包含按下列順序之步驟：a.經腫瘤內投予經活體外工程化之免疫細胞或TSC群至哺乳動物；及b.對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體。
在一實施態樣中，該活化配體係在與包含經活體外工程化之免疫細胞或TSC或載體例如腺病毒載體之組成物實質上相同的時間投予，例如在投予該細胞或載體組成物之前或之後的1小時內。在另一實施態樣中，該活化配體係在投予該經活體外工程化之免疫細胞或TSC或載體之後大約24小時或不到24小時之內投予。在又一實施態樣中，該活化配體係在投予該經活體外工程化之免疫細胞或TSC或載體之後大約48小時或不到48小時之內投予。在另一實施態樣中，該配體係RG-115932。在另一實施態樣中，該配體係以大約1至50毫克/公斤/天之劑量投予。在另一實施態樣中，該配體係以大約30毫克/公斤/天之劑量 投予。在另一實施態樣中，該配體係每天投予共7至28天。在另一實施態樣中，該配體係每天投予共14天。在另一實施態樣中，大約1x106至1x108細胞係經投予。在另一實施態樣中，大約1x107細胞係經投予。
在一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現IL-2及IL-12。IL-2對效應性及調節性T、NK及NK-T細胞展現強烈之免疫調節效應。預期在細胞內表現IL-2及IL-12將導致彼此相互上調受體，及藉由分開之傳訊途徑誘發不同但互補之生物效應。也預期IL-2及IL-12之組合將延長免疫刺激之時間及減少細胞之有效劑量以提高動物耐受性。見Dietrich 2002,Wigginton 2002,2001,1996 and Koyama,1997,McDermott and Atkins 2008；Berntsen et al 2008；Tarhini et al 2008；Heemskerk et al 2008；Horton et al 2008。IL-2之多核苷酸序列可得自登記號U25676(人)、NM_008366(小鼠)、NM_204153(雞)及NM_053836(大鼠)。IL-12之多核苷酸序列可得自登記號NM_000882(人IL12A)、NM_002187(人IL12B)、NM_008351(小鼠IL12a)、NM_008352(小鼠IL12b)、NM_213588(雞IL12A)、NM_213571(雞IL12B)、NM_053390(大鼠IL12a)及NM_022611(大鼠IL12b)。SEQ ID NO：13、15、21及23編碼人及小鼠之IL-12及彼之次單位。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現IL-18及IL-12。IL-18誘發IFN-γ產製及促進T輔助細 胞發育及NK活化。此外，IL-18可放大GM-CSF之產製及減少IL-10之產製。預期表現IL-18及IL-12將克服當單獨投予個別細胞介素時觀察到之限制。預期相較於當樹突細胞僅受到個別細胞介素單獨轉導時，在樹突細胞中同時表現IL-12及IL-18將刺激更強烈之腫瘤抗原特異性Th1反應。
腫瘤內注射經工程化以同時分泌IL-12及IL-18之DC媒介最高量之INF-γ生產及完全腫瘤拒絕(Tatsumi 2003)。見Vujanovic,2006。亦見Coughlin,1998,Subleski,206,Tatsumi,2003,and Sabel,2007；Shiratori et al 2007；Lian et al 2007；Iinuma et al 2006。IL-12之多核苷酸序列見上。IL-18之多核苷酸序列可得自登記號U90434(人)、NM_008360(小鼠)、EU747333(雞)及AY258448(大鼠)。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現IL-15及IL-12。IL-15具有和IL-2相同的一些生物活性，因此使得IL-15也可能被用於癌之治療。IL-15刺激NK細胞及經活化之T細胞之增生，且支持效應T細胞之擴增。報告指出IL-15與IL-12協同作用以增強NK細胞產製IFN-γ。Koka,2004；Basak 2008；Lasek et al 2004。在黑色素瘤模型中，腫瘤內投予IL-15及IL-12誘發顯著之腫瘤消退(Lasek 1999)。IL-12之多核苷酸序列見上。SEQ ID NO：11及19編碼人及小鼠IL-15。圖2及4係可被用於表現人及小鼠IL-12及IL-15之表現系統的質體基 因圖。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現IL-21及IL-12。IL-21及彼之受體與IL-2及IL-15享有序列同源性。IL-21促進NK細胞之擴增及成熟。IL-21之生物效應可能與IL-12具協同性，因為以IL-21處理NK細胞導致IL-12受體之顯著上調。此外，IL-21可增進IL-12信號轉導及合作以增加IFN-γ之產生。IL-12之多核苷酸序列見上。IL-21之多核苷酸序列可得自登記號AF254069(人)、NM_021782(小鼠)、NM_001024835(雞)及NM_001108943(大鼠)。SEQ ID NO：6、7、8、9及17編碼人及小鼠之IL-21。SEQ ID NO：1及2係編碼小鼠及人IL-12及IL-21之多核苷酸建構體。圖7及8係可被分別用於表現人及小鼠IL-12及IL-21之表現系統的質體基因圖。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現TNF-α及IL-12。TNF-α係免疫細胞之有效活化子，其媒介抗腫瘤特性。此外，TNF-α可與IL-12協同作用以增進IFN-γ及IL-12受體於T細胞上之表現。在動物試驗中，同時使用IL-12及TNF-α導致DN8+ T細胞之腫瘤浸潤、顯著IFN-γ產生及後續之腫瘤消退。見Sabel,2003,2004,2007,Taniguchi,1998,Lasek,2000；and Xia et al 2008。IL-12之多核苷酸序列見上。編碼TNF-α之多核苷酸序列可得自登記號X02910(人)、NM_013693(小鼠)及BC107671(大鼠)。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現IL-7及IL-12。IL-7係IL-2家族之成員，對T細胞及B細胞之淋巴細胞生成至關重要。IL-7調節初始及記憶CD8+ T細胞之存活及增生之恆定性。IL-7已被證實可增進對抗腫瘤之CTL產生。除此之外，IL-12直接作用在CD8+ T細胞以增進IL-7媒介之增生。另外，有報告指出IL-7及IL-12協同性增強CD8+ T細胞之細胞毒性。Mehrotra,1995；Sharma et al 2003；Tirapu et al 2002.因此，預期IL-7及IL-12共同表現將提供更理想之抗腫瘤反應。編碼IL-12之多核苷酸序列見上。編碼IL-7之多核苷酸序列可得自登記號J04156(人)、NM_008371(小鼠)、NM_001037833(雞)及NM_013110(大鼠)。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現GM-CSF及IL-12。GM-CSF調節造血祖細胞之分化及增生，且專業之抗原表現細胞(APC)諸如樹突細胞之成熟上扮演特別重要的角色。GM-CSF亦增強樹突細胞處理及表現抗原之能力。GM-CSF與IL-12之功能不同，但二者皆在動物試驗中誘發顯著之抗腫瘤反應。預期IL-12(T細胞活化)與GM-CSF(樹突細胞活化)之組合可導致更有效之抗腫瘤免疫性。在動物試驗中，GM-CSF與IL-12治療之組合顯著抑制多種癌模型中之腫瘤生長。Wang,2001；Chang,2007；Jean,2004；Nair,2006；Hill 2002；Small et al 2007.在人試驗中，GM-CSF+IL-12被成功地用於治療骨髓瘤病患，但二種細胞介素之組合作用導致循環B細胞減 少。Rasmussen,2003；Hansson,2007；Abdalla,2007.因此預期GM-CSF及IL-12在單一細胞中之共表現將避免非所欲之系統性反應諸如循環B細胞減少。編碼IL-12之多核苷酸序列見上。GM-CSF之多核苷酸序列可得自登記號M11734(人)、NM_009969(小鼠)、EU520303(雞)、NM_001037660(大鼠Csf2ra)及NM_133555(大鼠Csf2rb)。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現趨化激素(例如CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)或CCL21(6Ckine))及IL-12。趨化激素係在多種發炎及非發炎條件下調節白血球及其他細胞類型之移動及活化的趨化性細胞介素。發炎性細胞介素在發炎及組織傷害中控制白血球之招募。恆定性趨化激素發揮管家之功能，諸如引導白血球(例如樹突細胞)進入及留在二級淋巴器官內以及造血期間之骨髓及胸腺。在動物試驗中，腫瘤內共注射二種分開表現IL-12及CXCL10之腺病毒導致源自CT26鼠結直腸腺癌細胞系之腫瘤結節100%消退。Narvaiza et al.,2000.Emtage et al.,1999描述二種表現IL2及XCL1(淋巴細胞趨化因子)或IL-12及XCL1之雙重重組腺病毒載體。在小鼠之乳房腺癌腫瘤中，腫瘤內注射載體誘發強效之抗腫瘤反應且導致保護性免疫反應。在其他動物試驗中，共轉導表現IL-12及CCL27之腺病毒載體導致腫瘤消退及長 期特異性免疫反應。Gao et al.,2007.因此，預期在本發明中共同表現趨化激素及IL-12將導致協同性抗腫瘤活性。
在另一實施態樣中，樹突細胞係經工程化以條件性表現抗血管生成性細胞介素(例如IP-10及Mig)及IL-12。IP-10及Mig係T細胞及NK細胞之趨化劑，彼等抑制血管生成之能力依賴於NK細胞。動物試驗顯示二種腺病毒(其一表現IP10，另一表現IL-12)之組合療法導致顯著之抗腫瘤協同性。Narvaiza et al.,2000.在其他試驗中，表現IP10或MIG及/或IL-12之腺病毒載體係經腫瘤內投予至乳腺癌及纖維肉瘤之鼠模型。試驗發現，相較於以IP10、MIG、IL-12單獨治療或對照治療之動物，組合投予IP10或MIG與IL-12導致顯著腫瘤消退及增加荷瘤動物之存活時間，其中IP-10及IL12之組合最為有效。Palmer,2001.亦見Mazzolini,2003及Huang 2004。因此預期共同表現抗血管生成性細胞介素與IL-12將導致協同性抗腫瘤活性。
為了證實有效之IL-12-媒介性基因療法，使用條件性cDNA表現系統以允許在腫瘤內注射後不同的時間點開啟免疫細胞或TSC產製免疫調節劑及/或IL-12。根據在C57BL/6小鼠之侵入性B16黑色素瘤模型中的結果，達成下列結論：1)IL-12增加之量係由DC.RheoIL12在活化配體RG-115830存在時分泌，但該配體不存在時不分泌；2)腫瘤內DC.RheoIL12-基底療法係與腫瘤內DC.cIL12-基底療法一樣有效，只要RG-115830在DC注射的24小時內 被投予至治療動物(在更晚的時間點提供配體，使RG-115830療法失敗)；3)IL-12於DC中之表現似乎可延長這些細胞於腫瘤微環境中之存活，並與更多數量之腫瘤內注射DC移動至腫瘤引流之淋巴結有關；及4)與治療結果相關之最強免疫反應係由治療交叉敏化之腫瘤特異性CD8+ T細胞之量而非留在腫瘤微環境中之注射DC之量。整體而言，這些資料顯示DC.ILI2-基底療法可能成功，根據彼等對輸入(交叉敏化)第1型CD8+ T效應細胞而非後續輸出事件之正面影響，諸如注射DC-媒介性招募抗腫瘤T細胞至腫瘤微環境等。
在腫瘤內注射之前，該些細胞(免疫細胞或TSC)可能經因子處理以刺激細胞之活性。舉例來說，該等細胞可能經共同刺激分子之處理，諸如正向共同刺激分子包括OX40L、4-1BBL、CD40、CD40L、GITRL、CD70、LIGHT或ICOS-L或負向共同刺激分子諸如抗-CTLA4、抗-PD-L1或抗-PD-L2抗體。例如，該等細胞(例如免疫細胞或TSC)可能與表現一或多種共同刺激分子之細胞一起培養，例如表現CD40配體分子之J588淋巴瘤細胞。在另一實施態樣中，該等細胞(免疫細胞或TSC)可能經反向免疫抑制劑分子(耐受性抑制劑)之處理，諸如抗-TGF-β抗體(供抑制微環境內之TGF傳訊)、抗-IL10抗體、TGFbRII DN(以抑制在基因改質細胞內之TGF傳訊)、IL-10R DN、dnFADD(以抑制細胞內之細胞死亡途徑)、抗-SOCS1抗體、siRNA或誘餌(以抑制細胞內之抑制性細胞介素傳訊) 或抗-TGFa抗體。
如圖1至8所示之攜帶多核苷酸序列之重組腺病毒係經產製。舉例來說，hIL-21係藉由共轉染經限制酶消化左ITR上游之位點加以線性化之hIL-21表現載體及適當之(例如E3刪除)腺病毒骨架至允許性細胞系諸如HEK293細胞加以製備。攜帶鼠免疫調節劑基因之腺病毒載體被用於轉導鼠樹突細胞或TSC以用於鼠治療模型。以人之治療應用而言，編碼人同源免疫調節劑基因之多核苷酸被插入適當載體。該用於人治療性應用之腺病毒載體係於GMP之條件下生產。用於第III/IV期黑色素瘤病患之治療大綱(臨床試驗)實例如下：此案例之治療涉及腫瘤內注射經腺病毒轉導之樹突細胞及14天之經口投予活化藥物(配體)。進行30天之受試者篩選直到臨床試驗開始前一周。在任何處理程序進行之前，要求每位受試者簽署受試者同意書。計畫主持人將告知所有受試者關於試驗之性質、目的、時間、潛在危險及試驗期間將進行之處理程序，而且受試者之醫療紀錄可能受到FDA檢視。受試者(共16至20名)係經隨機分配至4組。所有組別在第一次經口投予配體後大約3小時，將接受腫瘤內注射最多5x107經轉導之樹突細胞。這4組被投予之配體每日口服劑量不同：例如第1組=0.01毫克/公斤、第2組=0.3毫克/公斤、第3組=1毫克/公斤、第4組=3毫克/公斤。在治療期間，每隔特定時間抽血以評估活化藥物及彼之主要代謝物之單一劑量及穩定狀態藥物動力學。同樣地，在特 定時間點抽血以評估對該病毒載體、RTS成份及腫瘤之體液性及細胞性免疫反應。在特定時間點收集尿液及抽血以進行血清化學、尿液分析及血液學檢查(安全性檢查)。在特定時間點進行腫瘤及/或引流淋巴結生檢以評估轉基因表現及對腫瘤之免疫反應以作為治療之結果。提前終止試驗之條件為病患出現不良反應，並記錄該不良反應。追蹤病患1、2、3及4個月以觀察不良反應及治療結果。
在另一實施態樣中，需要治療腫瘤之個體係(a)經投予經工程化以組成性或條件性表現免疫調節劑例如此處所揭示之免疫調節劑之樹突細胞，及/或(b)組成性或條件性表現免疫調節劑例如此處所揭示之免疫調節劑之載體係經腫瘤內注射至該個體。在一實施態樣中，該樹突細胞係經工程化以表現Ad-免疫調節劑載體，特別是Ad-RTS-免疫調節劑載體。在另一實施態樣中，經腫瘤內注射至個體之載體係Ad-免疫調節劑載體，特別是Ad-RTS-免疫調節劑載體。
在另一實施態樣中，需要治療腫瘤之個體係(a)經投予經工程化以組成性或條件性表現IL-12之樹突細胞，及(b)組成性或條件性表現IL-12之載體係經腫瘤內注射至該個體。在一實施態樣中，該樹突細胞係經工程化以表現Ad-IL-12載體，特別是Ad-RTS-IL-12載體。在另一實施態樣中，經腫瘤內注射至個體之載體係Ad-IL-12載體，特別是Ad-RTS-IL-12載體。
在另一實施態樣中，需要治療腫瘤之個體係(a)經投予 經工程化以組成性或條件性表現IL-12之樹突細胞，及(b該個體係經投予一或多種抗癌化學治療劑。在一實施態樣中，該經工程化之樹突細胞係經工程化以表現Ad-IL-12載體，特別是Ad-RTS-IL-12載體。該一或多種抗癌化學治療劑可在投予該經工程化之樹突細胞之前、在投予該經工程化之樹突細胞之後、或在投予該經工程化之樹突細胞之同時投予。在另一實施態樣中，該抗癌化學治療劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)、太平洋紫杉醇衍生物或類似物、替莫唑胺(temozolomide)、替莫唑胺衍生物或類似物、舒尼替尼(sunitinib)、舒尼替尼衍生物或類似物、吉西他濱(gemcitabine)、或吉西他濱衍生物或類似物。
在另一實施態樣中，需要治療腫瘤之個體係(a)經投予經工程化以組成性或條件性表現IL-12之樹突細胞，及(b)組成性或條件性表現IL-12之載體係經腫瘤內注射至該個體，及(c)該個體係經投予一或多種抗癌化學治療劑。在一實施態樣中，該樹突細胞係經工程化以表現Ad-IL-12載體，特別是Ad-RTS-IL-12載體。在另一實施態樣中，經腫瘤內注射至個體之載體係Ad-IL-12載體，特別是Ad-RTS-IL-12載體。該一或多種抗癌化學治療劑可在投予該經工程化之樹突細胞及該表現IL-12之載體之前、在投予該經工程化之樹突細胞及該表現IL-12之載體之後、或在投予該經工程化之樹突細胞及該表現IL-12之載體之同時投予。在一實施態樣中，該抗癌化學治療劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)、太平洋紫杉醇衍生物或類似物、替莫唑胺 (temozolomide)、替莫唑胺衍生物或類似物、舒尼替尼(sunitinib)、舒尼替尼衍生物或類似物、吉西他濱(gemcitabine)、或吉西他濱衍生物或類似物。
在另一實施態樣中，需要治療腫瘤之個體係(a)經投予經工程化以組成性或條件性表現免疫調節劑例如此處所揭示之免疫調節劑之樹突細胞，及(b該個體係經投予一或多種抗癌化學治療劑。在一實施態樣中，該經工程化之樹突細胞係經工程化以表現Ad-免疫調節劑載體，特別是Ad-RTS-免疫調節劑載體。該一或多種抗癌化學治療劑可在投予該經工程化之樹突細胞之前、在投予該經工程化之樹突細胞之後、或在投予該經工程化之樹突細胞之同時投予。在一實施態樣中，該抗癌化學治療劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)、太平洋紫杉醇衍生物或類似物、替莫唑胺(temozolomide)、替莫唑胺衍生物或類似物、舒尼替尼(sunitinib)、舒尼替尼衍生物或類似物、吉西他濱(gemcitabine)、或吉西他濱衍生物或類似物。
在另一實施態樣中，需要治療腫瘤之個體係(a)經投予經工程化以組成性或條件性表現免疫調節劑例如此處所揭示之免疫調節劑之樹突細胞，(b)組成性或條件性表現免疫調節劑例如此處所揭示之免疫調節劑之載體係經腫瘤內注射至該個體，及(c)該個體係經投予一或多種抗癌化學治療劑。在一實施態樣中，該樹突細胞係經工程化以表現Ad-免疫調節劑載體，特別是Ad-RTS-免疫調節劑載體。在另一實施態樣中，經腫瘤內注射至個體之載體係Ad-免 疫調節劑載體，特別是Ad-RTS-免疫調節劑載體。該一或多種抗癌化學治療劑可在投予該經工程化之樹突細胞及該表現免疫調節劑之載體之前、在投予該經工程化之樹突細胞及該表現免疫調節劑之載體之後、或在投予該經工程化之樹突細胞及該表現免疫調節劑之載體之同時投予。在一實施態樣中，該抗癌化學治療劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)、太平洋紫杉醇衍生物或類似物、替莫唑胺(temozolomide)、替莫唑胺衍生物或類似物、舒尼替尼(sunitinib)、舒尼替尼衍生物或類似物、吉西他濱(gemcitabine)、或吉西他濱衍生物或類似物。
在本發明之任何方法中，該疾病或疾患可為本申請案所揭示之疾病或疾患。在一實施態樣中，該疾病或疾患係列示於此處之表1之疾病或疾患。在另一實施態樣中，該疾病或疾患係列示於此處之表3之疾病或疾患。
在本發明之任何方法中，該癌或腫瘤可為本申請案所揭示之疾病或疾患。在一實施態樣中，該癌或腫瘤係列示於此處之表1之癌或腫瘤。在另一實施態樣中，該癌或腫瘤係列示於此處之表3之癌或腫瘤。
有可能測量免疫調節劑及/或IL-12表現對細胞群之影響，藉由測量來自病患之生物樣本中Th1/Tc1型細胞介素IFN-γ之表現量或活性量。
就本發明之目的而言，本發明提供一種測定以經活體外工程化之免疫細胞或TSC為基底之治療配方對癌病患之療效之方法，該方法包含： a.測量第一生物性樣本中干擾素γ(IFN-γ)之表現量或活性量或二者之量，該第一生物性樣本係於投予該經活體外工程化之細胞例如免疫細胞或TSC之前自人病患獲得，藉此產生對照量；b.對該病患經腫瘤內投予該經活體外工程化之細胞；c.對該病患投予有效量之活化配體；d.測量第二生物性樣本中IFN-γ之表現量或活性量或二者之量，該第二生物性樣本係於投予該活化配體之後自該病患獲得，藉此產生檢測量；及e.比較IFN-γ之對照量與檢測量，其中資料顯示IFN-γ之表現量、活性量或二者之檢測量相較於對照量增加即表示該治療性治療配方對該病患係有效的。本發明亦可任意選擇地包含下列額外步驟：f.取得活體檢查樣本及計算腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，及/或g.觀察因應治療之腫瘤消退。
用語「個體」係指完整之昆蟲、植物或動物。當個體係真菌或酵母菌時，也預期該配體將可同樣地發揮作用。本發明可使用之動物包括但不限於脊椎動物例如哺乳動物諸如人、齧齒動物、猴及其他動物，其中人或小鼠係為較佳。其他動物包括獸醫動物，諸如犬、貓、馬、牛、綿羊、山羊、豬及該類似動物。
本發明另提供一種增加免疫調節劑例如TNF-α表現之方法，該方法藉由導入一或多種調節序列及可任意選擇地 編碼信號肽之核酸至載體例如複製缺陷型腺病毒載體，其中該載體條件性表現該免疫調節劑。此處之用語「蛋白質表現」包括但不限於轉錄、轉錄後、轉譯及/或轉譯後。本發明亦包括一種增加免疫調節劑例如TNF-α之mRNA或蛋白質表現之方法，該方法包含產製條件性表現TNF-α之載體，其中該載體另包含一或多個與編碼該TNF-α之多核苷酸序列連接之調節序列，及添加活化配體，藉此誘發免疫調節劑之表現，其中該一或多個調節序列及/或信號肽增進該TNF-α之表現。本發明之各種調節區包括但不限於5'非轉譯區(5'UTR)、3' UTR或二者皆已被描述。在一實施態樣中，該5' UTR係5U2。5U2係融合犬SERCA2內含子2，其具有突變假定一致之poly-A位點，位於5'端側之外顯子2剪接供點及位於3'端側之外顯子3剪接受點，接著一部分之牛酪蛋白5'UTR之部分。在另一實施態樣中，該3'調節區係SV40或hGH之聚腺苷酸化信號。
在某些實施態樣中，本發明之方法亦關於增進TNF-α之分泌，藉由產製條件性表現TNF-α之載體，其中該載體另包含信號肽，藉此相較於包含TNF-α天然信號肽基因之載體例如TNF-α野生型信號肽增加TNF-α之分泌。特別是，本發明所使用之信號肽係經密碼子最佳化。在特定實施態樣中，該信號肽係由IL-2野生型信號肽基因所編碼。在另一特定實施態樣中，該信號肽係由經密碼子最佳化之IL-2信號肽基因所編碼。
雖然不希望受到理論之限制，但預期本發明將支持腫 瘤內投予以經活體外工程化之免疫細胞及TSC為基底之基因療法於臨床試驗之用途，以客觀臨床反應為主要試驗終點，及交叉敏化之抗腫瘤CD8+ T細胞(產生IFN-γ)為次要試驗終點。在活體內開啟或關閉免疫調節劑及/或IL-12表現之能力為治療增添安全及治療控制之元素，因為蛋白質表現之時間及量皆可藉由配體之投予加以控制，而且免疫調節劑及/或IL-12表現之時間也預期對本方法之治療有效性至關重要。
本發明另支持以條件性表現受到關注之基因的經活體外工程化之細胞作為創新方式以有用且高效地治療人疾病之治療性應用。
本發明亦提供在有需要之哺乳動物中治療腫瘤、減少腫瘤大小或防止腫瘤生成之方法，在該方法中條件性表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之載體(但該載體不包含於細胞中)係經腫瘤內投予至腫瘤微環境。在此實施態樣中，該載體係以未包裝於細胞諸如免疫細胞或TSC中之形式被投予至腫瘤。本發明亦提供在有需要之哺乳動物中治療疾病之方法，在該方法中條件性表現具有一或多種免疫調節劑之功能的蛋白質之載體(但該載體不包含於細胞中)係經投予至該哺乳動物。在此實施態樣中，該載體係以未包裝於細胞諸如免疫細胞或TSC中之形式被投予至腫瘤。
在一實施態樣中，免疫細胞、TSC、樹突細胞或骨髓樹突細胞不與載體一起被投予至腫瘤內。
在另一實施態樣中，本發明之不包含於細胞內之載體係於免疫細胞、TSC、樹突細胞或骨髓樹突細胞經腫瘤內投予之同時、之前或之後經腫瘤內投予。
在一實施態樣中，本發明之不包含於細胞內之載體係經腫瘤內投予至相同於免疫細胞或TSC所投予之病灶。在另一實施態樣中，本發明之不包含於細胞內之載體係經腫瘤內投予至不同於免疫細胞或TSC所投予之病灶。
在一實施態樣中，該載體在每次投藥周期皆投予至相同病灶。在另一實施態樣中，該經投予之載體在每次投藥周期皆不投予至相同病灶。
在一實施態樣中，該腫瘤係此處例如表1及3所列之任何腫瘤。在另一實施態樣中，該腫瘤係黑色素瘤、結直腸腫瘤、胰臟腫瘤、乳房腫瘤、肺腫瘤或腎腫瘤。在另一實施態樣中，該腫瘤係惡性黑色素瘤。在另一實施態樣中，該腫瘤係第III C或IV期惡性黑色素瘤。
在一實施態樣中，每次經腫瘤內投予載體週期之劑量係至少約1.0x109病毒粒子。在另一實施態樣中，每次經腫瘤內投予載體週期之劑量係至少約1.0x1010病毒粒子。在另一實施態樣中，每次經腫瘤內投予載體週期之劑量係約1.0x109至約1.0x1013病毒粒子。在另一實施態樣中，每次經腫瘤內投予載體週期之劑量係約1.0x1010至約1.0x1013病毒粒子。在另一實施態樣中，每次經腫瘤內投予載體週期之劑量係約1.0x1010、約1.0x1011、約1.0x1012或約1.0x1013病毒粒子。在一實施態樣中，該載 體係AD-RTS-IL-12。
在另一實施態樣中，本發明另提供在有需要之哺乳動物中治療肝臟疾病之方法，在該方法中條件性表現蛋白質之載體不包含於細胞中，且該載體係經投予至該哺乳動物。
在另一實施態樣中，本發明另提供在有需要之哺乳動物中治療溶酶體貯積病之方法，在該方法中條件性表現蛋白質之載體不包含於細胞中，且該載體係經投予至該哺乳動物。
在另一實施態樣中，本發明另提供在有需要之非人哺乳動物中治療疾病之方法，在該方法中條件性表現蛋白質之載體不包含於細胞中，且該載體係經投予至該哺乳動物。
活化配體之劑量係約5至100毫克/天，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100毫克/天。在一實施態樣中，該活化配體係以每天至少一次投予。在另一實施態樣中，該活化配體係以每天一次投予約14天。
在一實施態樣中，至少二種載體劑量(例如約1x1011及1x1012)係與至少三種不同的活化配體劑量(例如約5毫克/天至約100毫克/天)組合使用。
該領域之一般技藝人士將能最佳化劑量以在各種活化配體活化之程度下，提供有效之載體血漿量之範圍。
在一實施態樣中，投予至個體之活化配體之劑量係隨 著腫瘤內載體投予週期內之活化配體的投予時間而改變。在另一實施態樣中，投予至個體之活化配體之劑量係隨著腫瘤內載體投予週期內之活化配體的投予時間而減少。在另一實施態樣中，投予至個體之活化配體之劑量係隨著腫瘤內載體投予週期內之活化配體的投予時間而增加(逐步增加)。
在一實施態樣中，個體係經2、3、4、5、6、7、8、9或10次腫瘤內載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經3至7次腫瘤內載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經4至6次腫瘤內載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經5或6次腫瘤內載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經6次腫瘤內載體投予周期之治療。
在一實施態樣中，每次腫瘤內載體投予周期之間係相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。在另一實施態樣中，每次腫瘤內載體投予週期之間係相隔4周。
在一實施態樣中，每個隨後之腫瘤內載體投予周期的載體劑量改變。在另一實施態樣中，每個隨後之腫瘤內載體投予周期的載體劑量減少。在另一實施態樣中，每個隨後之腫瘤內載體投予周期的載體劑量增加。
在一實施態樣中，載體及活化配體之劑量、腫瘤內載體投予周期之次數及長度、載體投予之頻率及活化配體投予之頻率係闡述於實施例11中之表8。
在一實施態樣中，本發明亦提供包含醫藥上可接受之 載劑及本發明之不包含於細胞內之載體之醫藥組成物。適當載劑包括但不限於鹽水、蒸餾水、氯化鈉溶液、氯化鈉及無機鹽之混合物或彼等之類似混合物、物質溶液諸如甘露醇、乳糖、葡聚糖及葡萄糖之溶液、胺基酸溶液諸如甘胺酸及精胺酸之溶液、有機酸溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液之混合物、水性及非水性之等張無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、螯合劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調製劑呈等張性之溶質，及可包括懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩定劑及保存劑之水性及非水性之無菌懸浮液。該調製劑可存在於單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿及小瓶，且可被儲存於僅需在立即使用前加入無菌液體載劑例如水以供注射之冷凍乾燥(凍乾)狀態。
若此處所引用之任何參考文獻與本說明書之任何揭示或建議之間有所衝突，就本發明之目的而言應以後者為主。
此處引用之所有專利、專利申請案及公開資料係以參照方式整體完整納入此處。
應了解前面描述之實施態樣及範例並非意圖在任何方面限制本發明之範圍，而且此處所提之權利要求範圍係意圖包含不論是否在此處明白提出之所有實施態樣及範例。
2008年10月8日提出之美國專利申請案12/247,738(標題為「經工程化之樹突細胞及治療癌之用途))現以參照方式整體納入此處。2008年9月29日提出之美國專利申請案12/241,018(標題為「供生物治療性分子 表現之治療性基因開關建構體及生物反應體及彼等之用途))亦以參照方式整體納入此處。
圖1顯示編碼hIL-12之雙順反子轉錄物調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖2顯示編碼hIL-21及hIL-15之雙順反子轉錄物調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖3顯示編碼mIL-12之雙順反子轉錄物調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖4顯示編碼mIL-21及mIL-15之雙順反子轉錄物調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖5顯示hIL-12之調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖6顯示mIL-12之調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖7顯示編碼hIL-12及hIL-21之三順反子轉錄物調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖8顯示編碼mIL-12及mIL-21之三順反子轉錄物調節啟動子表現系統之質體基因圖。
圖9顯示載體rAd.RheoIL12之結構，其中E1及E3區已被刪除，且RheoSwitch®治療系統(RTS)-IL-12成份取代E1區。標示「IL12」之盒代表由IRES分開之IL-12p40及IL-12p35編碼序列。
圖10顯示轉錄、轉錄後、轉譯及轉譯後處理之摘要表。
圖11顯示有代表性生產支點之模塊元件。
圖12顯示具有開關及誘導性模塊合成基因之腺病毒相容性ULTRAVECTORTM骨架。
圖13顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43318)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt 5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV開放閱讀框(ORF)及SV40e+pA之3'調節區。
圖14顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43319)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt 5'UTR、TNFoptUV信號肽、TNFopt UV ORF及SV40e+pA之3'調節區。
圖15顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43320)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt 5'UTR、IL-2optUV信號肽、TNFopt UV ORF及SV40e+pA之3'調節區。
圖16顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43321)，該調節啟動子表現系統包含5U2 5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV ORF及SV40e+pA之3'調節區。
圖17顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43322)，該調節啟動子表現系統包含5U2 5'UTR、TNFoptUV信號肽、TNFopt UV ORF及SV40e+ pA之3'調節區。
圖18顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43323)，該調節啟動子表現系統包含5U2 5'UTR、IL-2optUV信號肽、TNFopt UV ORF及SV40e+pA之3'調節區。
圖19顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43324)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt 5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV ORF及hGH+pA之3'調節區。
圖20顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43325)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt 5'UTR、TNFoptUV信號肽、TNFopt UV ORF及hGH+pA之3'調節區。
圖21顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43326)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt 5'UTR、IL-2optUV信號肽、TNFopt UV ORF及hGH+pA之3'調節區。
圖22顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43327)，該調節啟動子表現系統包含5U2 5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV ORF及hGH+pA之3'調節區。
圖23顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43328)，該調節啟動子表現系統包含5U2 5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV ORF及hGH+pA 之3'調節區。
圖24顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43329)，該調節啟動子表現系統包含5U2 5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV ORF及hGH+pA之3'調節區。
圖25顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43533)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt5'UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwtUV ORF及TNFwt 3'UTR。
圖26顯示乘載調節啟動子表現系統之腺病毒載體基因圖(載體43534)，該調節啟動子表現系統包含TNFwt5'UTR、TNF全長ORF及TNFwt 3'UTR。
圖27顯示以含有不同PT3成份(-/+)之載體轉染HEK293細胞後，經RHEOSWITCH®配體誘導之TNF-α的經正常化之蛋白分泌量。
圖28顯示以含有不同PT3成份(-/+)之載體轉染CHO-K1細胞後，經RHEOSWITCH®配體誘導之TNF-α的經正常化之蛋白分泌量。
圖29顯示HEK293細胞經轉染後TNF-α分泌之倍數差異。
圖30顯示5U2 5'UTR與wtUV TNF-α 5'UTR之間的蛋白質分泌差異。
圖31之折線圖顯示小鼠B16F0黑色素瘤模型中之Ad-RTS-IL-12劑量依賴性試驗。小鼠在第12天經單一注 射Ad-RTS-IL-12劑量1ee7、1ee8、1ee9、5ee9、1ee10、5ee10病毒顆粒(vp)之治療，配體從第11天開始利用飼料遞送。X軸顯示腫瘤細胞接種後天數，Y軸顯示腫瘤體積。劑量顯示顯著抗腫瘤效應。相較於對照之腫瘤減少%係經顯示。
圖32之折線圖顯示試驗期間之體重變化。以Y軸上之體重%改變顯示。
圖33A及33B之折線圖顯示Ad-RTS-mIL12於Lewis小鼠肺癌(LLC)模型中之抗腫瘤活性(圖33A)及安全性(圖33B)。Lewis肺腫瘤生長於免疫競爭性C57b/6小鼠皮下。當腫瘤生長至所欲大小，開始治療。動物在腫瘤細胞接種後第6、9、13天接受單一劑量之AdRTS-mIL12(1e10 vp)。Ad-RTS-mIL12與活化配體相較於對照動物顯示顯著抗腫瘤活性。未觀察到重大毒性。
圖34A及34B之折線圖顯示小鼠黑色素瘤(B16F0)模型中之療效(圖34A)及安全性(圖34B)，其中動物係經Ad-RTS-mIL12治療。腫瘤在C57b/6小鼠之側腹皮下發展。單一劑量之Ad-RTS-mIL12(1e10 vp)在細胞接種後第13天(箭頭)經腫瘤內投予。活化配體(50、100、250、500、750及1000毫克/公斤)係於載體注射前24小時開始給予直到試驗結束。腫瘤生長抑制係以相較於對照動物之百分比顯示。Ad-RTS-IL12顯示具有廣泛活化配體劑量窗之治療效益。該治療之耐受性良好。
圖35A及35B之折線圖顯示Ad-RTS-mIL12於小鼠結 腸癌(CT26Luc)模型中之療效(圖35A)及安全性(圖35B)。小鼠結腸腫瘤在Balb/C小鼠之側腹皮下生長。動物在細胞接種後第11及18天(箭頭)以Ad-RTS-mIL12劑量1e10 vp/100微升經腫瘤內(i.t.)治療二次。活化配體在載體注射前24小時開始給予。腫瘤體積及體重在整個試驗中受到監測。Ad-RTS-mIL12治療相對於對照動物導致優異之腫瘤生長抑制(100%)。值得注意的是，所有接受Ad-RTS-mIL12加活化配體治療之動物為無腫瘤。
圖36A及36B之折線圖顯示Ad-RTS-mIL12於胰癌(PAN02)模型中之療效(圖36A)及安全性(圖36B)。皮下PAN02腫瘤荷瘤小鼠在腫瘤細胞接種後第7及14天(箭頭)接受單一Ad-RTS-mIL12劑量1e10 vp/100微升之腫瘤內(i.t.)治療。活化配體飼料係於載體投予前一天開始供給動物直至試驗結束。對照或僅載體組只餵食正常小鼠飼料。結果顯示Ad-RTS-IL12展現相對於對照動物之顯著抗腫瘤活性(97%)。Ad-RTS-IL12治療之結果未發現重大體重變化。
圖37係AD-RTS-mIFNα之載體基因圖。
圖38係AD-RTS-mTNFα之載體基因圖。
圖39A及39B之折線圖顯示Ad-RTS-mIL12於乳癌(4T1)模型中之療效(圖39A)及安全性(圖39B)。4T1腫瘤係於BALB/C小鼠之側腹皮下(s.c.)生長。荷瘤小鼠被隨機分配至各包含5隻動物之4個組別；分別是對照無治療組、僅活化配體(L)組、僅Ad-RTS-mIL12及Ad-RTS- mIL12加活化配體組。單一注射Ad-RTS-mIL12係於三個不同的時間點(箭頭)經腫瘤內(i.t.)以劑量1e10 v.p./100微升PBS給予。活化配體從載體注射前24小時開始經由飼料供給動物直至試驗結束。腫瘤大小(體積)及體重(%)係以平均值±SE顯示。無治療之動物(對照)的腫瘤生長快速。僅活化配體或三劑Ad-RTS-miL12但無活化配體之治療相較於對照組各具有22%及35%之輕微腫瘤生長抑制。值得注意的是，Ad-RTS-IL12加活化配體之治療相較於無治療之對照動物導致82%之顯著腫瘤生長抑制。任何治療組皆未發現重大體重減輕。
圖40係干擾素α-2a之載體基因圖。
實施例1
進行試驗以決定能在Renca腎細胞癌腫瘤模型中誘發腫瘤特異性免疫反應及抗腫瘤活性之樹突細胞之劑量及最有效之細胞介素。
二種腫瘤細胞系被用於此試驗：Renca及Renca-HA。後者之細胞系藉由以流感病毒血球凝集素(HA)轉染Renca細胞製備。Renca-HA模型之優點係追蹤抗原特異性T細胞之能力，因為CD8及CD4特異性HA-衍生性表位皆為已知且已被使用。
特定目的-測定腫瘤內投予樹突細胞後所誘發之HA-特異性免疫反應。
Renca-HA腫瘤係建立於BALB/c小鼠皮下。當腫瘤長到可摸到時，經腫瘤內注射樹突細胞。樹突細胞投予在7天內重複二次，總共進行3次投予。
使用下列小鼠分組(每組包括3隻小鼠)：1. 未治療小鼠；2. 以5x105經對照質體轉導之樹突細胞處理小鼠；3. 以106經對照質體轉導之樹突細胞處理小鼠；4. 以5x106經對照質體轉導之樹突細胞處理小鼠；5. 如第2至4組，使用經IL-12轉導之樹突細胞；6. 如第2至4組，使用經IL-15轉導之樹突細胞；及7. 如第2至4組，使用經IL-21轉導之樹突細胞。
為了測試不同細胞介素之組合的效果，小鼠同時接受下列處理：8. 5x105經IL-12轉導之樹突細胞及5x105經IL-15轉導之樹突細胞，9. 5x105經IL-12轉導之樹突細胞及5x105經IL-21轉導之樹突細胞，及10. 5x105經IL-15轉導之樹突細胞及5x105經IL-21轉導之樹突細胞。
最後一次投予後4天，收集荷瘤小鼠之淋巴結，使用MHC第I型相符肽(以檢測CD8+ T細胞反應)或MHC第II型相符肽(以檢測CD4+ T細胞反應)刺激細胞。
使用下列檢測分析： 1.ELISPOT IFN-γ及IL-2；2.T-細胞增生；3.檢測淋巴結細胞釋放之TNFα、IL-10、IL-4及GM-CSF。
此外，淋巴結細胞之NK活性係利用YAC細胞作為標靶評估。
同時，細胞經抗-CD3/CD28抗體刺激以評估T細胞之非特異性反應。
能誘發抗原特異性免疫反應之最有效的樹突細胞劑量被決定。
特定目的2-評估經細胞介素基因轉導之樹突細胞的抗腫瘤活性。
只有該些顯示能誘發統計顯著性免疫反應之經細胞介素轉導之樹突細胞被用於進一步試驗。
Renca-HA荷瘤小鼠之處理係如特定目的1中所述進行。使用在先前實驗顯示特定活性之劑量的經細胞介素轉導之DC。對照組使用經對照腺病毒轉導之樹突細胞。為了達到統計顯著性，各組包括10隻小鼠。
評估腫瘤生長。Renca-HA腫瘤包含可用於免疫學監測及初步測試抗腫瘤效應之免疫原性表位。然而，為了確認治療之潛在抗腫瘤活性，必須使用未經轉染之腫瘤細胞。因此，使用Renca腫瘤模型以重複上述實驗。
實施例2
腫瘤內注射經腺病毒轉導工程化以在RTS之控制下表現hIL-12及一或多種其他免疫調節劑之自體樹突細胞的安全性、耐受性、轉基因功能及免疫效應，將於第III及IV期黑色素瘤個體中利用以下描述之方法評估。
本試驗之對象為第III及IV期黑色素瘤受試者，受試者將被分成4組，每位受試者接受單次腫瘤內注射(注射至黑色素瘤腫瘤)經腺病毒轉導工程化以表現人介白素-12(hIL-12)及一或多種其他免疫調節劑之自體樹突細胞(被重新注入取得細胞之相同受試者)，該樹突細胞(DC)之劑量為5x107，連同每日口服劑量之活化藥物(活化配體)。該試驗將使用在活體外(在細胞自受試者取出之後)經腺病毒載體轉導以誘導性表現人IL-12及一或多種其他免疫調節劑之樹突細胞的注射液。被注射之DC產製IL-12及一或多種其他免疫調節劑之功能藉由經口投予活化藥物(RG-115932)以活化RTS而被「開啟」(誘導)。安全性及耐受性之評估包括理學檢查(包括ECOG體能狀態)、生命跡象監測、血清化學、尿液分析、血液學、不良反應「副作用」及腺病毒、RTS之成份及活化藥物所產生之抗體及細胞性免疫反應。為了評估治療進程，將測量口服活化藥物及彼之主要代謝物的單一劑量及穩定狀態藥物動力學/ADME、在目標腫瘤、引流淋巴結及周邊循環之活體樣本中之hIL-12量、其他免疫調節劑之量及細胞性免疫反應(T細胞)之分析以及血清細胞介素分析。
舉例來說，16名第III及IV期黑色素瘤病患被分成4 組，第1及2組包含3名病患，第3及4組包含5名病患。所有受試者將接受單次腫瘤內注射5x107自體DC，該DC經腺病毒載體轉導以在RTS之控制下編碼人IL-12及一或多種其他免疫調節劑。例如，受試者接受腫瘤內注射經腺病毒載體轉導以編碼在RTS之控制下之人IL-12及免疫調節劑諸如IL-15或IL-21之自體DC。
受試者將接受每日單次口服劑量之活化藥物(第1組：0.01毫克/公斤，第2組：0.1毫克/公斤，第3組：1.0毫克/公斤或第4組：3毫克/公斤)，第一劑在第1天DC注射前大約3小時投予，之後連續投予13天。符合再治療標準之合格受試者可接受額外之經腺病毒轉導之自體樹突細胞注射與14天每日單次口服劑量之活化藥物治療組合。第1組中之所有受試者皆在注射經活體外工程化之樹突細胞後的1個月內進行安全性、耐受性及樹突細胞功能之評估，之後才能讓受試者接受下一個最高劑量之活化藥物。安全性評估將在所有受試者初次注射該經工程化之樹突細胞之後持續進行3個月，若觀察到毒性或受試者接受額外之樹突細胞注射，則該追蹤期可能延長至總共6個月以監測受試者之安全。
此試驗證實單次或多次腫瘤內注射經腺病毒轉導之自體樹突細胞與口服活化藥物之組合對黑色素瘤病患之安全性及耐受性。該試驗提供口服活化藥物之穩定狀態藥物動力學/ADME。該試驗證實RTS於個體中之功能性，藉由測量經腺病毒轉導之自體樹突細胞於目標腫瘤及/或引流 淋巴結中因應RTS受到經口投予活化藥物之活化而表現hIL-12及一或多種其他免疫調節劑之表現。另外，該試驗證實在經口投予活化藥物之後，經腺病毒轉導之自體樹突細胞在目標腫瘤、引流淋巴結及周邊循環中就細胞性免疫反應而言之免疫效應。
黑色素瘤被選擇作為示範性癌，特別地就黑色素瘤而言。在實質腫瘤中，黑色素瘤特別顯示對免疫療法有所反應，且黑色素腫瘤容易進行腫瘤內注射及活體檢查。被納入試驗中之受試者罹患無法切除之第III或IV期黑色素瘤，腫瘤直徑至少0.5公分，腫瘤厚度不拘，影響淋巴結數量不拘，呈現通路中轉移或遠端轉移。
製備包含RheoSwitch治療系統、hIL-12及一或多種其他免疫調節劑之腺病毒
重組DNA藉由活體外腺病毒載體轉導而被轉移至樹突細胞(DC)。重組DNA被用於自腫瘤內注射之不成熟樹突細胞表現人IL-12(p70)及一或多種其他免疫調節劑，以使DC在腫瘤環境中存活及刺激成熟且導致DC後續遷移至引流淋巴結。此造成T輔助細胞偏向分化成Th1型，同時藉由腫瘤抗原之交叉敏化導致腫瘤特異性細胞毒性T細胞之活化。
用來作為重組腺病毒載體之重組DNA允許人IL-12及一或多種其他免疫調節劑在RheoSwitch®治療系統(RTS)之控制下表現。RTS包含自人泛素C啟動子表現之雙順反子信息，且編碼二種融合蛋白：Gal4-EcR及VP16- RXR。Gal4-EcR係酵母菌Gal4之DNA結合結構域(胺基酸1至147)與來自昆蟲雲杉色捲蛾(Choristoneura fumiferana)之蛻皮激素受體的DEF結構域之融合。在另一實施態樣中，RTS係由自人泛素C啟動子表現之雙順反子信息組成，且編碼二種融合蛋白：Gal4-EcR及VP16-RXR。Gal4-EcR係酵母菌Gal4之DNA結合結構域(胺基酸1至147)與來自昆蟲雲杉色捲蛾(Choristoneura fumiferana)之蛻皮激素受體的DEF結構域之融合。VP16-RXR係HSV-VP16之轉錄活化結構域與源自人及蝗蟲序列之嵌合性RXR的EF結構域之融合。這些Gal4-EcR及VP16-RXR序列被來自EMCV之內部核糖體進入位點(IRES)分開。當Gal4-EcR與小分子藥物(RG-115932)結合時這二個融合蛋白二聚化，並自包含6個Gal4-結合位點及一合成性最小啟動子之Gal4-反應性啟動子活化hIL-12與一或多種其他免疫調節劑之轉錄。以上描述之RTS轉錄單位係置於hIL-12及一或多種其他免疫調節劑轉錄單位之下游。這整個RTS-hIL12-免疫調節劑卡匣被納入腺病毒5基因組中E1區被刪除之位點。腺病毒骨架亦缺乏E3基因。腺病毒載體Ad-RTS-hIL-12之基因圖係顯示於US 2009/0123441 A1中之圖8。
此試驗使用之重組腺病毒載體除了該病毒載體序列之外還包含下列示範性調節元件：人泛素C啟動子、源自EMCV之內部核糖體進入位點、包含6套Gal4-結合位點、3套SP-1結合位點及一合成性最小啟動子序列之誘 導性啟動子、SV40聚腺苷酸化位點及源自人α-球蛋白基因之轉錄終止序列。應了解其他調節元件可被替代使用。
示範性重組腺病毒載體Ad-RTS-hIL-12-免疫調節劑係由下列方式產製。被EMCV-IRES(內部核糖體進入位點)分開之受體融合蛋白VP16-RXR及Gal4-EcR之編碼序列被插入腺病毒穿梭載體中受到人泛素C啟動子(組成性啟動子)之控制。接著，被IRES分開之hIL-12之p40及p35次單位及一或多種其他免疫調節劑之編碼序列被置於包含6套Gal4-結合位點之合成性誘導性啟動子之控制下地插入泛素C啟動子及受體序列之上游。該穿梭載體包含自左端至基因圖單位16(mu16)之腺病毒血清型5序列，之後的E1序列被刪除並由RTS、IL-12及一或多種其他免疫調節劑序列(RTS-hIL-12)取代。攜帶RTS-hIL-12-免疫調節劑之穿梭載體係由過渡性轉染至HT-1080細胞以測試活化藥物依賴性IL-12及其他免疫調節劑之表現。該穿梭載體接著藉由共轉染至HEK 293細胞與腺病毒骨架重組，以獲得重組腺病毒Ad-RTS-hIL-12-免疫調節劑。該腺病毒骨架包含基因組左側之mu 0至9.2及E3基因之序列刪除。該穿梭載體及腺病毒骨架包含自mu 9.2至mu 16之重疊序列，如此允許彼等之間重組及產製重組腺病毒載體。由於該重組腺病毒載體缺乏E1及E3區，因此該病毒在正常哺乳動物細胞內為複製缺陷。然而，該病毒可在包含腺病毒-5 E1區因此提供E1反式作用之HEK 293細胞中複製。
示範性重組腺病毒載體係由下列方式產製：攜帶DNA元件以供誘導性表現人IL12及一或多種其他免疫調節劑之線性化穿梭載體及腺病毒骨架被共轉染至HEK293細胞。在穿梭載體及病毒骨架之重疊序列之間重組導致重組腺病毒之產製並於HEK293細胞中被包裝成病毒顆粒。HEK293細胞係於含有胎牛血清之DMEM中生長。
用於提議試驗之病毒係經CsCl密度梯度離心純化。該重組腺病毒經過二次噬斑純化，所形成之種子保存液藉由在來自完整特徵化之種原細胞庫之HEK293細胞中擴增以用於產製種原病毒庫(MVB)。該MVB經過廣泛之cGMP/GLP放行檢測，包括複製型腺病毒(RCA)、無菌性、黴漿菌、伺機病毒、反轉錄病毒、人病毒HIV1/2、HTLV1/2、HAV、HBV、HCV、EBV、B19、CMV、HHV-6、7及8、牛及豬病毒、完整載體定序及藉由在人細胞系中經AD-誘導表現IL-12及一或多種其他免疫調節劑之功能性檢測。
來自MVB之病毒可被用於在cGMP廠中產製經純化之病毒，且可能再次進行放行檢測，包括識別性、RCA、無菌性、黴漿菌、伺機病毒、病毒顆粒對感染單位比、宿主細胞DNA、內毒素及蛋白質之汙染及藉由在人細胞系中經AD-誘導表現IL-12及一或多種其他免疫調節劑之功能性檢測。
適當之產製重組腺病毒之方法亦闡述於Anderson,R.D.,Gene Therapy 7：1034-1038(2000)。
適當之重組腺病毒進入宿主細胞之方法係闡述於Komita,H.et al.,Cancer Gene Therapy 16：883-891(2009)。
以包含hIL-12轉基因及一或多種其他免疫調節劑及RheoSwitch®治療系統(RTS)之腺病毒轉導自體樹突細胞。
源自人個體之樹突細胞係於活體外轉導並注射至腫瘤內。在進行病毒轉導前，將檢測該DC之存活性、純度(通常>80%細胞顯示DC表型)、無菌性、黴漿菌及內毒素特徵。在病毒轉導後，該細胞經過重複沖洗以移除任何未被吸收之病毒。以PCR檢測最後一次沖洗之上清液中的殘餘病毒含量。由於DC係在活體外經腺病毒載體(非整合型病毒)轉導，而且DC在經腫瘤內注射接著移動進入引流淋巴結之生命期很短，因此不預期該病毒DNA將嵌入任何非目標細胞。用來進行腺病毒轉導DC之方法預期可產生80至90%之轉導，被認為非常有效率。
以白血球分離術收集PBMC：受試者至UPCI門診進行分離術之單位進行標準90至120分鐘之白血球分離術。白血球分離術之步驟為自手臂靜脈抽出血液；血液通過離心機(細胞分離機)，血液成份在該處被分離並移除一或多種成份；剩下的成份回到個體相同或另一手臂之靜脈。在血液經由該細胞分離機處理之任何時間不抽取超過15%之個體總血量。在細胞分離機中，血液被分成血漿、血小板、白血球及紅血球。移除白血球(WBC)，所有其他成份回到個體之循環中。此步驟將盡量利用二條周邊靜脈 (IV)導管。如果不可行，可能需要利用中央靜脈導管。個體進行白血球分離術之前，必須由醫師消毒並例行監測生命跡象(包括血壓)。
處理：在收集後，手動傳送白血球包(leukapack)至CPL，並立刻於ELUTRATM中進行離心淘析處理。此為經驗證可供臨床使用之封閉系統。收集單核球組分，在收集及建立細胞存活性之後，細胞被轉移到有IL-4及GM-CSF存在之Aastrom盒中培養6天。所有處理及清洗步驟皆在無菌條件下進行。
初步接種：自單一白血球包(leukapack)收集到之單核球在台盼藍染色下計數，以決定存活細胞數目。以流式細胞分析單核球之純度。按照SOP-CPL-0166，將單核球以5x106至10x106細胞/毫升重懸於含1,000 IU/毫升之IL-4及1,000 IU/毫升之GM-CSF且不含血清、不含抗生素之CellGenix培養基，並置於Aastrom盒中。需要最小裝填體積50毫升及最小細胞數以供卡匣接種。
培養：Aastrom盒被置於Replicell系統之培養箱中，此系統為供未成熟DC產製之完全密封、符合cGMP之自動化培養裝置。
未成熟DC收集：在第6天，Aastrom盒被移出培養箱以收集未成熟DC。細胞經1,500rpm離心收集，CellGenix培養基清洗，台盼藍染色計數，並檢測形態學及表型特徵。
存活性：此特性係藉由在台盼藍存在下進行血球計細 胞計數測定。通常，>95%之收集細胞為存活細胞，即排除台盼藍染料。若存活性低於70%，該未成熟DC將被丟棄。
表型分析：在培養中產製之細胞在血球計上以顯微鏡觀察計算，利用台盼藍染料獲得初步鑑別計算(DC與淋巴細胞)。鑑別計算係由流式細胞分析確認，對DC與淋巴細胞設門(gating)，並利用未成熟DC之高前向及側向散射特性作為彼等之識別標準。未成熟DC通常包含>80%具有樹突細胞形態且具有DC表型之細胞。
IL-12p70效價分析：已清楚了解成熟DC(mDC)具有自行或在受到CD40L活化但不論有無添加先天免疫信號(例如LPS)之情況下產製IL-12p70之能力。標準化之IL-12p70產製分析最近被建立，可用於小量樣本或大批量之在各種條件下生產之DC疫苗。目前的效價分析由二個不同的步驟組成，第一步驟涉及共同培養反應性DC與作為刺激物之經人CD40配體基因穩定轉染之J588淋巴瘤細胞。第二步驟涉及檢測來自這些共同培養細胞之上清液，在Luminex系統中分析經J558/CD40L +/- LPS刺激之DC所分泌之IL-12p70之量。此效價分析之組間變異係數為18.5%(n=30)且具有廣泛之動態範圍，此有助於評估IL-12p70產製量差異極大之各種DC製品。利用13位正常捐贈者之單核球所製備之DC製品建立分析之正常範圍為8至999皮克/毫升，平均值為270皮克/毫升。
樹突細胞之製備及放行標準
每一批活體外製備之樹突細胞皆經過微生物汙染物(好氧及厭氧細菌、真菌及黴漿菌)及內毒素之檢查，並測定表型及功能性特徵。所有將被注射至個體之樹突細胞都是新鮮且不經冷凍保存之細胞。
DC之品質保證測試：如上述製備之DC經過無菌性、存活性、純度、效價及穩定性之檢測。細胞性製品之放行標準已被建立且嚴格遵守。
存活性：在培養中產製之細胞在血球計上以顯微鏡觀察計算，利用台盼藍染料獲得鑑別計算(DC與淋巴細胞)。此計數提供測試培養中的存活細胞百分比。超過70%之細胞顯示台盼藍排除之存活性及最少70%之細胞表現單核球衍生性DC標誌之HLA-DR及CD86係通過放行標準所需。其他標誌可被包括以供檢視分析，諸如檢測DC成熟狀態之CD83及CCR7，及檢測淋巴細胞汙染之CD3及CD19。
純度：經FITC-及PE-共軛單抗染色細胞之雙色流式細胞分析被用來測定經鑑定為形態學上表現具DC定義之表面抗原且缺乏單核球及T及B細胞系抗原之DC族群。以疫苗製備而言，所產製之DC必須表現HLA-DR及CD86且不能表現CD3、CD19或CD14。被認為是mDC之標準為細胞必須表現CD83+及CCR7+。
效價：為了定義DC之效價測量，我們如上述測定彼等產生IL-12p70之能力。
無菌性：DC係於匹茲堡醫學中心微生物實驗室中利用BD Bactec系統(貝克頓迪更生(Becton Dickenson)公司，馬里蘭州斯巴克斯)進行細菌(好氧及厭氧)及真菌培養測試。微生物培養之終結果可於14天後獲得。在放行DC以供疫苗用途之前，進行革蘭氏染色，必須沒有微生物存在。
IMCPL利用Gen-Probe黴漿菌組織培養快速檢測系統(Gen-Probe公司，加州聖地牙哥)測試黴漿菌，該系統根據核酸雜交技術。內毒素測試係利用鱉變形細胞溶解物致熱原檢測進行(Bio Whittaker公司，馬里蘭州沃克維爾市)。在收集細胞時及終產物放行前，於細胞培養上進行內毒素測試。可接受之內毒素量為<5EU/公斤體重。未經轉導及經轉導之樹突細胞將經冷凍保存以供未來分析。
預期所有經轉導之細胞將表現該轉基因。預計超過80%之DC將被轉導。該製品將具生物活性，因為該天然編碼序列仍維持在轉基因中。被注射至腫瘤之經病毒轉導之DC係具未成熟表型之DC，且在它們成熟之前不會表現IL-12及一或多種其他免疫調節劑，因此在此階段，IL-12及一或多種其他免疫調節劑之表現主要來自該轉基因。由於IL-12及一或多種其他免疫調節劑轉基因之表現係由小分子活化藥物RG-115932以劑量依賴性方式誘導，因此可以控制經轉導之DC內之轉基因表現至所欲之量。小部分經製備以供投予至人個體之轉導DC可以於活體外檢測活化藥物依賴性誘導IL-12及一或多種其他免疫調節 劑之表現。IL-12及一或多種其他免疫調節劑之表現可利用敏感性4奈克/毫升之ELISA檢測。
預期提議試驗所使用之載體轉導細胞之活體外誘導IL-12及一或多種其他免疫調節劑在24小時內產生每106細胞大約500奈克之IL-12及一或多種其他免疫調節劑，由ELISA測定。在使用小鼠黑色素瘤模型之臨床前試驗中，腫瘤內注射106或更多之轉導DC顯示療效。然而，預期該所需之腫瘤內注射量可能在更低之量即可顯示療效，因此利用5x107經轉導之DC作為起始量以測定所需之量是否更低或更高。
舉例來說，在活體外，經攜帶IL12及一或多種其他免疫調節劑之基因的重組腺病毒載體轉導之人及小鼠細胞系及原發性樹突細胞顯示以劑量依賴性方式因應活化藥物而誘導IL12之表現。
6.3.活化藥物之調製劑
此處使用之活化藥物被調製於下列任一種調製劑：(1)100%辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)；(2)李施德霖(Listerine)口味Labrasol(美國緯度製藥(Latitude Pharmaceuticals))，其包含(a)薄荷醇、(b)百里酚、(c)桉油醇、(d)阿斯巴甜、(e)糖精鈉、(t)檸檬酸、(g)薄荷香料、(h)奶油香料、(i)辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)；(3)Miglyol 812及phospholipon 90G(美國緯度製藥 (Latitude Pharmaceuticals))；或(4)Miglyol 812、phospholipon 90G及維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(美國緯度製藥(Latitude Pharmaceuticals))。
遞送
雖然可以想像使用各種濃度及特定程序，一個治療病患之實例將包括病患接受腫瘤內注射濃度5 x 107懸浮於無菌鹽水之經轉導之自體樹突細胞(AdDC)與口服活化藥物(RG-115932)，該自體樹突細胞係經工程化以在RTS之控制下表現hIL-12(人介白素12)及一或多種其他免疫調節劑。
起始治療
第1天住院病患訪視：第1天進行基礎理學檢查(包括生命跡象、體重及ECOG狀態)。收集尿液及抽血以進行基礎血清化學、尿液分析及血液學檢查(安全性檢查)。在腫瘤內注射經活體外工程化之樹突細胞的大約3小時前，每位受試者在用餐後立即投予活化藥物(第1組-0.01毫克/公斤、0.3毫克/公斤、1.0毫克/公斤及3毫克/公斤)。在第1天的特定時間間隔(投藥前、AD投藥後0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16及24小時)抽血以評估單一劑量之活化藥物及彼之主要代謝物的藥物動力學。每位受試者接受單次腫瘤內注射濃度5 x 107細胞之經腺病毒轉導之自體樹突細胞，該自體樹突細胞係經工程化以在RTS 之控制下表現hIL-12及一或多種其他免疫調節劑。仔細監測受試者之局部注射部位反應及/或過敏反應。第2至14天住院病患訪視：第2至14天，每位受試者在用餐後立即投予活化藥物。第2至14天每天記錄生命跡象及不良反應。在第4天±24小時，自大約50%之受試者取得腫瘤及/或引流淋巴結之活體樣本以測量hIL-12及細胞性免疫反應。第8天測量體重。第8天±24小時，自第4天未取得活體樣本之受試者取得腫瘤及/或引流淋巴結之活體樣本以測量hIL-12及一或多種其他免疫調節劑及細胞性免疫反應。在第4天±24小時及第8天±24小時抽血，以檢測抗腺病毒及/或RTS成份之潛在抗體及細胞性免疫反應。亦進行血清細胞介素分析，以了解該hIL-12及一或多種其他免疫調節劑轉基因之治療是否影響其他細胞介素之表現。第8天收集尿液及抽血以進行基礎血清化學、尿液分析及血液學檢查(安全性檢查)。在第8天的特定時間間隔(投藥前、AD投藥後0.5、1、2、4、6、8、12、16及24小時)抽血以評估該活化藥物及彼之主要代謝物的穩定狀態藥物動力學/ADME。
第14天住院病患訪視：第14天，每位受試者在用餐後立即投予活化藥物。每位受試者接受理學檢查(包括生命跡象、身高、體重及ECOG狀態)。收集尿液及抽血以進行血清化學、尿液分析及血液學檢查(安全性檢查)。在第14天±24小時抽血，以檢測抗腺病毒及/或RTS成份之潛在抗體及細胞性免疫反應。亦進行血清細胞介素分析， 以了解其他細胞介素之表現是否受到影響。
在特定住院及門診病患訪視時抽取受試者之血液，以測量抗腺病毒及RTS成份之潛在抗體及細胞性免疫反應。取得血液以進行基礎血清細胞介素分析。AdVeGFP感染性阻斷型試驗係用於檢測對腺病毒載體之抗體反應(Gambotto,Robins et al.2004)。對RTS成份之抗體反應將由西方墨點試驗及/或ELISA檢測，使用來自病患之血清及由表現載體產製之RTS蛋白。此外，多工細胞介素檢測將於血清中由路明克斯(Luminex)進行，以檢測IL-12、IFN-γ、IP-10及其他Th1/Th2細胞介素諸如IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5及IL-10。這些抗體及細胞介素檢測需要大約10毫升之血液。
抗腺病毒及/或RTS成份之潛在抗體及細胞性免疫反應：在特定住院及門診病患訪視時抽取受試者之血液，以評估抗腺病毒及RTS成份及腫瘤抗原之潛在抗體及細胞性免疫反應。AdVeGFP感染性阻斷型試驗係用於檢測對腺病毒載體之抗體反應(Nwanegbo et al.2004)。對RTS成份之抗體反應將由西方墨點試驗及/或ELISA檢測，使用來自病患之血清及由表現載體產製之RTS蛋白。此外，多工細胞介素檢測將於血清中由路明克斯(Luminex)進行，以檢測IL-12、IFN-γ、IP-10及其他Th1/Th2細胞介素諸如IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5及IL-10。這些抗體及細胞介素檢測需要大約10毫升之血液。
細胞性免疫反應試驗使用大約50至60毫升之血液， 將自其分離CD4及CD8 T細胞亞群。經分離之T細胞將於ELISPOT試驗中與經空AdV載體、AdV-RTS或AdV-RTS-hIL12-免疫調節劑載體轉導之自體DC混合，以檢測經AdV-及RTS-衍生性抗原活化之T細胞所產生之IFN-γ，若有的話。類似試驗將利用如上述之腫瘤細胞及/或表現共享黑色素瘤抗原之DC進行以檢測對腫瘤之早期免疫反應。其他試驗液可視需要進行。
懷孕測試：有懷孕可能之女性將在篩選訪視時及再治療期之第一次住院病患訪視之前進行尿液懷孕檢測。該檢測在初次治療及所有再治療期間投予活化藥物之前至少72、48、24或12小時進行。若尿液懷孕檢測呈現陽性，接著以血清懷孕檢測證實。若證實懷孕，該受試者將不能參加試驗或繼續參加再治療期。懷孕檢測可視需要盡量進行。
併用藥物問診：在篩選及再治療期之第一次住院病患訪視之前，將要求每位受試者提供併用藥物清單，以決定併用藥物與試驗期間及追蹤期發生的不良反應之任何可能的關係。
再治療標準：若受試者可耐受先前之AdDC接種而無限制性不良反應，且在可能的再治療之時未顯示疾病進行或症狀惡化，這些受試者將被考慮參加再治療。若計畫主持人及治療醫師認為，接受額外腫瘤內注射AdDC與14天連續活化藥物(第1研究世代之最高耐受劑量)之組合可能有臨床效益，則可對該名受試者提供再治療，前提為符 合下列標準：1 未出現限制性毒性，2 受試者之疾病穩定或顯示改善之臨床或主觀徵候，及3 未出現對RheoSwitch®治療系統之腺病毒成份的抗體或細胞性免疫反應。
評估轉基因功能及免疫學效應：在試驗篩選期間(第-12天至第-7天)、第4天、第8天及第14天及追蹤期的第1個月，取得腫瘤及相關引流淋巴結之穿孔或切除活體樣本，以進行hIL-12及一或多種其他免疫調節劑之轉基因表現及細胞性免疫反應之活體內評估。在再治療期的第-12天至第-7天及第14天，取得腫瘤及相關引流淋巴結之細針抽吸活檢樣本，以進行hIL-12及一或多種其他免疫調節劑之轉基因表現及細胞性免疫反應之活體內評估。活檢樣本將利用標準光學顯微鏡及免疫組織化學評估，以檢測腫瘤及引流淋巴結中T細胞之細胞性浸潤。活檢樣本切片將由不知道試驗病患背景之病理學家判讀。為了區別內源性IL-12及由腫瘤及引流淋巴結中經誘導之DC所表現之IL-12，將使用擴增RNA之RT-PCR與經適當設計之引子。在試驗篩選期間、第4天、第8天及第14天，追蹤期的第1個月，及再治療期的第-12至-7天、第8天及第14天抽血以進行血清細胞介素分析。進行血清細胞介素分析，以了解該hIL-12轉基因之治療是否影響其他細胞介素之表現。多工細胞介素檢測將於血清中由路明克斯 (Luminex)進行，以檢測IL-12、IFN-γ、IP-10及其他Th1/Th2細胞介素諸如IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5及IL-10。這些抗體及細胞介素檢測需要大約10毫升之血液。
活化藥物之單一劑量及穩定狀態藥物動力學：在試驗第1天的特定時間間隔(投藥前、早晨投藥後0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16及24小時)抽血以評估活化藥物及彼之主要代謝物的單一劑量藥物動力學，在試驗第8天抽血以測量活化藥物及彼之主要代謝物的穩定狀態藥物動力學/ADME。血漿由HPLC評估以獲得活化藥物及主要代謝物之下列穩定狀態藥物動力學終點：Cmax(最高血漿濃度)、Tmax(至最高血漿濃度時間)、Ctrough(最低血漿濃度，經計算為0及24小時之濃度的平均值)、C24h(24小時之血漿濃度)、AUC24h(自0至24小時之血漿濃度時間曲線下面積)、Ke(表觀排泄率)及T112(表觀半衰期)。
應了解前面描述之實施態樣及範例並非意圖在任何方面限制本發明之範圍，而且此處所提之權利要求範圍係意圖包含不論是否在此處明白提出之所有實施態樣及範例。
實施例3
合理選擇、模塊化之基因成份的組合可經由應用組合式轉基因技術諸如ULTRA VECTORTM而被快速地集合成為DNA表現建構體。為了證實個別地影響轉錄、轉錄後、轉譯及轉譯後處理之基因成份在集合後會一起影響基因表現量，使用RheoSwitch技術與任意選擇地人工 5'UTR、各種3'Reg+poly(A)信號(SV40及hGH)、信號肽(TNF-α及IL-2)及密碼子最佳化(+/-)設計之組合以調控轉錄，增加細胞產生及分泌TNF-α之能力。圖11顯示使用之調控元件，並以圖示代表兩側有特殊限制位點之各個模塊元件以提供精準集合模塊組合之方法。
模塊集合在經設計以接受合成性基因之DNA骨架的背景下進行。經工程化以供腺病毒包裝之ULTRA VECTORTM骨架實例顯示於圖12。組合式模塊設計與腺病毒之治療劑遞送良好地結合，因為允許使用比天然調節序列更短之小型調節序列。
活體外評估模塊組合
Figure 106128457-A0101-12-0252-93
載體被過渡性轉染至HEK293T細胞系以評估何種模塊組合導致增加之TNF-α產出。為了誘導TNF-α之表現，投予配體或載具控制至細胞。收集上清液並以ELISA測量TNF-α之量。為了設定類似野生型之基礎，載體43318包含UV符合野生型TNF-α 5'UTR、信號肽、編碼序列及SV40pA 3'Reg。個別地，TNF-α信號肽或成熟蛋白質編碼序列之模塊改變為Opt(1,2)密碼子最佳化導致蛋白質分泌逐漸增加(載體43319、43320)。另外以5U2 5'UTR模塊取代TNF-wt 5'UTR進一步提供分泌量(載體43322、43323)。TNF-α之最高分泌量是在野生型5'UTR、信號肽及編碼序列模塊分別被5U2、IL2及TNFOptUV模塊取代時(載體43329)。
為了證實TNF-α之分泌增加與細胞類型無關，該11種實驗載體及2個對照載體被轉染至CHO-K1細胞(見圖27)。載體43534(圖26)及載體43533(圖25)包含野生型TNF-α模塊係作為對照。載體43534係由野生型TNF-α序列組成，不含Ultra Vector集合支點。值得注意的是，UltraVector集合支點之存在不會不利地影響THF-α之生產及分泌。在此資料中，我們也證實以含有SV40e或hGH之polyA模塊取代TNF-α野生型3'Reg導致TNF-α的分泌增加。最大TNF-α產出係於5U2、IL2信號肽、TNFOptUV及hGHpA之組合下達成。來自CHO-K1細胞之資料顯示各模塊以5'UTR中之5U2、IL-2信號肽及TNFOptUV編碼序列取代而逐漸增加之相同趨勢。有趣的 是，增加之幅度在二種細胞類型中稍微不同。這表示雖然模塊在各種細胞類型中的作用類似，但特定細胞或組織類型之生理差異可能影響模塊取代效應之程度。擴大該組合矩陣以在各類別包括更多模塊可能允許依照細胞類型或測試組織找出最佳組合。可被包括於更大矩陣中之額外模塊實例係包括於SEQ ID NO：41至46。
實施例4：在動物模型中評估治療候選物
為了顯示誘導性最佳化TNF-α建構體治療癌例如前列腺癌或頭頸癌之有效性，可採用該疾病之頭頸癌小鼠模型。Smad4單一基因剔除已被證實可產生惡性人頭頸癌鱗狀細胞癌(HNSCC)之自發性模型(PMID：19841536)。
在缺乏該小鼠品系時，人衍生性HNSCC腫瘤細胞可被植入裸鼠。腫瘤建立後，該最佳化之TNF-α建構體可與腺病毒一起被導入腫瘤。各種劑量之配體可被投予至小鼠以調節所產生之最佳化TNF-α之量。測量腫瘤負荷及評估腫瘤壞死以自該最佳化TNF-α建構體中鑑別可能的治療候選物。
實施例5：治療實施態樣例
經工程化之TNF-α轉基因藉由腫瘤內注射非複製性腺病毒DNA載體被投予至病患。此基因計畫編碼經密碼子最佳化之成熟哺乳動物之細胞介素，該細胞介素與經密碼子最佳化之IL-2信號肽融合。接著，在該轉基因cds(IL-2 SP+TNF-α)之兩側加上野生型TNF-α 5'UTR及SV40 3' Reg+poly(A)信號，彼之表現係由RheoSwitch技術經由投予小心「撥入」劑量之活化配體控制(即在載體VVN-43320中具體化之DNA，見圖15)。初步資料顯示此DNA元件之組合產生最高可能性之TNF-α分泌誘導，同時仍提供對彼之表現「緊縮」且「不放鬆」之控制。也就是，此轉基因構型之未經誘導、基礎量之表現維持低量，比較不可能對病患展現不受控制、偏離目標之效應。
在本發明之替代實施態樣中，該經工程化之TNF-α轉基因以類似載體VVN-43329(見圖24)之模塊化DNA構型經由腺病毒投予至病患，其同時展現高基底表現及最高轉基因表現。此DNA採用人工工程化之5'U2及hGH poly(A)信號，以及完整之哺乳動物密碼子最佳化及IL-2信號肽。對於病患系統性毒性之控制係藉由在腫瘤內注射使用低MOI之腺病毒達成。在較小程度上，表現量及暫時控制亦可經由RheoSwitch活化配體調控。對此基因產物之分布的額外控制可藉由納入組織特異性miRNA反應元件加以達成，該反應元件可禁止在生命器官中偏離目標之表現或經由人工工程化腺病毒核殼以增強親和性。
在本發明之額外實施態樣中，該經工程化之TNF-α轉基因係與VVN-43328中之DNA類似(圖23)，其被預測將經由5'U2元件授予該人工mRNA高度穩定性。然而，此建構體不利用IL-2信號肽來加強分泌，且其維持來自編碼TNF-α之N'端的DNA之野生型序列。由於未知之原 因，高量分泌人工TNF-α可被清楚證實對病患不論內容之預後不利，然而細胞介素經由金屬蛋白酶「脫落(shedding)」之天然機轉可能藉由侷限該因子在彼之腫瘤環境中以限制病患毒性。如果外源性TNF-α之天然脫落仍顯示偏離目標之效應，彼之胞外結構域莖可藉由突變加以截短，以禁止天然蛋白酶之溶解，且該因子將經由細胞-細胞接觸為事實上之第二型跨膜蛋白以活化活性。或者，與載體VVN-43328描述之建構體類似之轉基因可編碼組成性表現之TNF-α，該TNF-α具有包含可供外源性蛋白酶切割之位點的突變莖胞外結構域。此外源性蛋白酶將反過來被置於RheoSwitch技術控制之啟動子元件之下，只有在活化配體存在時才被表現。因此，TNF-α之切割及活體內溶解性(但非表面表現)將由模塊化轉基因元件控制。
實施例6：Ad-RTS-IL-12之抗腫瘤療效
Ad-RTS-IL-12之抗腫瘤療效已在一系列黑色素瘤、結直腸癌、胰癌、乳癌、肺癌及腎癌之小鼠腫瘤模型中被評估。示範性劑量反應實驗如下所示。免疫競爭性C57b1/6母鼠(6至8周齡)係經B16F0小鼠黑色素瘤癌細胞之皮下接種。在腫瘤細胞接種後11天，當出現明顯之巨觀性腫瘤結節時(平均腫瘤體積約40mm3)，將小鼠分組，每組各5隻動物。總共分成9組：對照鹽水治療組、活化配體治療組、僅Ad-RTS-mIL12(1ee10 vp)組及另外6組以不同劑量之載體Ad-RTS-mIL-12(1e7、1e8、1e9、 5e9、1e10、5e10病毒顆粒)加活化載體治療。加配體組之小鼠在投予載體前一天，在2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(哈倫實驗室(Harlan Laboratories))飼料中提供100毫克/公斤活化配體(1000毫克配體/公斤飼料)。對照組小鼠提供2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet飼料。第12天，單次投予之100微升PBS中之Ad-RTS-mIL12被注射至腫瘤。每2至3天利用游標卡尺及磅秤測量腫瘤體積及體重，追蹤動物直到對照腫瘤到達2000毫米3。資料被上傳至Study Log動物試驗軟體。
如圖31所示，顯著之抗腫瘤效果出現於1ee8 vp以上之Ad-RTS-IL-12劑量(範圍73至99%)。最低測試劑量1ee7 vp之Ad-RTS-IL-12不顯示抗腫瘤效應。在活化配體不存在時，高劑量1ee10 vp之Ad-RTS-IL-12不具療效，表示需要Ad-RTS-IL-12與活化配體二者之組合。配體本身之治療亦不具療效。因此，此試驗顯示該強效之抗腫瘤療效係由Ad-RTS-IL-12與活化配體之組合所媒介。
體重分析如圖32所示。以最高劑量(5ee10 vp)之Ad-RTS-IL-12治療之動物在第19天顯示暫時性體重減輕，但在第26天恢復體重。在其他治療組中之動物未顯示任何清楚的劑量反應關係，只觀察到體重增加之微小變化。
實施例7：Ad-RTS-IL-12於Lewis肺癌模型中之療效
6至8周齡之免疫競爭性C57b/6母鼠經小鼠Lewis肺癌細胞(LLC)之皮下(s.c.)接種。在細胞接種後5天，小鼠 被隨機分配至總共4組之治療組及對照組(n=5)，分別為無治療組(對照)、僅活化配體組(RG-115932)、僅Ad-RTS-mIL12組及Ad-RTS-mIL12加活化配體組。接受活化配體(L)之組別自由採食與活化配體(1000毫克/公斤飼料)混合之2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(哈倫實驗室(Harlan Laboratories))飼料。接受僅Ad-RTS-mIL12或無治療之組別持續餵食一般飼料。當腫瘤到達28±6毫米3時開始治療。Ad-RTS-mIL12(1e10 vp/100微升PBS)係於腫瘤細胞接種後第6、9及13天經由腫瘤內(i.t.)注射投予小鼠。活化配體飼料(L)在載體投予前24小時開始給予小鼠。每隻小鼠的腫瘤體積及體重利用游標卡尺及磅秤測量每周三次直到試驗結束。當小鼠之腫瘤體積>1200毫米3時終止試驗。資料被上傳至Study Log動物試驗軟體。
治療後之腫瘤體積如圖33A所示。在對照及僅活化配體(L)組之Lewis肺腫瘤荷瘤小鼠顯示大約類似之腫瘤生長動力學。僅Ad-RTS-mIL12組之三個劑量導致中級腫瘤生長。重要的是，Ad-RTS-mIL12加活化配體(L)相較於對照組產生顯著之腫瘤生長抑制(78%)。此資料顯示Ad-RTS-mIL12在活化配體存在時抑制Lewis肺腫瘤之生長。監測體重以作為毒性指標。在試驗期間未發現嚴重之體重減輕。
實施例8：Ad-RTS-IL-12於黑色素瘤模型中之抗腫瘤療效
6至8周齡之免疫競爭性C57b/6母鼠經小鼠黑色素瘤癌細胞(B16F0)之皮下(s.c.)接種。在細胞接種後10天，小鼠被隨機分配至總共9組之治療組及對照組(n=5)，分別為無治療組(對照)、僅活化配體組(L)(RG-115932)、僅Ad-RTS-mIL12組及Ad-RTS-mIL12加不同劑量(50、100、250、500及1000毫克/公斤)之活化配體組。接受活化配體(L)之組別自由採食與活化配體(1000毫克/公斤飼料)混合之鼠2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet飼料。接受僅Ad-RTS-mIL12或無治療之組別持續餵食一般2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet chow diet飼料。當腫瘤到達56±18毫米3時開始治療。單一劑量之Ad-RTS-mIL12(1e10 vp/100微升PBS)係於腫瘤細胞接種後第13天經由腫瘤內(i.t.)注射投予小鼠。活化配體飼料(L)在載體注射前24小時給予小鼠。每隻小鼠的腫瘤體積及體重利用游標卡尺及磅秤測量每周三次直到試驗結束。當腫瘤體積>2000毫米3時終止試驗。資料被上傳至Study Log動物試驗軟體。
治療後之腫瘤體積及體重變化如圖34A及34B所示。在對照及僅活化配體(L)組之黑色素瘤荷瘤小鼠顯示類似之侵略性腫瘤生長。腫瘤生長動力學顯示活化配體組不具抗腫瘤活性。接受單一劑量Ad-RTS-mIL12(1e10 vp)但無配體之動物在第26天觀察到輕微之腫瘤生長抑制(12%)。Ad-RTS-mIL12加活化配體(L)之治療相較於對照小鼠導致腫瘤生長抑制(73至98%)。單一劑量之Ad-RTS- mIL12加50毫克/公斤之活化配體(L)相較於對照腫瘤產生顯著之腫瘤減小。值得注意的是，相較於50毫克/公斤活化配體，當活化配體之劑量增加至100至1000毫克/公斤，出現顯著之抗腫瘤活性(90至98%)。此資料清楚地顯示Ad-RTS-mIL12在黑色素瘤模型中具有療效，且展現廣泛之治療性活化配體劑量窗。監測體重以作為毒性指標。在第13及17天，1000毫克/公斤之活化配體劑量出現輕微暫時性體重改變(<5%)。在其餘試驗期間未發現嚴重之體重減輕。未發現活化配體劑量反應相關性體重變化。在不同劑量下之AdRTS-mIL12治療的耐受良好，沒有出現任何毒性徵候。
實施例9：Ad-RTS-IL-12於結腸癌模型中之抗腫瘤療效
6至8周齡之免疫競爭性Balb/C母鼠經螢光素酶表現穩定之小鼠結腸癌細胞(CT26Luc)之皮下(s.c.)接種。在細胞接種後10天，小鼠被隨機分配至總共3組之治療組及對照組(n=5)，分別為無治療組(對照)、僅活化配體組(RG-115932)及Ad-RTS-mIL12加活化配體組。接受活化配體(L)之組別自由採食與活化配體(1000毫克/公斤飼料)混合之2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(哈倫實驗室(Harlan Laboratories))飼料。接受無治療之組別持續餵食2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet chow diet。當腫瘤到達40±17毫米3時開始治療。Ad-RTS- mIL12(1e10 vp/100微升PBS)係於腫瘤細胞接種後第11及18天經由腫瘤內(i.t.)注射投予小鼠。活化配體飼料(L)在載體注射前24小時給予小鼠。每隻小鼠的腫瘤體積及體重利用游標卡尺及磅秤測量每周三次直到試驗結束。當小鼠腫瘤體積>2000毫米3時終止試驗。資料被上傳至Study Log動物試驗軟體。
治療後之腫瘤體積及體重變化如圖35A及35B所示。在對照及僅活化配體(L)組之結腸癌荷瘤小鼠顯示類似之侵略性腫瘤生長。腫瘤生長動力學顯示活化配體組不抑制腫瘤生長。二次劑量之Ad-RTS-mIL12加活化配體(L)相較於對照小鼠導致完全消退及腫瘤生長抑制(100%)。值得注意的是，Ad-RTS-mIL12治療導致五隻動物中的五隻完全沒有腫瘤。在Ad-RTS-mIL12治療後無腫瘤之小鼠再以親代CT26Luc細胞挑戰。五隻未曾接受接種之Balb/c小鼠亦經CT26Luc之皮下接種以作為對照組。該對照小鼠如預期地產生腫瘤結節。重要的是，在再挑戰後4周，所有經再挑戰之小鼠皆未發生腫瘤。此試驗顯示Ad-RTS-mIL12治療在侵略性結腸癌模型發展出強烈之抗腫瘤免疫性。監測體重以作為毒性指標。在試驗期間未發現嚴重之體重減輕。
實施例10：Ad-RTS-IL-12於胰癌模型中之抗腫瘤療效
6至8周齡之免疫競爭性C57b/6母鼠經同源PAN02 胰癌細胞(ATCC)之皮下(s.c.)接種。在細胞接種後6天，小鼠被隨機分配至4組每組各5隻動物，分別為無治療組、僅活化配體組(RG-115932)、僅Ad-RTS-mIL12組及Ad-RTS-mIL12加活化配體組。接受活化配體之組別自由採食與活化配體(1000毫克/公斤飼料)混合之2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(哈倫實驗室(Harlan Laboratories))飼料。接受僅Ad-RTS-mIL12或無治療之組別持續餵食2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet chow。小鼠在腫瘤細胞接種後第7及14天，接受劑量1e10 vp/100微升PBS之Ad-RTS-mIL12的單次腫瘤內(i.t.)注射治療。在載體治療開始時，腫瘤體積平均STGT mm3。
每周測量三次每隻小鼠的腫瘤體積及體重直到試驗結束。當小鼠之腫瘤體積超過600毫米3時終止試驗。由於胰腫瘤生長非常緩慢，我們定義試驗之終止。未接受治療之小鼠中的腫瘤生長正常。
在此腫瘤模型中，微小的腫瘤生長延緩在接受僅活化配體或僅Ad-RTS-mIL12治療之小鼠中被注意到。相反地，在所有Ad-RTS-mIL12治療小鼠中之腫瘤生長相較於未接受治療之對照小鼠受到大幅抑制(97%)。在試驗期間利用游標卡尺及磅秤測量體重以測量毒性。注射Ad-RTS-mIL12之小鼠的體重在投藥後無顯著體重降低，除了第12至13天顯示暫時性體重減少(<5%)。此外，未在任何動物觀察到病態行為(疲倦、毛皮粗糙、跛行、脫水、弓背姿 勢等)。腫瘤消退維持至第37天，當對照動物被犧牲時。資料被上傳至Study Log動物試驗軟體。
結果顯示於圖36A及36B。
實施例11：Ad-RTS-IL-12於乳癌模型中之抗腫瘤療效
此試驗之目的為評估Ad-RTS-mIL12腫瘤內治療在小鼠乳癌模型中之療效及毒性。
6至8周齡之BalbC母鼠係購自查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)或哈倫實驗室(美國)。動物照顧及實驗程序係根據英創松(Intrexon)公司之機構動物照顧及使用委員會準則進行。
小鼠乳癌(4T1)細胞系購自美國菌種保存中心(ATCC)(維吉尼亞州馬納薩斯市)。4T1細胞係生長於羅斯威爾紀念公園研究所培養基(Roswell Park Memorial Institute medium)(RPMI)1640(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯市)。該培養基添加熱不活化之胎牛血清(FCS)10%體積/體積、2毫莫耳L-麩醯胺酸(亞特蘭大生物(Atlanta Biologicals)公司，喬治亞州羅倫斯維爾市)、100 IU/毫升青黴素G及100微克/毫升鏈黴素。細胞於37℃、5% CO2中生長。所有細胞系接受例行檢測，並無發現黴漿菌。
6至8周齡之免疫競爭性BALB/c母鼠經同源之乳癌(4T1)細胞(1e5細胞/50微升)之皮下(s.c.)接種。在細胞接種後8天，小鼠被隨機分配至4組每組各5隻動物，分別 為無治療組、僅活化配體組、僅Ad-RTS-mIL12組及Ad-RTS-mIL12加活化配體組。接受活化配體之組別自由採食混合活化配體(1000毫克/公斤)之小鼠飼料。接受僅Ad-RTS-mIL12或無治療之組別持續餵食標準飼料(美國哈倫實驗室(Harlan Laboratories))。活化配體係經由Harlan Teklad(哈倫公司之客制飼料部門)生產之客製飼料投予，調製為1公斤和餵食對照動物相同之飼料中含有1000毫克之活化配體。小鼠在腫瘤細胞接種後第9、12及14天，接受劑量1e10 vp/100微升PBS之Ad-RTS-mIL12的單次腫瘤內(i.t.)注射治療。在載體治療開始時，平均腫瘤體積為36毫米3。每周測量三次每隻小鼠的腫瘤體積及體重直到試驗結束。當小鼠之腫瘤體積超過1000毫米3時終止試驗。
在乳癌4T1細胞接種後8天，小鼠被隨機分配至總共4組之治療及對照組(n=5/組)，分別為無治療組(對照)、僅活化配體組(L)、僅Ad-RTS-mIL12組及Ad-RTS-mIL12加活化配體組，如下表所示。
Figure 106128457-A0101-12-0265-94
當腫瘤平均體積到達36毫米3時開始治療。治療後之腫瘤體積如圖39A所示。僅Ad-RTS-IL-12治療及僅活化配體(L)對照組中的4T1荷瘤小鼠分別在第26天顯示~20%及35%之腫瘤生長抑制(圖39A)。重要的是，三劑之Ad-RTS-mIL12加活化配體相較於對照組導致顯著腫瘤生長抑制(82%)(p<0.005)。此資料顯示Ad-RTS-mIL12在活化配體存在時在乳癌(4T1)模型中展現強效之抗腫瘤活性。監測體重以作為毒性指標。在試驗期間未發現嚴重之體重減輕或死亡(圖39B)。
這些結果顯示直接腫瘤內注射Ad-RTS-mIL12加活化配體對誘導腫瘤消退高度有效，且在乳癌模型中具安全性。此模型中之抗腫瘤活性顯著(p<0.005)。
實施例12：投予無免疫細胞之Ad-RTS-IL-12載體之臨床程序
以下是可被用於實施本發明以投予Ad-RTS-IL-12載體之形式治療無法切除之第III C或IV期惡性黑色素瘤之臨床試驗計畫書。
本第1b期臨床試驗之目的為評估6個治療周期之腫瘤內注射Ad-RTS-IL-12與14天每日經口投予活化配體之組合的安全性及客觀反映、腫瘤反應率及免疫及其他生物活性。Ad-RTS-IL-12劑量將從1 x 1011病毒顆粒(vp)與5毫克/天劑量之活化配體開始(第1周期)投予。病毒顆粒與活化配體二者之劑量接著將根據固定計畫(表8)在每位受試者的每次重複治療周期中被調高，前提為該病患可耐受先前的治療周期。
此第1b期試驗之目的如下：
1.評估腫瘤內注射病患內劑量提高之AD-RTS-IL-12與劑量提高之活化配體之組合的重複治療周期對無法切除之第III C或IV期惡性黑色素瘤病患的安全性及耐受性。
2.藉由診斷性CT掃描(實質腫瘤反應評估標準(RECIST 1.1))、PET掃描及照片(若可行)獲得療效之適應症。
3.評估RheoSwitch治療系統(RTSTM)於病患之功能性，藉由評估AD-RTS-IL-12與活化配體組合之免疫效應，以接受注射之目標腫瘤、腫瘤相關性引流淋巴結(若可接近)及周邊循環中之細胞性免疫反應(特別是IL-12及其他細胞介素之基因表現、細胞毒性T淋巴細胞及Tregs之頻率)及其他生物活性(例如細胞凋亡及免疫細胞浸潤)而 言，並找出這些免疫及其他生物參數之變化與先前活化配體劑量及腫瘤反應之關係。
4.評估AD-RTS-IL-12被腫瘤細胞及腫瘤中之樹突細胞及巨噬細胞攝取之程度，以決定何種細胞攝取病毒不論攝取程度是否取決於AD-RTS-IL-12之劑量。測定腫瘤中、腫瘤相關引流淋巴結(若可接近)及周邊循環中之發炎反應及免疫反應(細胞性諸如細胞毒性淋巴細胞及Tregs，及誘導細胞介素)。將找出免疫及其他生物參數之改變與AD-RTS-IL-12及活化配體劑量及腫瘤反應之間的關係。
5.在病患亞群中評估每個周期第8至9天之穩定狀態期之藥物動力學特性。
6.評估將進行PK評估之病患的心電圖之QT/QTc間隔，心電圖係由連續性心電圖(Holter monitoring)獲得。
適應症：無法切除之第III C期(通路中轉移)、第IV期(M1a、M1b或M1c(LDH<=2xULN)惡性黑色素瘤，有至少4個可接近之病灶。
試驗設計：
第1b期、開放標籤、單組、多中心評估6個治療周期之安全性、耐受性、腫瘤反應(RECIST 1.1)及免疫及其他生物效應，各周期維持28天，每個周期進行腫瘤內注射Ad-RTS-IL-12與14天每日經口投予活化配體之組合。AD-RTS-IL-12及活化配體之劑量將根據圖1及表1所示在所有可耐受先前治療周期之病患中提高。
試驗族群：
所有人種之男性及女性，年齡18歲以上，具有無法切除之第III C或IV期之惡性黑色素瘤，ECOG體能狀態0至1，至少有4個可接近之病灶(最大直徑<=3公分，最小直徑>=1公分)或可摸到之腫瘤相關淋巴結(最大直徑<=5公分，最小直徑>=1.5公分)可供腫瘤內注射及活體檢查。
樣本大小：
最少12名及最多28名第III C或IV期之惡性黑色素瘤病患將參與本試驗。在此試驗計畫中之所有病患將進入單一組別，每次重複治療周期將依據圖1及表1進行AD-RTS-IL-12及活化配體之病患內劑量提高，前提是病患能耐受前次治療周期。
測試製品：
每個周期中病患將接受口服活化配體與腫瘤內注射基因療法(Ad-RTS-IL-12)之組合治療，該基因療法係經工程化以藉由對活化配體之劑量依賴性反應表現誘導性hIL-12。AD-RTS-IL-12將於中央製造廠中製備及冷凍，然後運送至適當之臨床中心。所有病患將接受腫瘤內注射(每個周期一次，最多6個周期，每次周期相隔4周)AD-RTS-IL-12(每次注射約1.0 x 1011及1.0 x 1012總病毒顆粒)。病患亦將接受每天一次之口服活化配體，每次周期連續14天。AD-RTS-IL-12及/或活化配體之劑量將在周期2至6開始時(見表8)，在所有能耐受前次治療周期之病患中進行病患內提高。AD-RTS-IL-12將於每次周期被 注射至不同病灶，若病灶之數目有限，該注射將以依序輪流之方式進行。在最少4個可接近病灶中的一個不接受注射，該病灶被用來評估AD-RTS-IL-12之系統性效應。病患投藥將交錯至少相隔24小時。每個周期將有一次腫瘤內注射，發生在投予第一劑活化配體後大約3小時(±30分鐘)。
劑量：
活化配體：最低劑量/天：5毫克；中間劑量/天：20毫克；最高劑量/天：100毫克。活化配體將在每次周期的前14天投予。
Ad-RTS-IL-12：劑量：每次注射大約1.0 x 1011或1.0 x 1012病毒顆粒/腫瘤懸浮於總體積0.5毫升無菌溶液，注射體積分布在整個病灶，特別是腫瘤邊緣之區域。
Figure 106128457-A0101-12-0269-95
以次高劑量治療將等到前次治療之安全性及耐受性被確認後才開始。若MTD被定義，則不繼續提高。
投予途徑：
活化配體：軟明膠膠囊中之溶液，在用餐30分鐘內口服；
AD-RTS-IL-12：
在每次周期的第一天注射至一個可接近之腫瘤病灶或需要時注射至腫瘤相關性(可摸到)引流淋巴結。
病患分組方法：
所有病患將根據表8接受治療，進入一組。在每次治療周期期間或之後，將嚴格檢驗所有病患之安全性及耐受性。只有在前次治療周期的耐受良好時才會提高劑量。
試驗期間：
此試驗將在每位病患篩選後持續大約28周。
在最多23天之篩選評估期後(第-30至-7天)，病患將被核准參加試驗。在第-6至-2天將進行基準期生檢，第0天將對評估PK之病患利用連續性心電圖(Holter monitoring)進行基準期心臟功能評估。在每次周期第1天，經核准之病患將開始接受試驗治療(一次腫瘤內注射AD-RTS-IL-12及依次活化配體口服劑量)。每次周期中之活化配體治療將持續共14天，接下來14天加以廓清及觀察安全性。試驗治療由6個周期組成，每個周期共維持28天，包括14天之追蹤期。治療後追蹤評估將於最後一次注射後6周進行(最後一次活化配體劑量之後4周)。測 定血中之病毒性DNA。若病毒性DNA存在於最後一次注射後6周，將繼續檢測病毒性DNA。然而，若各來源之Q-PCR呈現二次連續陰性結果，則無需再進行測試。
主要終點：
安全性及耐受性將由理學檢查(包括ECOG體能狀態)、心電圖中之QT/QTc間隔(在PK病患)、生命跡象、血清化學、尿液分析、血液學及病患之任何不良反應報告加以評估。客觀反應及反應率由CT掃描評估。
次要終點：
在8名病患亞組(每個AD-RTS-IL-12劑量4名病患)中之活化配體的穩定狀態藥物動力學。
b.腫瘤中、腫瘤相關引流淋巴結(若可接近)及周邊循環中因為治療導致之發炎及免疫反應之程度(細胞性諸如細胞毒性淋巴細胞及Tregs，及誘導細胞介素)。
c.免疫及其他生物參數與AD-RTS-IL-12及活化配體劑量及腫瘤反應之相關變化。
d.亦由PET掃描及照片評估之療效。
e.長期追蹤將長達5年。由計畫主持人每年聯絡病患。
納入標準：
a.所有人種、年齡18歲以上之男性或女性；b.無法切除之第III C(通路中轉移)或IV期黑色素瘤(M1a、M1b、M1c及LDH<=2x ULN)，來自原發表皮、黏膜或甲下之任何腫瘤厚度之黑色素瘤，或來自不明原發 部位；c.最少4個可接近之非內臟病灶(最大直徑<=3公分，最小>=1公分)或可摸到之腫瘤相關淋巴結(最大直徑<=5公分，最小>=1.5公分)以供腫瘤內注射或生檢。至少一個病灶將不被注射。
d.ECOG體能狀態0或1；e.無可見腦轉移之病患，在篩選時或參加試驗前30天內以對比增強MRI掃描評估；f.適當之基準期血液學及器官功能，由試驗治療之治療前及重複治療周期及活化配體劑量提高前之30天內的實驗室數值評估如下：血紅素>=10克/升，顆粒球>2500/毫米3，淋巴細胞>1000/毫米3，血小板>100,000/毫米3，血清肌酸酐<1.5 x ULN，AST、ALT、鹼性磷酸酶<2.5 x ULN，LDH<=2 x ULN，血清膽紅素<1.5 x ULN，絕對嗜中性球>500/毫米3；g.計畫主持人認為預期存活期至少大約6個月(主要由體能狀態評估)；h.女性必須停經或手術絕育或實施有效避孕措施；未經手術絕育及伴侶未停經或手術絕育之男性必須實施有效的避孕措施；i.正常凝血參數以PT/PTT測量；j.簽署IRB核准之受試者同意書。
排除標準：
a.需要特定治療之主動性、急性病毒性、細菌性或真 菌性感染；b. HIV感染，因為可能無法引起有效之免疫反應；c.需要類固醇(>10毫克強體松(prednisone)或相等物)或其他免疫抑制劑治療之活性自體免疫性疾病；d.篩選時(或參加試驗前30天內)發現可檢測之腦轉移之病患，以對比增強MRI掃描評估；e.病灶>3公分(LD)或可摸到之腫瘤相關性淋巴結>5公分(LD)之病患；f.血紅素<10克/升之病患；g.出現第IV期內臟轉移或其他遠處轉移，若LDH>2 x ULN；h.曾接受過AD-RTS-IL-12或活化配體治療之病患；i.曾接受過腫瘤內基因療法之病患；j.器官異體移植之接受者；k.其他併發之臨床活性惡性病，其他皮膚癌除外；l.距先前化學療法、荷爾蒙療法、放射療法、免疫療法或任何第一線治療之完成不到30天(在第一劑試驗藥物之前)；m.臨床顯著之腦血管疾病；n.併發嚴重心功能不全(紐約心臟協會分類III或IV)或冠狀動脈疾病或其病史；o.可能被認為是無法接受之麻醉或手術風險之急性醫學狀況諸如缺血性心臟病或肺病；p.併發出血或凝血疾病或其病史； q.併用免疫抑制療法諸如皮質類固醇(>10毫克強體松(prednisone)或相等物)及環孢靈A(cyclosporin A)；r.併用研究性治療，或在過去30天內(在試驗藥物之第一劑之前)接受任何研究性治療；s.併用經由CYP450 3A4途徑代謝之藥物；t.哺乳或懷孕婦女；u.對本製品之任何成分有過敏病史之病患，例如與活化配體有關之苯甲酸，其包含二個苯環；v.任何醫學或精神狀況，由計畫主持人考量認為將無法接受地減少該提議治療之安全性或遞送，或無法取得自願性受試者同意書。
統計方法：
客觀反應(CR+PR)將基於注射及非注射腫瘤病灶以及可摸到之腫瘤相關性淋巴結由CT掃描[利用實質腫瘤反應評估標準(RECIS T 1.1)]得到之大小變化評估。PET掃描及/或照片將可被分別用於評估代謝活性或大小(皮膚病灶)。
OS及ORR之主要分析將包括信賴區間，且將在樣本數到達12、16、20、24名病患及在最後一名病患治療後6周進行。
人口學、免疫學及生物活性數值，以及安全性參數包括不良反應頻率及實驗室數值將在追蹤期結束後進行描述性分析。結果將被摘要成表格、圖片及病患結果列表。
描述性統計學包括平均值、中位數、標準差及直方圖 將被用於摘要連續數值。頻率計算將被用於類別變數，包括客觀腫瘤反應。免疫及生物活性將與抗腫瘤效應相關。這些統計學將分層提供(腫瘤病灶大小：<=1公分最大直徑[LD]，>1公分LD；涉及DLN之大小：<=3公分LD，>3公分LD；病灶位置：內臟、非內臟；病灶注射狀態：注射、未注射)。統計分析將在各治療周期及整體結束後進行。以整體分析而言，觀察可被跨層結合，但不跨周期結合。
順從性：
本試驗依照現行藥品優良臨床試驗規範(cGCP)進行。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性mIL-12及mIL-21
<400> 1
Figure 106128457-A0101-12-0283-96
Figure 106128457-A0101-12-0284-97
Figure 106128457-A0101-12-0285-98
Figure 106128457-A0101-12-0286-99
Figure 106128457-A0101-12-0287-100
Figure 106128457-A0101-12-0288-101
Figure 106128457-A0101-12-0289-102
Figure 106128457-A0101-12-0290-103
Figure 106128457-A0101-12-0291-104
<210> 2
<211> 13333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性hIL-12及hIL-21
<400> 2
Figure 106128457-A0101-12-0291-105
Figure 106128457-A0101-12-0292-106
Figure 106128457-A0101-12-0293-107
Figure 106128457-A0101-12-0294-108
Figure 106128457-A0101-12-0295-109
Figure 106128457-A0101-12-0296-110
Figure 106128457-A0101-12-0297-111
Figure 106128457-A0101-12-0298-112
Figure 106128457-A0101-12-0299-113
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<211> 11553
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性mIL-21及mIL-15
<400> 3
Figure 106128457-A0101-12-0299-114
Figure 106128457-A0101-12-0300-115
Figure 106128457-A0101-12-0301-116
Figure 106128457-A0101-12-0302-117
Figure 106128457-A0101-12-0303-118
Figure 106128457-A0101-12-0304-119
Figure 106128457-A0101-12-0305-120
<210> 4
<211> 12279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性mIL-12
<400> 4
Figure 106128457-A0101-12-0306-121
Figure 106128457-A0101-12-0307-122
Figure 106128457-A0101-12-0308-123
Figure 106128457-A0101-12-0309-124
Figure 106128457-A0101-12-0310-125
Figure 106128457-A0101-12-0311-126
Figure 106128457-A0101-12-0312-127
Figure 106128457-A0101-12-0313-128
<210> 5
<211> 11601
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性hIL-21及hIL-15
<400> 5
Figure 106128457-A0101-12-0313-129
Figure 106128457-A0101-12-0314-130
Figure 106128457-A0101-12-0315-131
Figure 106128457-A0101-12-0316-132
Figure 106128457-A0101-12-0317-133
Figure 106128457-A0101-12-0318-134
Figure 106128457-A0101-12-0319-135
Figure 106128457-A0101-12-0320-136
<210> 6
<211> 12270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性hIL-12
<400> 6
Figure 106128457-A0101-12-0320-137
Figure 106128457-A0101-12-0321-138
Figure 106128457-A0101-12-0322-139
Figure 106128457-A0101-12-0323-140
Figure 106128457-A0101-12-0324-141
Figure 106128457-A0101-12-0325-142
Figure 106128457-A0101-12-0326-143
Figure 106128457-A0101-12-0327-144
<210> 7
<211> 10404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性mIL-21
<400> 7
Figure 106128457-A0101-12-0327-145
Figure 106128457-A0101-12-0328-146
Figure 106128457-A0101-12-0329-147
Figure 106128457-A0101-12-0330-148
Figure 106128457-A0101-12-0331-149
Figure 106128457-A0101-12-0332-150
Figure 106128457-A0101-12-0333-302
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<211> 10452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性hIL-21
<400> 8
Figure 106128457-A0101-12-0333-303
Figure 106128457-A0101-12-0334-304
Figure 106128457-A0101-12-0335-305
Figure 106128457-A0101-12-0336-306
Figure 106128457-A0101-12-0337-307
Figure 106128457-A0101-12-0338-308
Figure 106128457-A0101-12-0339-309
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<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性mIL-21
<220>
<221> CDS
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<400> 9
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Figure 106128457-A0101-12-0340-311
<210> 10
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 10
Figure 106128457-A0101-12-0340-312
Figure 106128457-A0101-12-0341-313
<210> 11
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性mIL-15
<220>
<221> CDS
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<400> 11
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Figure 106128457-A0101-12-0342-316
<210> 12
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 12
Figure 106128457-A0101-12-0342-315
Figure 106128457-A0101-12-0343-317
<210> 13
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1008)
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Figure 106128457-A0101-12-0344-319
Figure 106128457-A0101-12-0345-320
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 14
Figure 106128457-A0101-12-0345-321
Figure 106128457-A0101-12-0346-322
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> CDS
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Figure 106128457-A0101-12-0348-324
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 16
Figure 106128457-A0101-12-0348-325
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> CDS
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<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 18
Figure 106128457-A0101-12-0350-328
Figure 106128457-A0101-12-0351-330
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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Figure 106128457-A0101-12-0352-333
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<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 20
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Figure 106128457-A0101-12-0353-334
<210> 21
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
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Figure 106128457-A0101-12-0354-336
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 22
Figure 106128457-A0101-12-0355-337
Figure 106128457-A0101-12-0356-338
<210> 23
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性hIL-12,p35
<220>
<221> CDS
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<400> 23
Figure 106128457-A0101-12-0356-339
Figure 106128457-A0101-12-0357-341
<210> 24
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性建構體
<400> 24
Figure 106128457-A0101-12-0357-340
Figure 106128457-A0101-12-0358-342
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)
<400> 25
Figure 106128457-A0101-12-0359-343
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 26
Figure 106128457-A0101-12-0359-344
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)
<400> 27
Figure 106128457-A0101-12-0359-347
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性歸巢內核酸？(HE)(I-SceI)
<400> 28
Figure 106128457-A0101-12-0359-345
<210> 29
<211> 37323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)
<400> 29
Figure 106128457-A0101-12-0359-346
Figure 106128457-A0101-12-0360-348
Figure 106128457-A0101-12-0361-349
Figure 106128457-A0101-12-0362-350
Figure 106128457-A0101-12-0363-351
Figure 106128457-A0101-12-0364-352
Figure 106128457-A0101-12-0365-353
Figure 106128457-A0101-12-0366-354
Figure 106128457-A0101-12-0367-355
Figure 106128457-A0101-12-0368-356
Figure 106128457-A0101-12-0369-357
Figure 106128457-A0101-12-0370-358
Figure 106128457-A0101-12-0371-359
Figure 106128457-A0101-12-0372-360
Figure 106128457-A0101-12-0373-361
Figure 106128457-A0101-12-0374-362
Figure 106128457-A0101-12-0375-363
Figure 106128457-A0101-12-0376-364
Figure 106128457-A0101-12-0377-365
Figure 106128457-A0101-12-0378-366
Figure 106128457-A0101-12-0379-367
Figure 106128457-A0101-12-0380-368
Figure 106128457-A0101-12-0381-369
<210> 30
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人腫瘤壞死因子WT 5' UTR
<400> 30
Figure 106128457-A0101-12-0381-370
<210> 31
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5u2
<400> 31
Figure 106128457-A0101-12-0381-371
<210> 32
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optUV 1：2信號肽-IL-2
<400> 32
Figure 106128457-A0101-12-0382-374
<210> 33
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtUV信號肽-人TNF(TNF超家族，成員2)
<400> 33
Figure 106128457-A0101-12-0382-373
<210> 34
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optUV 1：2信號肽-人腫瘤壞死因子(TNF超家族，成員2)
<400> 34
Figure 106128457-A0101-12-0382-372
<210> 35
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtUV編號序列人TNF(TNF超家族，成員2)
<400> 35
Figure 106128457-A0101-12-0383-375
<210> 36
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optUV 1：2編碼序列智人(Homo sapiens)腫瘤壞死因子(TNF超家族，成員2)
<400> 36
Figure 106128457-A0101-12-0383-376
<210> 37
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α之胺基酸序列
<400> 37
Figure 106128457-A0101-12-0383-377
Figure 106128457-A0101-12-0384-379
<210> 38
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SV40e 3Reg含polyA
<400> 38
Figure 106128457-A0101-12-0384-378
<210> 39
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH 3Reg含PolyA
<400> 39
Figure 106128457-A0101-12-0385-380
<210> 40
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TNF α 3'UTR
<400> 40
Figure 106128457-A0101-12-0385-381
Figure 106128457-A0101-12-0386-383
<210> 41
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TNF α 3'UTR AtoC突變
<400> 41
Figure 106128457-A0101-12-0386-382
Figure 106128457-A0101-12-0387-384
<210> 42
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人GAST,3'-UTR
<400> 42
Figure 106128457-A0101-12-0387-386
<210> 43
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性3' REG
<400> 43
Figure 106128457-A0101-12-0387-385
Figure 106128457-A0101-12-0388-390
<210> 44
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人GAPDH 5UTR
<400> 44
Figure 106128457-A0101-12-0388-389
<210> 45
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtUV胰島素SP編碼序列
<400> 45
Figure 106128457-A0101-12-0388-388
<210> 46
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wtUV人FGF-19信號肽
<400> 46
Figure 106128457-A0101-12-0388-387
<210> 47
<211> 10780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN_43318
<400> 47
Figure 106128457-A0101-12-0389-391
Figure 106128457-A0101-12-0390-392
Figure 106128457-A0101-12-0391-393
Figure 106128457-A0101-12-0392-394
Figure 106128457-A0101-12-0393-395
Figure 106128457-A0101-12-0394-396
Figure 106128457-A0101-12-0395-397
<210> 48
<211> 10780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43319
<400> 48
Figure 106128457-A0101-12-0395-398
Figure 106128457-A0101-12-0396-399
Figure 106128457-A0101-12-0397-400
Figure 106128457-A0101-12-0398-401
Figure 106128457-A0101-12-0399-402
Figure 106128457-A0101-12-0400-403
Figure 106128457-A0101-12-0401-404
<210> 49
<211> 10624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43320
<400> 49
Figure 106128457-A0101-12-0401-405
Figure 106128457-A0101-12-0402-406
Figure 106128457-A0101-12-0403-407
Figure 106128457-A0101-12-0404-408
Figure 106128457-A0101-12-0405-409
Figure 106128457-A0101-12-0406-410
Figure 106128457-A0101-12-0407-411
<210> 50
<211> 10790
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43321 5u2
<400> 50
Figure 106128457-A0101-12-0408-412
Figure 106128457-A0101-12-0409-413
Figure 106128457-A0101-12-0410-414
Figure 106128457-A0101-12-0411-415
Figure 106128457-A0101-12-0412-416
Figure 106128457-A0101-12-0413-417
Figure 106128457-A0101-12-0414-418
<210> 51
<211> 10790
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43322 5U2
<400> 51
Figure 106128457-A0101-12-0414-419
Figure 106128457-A0101-12-0415-420
Figure 106128457-A0101-12-0416-421
Figure 106128457-A0101-12-0417-422
Figure 106128457-A0101-12-0418-423
Figure 106128457-A0101-12-0419-424
Figure 106128457-A0101-12-0420-425
<210> 52
<211> 10575
<212> DNA
<213> 人工有機體
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43323 5U2
<400> 52
Figure 106128457-A0101-12-0420-426
Figure 106128457-A0101-12-0421-427
Figure 106128457-A0101-12-0422-428
Figure 106128457-A0101-12-0423-429
Figure 106128457-A0101-12-0424-430
Figure 106128457-A0101-12-0425-431
Figure 106128457-A0101-12-0426-432
Figure 106128457-A0101-12-0427-433
<210> 53
<211> 11276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43324
<400> 53
Figure 106128457-A0101-12-0427-434
Figure 106128457-A0101-12-0428-435
Figure 106128457-A0101-12-0429-436
Figure 106128457-A0101-12-0430-437
Figure 106128457-A0101-12-0431-438
Figure 106128457-A0101-12-0432-439
Figure 106128457-A0101-12-0433-440
<210> 54
<211> 11276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43325
<400> 54
Figure 106128457-A0101-12-0433-441
Figure 106128457-A0101-12-0434-442
Figure 106128457-A0101-12-0435-443
Figure 106128457-A0101-12-0436-444
Figure 106128457-A0101-12-0437-445
Figure 106128457-A0101-12-0438-446
Figure 106128457-A0101-12-0439-447
Figure 106128457-A0101-12-0440-448
<210> 55
<211> 11120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5PolyDNA_from_VVN-43326
<400> 55
Figure 106128457-A0101-12-0440-449
Figure 106128457-A0101-12-0441-450
Figure 106128457-A0101-12-0442-451
Figure 106128457-A0101-12-0443-452
Figure 106128457-A0101-12-0444-453
Figure 106128457-A0101-12-0445-454
Figure 106128457-A0101-12-0446-455
<210> 56
<211> 11286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43327 5U2
<400> 56
Figure 106128457-A0101-12-0447-456
Figure 106128457-A0101-12-0448-457
Figure 106128457-A0101-12-0449-458
Figure 106128457-A0101-12-0450-459
Figure 106128457-A0101-12-0451-460
Figure 106128457-A0101-12-0452-461
Figure 106128457-A0101-12-0453-462
<210> 57
<211> 11286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43328
<400> 57
Figure 106128457-A0101-12-0453-463
Figure 106128457-A0101-12-0454-464
Figure 106128457-A0101-12-0455-465
Figure 106128457-A0101-12-0456-466
Figure 106128457-A0101-12-0457-467
Figure 106128457-A0101-12-0458-468
Figure 106128457-A0101-12-0459-469
Figure 106128457-A0101-12-0460-471
<210> 58
<211> 11130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43329
<400> 58
Figure 106128457-A0101-12-0460-470
Figure 106128457-A0101-12-0461-472
Figure 106128457-A0101-12-0462-473
Figure 106128457-A0101-12-0463-474
Figure 106128457-A0101-12-0464-475
Figure 106128457-A0101-12-0465-476
Figure 106128457-A0101-12-0466-477
<210> 59
<211> 11824
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43533
<400> 59
Figure 106128457-A0101-12-0467-478
Figure 106128457-A0101-12-0468-479
Figure 106128457-A0101-12-0469-480
Figure 106128457-A0101-12-0470-481
Figure 106128457-A0101-12-0471-482
Figure 106128457-A0101-12-0472-483
Figure 106128457-A0101-12-0473-484
<210> 60
<211> 11780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyDNA_from_VVN-43534
<400> 60
Figure 106128457-A0101-12-0474-485
Figure 106128457-A0101-12-0475-486
Figure 106128457-A0101-12-0476-487
Figure 106128457-A0101-12-0477-488
Figure 106128457-A0101-12-0478-489
Figure 106128457-A0101-12-0479-490
Figure 106128457-A0101-12-0480-491
<210> 61
<211> 12196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad-RTS-hIL-12是VVN2823
<400> 61
Figure 106128457-A0101-12-0481-492
Figure 106128457-A0101-12-0482-493
Figure 106128457-A0101-12-0483-494
Figure 106128457-A0101-12-0484-495
Figure 106128457-A0101-12-0485-496
Figure 106128457-A0101-12-0486-497
Figure 106128457-A0101-12-0487-498
Figure 106128457-A0101-12-0488-499
<210> 62
<211> 12166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ad-RTS-mIL-12是VVN2539
<400> 62
Figure 106128457-A0101-12-0488-500
Figure 106128457-A0101-12-0489-501
Figure 106128457-A0101-12-0490-502
Figure 106128457-A0101-12-0491-503
Figure 106128457-A0101-12-0492-504
Figure 106128457-A0101-12-0493-505
Figure 106128457-A0101-12-0494-506
Figure 106128457-A0101-12-0495-507
Figure 106128457-A0101-11-0003-1

Claims (13)

  1. 一種套組，其包含至少2種成分：(A)至少1.0×1011個病毒粒子，該病毒粒子包含多核苷酸，該多核苷酸編碼以蛻皮激素受體為基底之基因開關，其中該多核苷酸包含：(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子；和(2)一種與啟動子可操作性連接之多核苷酸，該多核苷酸編碼免疫調節劑蛋白，該免疫調節劑蛋白與人IL-12具有至少90%一致性，該啟動子係藉由該配體依賴性轉錄因子活化；及(B)一或多個約10至約20mg之二醯基肼配體的劑量，該二醯基肼配體活化該配體依賴性轉錄因子。
  2. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該病毒粒子係腺病毒。
  3. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該套組包含約20mg之二醯基肼配體的劑量。
  4. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該套組包含約1.0×1011至約1.0×1012個病毒粒子。
  5. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該病毒粒子將經由腫瘤內投予。
  6. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該二醯基肼配體將經由口服投予。
  7. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該二醯基肼配體係RG-115819。
  8. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該二醯基肼配體係RG-115830。
  9. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該二醯基肼配體係RG-115932。
  10. 如申請專利範圍第1項之套組，其係用於治療人之神經膠質瘤。
  11. 如申請專利範圍第10項之套組，其中該神經膠質瘤係神經膠母細胞瘤。
  12. 如申請專利範圍第1項之套組，其中自投予該病毒粒子之前24小時至投予該病毒粒子之後24小時的期間，第一劑量之該二醯基肼配體將被投予。
  13. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該二醯基肼配體將被每日投予達7至28天之期間。
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