JP2018011597A - 治療タンパク質を条件的に発現するベクター、該ベクターを含む宿主細胞およびそれらの使用 - Google Patents

治療タンパク質を条件的に発現するベクター、該ベクターを含む宿主細胞およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】癌、リソソーム蓄積病、眼疾患、肝疾患または感染症の遺伝子治療のためのポリヌクレオチドの提供。【解決手段】遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の治療タンパク質の機能(複数可)を有するタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターであって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、ベクター。【選択図】なし

Description

本発明は、疾患および障害、例えば、癌、リソソーム蓄積病、眼疾患、肝疾患または感
染症の治療のための遺伝子治療の分野に関する。一実施形態において、本発明は、免疫細
胞または治療補助細胞(TSC)が1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジ
ュレーター)を発現するような該細胞の遺伝子操作および治療としての該細胞の使用を提
供する。別の一実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている治療タンパク質
(例えば、免疫モジュレーター(immunodulator))、例えば、IL−12、TNF−α
の条件的な発現のためのベクター、例えば、アデノウイルスおよびこのようなベクターを
用いる方法を包含する。
インターロイキン−12(IL−12)は、防御免疫応答および腫瘍形成の抑制を非限
定的に含む、いくつかの生物学的過程への寄与に関係するI型サイトカインファミリーの
メンバーである(Abdi et al., 2006;Adorini, 1999;Adorini, 2001;Adorini et al.,
2002;Adorini et al., 1996;Akhtar et al., 2004;Akiyama et al., 2000;Al-Mohan
na et al., 2002;Aliberti et al., 1996;Allavena et al., 1994;Alli and Khar, 20
04;Alzona et al., 1996;Amemiya et al., 2006;Araujo et al., 2001;Arulanandam
et al., 1999;Athie et al., 2000;Athie-Morales et al., 2004;Bertagnolli et al.
, 1992;Bhardwaj et al., 1996;Biedermann et al., 2006;Brunda and Gately, 1994
;Buchanan et al., 1995;Romani et al., 1997;Rothe et al., 1996;Satoskar et al
., 2000;Schopf et al., 1999;Thomas et al., 2000;Tsung et al., 1997;Wolf et a
l., 1994;Yuminamochi et al., 2007)。IL−12がヒト疾患(例えば、癌)を抑える
ための有望な標的である可能性を示唆する証拠は増えている。
IL−12が1型抗腫瘍NK細胞、CD4T細胞およびCD8T細胞に対するその
強力な補助活性に基づき、癌治療薬として依然として有望であるという事実(Trinchieri
, 2003)にもかかわらず、患者において報告されている組換えヒトIL−12(rhIL
−12)の毒性(Atkins et al., 1997)は、臨床適用のためのGMP等級のrhIL−
12の供給源が限られていることと併せて、IL−12に基づく治療アプローチの成功を
妨げてきた。このため、遺伝子治療アプローチがより安全で、筋道の立った治療選択肢で
あると考えることは妥当であるように思われる。実際に、組換えウイルス(Sangro et al
., 2004;Triozzi et al., 2005)もしくは組換えプラスミドに基づくIL−12 cD
NA(Heinzerling et al., 2005)の、またはIL−12遺伝子が改変された自己線維芽
細胞(Kang et al., 2001)の腫瘍内または腫瘍周囲送達を採り入れた第1相臨床試験で
は、安全性および十分な忍容性が明らかにされている。
しかし、これらの遺伝子療法を受けている黒色腫または様々な癌の患者における客観的
な臨床的奏効は稀で、一定せず、一過性であり、かつ多くは治療部位に限局していた(He
inzerling et al., 2005;Kang et al., 2001;Sangro et al., 2004;Triozzi et al.,
2005)。疾患の消散が部分的または完全であった症例では、腫瘍浸潤性リンパ球の頻度の
増大(Heinzerling et al., 2005;Sangro et al., 2004)および腫瘍特異的循環CD8
T細胞のレベルの上昇(Heinzerling et al., 2005)が認められており、これはこれら
の患者における抗原特異的T細胞のクロスプライミングの向上と合致する。
特異的T細胞のクロスプライミングは、IL−12の自然の、しかし調節下にある供給
源として働く樹状細胞(DC)によって最もうまく達成されるため(Berard et al., 200
0)、DCに基づくIL−12遺伝子治療の前臨床試験での有効性が相対的に優れていた
という最近の報告は大変興味深い(Satoh et al., 2002;Tatsumi et al., 2003;Yamana
ka et al., 2002)。例えば、マウスモデルにおける、IL−12p70を産生するよう
に(組換えアデノウイルス感染により)遺伝子操作されたDCの腫瘍内(i.t.)注射
は、広域反応性の腫瘍特異的CD8T細胞レパートリーのクロスプライミングの劇的な
向上をもたらし、それに呼応して腫瘍拒絶が生じたことが示されている(Tatsumi et al.
, 2003)。CMVに基づくプロモーターの下でmIL−12をコードする組換えアデノウ
イルス(rAd.cIL12、(Tatsumi et al., 2003))が以前に用いられたことを考
慮すれば、遺伝子操作されたDCによるIL−12の産生は恒常的であり、それ故に、初
期の腫瘍病変内および後期の腫瘍流入領域リンパ節内でのこのサイトカインの免疫学的影
響を治療成績に関して分けて分析することはできなかった。このため、導入遺伝子の発現
レベルおよび導入遺伝子の活性化のタイミングの両方を調節することを目的として、IL
−12の条件的発現のために遺伝子操作されたDCには需要が存在する。本発明は、その
ような細胞の使用に関する有望な治療成績を提供する。
前臨床または臨床試験において現在研究中の治療タンパク質の多くは、患者の宿主細胞
において核酸配列が発現する前の患者に存在しても、あるいは適切な生理的状況において
も、有害な副作用を示さない。しかし、腫瘍壊死因子(TNF)等、一部のタンパク質は
、正常な生理的組織または状況の外部で発現すると(例えば、非標的組織に曝露されると
)有害作用を生じる。このタンパク質の全身投与は、あるいは局所投与であっても、多く
の非腫瘍細胞型に対し非常に毒性があり、アナフィラキシーおよびカヘキシーを増強する
。さらに、TNF−αへの曝露の延長は、急性刺激とは大きく異なる細胞応答を生じ得る
。このため、癌に対する安全かつ有効なTNF−α療法は、依然として達成困難である。
対象核酸配列によってコードされたタンパク質を含有するベクター組成物による遺伝子
の発現に付随する問題を考慮すると、依然として、直接注射に用いられる、あるいは細胞
に基づく治療法における使用のための導入ベクター組成物を改善する必要がある。
リソソーム蓄積症(LSD)は、現在、酵素補充療法の形態のタンパク質療法でしか治
療できない遺伝性の遺伝子障害のクラスを表す。
LSDは、1つまたは複数のリソソーム酵素の欠損と、それによって生じるリソソーム
内部における未消化巨大分子の蓄積によって特徴付けられる49種の遺伝性障害のクラス
である。これら老廃物の蓄積により細胞内のリソソームが肥大し、細胞損傷および変性を
もたらす。臓器および組織における損傷の蓄積は、肉体および/または精神状態における
進行性の悪化を生じ、最終的に死をもたらす。診断は通常、乳児期になされる。個々の疾
患の重症度は変動的であり、欠損遺伝子によって産生される残存酵素活性の量と相関する
LSDの発生率は、およそ5000人に1人(世界的に130,000症例)である。
重症度は変動的であり、欠損遺伝子によって産生される残存酵素活性の量と相関する。重
度に罹患した患者は、10代までしか生きられないが、より軽度に罹患した患者は、成人
期まで生存できる。
酵素補充療法は、LSDの治療に利用できる唯一の方法である。治療法は、リソソーム
を標的とする、蓄積した老廃物分子を崩壊させる活性タンパク質の全身注入からなる。L
SDタンパク質療法の例として、ファブリー病のためのファブラザイム(Genzyme
)、MPS IIのためのエラプレース(Shire)、ポンペ病のためのMyozom
e(Genzyme)およびゴーシェ病のためのセレザイム(Genzyme)が挙げら
れる。
酵素補充療法は、翻訳後タンパク質修飾の必要があること、補充酵素が、インビボにお
いて短い半減期を示すこと、そして患者が補充酵素に対し免疫応答を発症すること等、若
干の問題点を伴う。したがって、依然として、本技術分野において、リソソーム蓄積症を
治療するための酵素補充療法および酵素補充療法に代わる治療法の必要がある。
本発明は、1つまたは複数のプロモーターの制御下にある、1つまたは複数の治療タン
パク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコ
ードする組換えベクターを提供する。1つの態様において、1つまたは複数のプロモータ
ーは条件的である。別の態様において、1つまたは複数のプロモーターは構成的である。
別の態様において、ベクターは、ジアシルヒドラジン(例えば、RG−115819、R
G−115830またはRG−115932)などの可溶性低分子リガンドの供給によっ
て条件的に活性化させることのできるプロモーターで駆動される1つまたは複数のタンパ
ク質をコードするアデノウイルスベクターである。本ベクターは、免疫細胞、TSCから
のタンパク質(複数可)発現および治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)を含
むベクターの直接注射からのタンパク質(複数可)発現の制御を可能にする。
1つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む
、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つ
または複数のタンパク質を条件的に発現させるためのベクターであって、遺伝子スイッチ
をコードする前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガ
ンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前記リガ
ンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、治療タンパク質(
例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド、を含むベクターを提供する。1つの態様において、治療タンパク質(
例えば、免疫モジュレーター)は、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5
、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニット、IL−
15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、
IFN−α、IFN−γ、CCL3(MIP−1a)、CCL5(RANTES)、CC
L7(MCP3)、XCL1(リンホタクチン)、CXCL1(MGSA−α)、CCR
7、CCL19(MIP−3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)
、CXCL12(SDF−1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4−1BB
L、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b−デフェンシン、HMGB1、F
lt3L、IFN−β、TNF−α、dnFADD、TGF−α、PD−L1RNAi、
PD−L1アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRIIDN、ICOS−L、S1
00、CD40L、p53、サバイビン、p53−サバイビン融合体、MAGE3、PS
AおよびPSMAから選択される。
別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、
1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つま
たは複数のタンパク質およびIL−12の機能を有するタンパク質を発現させるためのベ
クターであって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、
リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、(2)1つまたは
複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する前記タンパク質を
コードするポリヌクレオチド、および(3)IL−12の機能を有するタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド、を含み;ここで(2)および(3)の少なくとも1つのポリヌ
クレオチドがリガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されてい
る、ベクターを提供する。
一部の実施形態において、本発明のベクターは、TNF−αを条件的に発現する。特定
の実施形態において、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1
つまたは複数のタンパク質、例えば、TNF−αを条件的に発現するベクター、例えば、
アデノウイルスベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。シグ
ナルペプチドは、コドン最適化されていてよい。他の実施形態において、ベクターは、5
’非翻訳領域(UTR)、3’調節領域またはその両方をさらに含み、タンパク質発現お
よび/または全収率を改善する。
本発明はさらに、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の
機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターによって細
胞を改変すること(例えば、トランスフェクトすること、エレクトロポレーションを行う
こと、その他)により、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター
)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質を発現する細胞、例えば免疫細胞またはT
SCの集団を生成する方法であって、そのベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌ
クレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された
、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前
記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、治療タンパ
ク質(例えば、免疫モジュレーター)モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、組換え遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを
含むベクターによって細胞を改変することにより、1つまたは複数の治療タンパク質(例
えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質およびIL−12の機能を有する
タンパク質を発現する細胞、例えば免疫細胞またはTSCの集団を生成する方法であって
、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性
転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、(2)1つまたは複数の治療タン
パク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する前記タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド、および(3)IL−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌク
レオチド、を含み;ここで(2)および(3)の少なくとも1つのポリヌクレオチドが前
記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されている、方法を
提供する。
一部の実施形態において、本発明は、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)
の機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するベクターおよび1つまた
は複数の調節配列を生成する段階であって、前記1つまたは複数の調節配列が、治療タン
パク質(例えば、免疫モジュレーター)、例えば、TNF−αの発現を改善する段階を含
む、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)、例えば、TNF−αの発現、その
mRNA発現またはタンパク質発現を増加させる方法を提供する。
本発明はさらに、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の
機能を有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する組換えベクターによって改
変された(例えば、トランスフェクトされた、エレクトロポレーションを受けた、その他
)、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1
つまたは複数のタンパク質を発現する細胞、例えば免疫細胞またはTSCの集団であって
、そのベクターが遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレ
オチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコード
する少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前記リガンド依存性転写因子によって
活性化されるプロモーターに連結された、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター
)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、集
団を提供する。
別の態様において、本発明は、組換え遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを
含むベクターによって改変された、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジ
ュレーター)の機能を有するタンパク質およびIL−12の機能を有するタンパク質を発
現する細胞、例えば免疫細胞またはTSCの集団であって、前記ポリヌクレオチドが、(
1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくと
も1つの転写因子配列、(2)1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレ
ーター)の機能を有する前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および(3)I
L−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含み;ここで(2
)および(3)の少なくとも1つのポリヌクレオチドが前記リガンド依存性転写因子によ
って活性化されるプロモーターに連結されている、集団を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の細胞、例えば免疫細胞またはTSCの2つまた
はそれ以上の集団を含む組成物であって、組成物中のそれぞれの細胞の集団が、組成物中
の他の細胞集団において発現される1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジ
ュレーター)とは異なる1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター
)を発現する、組成物を提供する。1つの態様において、組成物は2つの細胞集団を含む
。別の態様において、組成物は2つを上回る細胞集団を含む。別の態様において、組成物
は3つの細胞集団を含む。別の態様において、組成物は4つの細胞集団を含む。
別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベ
クターを含む、インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞またはTSCであっ
て、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存
性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前記リガンド依存
性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された、治療タンパク質(例えば、
免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含む
細胞を提供する。別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレ
オチドを含むベクターを含む、インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞また
はTSCであって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された
、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、(2)治療タン
パク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質をコードするポリヌク
レオチド、および(3)IL−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チド、を含み;ここで(2)および(3)の少なくとも1つのポリヌクレオチドが前記リ
ガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結されている、細胞を提供
する。
別の態様において、本発明は、本発明のインビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免
疫細胞またはTSCの2つまたはそれ以上の集団を含む組成物であって、組成物中のイン
ビトロで遺伝子操作された細胞の集団のそれぞれが遺伝子スイッチをコードするポリヌク
レオチドを含むベクターを含み、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的
に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、お
よび(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに連結された
、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質をコードす
るポリヌクレオチド、を含み、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞のそれぞれ
の集団が、組成物中のインビトロで遺伝子操作された細胞の他の集団において発現される
1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)とは異なる1つまたは
複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)を発現する、組成物を提供する。
1つの態様において、本発明は、インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞ま
たはTSCの2つまたはそれ以上の集団を含む組成物であって、前記細胞集団のそれぞれ
が遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、前記ポリヌクレ
オチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコード
する少なくとも1つの転写因子配列、(2)治療タンパク質(例えば、免疫モジュレータ
ー)の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および(3)IL−12
の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、を含み;ここで(2)および
(3)の少なくとも1つのポリヌクレオチドが前記リガンド依存性転写因子によって活性
化されるプロモーターに連結されている、組成物を提供する。1つの態様において、組成
物はインビトロで遺伝子操作された細胞の2つの集団を含む。別の態様において、組成物
はインビトロで遺伝子操作された細胞の2つを上回る集団を含む。別の態様において、組
成物はインビトロで遺伝子操作された細胞の3つの集団を含む。別の態様において、組成
物はインビトロで遺伝子操作された細胞の4つの集団を含む。
本発明は、また、細胞、例えば、本明細書に記載されている免疫細胞もしくはTSCの
集団を含む医薬組成物、または細胞集団を欠く、発現ベクターの直接注射に適した、すな
わち、直接的に注射される組成物を提供する。
1つの態様において、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質
をコードするポリヌクレオチドは遺伝子スイッチのプロモーターの制御下にあり、IL−
12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは構成的プロモーターの制
御下にある。別の態様において、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュ
レーター)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドお
よびIL−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは両方とも、遺
伝子スイッチの1つのマルチシストロン性プロモーターの制御下にある。別の態様におい
て、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1
つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは遺伝子スイッチのプロモータ
ーの制御下にあり、IL−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
は、遺伝子スイッチプロモーターとは異なる条件的プロモーターの制御下にある。さらな
る態様において、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機
能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する遺伝子調
節システム、およびIL−12の機能を有するポリヌクレオチドに関する遺伝子調節シス
テムはオルソゴナル(orthogonal)である。さらなる態様において、各タンパク質をコー
ドする各ポリヌクレオチドに関する遺伝子調節システムはオルソゴナルである。
1つの態様において、本発明はまた、黒色腫腫瘍、神経膠腫腫瘍、腎癌および前立腺癌
、さらには表1に列記された癌など、ただしこれらには限定されない癌の治療も提供する
。IL−12遺伝子治療は、動物モデル試験において組換えcDNAベクターとして適用
した場合に抗腫瘍効果を示している(Faure et al., 1998;Sangro et al., 2005)が、
遺伝子を改変したDCの状況で適用した場合にはさらに効果的であった(Satoh et al.,
2002;Svane et al., 1999;Tatsumi et al., 2003;Yamanaka et al., 2002)。しかし
、現在までに、プラスミドまたはウイルスベクターを採り入れたIL−12遺伝子治療の
ヒト第I相試験は、癌の環境では持続性のある客観的な臨床的奏効を達成することができ
ていない(Heinzerling et al., 2005;Kang et al., 2001;Sangro et al., 2004;Trio
zzi et al., 2005)。本明細書に記載された遺伝子治療は、有望な治療手段を提供する。
一実施形態において、本発明は、
(a)治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数
のタンパク質を条件的に発現するようインビトロで遺伝子操作された本発明の免疫細胞、
TSCの集団またはベクター(またはそれらの組合せ)を、腫瘍周囲の領域における腫瘍
微小環境へと腫瘍内投与、あるいは全身投与する段階と、
(b)前記哺乳動物に治療上有効量の活性化リガンドを投与して、これにより治療タン
パク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質の発現を誘導し、前記
腫瘍を治療する段階と、
を含む、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって
、以下の段階:
(a)治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数の
タンパク質を条件的に発現するようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTS
Cの集団を、腫瘍の微小環境に腫瘍内投与する段階;および
(b)前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
の発現を誘導して該腫瘍を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
以下の段階:
(a)治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数の
タンパク質を条件的に発現するようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTS
Cの2つまたはそれ以上の集団を、腫瘍の微小環境に腫瘍内投与する段階であって、免疫
細胞またはTSCの各集団が1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレー
ター)の異なるセットを発現する段階;および
(b)前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する複数のタン
パク質の発現を誘導して前記腫瘍を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、以下
の段階:
(a)腫瘍の微小環境に対して、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能
を有する1つまたは複数のタンパク質およびIL−12の機能を有するタンパク質を条件
的に発現するようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を腫瘍内
投与する段階であって、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する
タンパク質またはIL−12のうち少なくとも1つが、リガンドによって活性化される条
件的プロモーターの制御下にあるような段階;ならびに
(b)前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
および/またはIL−12の機能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記腫瘍を治療
する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物における腫瘍を治療するための方法であって、
以下の段階:
(a)腫瘍の微小環境に対して、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能
を有する1つまたは複数のタンパク質およびIL−12の機能を有するタンパク質を条件
的に発現するようにインビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの2つまたはそ
れ以上の集団を腫瘍内投与する段階であって、免疫細胞またはTSCのそれぞれの集団が
治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数のタンパ
ク質の異なるセットを発現し、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を
有するタンパク質またはIL−12のうち少なくとも1つが、リガンドによって活性化さ
れる条件的プロモーターの制御下にあるような段階;ならびに
(b)前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
および/またはIL−12の機能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記腫瘍を治療
する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階:
(a)前記哺乳動物に対して、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を
有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するように改変された改変細胞の集団
を投与する段階;および
(b)前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
の発現を誘導して、前記疾患または障害を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階:
(a)前記哺乳動物に対して、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を
有する1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現するように改変された改変細胞の2つ
またはそれ以上の集団を投与する段階であって、改変細胞のそれぞれの集団が1つまたは
複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の異なるセットを発現する、段階
;および
(b)前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
の発現を誘導して、前記疾患または障害を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階:
(a)前記哺乳動物に対して、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を
有する1つまたは複数のタンパク質およびIL−12の機能を有するタンパク質を条件的
に発現するように改変された改変細胞の集団を投与する段階であって、治療タンパク質(
例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質またはIL−12のうち少なく
とも1つが、リガンドによって活性化される条件的プロモーターの制御下にある段階;な
らびに
(b)前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
および/またはIL−12の機能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記疾患または
障害を治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を治療するための方法
であって、以下の段階:
(a)前記哺乳動物に対して、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を
有する1つまたは複数のタンパク質およびIL−12の機能を有するタンパク質を条件的
に発現するように改変された改変細胞の2つまたはそれ以上の集団を投与する段階であっ
て、改変細胞のそれぞれの集団が免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタ
ンパク質の異なるセットを発現し、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機
能を有するタンパク質またはIL−12のうち少なくとも1つが、リガンドによって活性
化される条件的プロモーターの制御下にあるような段階;ならびに
(b)前記哺乳動物に対して、1つまたは複数の活性化リガンドの治療的有効量を投与す
る段階;を含み、
それにより、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタンパク質
および/またはIL−12の機能を有するタンパク質の発現を誘導して、前記疾患または
障害を治療する方法を提供する。
本発明はまた、遺伝子操作された細胞に基づく、例えば免疫細胞またはTSCに基づく
治療法の有効性を判定するための方法であって、患者におけるIFN−γ発現または活性
のレベルを治療法の開始前に測定し、それにより対照レベルを求めて、その後に、治療タ
ンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質お
よび任意でIL−12の機能を有するタンパク質を発現するように遺伝子操作された細胞
の投与を行い、活性化リガンドの有効量を投与し、続いて発現のIFN−γのレベルを測
定して試験レベルを求めた上で、対照レベルを試験レベルと比較してその治療レジメンが
有効であるか否かを判定することによる方法も提供する。
(a)哺乳動物において少なくとも1つの治療タンパク質(例えば、免疫モジュレータ
ー)、例えば、IL−12、TNF−αを条件的に発現する治療上有効量のベクターを投
与する段階と、(b)治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有するタ
ンパク質の発現を活性化する治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガンドを前記哺乳
動物に投与して、これにより治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有
するタンパク質の発現を誘導し、腫瘍を治療する段階とを含む、それを必要とする哺乳動
物における腫瘍を治療、腫瘍サイズを縮小または腫瘍形成を阻止する方法が、さらに包含
される。
1つの態様において、本発明は、患者における、インビトロで遺伝子操作された細胞に
基づく、例えば免疫細胞またはTSCに基づく治療レジメンの有効性を判定するための方
法であって、
(a)それを必要とする前記患者から、インビトロで遺伝子操作された細胞の投与の前に
入手した第1の生体試料におけるインターフェロン−γ(IFN−γ)の発現のレベルま
たは活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって対照レベルを求める段階;
(b)治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数の
タンパク質および任意でIL−12の機能を有するタンパク質を条件的に発現するように
遺伝子操作された、インビトロで遺伝子操作された細胞を、それを必要とする患者に対し
て投与する段階;ならびに
(c)活性化リガンドの有効量を、それを必要とする前記患者に対して投与する段階;
(d)それを必要とする前記患者から、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞および活
性化リガンドの投与後に入手した第2の生体試料におけるIFN−γの発現のレベルまた
は活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって試験レベルを求める段階;ならび

(e)IFN−γの対照レベルを試験レベルと比較し、IFN−γの発現、活性またはそ
の両方の試験レベルが対照レベルに比して高いことにより、その治療レジメンがそれを必
要とする前記患者において有効であることが指し示される段階、を含む方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド
を含む、1つまたは複数の治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能(複数
可)を有するタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターを腫瘍微小環境へ
と腫瘍内投与する段階であって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的
に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、
(2)リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された
、治療タンパク質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数のタン
パク質をコードするポリヌクレオチドとを含み、前記1つまたは複数の治療タンパク質(
例えば、免疫モジュレーター)が、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5
、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニット、IL−
15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、
IFN−α、IFN−γ、IFN−α1、IFNα2、IL−15−R−α、CCL3(
MIP−1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(リンホ
タクチン)、CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP−3b)、C
XCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF−1)、CC
L21(6Ckine)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70、GITRL
、LIGHT、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、TNF−α、
dnFADD、BCG、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS−L、S100、CD40L、OX
40L、p53、サバイビン、p53−サバイビン融合体、MAGE3、PSAおよびP
SMAから選択され、前記ベクターが細胞内に含有されていない段階と、(b)哺乳動物
に治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガンドを投与して、これにより治療タンパク
質(例えば、免疫モジュレーター)の機能を有する1つまたは複数のタンパク質の発現を
誘導し、腫瘍を治療する段階とを含む、それを必要とする哺乳動物における腫瘍を治療、
腫瘍サイズを縮小または腫瘍形成を阻止するための方法を提供する。
本発明は、また、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパ
ク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与する段階であって、
前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前記リガンド依存性転
写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、1つまたは複数のタン
パク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ベクターが細胞内に含有されていない
段階と、(b)前記非ヒト動物に治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガンドを投与
して、これにより1つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、疾患を治療する段階とを
含む、それを必要とする哺乳動物における疾患を治療するための方法を提供する。
本発明は、また、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、1つま
たは複数のタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与す
る段階であって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、
リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前記
リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、1つ
または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ベクターが、インビ
ボ投与前に細胞内に含有されていない段階と、(b)前記哺乳動物に治療上有効量の1つ
または複数の活性化リガンドを投与して、これにより1つまたは複数のタンパク質の発現
を誘導し、リソソーム蓄積病を治療する段階とを含む、それを必要とする哺乳動物におけ
るリソソーム蓄積病を治療するための方法を提供する。
本発明は、また、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパ
ク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターを哺乳動物に投与する段階であって、
前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転
写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列、および(2)前記リガンド依存性転
写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、1つまたは複数のタン
パク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内
に含有されていない段階と、(b)前記非ヒト動物に治療上有効量の1つまたは複数の活
性化リガンドを投与して、これにより1つまたは複数のタンパク質の発現を誘導し、肝疾
患を治療する段階とを含む、それを必要とする哺乳動物における肝疾患を治療するための
方法を提供する。
hIL−12をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 hIL−21およびhIL−15をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 mIL−12をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 mIL−21およびmIL−15をコードするバイシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 hIL−21のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 mIL−21のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 hIL−12およびhIL−21をコードするトリシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 mIL−12およびmIL−21をコードするトリシストロン性転写物のための調節性プロモーター発現システムに関するプラスミド地図を示している。 E1領域およびE3領域が欠失し、かつE1領域がRheoSwitch(登録商標)TherapeuticSystem(RTS)−IL−12成分に置き換えられているベクターrAd.RheoIL12の構造を示している。「IL12」と表示した枠は、IRESによって隔てられたIL−12p40コード配列およびIL−12p35コード配列を提示している。 翻訳、転写後、翻訳および翻訳後過程の概略図を示す図である。 生産ピボットを表示するモジュラーエレメントを示す図である。 スイッチおよび誘導性モジュラー合成遺伝子を備えるアデノウイルス適合性ULTRAVECTOR(登録商標)骨格の略図を示す図である。 TNFwt 5’UTR、TNFwt UVシグナルペプチド、TNFwt UVオープンリーディングフレーム(ORF)およびSV40e+pAの3’調節領域を含む、調節されたプロモーター発現系のためのアデノウイルスベクターマップ(ベクター43318)を示す図である。 TNFwt 5’UTR、TNFoptUVシグナルペプチド、TNFopt UV ORF、およびSV40e+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43319)を示している。 TNFwt 5’UTR、IL−2optUVシグナルペプチド、TNFopt UV ORF、およびSV40e+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43320)を示している。 5U2 5’UTR、TNFwtUVシグナルペプチド、TNFwtUV ORF、およびSV40e+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43321)を示している。 5U2 5’UTR、TNFoptUVシグナルペプチド、TNFopt UV ORF、およびSV40e+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43322)を示している。 5U2 5’UTR、IL−2optUVシグナルペプチド、TNFopt UV ORF、およびSV40e+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43323)を示している。 TNFwt 5’UTR、TNFwtUVシグナルペプチド、TNFwtUV ORF、およびhGH+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43324)を示している。 TNFwt 5’UTR、TNFoptUVシグナルペプチド、TNFopt UV ORF、およびhGH+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43325)を示している。 TNFwt 5’UTR、IL−2optUVシグナルペプチド、TNFopt UV ORF、およびhGH+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現システムに関するアデノウイルスベクター地図(ベクター43326)を示している。 5U2 5’UTR、TNFwtUVシグナルペプチド、TNFwtUV ORF、およびhGH+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクター地マップ(ベクター43327)を示している。 5U2 5’UTR、TNFwtUVシグナルペプチド、TNFwtUV ORF、およびhGH+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクター地マップ(ベクター43328)を示している。 5U2 5’UTR、TNFwtUVシグナルペプチド、TNFwtUV ORF、およびhGH+pAの3’調節領域を含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクター地マップ(ベクター43329)を示している。 TNFwt5’UTR、TNFwtUVシグナルペプチド、TNFwtUV ORF、およびTNFwt3’UTRを含む調節性プロモーター発現系に関するアデノウイルスベクターマップ(ベクター43533)を示している。 TNFwt 5’UTR、TNF全長ORFおよびTNFwt 3’UTRを含む、調節されたプロモーター発現系のためのアデノウイルスベクターマップ(ベクター43534)を示す図である。 RHEOSWITCH(登録商標)リガンドを介した誘導による、様々なPT3構成要素(−/+)を備えるベクターでHEK293細胞をトランスフェクションした後の、正規化したTNF−αタンパク質分泌レベルを示すグラフを示す図である。 RHEOSWITCH(登録商標)リガンドを介した誘導による、様々なPT3構成要素(−/+)を備えるベクターでCHO−K1細胞をトランスフェクションした後の、正規化したTNF−αタンパク質分泌レベルを表示するグラフを示す図である。 HEK293細胞をトランスフェクションした後のTNF−α分泌における倍数差を示す図である。 5U2 5’UTRと、wtUV TNF−α5’UTRとの間のタンパク質分泌の差を示す図である。 マウスB16F0メラノーマモデルにおけるAd−RTS−IL−12用量反応試験を示す線グラフである。12日目に、1ee7;1ee8;1ee9;5ee9;1ee10;5ee10ウイルス粒子(vp))用量のAd−RTS−IL−12の単一注射でマウスを処置し、固形飼料を用いたリガンドの送達を11日目に開始した。x軸は腫瘍細胞接種後日数を示し、y軸は腫瘍体積を示す。用量レベルは、実質的な抗腫瘍効果を示した。対照と比較した%腫瘍低下が示される。 試験過程を通じた体重変化を示す線グラフである。変化は、%体重としてy軸に示す。 Lewisマウス肺癌(LLC)モデルにおけるAd−RTS−mIL12の抗腫瘍活性(図33A)および、モデルにおける安全性(図33B)を示す線グラフである。免疫適格性C57b/6マウスにおいてLewis肺腫瘍を皮下増殖させた。腫瘍が所望のサイズに達したら治療を開始した。腫瘍細胞接種後6、9、13日目に、単一用量のAdRTS−mIL12(1e10vp)を動物に投与した。アクチベーターを含むAd−RTS−mIL12は、対照動物と比べて顕著な抗腫瘍活性を提示した。目立った毒性は認められなかった。 動物をAd−RTS−mIL12で処置した、マウスメラノーマ(B16F0)モデルにおける有効性(図34A)および、安全性(図34B)を示す線グラフである。C57b/6マウス側腹部のs.c.にて腫瘍を発達させた。細胞接種後13日目(矢印)に、単一用量のAd−RTS−mIL12(1e10vp)を腫瘍内(i.t.)投与した。アクチベーターリガンド(50、100、250、500、750および1000mg/kg)は、ベクター注射の24時間前に実験終了まで投与した。腫瘍増殖阻害をパーセンテージとして示し、対照動物と比較した。Ad−RTS−IL12は、広範囲のアクチベーター用量ウィンドウで治療効果を示した。この処置は耐容性を示した。 マウス結腸癌(CT26Luc)モデルにおけるAd−RTS−mIL12の有効性(図35A)および安全性(図35B)を示す線グラフである。マウス結腸腫瘍をBalb/Cマウスの側腹部領域で皮下増殖させた。細胞接種後11および18日目(矢印)に、動物を1e10vp/100ul用量レベルのAd−RTS−mIL12で2回腫瘍内(i.t.)処置した。アクチベーターは、ベクター注射の24時間前に開始した。実験を通じて腫瘍体積および体重をモニターした。Ad−RTS−mIL12による処置は、対照動物と比べて著しい腫瘍増殖阻害(100%)をもたらした。特に、Ad−RTS−mIL12とアクチベーターで処置した全動物は、腫瘍を持たなかった。 有効性(図36A)および、安全性(図36B)を示す線グラフである。膵臓癌(PAN02)モデルにおけるAd−RTS−mIL12の有効性を示す。腫瘍細胞接種後7および14日目(矢印)に、皮下PAN02腫瘍を生じたマウスを1e10vp/100ul用量レベルの単一用量のAd−RTS−mIL12で腫瘍内(i.t.)処置した。ベクター投与の前日に実験終了までアクチベーター固形飼料を動物に給餌した。対照またはベクター単独群は、正常な齧歯類固形飼料のみを与えた。この結果は、Ad−RTS−IL12が、対照動物と比べて有意な抗腫瘍活性(97%)を提示することを示唆する。Ad−RTS−IL12治療の結果、目立った体重変化は見られなかった。 AD−RTS−mIFNαのベクターマップである。 AD−RTS−mTNFαのベクターマップである。 乳癌(4T1)モデルにおけるAd−RTS−mIL12の有効性(図39A、および安全性(図39B)を示す線グラフである。4T1腫瘍をBALB/Cマウスの側腹部において皮下(s.c.)増殖させた。腫瘍を生じたマウスを、処置なし対照、アクチベーターリガンド(L)単独、Ad−RTS−mIL12単独およびAd−RTS−mIL12とアクチベーターリガンドの、各群5匹の動物の4群にランダム化した。3種の異なる時点(矢印)において、Ad−RTS−mIL12の単一注射を1e10v.p./100μl PBSの用量レベルで腫瘍内(i.t.)投与した。ベクター注射の24時間前に実験終了まで、アクチベーターリガンドを固形飼料によりマウスに投与した。腫瘍サイズ(体積)および体重(%)を平均±SEとして示す。処置なし動物(対照)は、急速な腫瘍増殖を行った。アクチベーターリガンド単独またはアクチベーターリガンドなしの3用量のAd−RTS−mIL12による処置は、対照と比べてそれぞれ22%および35%とわずかに腫瘍増殖を阻害した。特に、Ad−RTS−IL12とアクチベーターリガンドによる処置は、処置なし対照動物と比較して82%と有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。どの処置においても目立った体重減少は見られなかった。 インターフェロンα−2aのベクターマップである。
配列の詳細な説明
治療タンパク質
サイトカイン
感染に対する炎症性反応のために重要なサイトカインであるインターロイキン1(IL−
1)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号M2898
3(ヒトIL−1α);M15330(ヒトIL−1β);AF201830(ヒトIL
−1δ);AF201831(ヒトIL−1ε);AF201832(ヒト1L−1ζ)
;AF201833(ヒトIL−1η);NM_010554(マウスIL−1α);N
M_008361(マウスIL−1β);NM_019451(マウスL−1δ);□N
M_019450(マウスIL−1f6);NM_027163(マウスIL−1f8)
;NM_153511(マウスIL−1f9);NM_204524(ニワトリIL−1
β);NM_017019(ラットIL−1α);およびNM_031512(ラットI
L−1β)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる
インターロイキン1(IL−1)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号AAA59134(ヒトIL−1α);AAA59135(ヒトIL−1β)
;AAF25210(ヒトIL−1δ);AAF25211(ヒトIL−1ε);AAF
25212(ヒト1L−1ζ);AAF25213(ヒトIL−1η);NP_0346
84(マウスIL−1α);NP_032387(マウスIL−1β);NP_0623
24(マウスL−1δ);□□NP_062323(マウスIL−1f6);NP_08
1439(マウスIL−1f8);NP_705731(マウスIL−1f9);NP_
989855(ニワトリIL−1β);NP_058715(ラットIL−1α);およ
びNP_113700(ラットIL−1β)として入手可能であり、これらの配列は参照
により本明細書に組み入れられる。Laurent et al., Psychiatr. Genet. 7:103 (1997)は
、ヒトインターロイキン−1β遺伝子における多型性突然変異を同定している。
IL−4、IL−7、IL−9、IL−15およびIL−21を含むサイトカインのフ
ァミリーに属する、インターロイキン2(IL−2)のポリヌクレオチド配列は、公開デ
ータベースから、アクセッション番号U25676(ヒト);NM_008366(マウ
ス);NM_204153(ニワトリ);およびNM_053836(ラット)として入
手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン2(IL−2)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号AAA70092(ヒト);NP_032392(マウス);NP_9894
84(ニワトリ);およびNP_446288(ラット)として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
Liu et al., Appl. Biochem.Biotechnol.133:77 (2006)は突然変異性ヒトIL−2を作
製しており、Lorberboum et al., J. Biol. Chem. 265:16311 (1990)はキメラIL−2の
作製を記載している。
ナイーブヘルパーT細胞のTh2細胞への分化を誘導するサイトカインであるインター
ロイキン4(IL−4)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号M23442(ヒト);NM_021283(マウス);NM_0010070
79(ニワトリ);およびNM_201270(ラット)として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン4(IL−4)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号AAA59150(ヒト);NP_067258(マウス);NP_0010
07080(ニワトリ);およびNP_958427(ラット)として入手可能であり、
これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
Kawashima et al., J. Med. Genet. 35:502 (1998)は、アトピー性皮膚炎と関連付けら
れているIL−4遺伝子における多型を記載している。
インターロイキン7(IL−7)は、B細胞およびT細胞の発生のために重要なサイト
カインである。IL−7のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号J04156(ヒト);NM_008371(マウス);NM_0010378
33(ニワトリ);およびNM_013110(ラット)として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン7(IL−7)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号AAA59156(ヒト);NP_032397(マウス);NP_0010
32922(ニワトリ);およびNP_037242(ラット)として入手可能であり、
これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
Feng et al., Genetics 175:545 (2007)は、機能的欠陥をもたらす、IL−7における
点突然変異を同定している。
インターロイキン9(IL−9)は、T細胞によって産生されるサイトカインであり、
造血細胞の調節因子である。IL−9のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから
、アクセッション番号NM_000590(ヒト);NM_008373(マウス);N
M_001037825(ニワトリ);およびNM_001105747(ラット)とし
て入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン9(IL−9)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号NP_000581(ヒト);NP_032399(マウス);NP_001
032914(ニワトリ);およびNP_001099217(ラット)として入手可能
であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
IL−12は、活性化されたT細胞およびNK細胞に対する増殖因子として作用し、N
K/リンホカインにより活性化されたキラー細胞の溶解活性を高め、かつ休止末梢血単核
細胞(PBMC)によるIFN−γの産生を刺激することのできるサイトカインである。
IL−12のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM
_000882(ヒトIL12A);NM_002187(ヒトIL12B);NM_0
08351(マウスIL12a);NM_008352(マウスIL12b);NM_2
13588(ニワトリIL12A);NM_213571(ニワトリIL12B);NM
_053390(ラットIL12a);およびNM_022611(ラットIL12b)
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン12(IL−12)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号NP_000873(ヒトIL12A);NP_002178(ヒトIL
12B);NP_032377(マウスIL12a);NP_032378(マウスIL
12b);NP_998753(ニワトリIL12A);NP_998736(ニワトリ
IL12B);NP_445842(ラットIL12a);およびNP_072133(
ラットIL12b)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入
れられる。
インターロイキン15(IL−15)は、T細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化
および増殖を調節するサイトカインである。IL−15のポリヌクレオチド配列は、公開
データベースから、アクセッション番号U14407(ヒト);NM_008357(マ
ウス);EU334509(ニワトリ);およびAF015719(ラット)として入手
可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン15(IL−15)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号AAA21551(ヒト);NP_032383(マウス);ABY55
312(ニワトリ);およびAAB94536(ラット)として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン18(IL−18)、マクロファージによって産生され、インターロ
イキン12とともに、微生物産物の感染後に細胞媒介性免疫を誘導するサイトカイン。I
L−18のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号U90
434(ヒト);NM_008360(マウス);EU747333(ニワトリ);およ
びAY258448(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細
書に組み入れられる。
インターロイキン18(IL−18)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号AAB50010(ヒト);NP_032386(マウス);ACE79
188(ニワトリ);およびAAP14669(ラット)として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
細胞増殖を誘導することによって、ナチュラルキラー細胞および細胞傷害性T細胞を含
む免疫系の細胞に対して強力な調節作用を及ぼすサイトカインであるインターロイキン2
1(IL−21)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番
号AF254069(ヒト);NM_021782(マウス);NM_00102483
5(ニワトリ);およびNM_001108943(ラット)として入手可能であり、こ
れらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン21(IL−21)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号AAG29348(ヒト);NP_068554(マウス);NP_00
1020006(ニワトリ);およびNP_001102413(ラット)として入手可
能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン27(IL−27)は、Bリンパ球およびTリンパ球の活性の調節に
おいて重要な役割を果たすサイトカインである。IL−27のポリヌクレオチド配列は、
公開データベースから、アクセッション番号AY099296(ヒト);NM_1456
36(マウス);およびXM_344962(ラット)として入手可能であり、これらの
配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン27(IL−27)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号AAM34498(ヒト);NP_663611(マウス);およびXP
_344963(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に
組み入れられる。
特異的な細胞表面受容体(IFNAR)と結合し、マクロファージおよびナチュラルキ
ラー(NK)細胞の両方を刺激して抗ウイルス応答を誘発させる一群のインターフェロン
タンパク質のメンバーであるインターフェロンβ1(IFNB1)のポリヌクレオチド配
列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002176(ヒト);NM_
010510(マウス);NM_001024836(ニワトリ);およびNM_019
127(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れ
られる。
インターフェロンβ1(IFNB1)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号NP_002167(ヒト);NP_034640(マウス);NP_0
01020007(ニワトリ);およびNP_062000(ラット)として入手可能で
あり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターフェロンγ(IFN−γ)は、唯一のII型インターフェロンであり、かつ抗
ウイルス活性、免疫調節および抗腫瘍活性を有する可溶性サイトカインである。IFN−
γのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_000
619(ヒト);NM_008337(マウス);およびNM_138880(ラット)
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターフェロンγ(IFN−γ)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセ
ッション番号NP_000610(ヒト);NP_032363(マウス);およびNP
_620235(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に
組み入れられる。
主として単球/マクロファージによって分泌され、脂質代謝、凝固、インスリン抵抗性
および内皮機能に対して作用を及ぼす多機能性の炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死
因子(TNF−α)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション
番号X02910(ヒト);NM_013693(マウス);およびBC107671(
ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
TNF−αのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号CAA26
669(ヒト);NP_038721(マウス);およびAAI07672(ラット)と
して入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
ヒトTNF−−α(本明細書において、hTNF−αまたは単にhTNFと略記)は、
17kD可溶型(sTNF−α)および26kD膜結合型(tmTNF−α)として存在
するヒトサイトカインであり、その生物活性型は、17kD分子が非共有結合した三量体
で構成される。hTNF−αの構造は、例えば、Pennica, D., et al. (1984) Nature 31
2:724-729; Davis, J. M., et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326およびJones, E.
Y., et al. (1989) Nature 338:225-228に記載されている。TNF−αは、1型TNF受
容体(TNFR−1)または2型TNF受容体(TNFR−2)と結合することができ、
免疫細胞の調節、アポトーシスもしくは炎症の誘導または腫瘍化もしくはウイルス複製の
阻害に関与する。TNF/TNFR結合によって生じる細胞シグナル伝達カスケードは、
例えば、Wajant, H., et al. (2003) Cell Death Differ. 10(1): 45-65またはChen, G.,
et al. (2002) Science 296: 1634-5に記載されている。
全長ヒトTNF−αポリペプチドは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ド
メインからなる。ヒトTNF−αポリペプチド配列として233aaのポリペプチド配列
が報告されており、これは本明細書において、細胞質ドメイン(SEQ ID NO:3
7のアミノ酸1〜35)、膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:37のアミノ酸36〜
56)および細胞外ドメイン(SEQ ID NO:37のアミノ酸57〜233)を有
するSEQ ID NO:37と称する。SEQ ID NO:37は、SEQ ID
NO:35または36をコードするヌクレオチド配列である。ヒトTNF−α変種として
、次の変異、L105S、R108W、L112F、A160V、S162F、V167
A、E222K、F63S、PSD84−86VNRまたはE183Rのうち1つまたは
複数を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ケモカイン
ケモカイン(Cモチーフ)リガンド1(XCL1、リンホタクチンとしても知られる)は
、CD4+T細胞およびCD8+T細胞にとっては走化性であるが単球にとってはそうで
はなく、末梢血リンパ球における細胞内カルシウムの上昇を誘導する。XCL1のポリヌ
クレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002995(ヒ
ト);NM_008510(マウス);およびNM_134361(ラット)として入手
可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
XCL1のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_002
986(ヒト);NP_032536(マウス);およびNP_599188(ラット)
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。米国特許
第6,022,534号は、リンホタクチン、ならびに細胞傷害性T細胞および/もしく
はNK細胞を誘引するため、ならびに/または増殖もしくは常在細胞を誘導するためのそ
れらの使用を開示している。抗リンホタクチン抗体およびXCL1融合タンパク質の単離
および使用のための方法も開示されている。
急性炎症性状態において多形核白血球の動員および活性化に関与するいわゆるモノカイ
ン(主として単球およびマクロファージによって産生されるサイトカインの一種)である
、マクロファージ炎症性タンパク質−1(MIP−1)としても知られるCCケモカイン
リガンド3(CCL3)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッシ
ョン番号NM_002983(ヒト);NM_011337(マウス);およびNM_0
13025(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み
入れられる。
CCL3のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_002
974(ヒト);NP_035467(マウス);およびNP_037157(ラット)
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
炎症および喘息に関与する炎症誘発性サイトカインであるCCL5(RANTES)の
ポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号AF043341
(ヒト);NM_013653(マウス);およびNM_031116(ラット)として
入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
CCL5のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号AAC035
41(ヒト);NP_038681(マウス);およびNP_112378(ラット)と
して入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
炎症および癌浸潤の際にマクロファージ動員に関与するケモカインであるCCケモカイ
ンリガンド7(CCL7)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号NM_006273(ヒト);NM_013654(マウス);およびNM_
001007612(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細
書に組み入れられる。
CCL7のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_006
264(ヒト);NP_038682(マウス);およびNP_001007613(ラ
ット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
ケモカイン(CXCモチーフ)リガンド9(CXCL9、MIGとしても知られる)は
、γインターフェロンによって誘導されうるT細胞化学誘引物質である。CXCL9のポ
リヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002416
(ヒト);NM_0108599(マウス);およびNM_145672(ラット)とし
て入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
CXCL9のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_00
2407(ヒト);NP_032625(マウス);およびNP_663705(ラット
)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド10(CXCL10)は、免疫系における
細胞に対する化学誘引、T細胞の内皮細胞との接着、抗腫瘍活性および血管新生における
役割を有する低分子サイトカインである。CXCL10のポリヌクレオチド配列は、公開
データベースから、アクセッション番号X02530(ヒト);NM_021274(マ
ウス);およびBC058444(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照
により本明細書に組み入れられる。
ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド10(CXCL10)のアミノ酸配列は、
公開データベースから、アクセッション番号CAA26370(ヒト);NP_0672
49(マウス);およびAAH58444(ラット)として入手可能であり、これらの配
列は参照により本明細書に組み入れられる。
ストロマ細胞−由来因子1(SDF−1)としても知られるケモカイン(C−X−Cモ
チーフ)リガンド12(CXCL12)は、インタークリンファミリーに属する低分子サ
イトカインであり、このファミリーのメンバーは白血球を活性化し、多くの場合、LPS
、TNFまたはIL1などの炎症誘発性刺激によって誘導される。CXCL12のポリヌ
クレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_000609(ヒ
ト);NM_001012477(マウス);NM_204510(ニワトリ);および
NM_001033883(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により
本明細書に組み入れられる。
CXCL12のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_0
00600(ヒト);NP_001012495(マウス);NP_989841(ニワ
トリ);およびNP_001029055(ラット)として入手可能であり、これらの配
列は参照により本明細書に組み入れられる。
Hansson et al., Microbes and Infection 8:841 (2006)は、ケモカイン(C−Cモチ
ーフ)受容体7(CCR7)とケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド19(CCL19
、MIP−3βとしても知られる)との間の相互作用が、一次免疫応答の生成のために決
定的に重要であると考察している。CCR7のポリヌクレオチド配列は、公開データベー
スから、アクセッション番号NM_001838(ヒト);およびNM_007719(
マウス)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
CCR7のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_001
829(ヒト);およびNP_031745(マウス)として入手可能であり、これらの
配列は参照により本明細書に組み入れられる。
CCL19のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号N
M_006274(ヒト);およびNM_011888(マウス)として入手可能であり
、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
CCL19のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_00
6265(ヒト);およびNP_036018(マウス)として入手可能であり、これら
の配列は参照により本明細書に組み入れられる。
CCケモカインリガンド21(CCL21)は、CCR7の十分に確立されたリガンド
であり、CD4+T細胞が定常状態「セットポイント」に到達するためには必要であるが
CD8+T細胞についてはそうではなく、CCL21の発現の擾乱は自己免疫に対する感
受性を変化させる可能性があり、そのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、
アクセッション番号AB002409(ヒト);NM_011335(マウスCCL21
a);NM_011124(マウスCCL21b);およびNM_023052(マウス
CCL21c);として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れ
られる。
CCL21のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号BAA21
817(ヒト);NP_035465(マウスCCL21a);NP_035254(マ
ウスCCL21b);およびNP_075539(マウスCCL21c)として入手可能
であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
インターロイキン−8(IL−8)は、好中球活性化ペプチド−1またはSCYB8と
も呼ばれるケモカインであり、炎症性刺激に応答していくつかの種類の細胞によって分泌
される組織由来ペプチドである。米国特許第6,133,426号および第6,177,
980号は、ヒト化抗IL−8抗体のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を開示し
ている。ヒトIL−8のポリヌクレオチド配列は、公開データベースからアクセッション
番号NM_000584として入手可能であり、その配列は参照により本明細書に組み入
れられる。
ヒトIL−8のアミノ酸配列は、公開データベースからアクセッション番号NP_00
0575として入手可能であり、その配列は参照により本明細書に組み入れられる。
増殖因子
顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)は、白血球増殖因子として機
能し、幹細胞を刺激して顆粒球(好中球、好酸球および好塩基球)ならびに単球を生成さ
せるサイトカインである。GM−CSFのポリヌクレオチド配列は、公開データベースか
ら、アクセッション番号M11734(ヒト);NM_009969(マウス);EU5
20303(ニワトリ);NM_001037660(ラットCsf2ra);およびN
M_133555(ラットCsf2rb)として入手可能であり、これらの配列は参照に
より本明細書に組み入れられる。
顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)のアミノ酸配列は、公開デ
ータベースから、アクセッション番号AAA52122(ヒト);NP_034099(
マウス);ACB11534(ニワトリ);NP_001032749(ラットCsf2
ra);およびNP_598239(Csf2rb)として入手可能であり、これらの配
列は参照により本明細書に組み入れられる。
造血幹細胞または始原細胞またはその両方の表面で増殖因子受容体として機能する可能
性がある、FMS関連チロシンキナーゼリガンド(FLT3/FLK2リガンド、Flt
3L)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号U048
06(ヒト);およびNM_013520(マウス)として入手可能であり、これらの配
列は参照により本明細書に組み入れられる。
FLT3/FLK2リガンド(Flt3L)のアミノ酸配列は、公開データベースから
、アクセッション番号AAA17999(ヒト);およびNP_038548(マウス)
として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
形質転換した表現型を培養細胞に可逆的に付与することのできる、ある種のヒト癌にお
いてアップレギュレートしているトランスフォーミング増殖因子α(TGF−α)のポリ
ヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_0010996
91(ヒト);NM_031199(マウス);NM_001001614(ニワトリ)
;およびNM_012671(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照によ
り本明細書に組み入れられる。
TGF−αのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_00
1093161(ヒト);NP_112476(マウス);NP_001001614(
ニワトリ);およびNP_036803(ラット)として入手可能であり、これらの配列
は参照により本明細書に組み入れられる。
アジュバント
β−デフェンシンは、多くのグラム陰性菌およびグラム陽性菌、真菌ならびにウイルスに
対する先天性免疫応答との関連性が示されている抗菌性ペプチドである。β−デフェンシ
ンのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号X92744
(ヒトhBD−1);AJ000152(ヒトhBD−2);AF217245(ヒトβ
デフェンシン−3);AJ314835(ヒトβデフェンシン−4);AB089180
(ヒトhBD−5);AY122466(ヒトデフェンシンβ106、DEFB106)
;AF540979(ヒトβデフェンシン107、DEFB107);AF529416
(ヒトβデフェンシン、DEFB108);DQ012014(ヒトβデフェンシン11
0、DEFB110);DQ012015(ヒトβデフェンシン111、DEFB111
);DQ012016(ヒトβデフェンシン112、DEFB112);DQ01201
7(ヒトβデフェンシン113、DEFB113);DQ012018(ヒトβデフェン
シン114、DEFB114);DQ012019(ヒトβデフェンシン115、DEF
B115);DQ012020(ヒトβデフェンシン116、DEFB116);DQ0
12021(ヒトβデフェンシン117、DEFB117);NM_007843(マウ
スデフェンシンβ1);NM_010030(マウスデフェンシンβ2、Defb2);
NM_013756(マウスデフェンシンβ3、Defb3);NM_019728(マ
ウスデフェンシンβ4、Defb4);NM_030734(マウスデフェンシンβ5、
Defb5);NM_054074(マウスデフェンシンβ6、Defb6);NM_1
39220(マウスデフェンシンβ7);NM_153108(マウスデフェンシンβ8
、Defb8);NM_139219(マウスデフェンシンβ9、Defb9);および
NM_139225(マウスデフェンシンβ10、Defb10)として入手可能であり
、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
β−デフェンシンのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号CA
A63405(ヒトhBD−1);CAB65126(ヒトhBD−2);AAF738
53(ヒトβデフェンシン−3);CAC85520(ヒトβデフェンシン−4);BA
C10630(ヒトhBD−5);AAM93908(ヒトデフェンシンβ106、DE
FB106);AAN33115(ヒトβデフェンシン107、DEFB107);AA
Q09525(ヒトβデフェンシン、DEFB108);AAY59750(ヒトβデフ
ェンシン110、DEFB110);AAY59751(ヒトβデフェンシン111、D
EFB111);AAY59752(ヒトβデフェンシン112、DEFB112);A
AY59753(ヒトβデフェンシン113、DEFB113);AAY59754(ヒ
トβデフェンシン114、DEFB114);AAY59755(ヒトβデフェンシン1
15、DEFB115);AAY59756(ヒトβデフェンシン116、DEFB11
6);AAY59757(ヒトβデフェンシン117、DEFB117);NP_031
869(マウスdefeninβ1);NP_034160(マウスデフェンシンβ2、
Defb2);NP_038784(マウスデフェンシンβ3、Defb3);NP_0
62702(マウスデフェンシンβ4、Defb4);NP_109659(マウスデフ
ェンシンβ5、Defb5);NP_473415(マウスデフェンシンβ6、Defb
6);NP_631966(マウスデフェンシンβ7、Defb7);NP_69474
8(マウスデフェンシンβ8、Defb8);NP_631965(マウスデフェンシン
β9、Defb9);およびNP_631971(マウスデフェンシンβ10、Defb
10)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。そ
のほかのヒトおよびラットのデフェンシンのペプチド配列については、米国特許第5,2
42,902号も参照されたい。
高速移動群ボックス−1(HMGB1)タンパク質は、サイトカインとして機能して、
壊死性細胞死および癌、病原体による浸潤、外傷ならびに敗血症に対する局所的および全
身的な応答を媒介する非ヒストン染色体タンパク質である。HMGB1タンパク質のポリ
ヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_002128(
ヒト);NM_010439(マウス);NM_204902(ニワトリ);およびNM
_012963(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に
組み入れられる。
高速移動群ボックス−1(HMGB1)のアミノ酸配列は、公開データベースから、ア
クセッション番号NP_002119(ヒト);NP_034569(マウス);NP_
990233(ニワトリ);およびNP_037095(ラット)として入手可能であり
、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
食細胞性S100タンパク質は、炎症性反応を媒介し、炎症性細胞を組織損傷の部位に
動員するほか、先天性免疫に重要な損傷関連分子パターン(DAMP)分子のメンバーで
もある。Foell et al., J. Leukocyte Biol. 81:1 (2006)を参照のこと。S100タンパ
ク質のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号BC014
392(ヒトS100A1);BC002829(ヒトS100A2);BC01289
3(ヒトS100A3);BC016300(ヒトS100A4);Z18954(ヒト
S100D);BC001431(ヒトS100A6);BC034687(ヒトS10
0A7);BC005928(ヒトS100A8);BC047681(ヒトS100A
9);BC015973(ヒトS100A10);D38583(ヒトクラギザリン(c
lagizzarin));NM_011309(マウスS100a1);NM_009
115(マウスS100b);NM_013650(マウスS100a8);NM_00
9114(マウスS100a9);NM_011310(マウスS100a3);NM_
011311(マウスS100a4);およびNM_011312(マウスS100a5
)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
S100タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号A
AH14392(ヒトS100A1);AAH02829(ヒトS100A2);AAH
12893(ヒトS100A3);AAH16300(ヒトS100A4);CAA79
479(ヒトS100D);AAH01431(ヒトS100A6);AAH34687
(ヒトS100A7);AAH05928(ヒトS100A8);AAH47681(ヒ
トS100A9);AAH15973(ヒトS100A10);BAA07597(ヒト
クラギザリン);NP_035439(マウスS100a1);NP_033141(マ
ウスS100b);NP_038678(マウスS100a8);NP_033140(
マウスS100a9);NP_035440(マウスS100a3);NP_03544
1(マウスS100a4);およびNP_035442(マウスS100a5)として入
手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
マンノース糖の重合体である植物性多糖の1つであるマンナンは、免疫応答の生成のた
めに有用である。米国特許第5,807,559号は、腫瘍に付随する糖質構造に対する
、または感染性因子および/もしくは感染した宿主細胞上に発現される糖質構造に対する
T細胞免疫を生じさせるために有用な可能性のある、マンナンの免疫原性コンジュゲート
を開示している。米国特許第5,773,425号は、症状を緩和するため、および/ま
たはウイルス性疾患を治癒させるため、ならびに免疫応答を強化するためのマンナンの使
用を開示している。
弱毒生マイコバクテリア種であるカルメット−ゲラン桿菌(BCG)は、重症および致
死性の結核を予防するためのワクチンとして用いられる。米国特許第7,393,541
号は、哺乳動物対象におけるマイコバクテリアに対するインビボでのT細胞媒介性免疫応
答を生じさせるためのアジュバントワクチンの作製を開示している。Hubbard and Collin
s, Infect. Immun. 59(2):570。米国特許第5,292,513号は、殺菌活性および抗
ウイルス活性の強化を要する患者における加熱死BCGによる、インビボでのマクロファ
ージのプライミングのための方法を開示している。BCGの全ゲノム配列は、公開データ
ベースから、アクセッション番号NC_008769(ウシ型結核菌BCG株(M. b
ovis BCG str.)Pasteur 1173P2、全ゲノム)として入手可
能である。
細菌リポ多糖(LPS)は、グラム陰性菌が感染した際に強い免疫応答を誘導するエン
ドトキシンである。米国特許第4,148,877号は、細菌培養物からのLPSの分画
、および細菌感染に対する抵抗性を誘導するための薬物としてのその画分の使用を開示し
ている。米国特許第5,292,513号は、殺菌活性および抗ウイルス活性の強化を要
する患者におけるLPSによるインビボでのマクロファージのプライミングを開示してい
る。
(正の)共刺激分子
OX40リガンド(OX40L)は、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリーのメ
ンバー4(Tnfsf4)に属し、樹状細胞上で発現され、Th2細胞の分化を促進する
。OX40リガンドのポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション
番号X79929(ヒト);U12763(マウス);およびAF037067(ラット
)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
OX40リガンド(OX40L)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号CAA56284(ヒト);AAA21871(マウス);およびAAC67
236(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れ
られる。
4−1BBリガンド(4−1BBL)は、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリ
ーのメンバー9(Tnfsf9)に属し、これは2型膜貫通糖タンパク質であり、活性化
Tリンパ球上で発現される。4−1BBLのポリヌクレオチド配列は、公開データベース
から、アクセッション番号NM_003811(ヒト);NM_009404(マウス)
;およびAY332409(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により
本明細書に組み入れられる。
4−1BBリガンド(4−1BBL)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アク
セッション番号NP_003802(ヒト);NP_033430(マウス);およびA
AQ01228(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に
組み入れられる。
CD40タンパク質は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー5に属し、
T細胞依存性免疫グロブリンクラススイッチ、記憶B細胞の発生および胚中心形成を含む
、広範囲にわたる種々の免疫応答および炎症性反応を媒介するのに必須である。CD40
タンパク質のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号X6
0592(ヒト);NM_170701(マウス);NM_204665(ニワトリ);
およびNM_134360(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により
本明細書に組み入れられる。
CD40タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号C
AA43045(ヒト);NP_733802(マウス);NP_989996(ニワト
リ);およびNP_599187(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照
により本明細書に組み入れられる。
CD40L(CD40リガンドまたはCD154)は、主として活性化T細胞において
発現される、TNFスーパーファミリー分子のメンバーである。これは、抗原提示細胞上
のCD40と結合する。CD40Lは、同時刺激分子の役割を果たし、抗原提示細胞上の
MHC分子によるT細胞受容体刺激と関連して抗原提示細胞における活性化を誘導する。
CD40Lは、3種の結合パートナー、CD40、α5β1インテグリンおよびαIIb
β3を有する。CD40L配列は、公開データベースから、受託番号NM_000074
およびMP_000065(ヒト)およびNM_011616およびNP_035746
(マウス)として入手できる。
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質(GITR)
は、T細胞刺激を介して有効な腫瘍免疫を誘起することができる。抗GITRモノクロー
ナル抗体(mAb)の投与は、強力な腫瘍特異的免疫を惹起することができ、定着した腫
瘍を、顕性の自己免疫疾患を誘発することなく根絶させた。Ko et al., J. Exp. Med. 7:
885 (2005)。米国特許第6,503,184B1号は、抗GITR抗体を開示している。
GITRリガンド(GITRL)のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、
アクセッション番号AY358868(ヒト);およびAY359852(マウス)とし
て入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
GITRリガンド(GITRL)のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッ
ション番号AAQ89227(ヒト);およびAAQ55265(マウス)として入手可
能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)結合リガンド(HSVgD)は、p
30またはLIGHTとも称され、T細胞の共刺激に関与するTNFファミリーのメンバ
ーである。LIGHTは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)およびリン
ホトキシン−β受容体(LT−βR)という2つの受容体を有する。HSVgDはHVE
Mのリガンドであり、T細胞に対するコスティミュレーターとして作用することによって
T細胞を活性化し、T細胞の増殖およびサイトカイン分泌をもたらす。LIGHTのポリ
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列については米国特許第7,118,742号を参照
されたい。米国特許第5,654,174号は、カルボニル末端残基の欠失を伴う変異性
gDタンパク質を記載している。
CD70は、CD27と結合するサイトカインである。これはT細胞活性化において役
割を果たし、共刺激されたT細胞の増殖を誘導し、細胞溶解性T細胞の生成を増強する。
CD70のポリヌクレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_
001252(ヒト);NM_011617(マウス);およびNM_00110687
8(ラット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられ
る。
CD70のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_001
243(ヒト);NP_035747(マウス);およびNP_001100348(ラ
ット)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
ICOS−Lは、T細胞特異的な細胞表面受容体ICOSのリガンドであり、T細胞増
殖およびサイトカイン分泌のための共刺激シグナルとして作用する。ICOS−Lはまた
、B細胞の増殖および形質細胞への分化も誘導する。ICOS−Lは、炎症性状態に対す
る局所的組織応答を媒介する上でも、さらには記憶T細胞の機能を共刺激することによっ
て二次免疫応答を媒介する上でも役割を果たしうると考えられる。ICOS−Lのポリヌ
クレオチド配列は、公開データベースから、アクセッション番号NM_015259(ヒ
ト);およびNM_015790(マウス)として入手可能であり、これらの配列は参照
により本明細書に組み入れられる。
ICOS−Lのアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号NP_0
56074(ヒト);およびNP_056605(マウス)として入手可能であり、これ
らの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
PD−L1(CD274としても知られる)タンパク質は、活性化された単球、T細胞
およびB細胞で発現される。PD−L1は、IFN−γで処理した単球において、さらに
は他のアクチベーターとともにIFN−γで処理した樹状細胞およびケラチノサイトにお
いてアップレギュレートされる。PD−L1タンパク質のポリヌクレオチド配列は、公開
データベースから、アクセッション番号NM_014143(ヒト);およびNM_02
1893(マウス)として入手可能であり、これらの配列は参照により本明細書に組み入
れられる。
PD−L1タンパク質のアミノ酸配列は、公開データベースから、アクセッション番号
NP_054862(ヒト);およびNP_068693(マウス)として入手可能であ
り、これらの配列は参照により本明細書に組み入れられる。
(負の)共刺激分子
cytotoxic T lymphocyte−associated 4(CTLA
4)は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、活性化T細胞において発
現される共刺激分子である。米国特許第7,034,121号および第6,984,72
0号は、CTLA4に対する抗体の調製および使用の方法を開示している。米国特許第6
,984,720号はまた、抗CTLA4抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列も開示し
ている。
PD−1分子は、PD−1リガンド(PD−L1)と結合する、免疫グロブリン遺伝子
スーパーファミリーのメンバーである。T細胞上のPD−1受容体にPD−L1が結合す
ると、共刺激シグナルが細胞に伝達され、そのために細胞が細胞周期を進行させることが
妨げられて、T細胞増殖が増加する。PD−L1とT細胞上の受容体との相互作用の抗P
D−L1抗体による阻害は、免疫応答のダウンレギュレーションをもたらし、これは免疫
細胞エネルギーと命名されている。米国特許第7,029,674号は、抗PD−L1抗
体の調製方法および配列を開示している。
PD−L2は、主としてPD−1(またはヒトホモログPDCD1)のリガンドとして
知られている。しかし、PD−12は、PDCD1非依存的な様式でのTリンパ球増殖お
よびIFN−γ産生のために必須な共刺激シグナルに関与することが報告されている。P
DCD1との相互作用は、細胞周期進行およびサイトカイン産生を阻止することにより、
T細胞増殖を阻害する。Yamazaki et al., J. of Immunol. 169: 5538(2002)およびAnsar
i et al., J. Exp. Med. 198:63(2003)は、抗PD−L2モノクローナル抗体の調製を記
載している。
対抗性免疫抑制物質(Counter Immune Suppressant)(寛容阻害因子(Tolerance Inhi
bitor))
トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)は、I型およびII型という2種類の
膜貫通性セリン/トレオニンキナーゼ受容体のうち1つと相互作用することによって細胞
増殖および分化を調節する多機能性タンパク質である。Chen et al., Science 28:1335 (
1993)を参照されたい。TGF受容体II型(TGFR2)はI型受容体をリン酸化して
活性化し、後者は自己リン酸化して、続いてSMAD転写レギュレーターと結合してそれ
を活性化する。Lynch MA et al., Cancer Res. 58:4227(1998)は、ヒト卵巣癌と関連のあ
るトランスフォーミング増殖因子β受容体II型遺伝子(TGFBR2)における突然変
異を記載している。Brand et al. ,J. Biol. Chem. 268:11500-11503 (1993)は、セリン
/トレオニンキナーゼ細胞質ドメインと予想されるものの欠失(TGFβR2 cDNA
H2−3FFのヌクレオチド1172〜2036、公開データベースからアクセッショ
ン番号M85079として入手可能、アミノ酸配列はアクセッション番号AAA6116
4として入手可能)が、3種のTGF−β(1、2および3)に依存的な遺伝子発現をす
べて損なわせることを記載している。TGF−βはほとんどのヒト腫瘍において発現され
、腫瘍抗原特異的な細胞性免疫を阻害する。Foster et al., J. Immunother. 31:500 (20
08)は、細胞傷害性Tリンパ球におけるドミナントネガティブTGFβR2の発現が、T
GF−βの阻害作用に対する抵抗性につながることを記載している。
TGFβは、形質転換の誘導においてTGFαと相乗的に作用する。これはまた、負の
オートクリン増殖因子としても作用する。TGFβ活性化およびシグナル伝達の調節不全
は、アポトーシスをもたらす可能性がある。Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 9
7:8015 (2000)は、抗TGFβ抗体の投与が、顕性腎症を発症するII型糖尿病のモデル
であるdb/dbマウスにおける腎機能不全および糸球体硬化を予防しうることを記載し
ている。TGFβモノクローナル抗体の作製および使用の方法は、米国特許第6,419
,928号に記載されている。Barcellos-Hoff et al., Am J. Pathol.147:5 (1995)も、
TGFβ抗体の作製のための方法を記載している。TGFβ融合タンパク質構築物のアミ
ノ酸配列およびヌクレオチド配列は、米国特許第6,756,215号に記載されている
IL−10は、活性化されたTh2細胞、B細胞、ケラチノサイト、単球およびマクロ
ファージによって産生されるサイトカインである。IL−10は、活性化マクロファージ
によって、およびヘルパーT細胞によって産生される、IFN−γ、IL−2、IL−3
、TNFおよびGM−CSFを含むいくつかのサイトカインの合成を阻害する。IL−1
0は、活性化されたヒトB細胞の成長および分化を促進し、Th1応答を阻害して移植拒
絶反応およびT細胞媒介性自己免疫疾患を予防する上で有用である。O'Farrell et al.,
EMBOJ. 17:1006 (1998);Kanbayashi et al., Cell Immunol.171:153 (1996);Fukushima
et al., Br. J. Ophthalmol. 90:1535 (2006);およびvan Lent et al., Ann. Rheum. D
is. 66:334 (2007)は、抗IL10抗体の調製を記載している。米国特許第7,326,
567号は、IL−10抗体のポリヌクレオチド配列を開示している。米国特許第5,8
37,232号は、抗IL−10抗体を用いてB細胞媒介性自己免疫障害を治療するため
の方法を開示している。
サイトカインシグナル伝達抑制因子(SOCS)ファミリータンパク質は、サイトカイ
ンシグナル伝達を調節する古典的なネガティブフィードバック系の一部を構成する。Alex
ander et al. Cell 98:597(1999)は、サイトカインシグナル伝達抑制因子1(SOCS1
)がインターフェロン−γシグナル伝達の決定的な阻害因子であり、そのサイトカインの
新生児に対する致死的な可能性のある作用を防止することを記載している。Hilton et al
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:114 (1999)は、SOCS1が、JAK/STAT3経
路を通じてシグナルを伝達するサイトカインの負の調節に関与していると考察している。
Ohya et al. J. Biol. Chem. 272:27178 (1997)は、SOCSタンパク質がインターロイ
キン6(IL−6)および白血病阻害因子(LIF)によるシグナル伝達の主要な調節因
子であると思われると記載している。米国特許第6,534,277号は、抗体が細胞ま
たはその子孫によって発現されるようにSOCS1抗体をコードする核酸配列を細胞に導
入し、続いて治療効果のために組換え細胞をインビボで投与する、抗SOCS1抗体の調
製および使用のための方法を開示している。米国特許第6,323,317号および第7
,049,418号も、抗SOCS1抗体を開示している。
TGF−αは、EGF受容体と結合し、TGF−βと相乗的に作用して、軟寒天中での
足場非依存的な細胞増殖を促進することのできる分裂促進性ポリペプチドである。Ellis
et al., N. Engl. J. Med. 317:158 (1987)は、TGF−αが黒色腫のある種の傍腫瘍性
症状発現において役割を果たすことを記載している。米国特許第4,742,003号お
よびXian et al., The J. of Histochem. & Cytochem. 47:949 (1999)は、抗TGF−α
抗体の調製の方法を記載している。
腫瘍壊死因子受容体(TNFR1)およびFasはいずれも、プログラム細胞死(アポ
トーシス)および受容体オリゴマー化のためのFasおよびTNF誘導性シグナル伝達の
ために必須である、細胞質Fas結合デスドメインタンパク質(FADD)を含む。Fa
s受容体の細胞質領域またはドメインと結合する能力を有し、FAS媒介性アポトーシス
を阻害する、FADDと命名された哺乳動物タンパク質が同定されている。FADDのポ
リヌクレオチド配列は、公開データベースからアクセッション番号U24231として、
アミノ酸配列はアクセッション番号AAA86517として入手可能であり、これらは参
照により本明細書に組み入れられる。機能的に完全なネイティブ性FADDのドミナント
ネガティブ阻害因子であるFADD断片またはそれをコードする核酸は、米国特許第6,
562,797B1号に記載されている。
p53(タンパク質53または腫瘍タンパク質53としても知られる)は、ヒトにおい
ては、TP53遺伝子によってコードされた腫瘍サプレッサータンパク質である。p53
は、細胞周期を調節することにより、癌抑制に関与する腫瘍サプレッサーとして機能する
ため、多細胞生物において重要である。p53のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は
、受託番号NM_00546およびNP_000537(ヒト)およびNM_01164
0およびNP_035770(マウス)として入手できる。
サバイビンは、アポトーシス阻害剤ファミリーのメンバーである。サバイビンタンパク
質は、カスパーゼ活性化を阻害するよう機能し、これにより、アポトーシスまたはプログ
ラム細胞死の負の調節を行う。この機能は、サバイビン誘導経路の破壊が、アポトーシス
の増加および腫瘍成長の減少をもたらすことによって示された。サバイビンタンパク質は
、多くのヒト腫瘍および胎児組織において高度に発現するが、高分化型細胞には全く存在
しない。したがって、この事実から、サバイビンは、癌細胞を標的とするが、正常な細胞
には作用しないため、癌治療の理想的な標的となった。サバイビン発現はまた、細胞周期
によって高度に調節され、G2〜M期でしか発現しない。サバイビンが、有糸分裂におい
てチューブリンとの相互作用により紡錘体に局在し、有糸分裂調節に貢献的な役割を果た
し得ることが知られている。サバイビンの調節は、p53タンパク質に関与すると思われ
る。p53のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列は、受託番号NM_00101227
0およびNP_001012270(ヒト)およびNM_001012273およびNP
_001012273(マウス)として入手できる。
メラノーマ関連抗原−3(MAGE3)アミノ酸配列は、受託番号P43357−1(
UniParc)として見出すことができる。
前立腺特異的抗原(PSA)は、前立腺の細胞によって産生されるタンパク質である。
PSAは、健常な前立腺の男性の血清中に少量存在するが、これは、前立腺癌その他の前
立腺障害が存在すると、多くの場合上昇する。
前立腺特異的膜抗原(PSMA)は、前立腺組織および他の数種の組織に存在する2型
内在性膜糖タンパク質である。これは、前立腺癌に対する治療標的候補である。
配列表の説明
SEQ ID NO:1は、mL−12およびm−IL21をコードする構築物のポリヌ
クレオチド配列である。
SEQ ID NO:2は、hIL−12およびhIL−21をコードする構築物のポ
リヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:3は、mIL−21およびmIL−15をコードする構築物のポ
リヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:4は、mIL−12をコードする構築物のポリヌクレオチド配列
である。
SEQ ID NO:5は、hIL−21およびhIL−15をコードする構築物のポ
リヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:6は、hIL−21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列
である。
SEQ ID NO:7は、mIL−21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列
である。
SEQ ID NO:8は、hIL−21をコードする構築物のポリヌクレオチド配列
である。
SEQ ID NO:9は、mIL−21をコードするポリヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:10は、mIL−21のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:11は、mIL−15をコードするポリヌクレオチド配列である
SEQ ID NO:12は、mIL−15のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:13は、mIL−12のmp40をコードするポリヌクレオチド
配列である。
SEQ ID NO:14は、mIL−12のmp40のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:15は、mIL−12のmp35をコードするポリヌクレオチド
配列である。
SEQ ID NO:16は、mIL−12のmp35のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:17は、hIL−21をコードするポリヌクレオチド配列である
SEQ ID NO:18は、hIL−21のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:19は、hIL−15をコードするポリヌクレオチド配列である
SEQ ID NO:20は、hIL−15のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:21は、hIL−12のp40をコードするポリヌクレオチド配
列である。
SEQ ID NO:22は、hIL−12のp40のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:23は、hIL−12のp35をコードするポリヌクレオチド配
列である。
SEQ ID NO:24は、hIL−12のp35のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:25は、ショウジョウバエ(Drosophila)で認められ
るエクジソン応答エレメントの核酸配列である。
SEQ ID NO:26は、キイロショウジョウバエ(Drosophilamel
anogaster)で認められるエクジソン応答エレメントの核酸配列である。
SEQ ID NO:27は、キイロショウジョウバエで認められるエクジソン応答エ
レメントの核酸配列である。
SEQ ID NO:28は、ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)酵素(I−Sc
eI)の制限部位である。
SEQ ID NO:29は、ヒトIL−12コード配列を含むアデノウイルスベクタ
ー:Ad−RTS−hIL−12(SP1−RheoIL−12)のDNA配列である。
SEQ ID NO:30は、ヒトTNF野生型5’UTRの核酸配列である。
SEQ ID NO:31は、5U2 5’UTRの核酸配列である。
SEQ ID NO:32は、IL−2シグナルペプチドをコードするコドン最適化さ
れた核酸配列である。
SEQ ID NO:33は、ヒトTNF−αシグナルペプチドをコードする野生型核
酸配列である。
SEQ ID NO:34は、ヒトTNF−αシグナルペプチドをコードするコドン最
適化されたヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:35は、ヒトTNF−αをコードする野生型核酸配列である。
SEQ ID NO:36は、ヒトTNF−αをコードするコドン最適化された核酸配
列である。
SEQ ID NO:37は、ヒトTNF−αのアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:38は、SV40ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオ
チド配列を含む3’調節領域の核酸配列である。
SEQ ID NO:39は、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルをコードする
ヌクレオチド配列を含む3’調節領域の核酸配列である。
SEQ ID NO:40は、野生型ヒトTNF−α3’UTRを含む核酸配列である
SEQ ID NO:41は、ヒトTNF−α3’UTR AtoC変異体の核酸配列
である。
SEQ ID NO:42は、ヒトGAST 3’UTRの核酸配列である。
SEQ ID NO:43は、合成3’調節領域の核酸配列である。
SEQ ID NO:44は、ヒトGAPDH 5’UTRの核酸配列である。
SEQ ID NO:45は、インスリンSPの野生型核酸配列である。
SEQ ID NO:46は、ヒトFGF−19シグナルペプチドをコードする野生型
核酸配列である。
SEQ ID NO:47は、ベクター43318の核酸配列である。
SEQ ID NO:48は、ベクター43319の核酸配列である。
SEQ ID NO:49は、ベクター43320の核酸配列である。
SEQ ID NO:50は、ベクター43321の核酸配列である。
SEQ ID NO:51は、ベクター43322の核酸配列である。
SEQ ID NO:52は、ベクター43323の核酸配列である。
SEQ ID NO:53は、ベクター43324の核酸配列である。
SEQ ID NO:54は、ベクター43325の核酸配列である。
SEQ ID NO:55は、ベクター43326の核酸配列である。
SEQ ID NO:56は、ベクター43327の核酸配列である。
SEQ ID NO:57は、ベクター43328の核酸配列である。
SEQ ID NO:58は、ベクター43329の核酸配列である。
SEQ ID NO:59は、ベクター43533の核酸配列である。
SEQ ID NO:60は、ベクター43534の核酸配列である。
SEQ ID NO:61は、ベクターVVN2823(Ad−RTS−hIL−12
)の核酸配列である。
SEQ ID NO:62は、ベクターVVN2539(Ad−RTS−mIL−12
)の核酸配列である。
発明の詳細な説明
定義
別に定義する場合を除き、本明細書において用いられるすべての技術用語、表記および他
の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解さ
れている意味を有するものとする。場合によっては、明確さおよび/または参照の便宜を
図るために、意味が一般的に理解されている用語を本明細書において定義しているが、こ
のような定義を本明細書に含めたことは、当技術分野において一般に理解されているもの
との実質的な違いを意味するとは必ずしもみなされるべきではない。分子生物学の用語お
よび/または方法および/またはプロトコールの一般的に理解されている定義は、Rieger
et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Ve
rlag: New York, 1991;Lewin, Genes V, Oxford University Press:NewYork, 1994;Sam
brook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)およびAusubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994)に見出すことができる。適宜
、市販のキットおよび/または試薬の使用を伴う手順は、別に記載のある場合を除き、一
般に、製造元の手引きおよび/またはプロトコールおよび/またはパラメーターに従って
実施する。
本発明において「単離された」という用語は、その元の環境(それが天然に存在する環
境)から取り出された生物材料(細胞、核酸またはタンパク質)のことを指す。例えば、
植物または動物において天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、そ
れが天然に存在する隣接核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」とみ
なされる。
生物材料に対して適用される「精製された」という用語は、その材料が、他の化合物の
存在を排除して、絶対的純粋さを呈する形で存在することを要求するものではない。そう
ではなくて、この用語は相対的な定義である。
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「ポリヌ
クレオチド」は互換的に用いられ、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかにある
、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン;「RNA分子
」)もしくはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デ
オキシチミジン、またはデオキシシチジン;「DNA分子」)のリン酸エステル重合形態
、またはその任意のホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステ
ルなどのことを指す。DNA−DNA、DNA−RNAおよびRNA−RNAの二本鎖ヘ
リックスが可能である。核酸分子、特にDNA分子またはRNA分子という用語は、分子
の一次構造および二次構造のみのことを指し、それを何らかの特定の三次形態に限定する
ことはない。したがって、この用語は、いくつか例を挙げると、直鎖状または環状DNA
分子(例えば、制限断片)、プラスミド、超らせんDNAおよび染色体において認められ
る二本鎖DNAを含む。特定の二本鎖DNA分子の構造について考察する際に、本明細書
では配列を、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAと相同の配列を有する鎖)に沿って
5’から3’への向きの配列のみを表示するという通常の慣習に従って記載することがあ
る。「組換えDNA分子」とは、分子生物学的操作を受けたDNA分子のことである。D
NAには、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNA、合成DNAおよび半合成DNA
が非限定的に含まれる。
ポリヌクレオチド配列に対して適用される「断片」という用語は、参照核酸に比して長
さが短く、その共通の部分にわたって、参照核酸と同一なヌクレオチド配列を含むヌクレ
オチド配列のことを指す。本発明によるそのような核酸断片は、必要に応じて、それを構
成要素とする、より大きいポリヌクレオチドの中に含まれていてもよい。そのような断片
は、本発明による核酸の少なくとも6、8、9、10、12、15、18、20、21、
22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、5
7、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、13
5、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000
、3000、4000、5000個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの範囲にわた
る長さのオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
本明細書で用いる場合、「単離された核酸断片」とは、合成性、非天然性または改変さ
れたヌクレオチド塩基を任意で含む、一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAの重
合体のことを指す。DNAの重合体の形態にある単離された核酸断片は、cDNA、ゲノ
ムDNAまたは合成DNAの1つまたは複数のセグメントで構成されてもよい。
「遺伝子」とは、転写のみによって(例えば、生物活性のあるRNA種)、または転写
および翻訳によって(例えば、ポリペプチド)産生される機能性分子を含む、機能性分子
をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのことを指す。「遺伝子」という用語
は、cDNAおよびゲノムDNA核酸を範囲に含む。「遺伝子」はまた、コード配列の前
の調節配列(5’非コード配列)および後の調節配列(3’非コード配列)を含む、特定
のRNA、タンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片のことも指す。「ネイティ
ブ性遺伝子」とは、それ自身の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子のことを指す
。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒には見られない調節配列および/またはコード配
列を含む、ネイティブ性遺伝子ではない任意の遺伝子のことを指す。したがって、キメラ
遺伝子は、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが天
然に見出されるものとは異なる様式で並んでいる調節配列およびコード配列を含みうる。
キメラ遺伝子は、異なる源に由来するコード配列および/または異なる源に由来する調節
配列を含みうる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム中でその天然の位置にあるネイテ
ィブ性遺伝子のことを指す。「外来性」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物中に
通常は見られず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子のことを指す。外来性
遺伝子には、非ネイティブ性生物に挿入されたネイティブ性遺伝子、またはキメラ遺伝子
が含まれうる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子
のことである。例えば、インターロイキン−12(IL−12)遺伝子はIL−12タン
パク質をコードする。IL−12は、ジスルフィド結合によって連結されて完全に機能性
のIL−12p70を生じる、35kDサブユニット(p35)および40kDサブユニ
ット(p40)のヘテロ二量体である。IL−12遺伝子はp35サブユニットおよびp
40サブユニットの両方をコードする。
「異種DNA」とは、細胞内に、または細胞の染色体部位内に天然には位置しないDN
Aのことを指す。異種DNAは細胞にとって外来性である遺伝子を含みうる。
「ゲノム」という用語は、染色体、ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスの
DNAまたはRNAを含む。
核酸分子は、その核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度に関して適切な
条件下で、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAなどの別の核酸分子とアニーリングしう
る場合に、そのもう一方の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄の条件は周知であり、Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor(1989)、特にその中の第11章および表11.1に例示されている。温度および
イオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定づける。
ストリンジェンシー条件は、遠い関係にある生物由来の相同配列のように中程度の類似
性のある断片から、近い関係にある生物由来のそっくり同じ機能性酵素を産生する遺伝子
のように極めて類似性の高い断片に至るまでをスクリーニングしうるように調節すること
が可能である。相同核酸の予備的スクリーニングのためには、T55°に対応する低ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、5×SSC、0.1%SDS、
0.25%乳、およびホルムアミドなし;または30%ホルムアミド、5×SSC、0.
5%SDSを用いることができる。中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション
条件は、より高いT、例えば、40%ホルムアミド、5×または6×SSCに対応する
。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いT、例えば、50%
ホルムアミド、5×または6×SSCに対応する。
ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが可能である。「
相補的」という用語は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述す
るために用いられる。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であ
り、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明はまた、本明細書に
おいて開示または使用される完全な配列に対して、さらにはそれらの実質的に類似した核
酸配列に対して相補的な単離された核酸断片も含む。
本発明の1つの態様においては、ポリヌクレオチドを、T55℃でのハイブリダイゼ
ーション段階を含み、上述の条件を用いるハイブリダイゼーション条件を用いることによ
って検出する。他の態様において、Tは60℃、63℃または65℃である。
ハイブリダイゼーション後の洗浄もストリンジェンシー条件を決定づける。条件の1つ
のセットでは、6×SSC、0.5%SDS中、室温、15分間で開始し、続いて2×S
SC、0.5%SDS中、45℃、30分間で繰り返し、続いて0.2×SSC、0.5
%SDS中、50℃、30分間を2回繰り返す、一連の洗浄を用いる。ストリンジェント
な条件の1つのセットでは、より高い温度を用い、0.2×SSC、0.5%SDS中で
の最後の2回の30分間の洗浄の温度を60℃に高める以外は、洗浄は上記のものと同じ
とする。より高度にストリンジェントな条件の別のセットでは、0.1×SSC、0.1
%SDS中、65℃で最後の2回の洗浄を用いる。
核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において
周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。2つのヌクレオチド配
列間の類似性および相同性の度合いが大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリ
ッドのためのTの値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性(より高
いTに対応)は、RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNAの順に低くなる。
長さが100ヌクレオチドを上回るハイブリッドについては、Tを計算するための式が
導き出されている(Sambrook et al.、前記、9.50-0.51を参照)。より短い核酸、すなわ
ちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要にな
り、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定づける(Sambrook et al.、前記、11.
7-11.8を参照)。
本発明の1つの態様においては、ポリヌクレオチドを、500mM未満の塩中および少
なくとも37℃でのハイブリダイゼーション段階、ならびに2×SSPE中、少なくとも
63℃の温度での洗浄段階を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによって検出
する。別の態様において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション段階
に関して200mM未満の塩および少なくとも37℃を含む。さらなる態様において、ハ
イブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方の段階に関して
2×SSPEおよび63℃を含む。
別の態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチド
である。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは少なくとも約15ヌクレ
オチド;例えば、少なくとも約20ヌクレオチド;例えば、少なくとも30ヌクレオチド
である。さらに、当業者であれば、温度および洗浄液の塩濃度を、プローブの長さなどの
要因に応じて適宜調節しうることを理解するであろう。
「プローブ」という用語は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対合して二本鎖分子を形成
することのできる一本鎖核酸分子のことを指す。
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNA分子、c
DNA分子、プラスミドDNAまたはmRNA分子とハイブリダイズ可能な短鎖核酸のこ
とを指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、32P−ヌクレオチド、またはビオチンなど
の標識を共有結合させたヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチド
は、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。オリゴヌクレオチ
ド(その一方または両方が標識されていてもよい)は、核酸の全長もしくは断片をクロー
ニングするため、DNAシークエンシングのため、または核酸の存在を検出するためのP
CRプライマーとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドを、DNA分子と
三重らせんを形成させるために用いることもできる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成
により、好ましくは核酸合成装置にて調製する。このため、オリゴヌクレオチドを、チオ
エステル結合などの天然に存在しないホスホエステル類似体結合によって調製することが
できる。
「プライマー」とは、標的核酸配列とハイブリダイズして、適した条件下でDNA合成
のための開始点としての役を果たしうる二本鎖核酸領域を作り出すオリゴヌクレオチドの
ことを指す。そのようなプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において、またはDNAシ
ークエンシングのために用いることができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、PCRと略記され、特定の核酸配列を酵素的に増幅する
ためのインビトロ法のことを指す。PCRは一連の温度サイクルの繰り返しを伴い、各サ
イクルは次の3つの段階を含む:標的分子の鎖を分離させるためのテンプレート核酸の変
性、一本鎖PCRオリゴヌクレオチドプライマーとテンプレート核酸とのアニーリング、
およびアニールしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長。PCRは、標的分子の
存在を検出するための手段、および定量的または半定量的な条件下で、核酸の出発プール
内のその標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」は、RT−PCRと略記され、1つまたは複数のRN
A分子から1つまたは複数の標的cDNA分子を酵素的に生成し、続いて上記の1つまた
は複数の標的cDNA分子内の1つまたは複数の特定の核酸配列を酵素的に増幅するため
のインビトロ法のことを指す。RT−PCRはまた、標的分子の存在を検出するための手
段、および定量的または半定量的な条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対
量を決定するための手段も提供する。
DNA「コード配列」または「コード領域」とは、ポリペプチドをコードし、適した調
節配列の制御下に置かれると体外、インビトロまたはインビボで細胞内でポリペプチドに
転写および翻訳されうる二本鎖DNA配列のことを指す。「適した調節配列」とは、コー
ド配列の上流(5’非コード配列)、内部、または下流(3’非コード配列)に位置し、
随伴するコード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及
ぼすヌクレオチド配列のことを指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、
イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位
およびステム−ループ構造が含まれうる。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端にあ
る開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端にある翻訳停止コドンによって決定される。
コード配列には、原核生物配列、mRNA由来のcDNA、ゲノムDNA配列、さらには
合成DNA配列が非限定的に含まれうる。コード配列が真核生物細胞における発現を意図
したものである場合には、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配
列に対して3’側に位置することになる。
「オープンリーディングフレーム」は、ORFと略記され、ATGまたはAUGなどの
翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、かつポリペプチド配列に
翻訳される可能性のある、DNA、cDNAまたはRNAのいずれかである、ある長さの
核酸配列のことを指す。
「頭−頭(head-to-head)」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチ
ド配列の互いに対する向きを記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、一
方のポリヌクレオチドのコード鎖の5’末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の
5’末端に隣接していれば頭−頭の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチ
ドの転写の方向は他方のポリヌクレオチドの5’末端から離れる方に進行する。「頭−頭
」という用語は、(5’)−(5’)と略記してもよく、また、記号(←→)または(3
’←5’5’→3’)によって表示してもよい。
「尾−尾」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド配列の互いに対
する向きを記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオ
チドのコード鎖の3’末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の3’末端に隣接し
ていれば尾−尾の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドに向かうように進行する。「尾−尾」という用語は、(3’)−
(3’)と略記してもよく、また、記号(→←)または(5’→3’3’←5’)によっ
て表示してもよい。
「頭−尾」という用語は、本明細書において、2つのポリヌクレオチド配列の互いに対
する向きを記述するために用いられる。2つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオ
チドのコード鎖の5’末端がもう一方のポリヌクレオチドのコード鎖の3’末端に隣接し
ていれば頭−尾の向きに位置しており、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向は
他方のポリヌクレオチドと同じ方向に進行する。「頭−尾」という用語は、(5’)−(
3’)と略記してもよく、また、記号(→→)または(5’→3’5’→3’)によって
表示してもよい。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3’側に位置するヌクレオチド
配列のことを指す。特に、下流ヌクレオチド配列は一般に、転写開始点の後に続く配列に
関係している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して5’側に位置するヌクレオチド
配列のことを指す。特に、上流ヌクレオチド配列は一般に、コード配列または転写開始点
の5’側に位置する配列に関係している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始
部位の上流に位置する。
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は互換的に用いられ、二本
鎖DNA内の特定のヌクレオチド配列の内部に結合してそれを切断する酵素のことを指す
「相同組換え」とは、別のDNA分子への外来DNA配列の挿入、例えば、染色体への
ベクターの挿入のことを指す。好ましくは、ベクターは、特異的な染色体部位を相同組換
えのための標的とする。特異的な相同組換えのために、ベクターは、ベクターの染色体と
の相補的結合およびその中への組み入れが可能になるように、染色体の配列に対する十分
に長い相同性領域を含むと考えられる。相同性領域がより長く、配列類似性の度合いがよ
り大きいほど、相同組換えの効率を高めることができる。
当技術分野において公知のいくつかの方法を用いて、本発明によるポリヌクレオチドを
増やすことができる。ひとたび適した宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現
ベクターを増やして、大量に調製することができる。本明細書において記載される通り、
用いうる発現ベクターには、少数であるが例を挙げると、以下のベクターまたはその誘導
体が非限定的に含まれる:ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動
物のウイルス;バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス;酵母ベクター;バクテリオファー
ジベクター(例えば、λ)、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター。
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニングおよび/または導入のための任意
の媒体のことを指す。ベクターは、別のDNAセグメントを結びつけて、結びつけたセグ
メントの複製を生じさせることのできるレプリコンであってもよい。「レプリコン」とは
、インビボでDNA複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複
製することのできる、任意の遺伝因子(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色
体、ウイルス)のことを指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボまた
はインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス性および非ウイルス性媒体の両方を含
む。当技術分野において公知の数多くのベクターを、核酸を操作して、応答エレメントお
よびプロモーターを遺伝子に組み入れるなどのために用いることができる。考えられるベ
クターには、例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、またはpBR322もしくは
pUCプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクターなどを
含む、プラスミドまたは改変ウイルスが含まれる。本発明において有用なベクターの別の
例は、WO2007/038276号に記載された、ULTRAVECTOR(商標)P
roduction System(Intrexon Corp., Blacksb
urg, VA)である。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応するDNA
断片の、適したベクター中への挿入は、適切なDNA断片を、相補的付着末端を有する選
択したベクター中にライゲートすることによって達成することができる。または、DNA
分子の末端を酵素的に修飾してもよく、またはヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末
端にライゲートすることによって任意の部位を作製してもよい。そのようなベクターは、
マーカーが細胞ゲノム中に組み入れられた細胞の選択をもたらす選択マーカー遺伝子を含
むように遺伝子操作することができる。そのようなマーカーは、マーカーを組み入れ、そ
れによってコードされるタンパク質を発現する宿主細胞の同定および/または選択を可能
にする。
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、さらには生きている動物対
象において多岐にわたる遺伝子送達用途に用いられている。用いうるウイルスベクターに
は、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター
、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベク
ター、エプスタイン−バーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ジェミニウイル
スベクターおよびカリモウイルスベクターが非限定的に含まれる。非ウイルス性ベクター
には、プラスミド、リポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA−タンパク質複
合体および生体高分子が含まれる。核酸に加えて、ベクターが、1つもしくは複数の調節
領域、ならびに/または核酸移入の結果(どの組織への導入か、発現の持続時間など)を
選択、測定およびモニターする上で有用な選択マーカーを含んでもよい。
「プラスミド」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖D
NA分子の形態にある、多くの場合は遺伝子を保有している染色体外因子のことを指す。
そのような因子は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択した遺伝子産物のためのプロモ
ーター断片およびDNA配列を適切な3’非翻訳配列とともに細胞に導入することのでき
る独特な構築物として連結されるか組み換えられている、任意の源に由来する、一本鎖ま
たは二本鎖のDNAまたはRNAの、直鎖状、環状または超らせん状の、自律複製配列、
ゲノム組込み配列、ファージ配列またはヌクレオチド配列であってよい。
「クローニングベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドのように、別の
核酸セグメントを結びつけて、結びつけたセグメントの複製を生じさせることのできる、
連続して複製するある単位長の核酸、好ましくはDNAであって、かつ複製起点を含む、
「レプリコン」のことを指す。クローニングベクターは、1つの細胞種において複製が可
能であって、別のものにおいて発現が可能であってもよい(「シャトルベクター」)。ク
ローニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択のために用いうる1つもしくは複数の
配列、および/または関心対象の配列を挿入するための1つもしくは複数のマルチクロー
ニングサイトを含んでもよい。
「発現ベクター」という用語は、挿入された核酸配列の発現を可能とするように設計さ
れたベクター、プラスミドまたは媒体のことを指す。クローニングされた遺伝子、すなわ
ち挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどの
制御エレメントの制御下に置かれる。開始制御領域またはプロモーターは、所望の宿主細
胞において核酸の発現を駆動するのに有用であり、非常に多く、当業者には知られている
。これらの遺伝子の発現を駆動することのできる事実上あらゆるプロモーターを発現ベク
ター中に用いることができ、これにはウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プ
ロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異
的プロモーター、病原性または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性
プロモーター、光調節性プロモーター;CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GA
L10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、L
EU2、ENO、TPI、アルカリ性ホスファターゼプロモーター(サッカロミセス属(
Saccharomyces)における発現のために有用);AOX1プロモーター(ピキア属(Pichi
a)における発現のために有用);β−ラクタマーゼ、lac、ara、tet、trp
、lP、lP、T7、tacおよびtrcプロモーター(大腸菌(Escherichia coli
)における発現のために有用);光調節性、種子特異的、花粉特異的、子房特異的、カリ
フラワーモザイクウイルス35S、最小CMV35S、キャッサバ葉脈モザイクウイルス
(CsVMV)、クロロフィルa/b結合タンパク質、リブロース−1,5−二リン酸カ
ルボキシラーゼ、苗条特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿
状ウイルス、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸
レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパ
ク質およびアントシアニンプロモーター(植物細胞における発現のために有用);SV4
0初期(SV40e)プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス(RSV)の3’末端反復
配列(LTR)に含まれるプロモーター、アデノウイルス(Ad)のE1Aのプロモータ
ーまたは主要後期プロモーター(MLP)遺伝子、サイトメガロウイルス(CMV)初期
プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)プロモーター
、バキュロウイルスIE1プロモーター、伸長因子1α(EF1)プロモーター、ホスホ
グリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、ユビキチン(Ubc)プロモーター、ア
ルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Lプロモーターの調節配列および転写
制御領域、ユビキタスプロモーター(HPRT、ビメンチン、α−アクチン、チューブリ
ンなど)、中間フィラメント(デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAPな
ど)のプロモーター、(MDR、CFTRまたは第VIII因子型などの)治療用遺伝子
のプロモーター、病原性または疾患関連プロモーター、ならびに、組織特異性を呈し、か
つトランスジェニック動物で利用されているプロモーター、例えば、膵臓腺房細胞におい
て活性のあるエラスターゼI遺伝子制御領域;膵臓β細胞において活性のあるインスリン
遺伝子制御領域、リンパ細胞において活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、
乳房、リンパ系および肥満細胞において活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域;肝臓に
おいて活性のあるアルブミン遺伝子、ApoAIおよびApoAII制御領域、肝臓にお
いて活性のあるα−フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓において活性のあるα1−ア
ンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞において活性のあるβ−グロビン遺伝子制御
領域、脳内の乏突起神経膠細胞において活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御
領域、骨格筋において活性のあるミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域、および視床下部にお
いて活性のあるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモ
ーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α−
アクチンのプロモーターなどを非限定的に含む、当技術分野において公知の動物および哺
乳動物プロモーターが非限定的に含まれる。加えて、これらの発現配列を、エンハンサー
または調節配列などの付加によって修飾してもよい。
ベクターは、当技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレク
トロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキスト
ラン法、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用
、またはDNAベクター輸送体などによって、所望の宿主細胞に導入することができる(
例えば、Wu et al., J. Biol Chem. 267:963 (1992);Wu et al., J. Biol. Chem. 263:1
4621 (1988);およびHartmut et al.、カナダ特許出願第2,012,311号を参照)
また、本発明によるポリヌクレオチドを、リポフェクションによってインビボで導入す
ることもできる。過去10年の間に、インビトロでの核酸のカプセル封入およびトランス
フェクションのためのリポソームの使用が増えている。リポソーム媒介トランスフェクシ
ョンに伴う困難および危険を抑えるように設計された合成カチオン脂質を用いて、マーカ
ーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製す
ることができる(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413 (1987);Mack
ey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027 (1988);およびUlmer et al., Scienc
e 259:1745 (1993))。カチオン脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル封入を助長
し、また、負に荷電した細胞膜との融合も助長しうる(Felgner et al., Science 337:38
7 (1989))。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、WO95/18
863号、WO96/17823号、および米国特許第5,459,127号に記載され
ている。インビボで外因性遺伝子を特定の臓器に導入するためのリポフェクションの使用
には、いくつかの実用的な利点がある。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲティング
は、恩恵のある1つの領域である。トランスフェクションを特定の細胞種に向かわせるこ
とが、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような細胞不均質性のある組織において特に好ましい
と考えられることは明らかである。脂質をターゲティングの目的で他の分子に化学的にカ
ップリングさせてもよい(Mackey et al. 1988、前記)。標的指向性ペプチド、例えばホ
ルモンもしくは神経伝達物質など、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド性分
子を、リポソームに化学的にカップリングさせることが可能と考えられる。
カチオン性オリゴペプチド(例えば、WO95/21931号)、DNA結合タンパク
質由来のペプチド(例えば、WO96/25508号)、またはカチオン性重合体(例え
ば、WO95/21931号)などの他の分子も、インビボでの核酸のトランスフェクシ
ョンを助長するために有用である。
ベクターを裸のDNAプラスミドとしてインビボで導入することも可能である(米国特
許第5,693,622号、第5,589,466号および第5,580,859号を参
照)。受容体を介したDNA送達アプローチを用いることもできる(Curiel et al., Hum
. Gene Ther. 3:147 (1992);およびWu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987))。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外因性または異種性のRNAまた
はDNAの取り込みのことを指す。外因性または異種性のRNAまたはDNAが細胞の内
側に導入された場合、細胞はそのようなRNAまたはDNAによって「トランスフェクト
」されている。トランスフェクトされたRNAまたはDNAが表現型の変化をもたらす場
合、細胞は外因性または異種性のRNAまたはDNAによって「形質転換」されている。
形質転換用のRNAまたはDNAは染色体DNAに組み込まれて(共有結合されて)、細
胞のゲノムを構成することができる。
「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物のゲノム中への核酸断片
の移入のことを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック
」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
加えて、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅または発現
が求められる細胞宿主における複製のための1つまたは複数の起点、マーカーまたは選択
マーカーを含んでもよい。
「選択マーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐
性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択するこ
とのできる識別用因子、通常は抗生物質耐性遺伝子または化学物質耐性遺伝子のことを指
し、この効果を利用して、関心対象の核酸の遺伝を追跡し、かつ/または関心対象の核酸
を遺伝によって受け継いだ細胞もしくは生物を同定する。当技術分野において公知であり
、用いられる選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタ
マイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなど
に対する耐性を与える遺伝子;および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち
、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが含まれる
「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定すること
ができる識別用因子をコードする核酸のことを指し、この効果を利用して、関心対象の核
酸の遺伝を追跡し、関心対象の核酸を遺伝によって受け継いだ細胞もしくは生物を同定し
、かつ/または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定する。当技術分野において公知であ
り、用いられるレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ(Luc)、緑色蛍光タンパ
ク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β−ガ
ラクトシダーゼ(LacZ)、β−グルクロニダーゼ(Gus)などが含まれる。選択マ
ーカー遺伝子をレポーター遺伝子とみなすこともできる。
「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に用いられ、コード配列または
機能性RNAの発現を制御することのできるDNA配列のことを指す。一般に、コード配
列はプロモーター配列の3’側に位置する。プロモーターは、その全体がネイティブ性遺
伝子に由来してもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエ
レメントで構成されてもよく、またはさらには合成DNAセグメントを含んでもよい。当
業者であれば、異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞種において、または発生
の異なる段階において、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の
発現を導くことを理解するであろう。遺伝子をほとんどの細胞種においてほとんどの時点
で発現させるプロモーターは、一般的には「構成的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を
特定の細胞種において発現させるプロモーターは、一般的には「細胞特異的プロモーター
」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の
段階で発現させるプロモーターは、一般的には「発生特異的プロモーター」または「細胞
分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する作用物質、生体分子、化
学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導され、遺伝子を発現さ
せるプロモーターは、一般的には「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」
と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に明確には規定され
ないため、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有しうることも認識され
ている。
本発明のベクターの任意のものにおいて、ベクターは任意で、本明細書に開示されたプ
ロモーターを含む。1つの態様において、プロモーターは、本明細書において表1に列記
されたプロモーターである。
本発明のベクターの任意のものにおいて、ベクターは任意で、組織特異的プロモーター
を含む。1つの態様において、組織特異的プロモーターは、本明細書に開示された組織特
異的プロモーターである。別の態様において、組織特異的プロモーターは、本明細書にお
いて表2に列記された組織特異的プロモーターである。
プロモーター配列は、典型的には、その3’末端では転写開始部位を境界とし、上流(
5’方向)に、バックグラウンドを超える検出可能なレベルでの転写を開始させるのに必
要な最少数の塩基またはエレメントを含むように伸びる。プロモーター配列の内部には、
転写開始部位(例えば、ヌクレアーゼS1を用いたマッピングによって規定することが好
都合である)のほか、RNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセ
ンサス配列)も存在する。
「治療用スイッチプロモーター」(「TSP」)とは、遺伝子スイッチ構成要素の発現
を制御するプロモーターのことを指す。遺伝子スイッチおよびそれらの様々な成分は、本
明細書における他の箇所に詳細に記載されている。ある態様において、TSPは構成的で
あり、すなわち、継続的に活性がある。構成的TSPは、構成的−遍在性(すなわち、い
かなる組織または細胞においても、別の因子もレギュレーターも必要とせずに、全般的に
機能する)、または構成的−組織もしくは細胞特異的(すなわち、特定の組織型または細
胞種において、別の因子もレギュレーターも必要とせずに、全般的に機能する)のいずれ
であってもよい。ある態様において、本発明のTSPは、疾患、障害または病状に付随す
る条件下で活性化される。2つまたはそれ以上のTSPがかかわる本発明のある態様にお
いて、プロモーターは構成的プロモーターおよび活性化しうるプロモーターの組合せであ
ってよい。本明細書で用いる場合、「疾患、障害または病状に付随する条件下で活性化さ
れるプロモーター」には、疾患特異的プロモーター、特定の生理的、発生的、分化的また
は病的条件に応答するプロモーター、特異的な生体分子に応答するプロモーター、および
疾患、障害または病状に付随する特定の組織型または細胞種、例えば、腫瘍組織または悪
性細胞に特異的なプロモーターが非限定的に含まれる。TSPは、天然に存在するプロモ
ーターの配列、天然に存在するプロモーターに由来する改変配列、または合成配列(例え
ば、プロモーターの応答性を変更するための、最小プロモーター配列中への応答エレメン
トの挿入)を含みうる。
コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、続いてそれがト
ランス−RNAスプライシングされ(コード配列がイントロンを含む場合)、コード配列
によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞内で転写制御配列および翻訳制
御配列の「制御下」にある。
「転写制御配列および翻訳制御配列」とは、宿主細胞におけるコード配列の発現をもた
らす、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのDNA調節配列のことを指す
。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
「応答エレメント」という用語は、転写因子のDNA結合ドメインとの相互作用を通じ
て媒介される、プロモーターに対する応答性を付与する1つまたは複数のシス作用性DN
Aエレメントのことを指す。このDNAエレメントは、その配列がパリンドローム性(完
全または不完全)であるか、または様々な数のヌクレオチドによって隔てられた配列モチ
ーフもしくはハーフサイト(halfsite)で構成されるかのいずれかであってよい。ハーフ
サイトは類似または同一であってよく、直列反復配列もしくは逆方向反復配列のいずれか
として、または単一のハーフサイトもしくは縦列に隣接するハーフサイトの多量体として
配列されうる。応答エレメントは、この応答エレメントが組み入れられる細胞または生物
の性質に応じて、異なる生物から単離された最小プロモーターを含んでもよい。転写因子
のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのDNA
配列と結合して、この応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始させるかまた
は抑制する。天然エクジソン受容体の応答エレメントのDNA配列の例には、RRGG/
TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO:25)(Cherbas et. al., Genes
Dev. 5:120 (1991)を参照);AGGTCAN(n)AGGTCA、式中、N(n)は1
つまたは複数のスペーサーヌクレオチドでありうる(SEQ ID NO:26)(D'Av
ino et al., Mol. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995)を参照);およびGGGTTGAA
TGAATTT(SEQ ID NO:27)(Antoniewski et al., Mol. Cell Biol.
14:4465 (1994)を参照)が含まれる。
「機能的に連結された」という用語は、一方の機能がもう一方によって影響されるよう
な、1つの核酸断片上の核酸配列の連係のことを指す。例えば、プロモーターは、コード
配列の発現に影響を及ぼしうる(すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあ
る)場合、プロモーターはそのコード配列と機能的に連結している。コード配列は、セン
スまたはアンチセンスの向きに、調節配列と機能的に連結させることができる。
「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、核酸またはポリヌクレオチドに由来す
るセンスRNA(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積のことを
指す。発現が、mRNAのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳のことを指すこともあ
る。
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特定の
制限部位に、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することの
できるDNAのセグメントのことを指す。DNAのセグメントは、関心対象のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳の
ための正しいリーディングフレームでのカセットの挿入を確実とするように設計される。
「形質転換カセット」とは、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
み、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を助長するエレメントを有す
る特定のベクターのことを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット
および形質転換カセットは、宿主細胞における関心対象のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドの発現強化を可能とするエレメントも含みうる。これらのエレメントには、
プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列
、ポリアデニル化配列が非限定的に含まれうる。
本発明において、「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターと連係している応答
エレメントと、応答エレメントおよびプロモーターが組み入れられた遺伝子の発現を1つ
または複数のリガンドの存在下でモジュレートするリガンド依存性転写因子に基づく系と
の組合せのことを指す。「遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド」という用語は
、プロモーターと連係している応答エレメントと、応答エレメントおよびプロモーターが
組み入れられた遺伝子の発現を1つまたは複数のリガンドの存在下でモジュレートするリ
ガンド依存性転写因子に基づく系をコードするポリヌクレオチドとの組合せのことを指す
本発明の治療用スイッチプロモーターは、特定の疾患、障害または病状を治療するため
、改善するため、または予防するために有用な任意のプロモーターであってよい。その例
には、特定の疾患、障害または病状の際にのみ発現増大を呈する遺伝子のプロモーター、
および特定の細胞条件(例えば、増殖、アポトーシス、pHの変化、酸化状態、酸素レベ
ル)下で発現増大を呈する遺伝子のプロモーターが非限定的に含まれる。遺伝子スイッチ
が複数の転写因子配列を含むいくつかの態様においては、疾患特異的または病状特異的プ
ロモーターと、治療用産物が発現される組織を限定する組織型特異的または細胞種特異的
プロモーターとを組み合わせることにより、治療方法の特異性を高めることができる。し
たがって、組織特異的または細胞種特異的プロモーターは、治療用スイッチプロモーター
の定義の範囲に含まれる。
疾患特異的プロモーターの例として、癌を治療するために有用なプロモーターには、癌
遺伝子のプロモーターが含まれる。癌遺伝子のクラスの例には、増殖因子、増殖因子受容
体、プロテインキナーゼ、プログラム細胞死レギュレーターおよび転写因子が非限定的に
含まれる。癌遺伝子の具体的な例には、sis、erb B、erb B−2、ras、
abl、mycおよびbcl−2およびTERTが非限定的に含まれる。他の癌関連遺伝
子の例には、新生物細胞において過剰発現される腫瘍関連抗原遺伝子および他の遺伝子(
例えば、MAGE−1、癌胎児性抗原、チロシナーゼ、前立腺特異的抗原、前立腺特異的
膜抗原、p53、MUC−1、MUC−2、MUC−4、HER−2/neu、T/Tn
、MART−1、gp100、GM2、Tn、sTnおよびトンプソン・フリーデンライ
ヒ(Thompson-Friedenreich)抗原(TF))が含まれる。
当技術分野において公知であり、本発明における治療用スイッチプロモーターとして有
用なプロモーター配列および他の調節エレメント(例えば、エンハンサー)の例は、表1
および2に列記された参考文献中に、各プロモーターと関連のある疾患/障害(表1)ま
たは組織特異性(表2)とともに開示されている。これらの参考文献中に開示されている
プロモーター配列は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
表1に列挙するタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、治療用プロモ
ーターではないプロモーターを備える本発明のベクターを用いて発現することもできる。



特定の疾患または障害の際に発現レベルの変化を呈し、それ故に本発明において有用な
プロモーターをもたらす可能性のある他の遺伝子には、表3に(関連のある疾患/障害と
ともに)列記された遺伝子が非限定的に含まれる。
疾患、障害または病状の際に発現パターンがモジュレートされる遺伝子がひとたび同定
されれば、その遺伝子のプロモーターは本発明の遺伝子スイッチに用いうる可能性がある
。プロモーター領域を含む、多くの遺伝子の配列が当技術分野において公知であり、公開
データベース、例えば、GenBankで入手可能である。このため、ひとたび適切な遺
伝子が同定されれば、そのプロモーター配列を容易に同定して入手することができる。本
発明の別の局面は、そのプロモーターを単離して遺伝子スイッチ中に配置することのでき
る、適した遺伝子を同定することを対象とする。したがって、プロモーターを単離して、
その後の状況または環境において用いることができる限り、遺伝子の実体は、本発明の具
体的な態様において特に重要ではないと考えられる。本発明はこのため、まだ同定されて
いない遺伝子に由来するプロモーターの使用も含む。ひとたび適した遺伝子が同定されれ
ば、プロモーター機能のために必要な遺伝子配列を決定することは、当技術分野の定型的
な技能または実験に属する事柄である。実際に、関心対象の遺伝子のプロモーター領域の
決定の助けになる、いくつかの商業的プロトコールが存在する。例を挙げると、Ding
らは最近、ヒトSprouty4遺伝子の5’隣接配列を漸進的に欠失させることにより
、新規Sprouty4遺伝子のプロモーター配列を解明した(Am. J. Physiol. Lung C
ell. Mol. Physiol. 287:L52 (2004)、これは参照により組み入れられる)。手短に述べ
ると、ひとたび転写開始部位が決定されたところで、一般的なPCRプライマーを用いて
PCR断片を生成させて、5’隣接セグメントのセグメントを一方向様式でクローニング
した。生成されたセグメントをルシフェラーゼレポーターベクター中にクローニングして
、ルシフェラーゼ活性を測定することで、ヒトSprouty4遺伝子のプロモーター領
域が決定された。
遺伝子プロモーターの取得および検証のためのプロトコールの別の例は、以下の段階を
含む:(1)組織型が同様/同一である罹患性および非罹患性の細胞/組織試料を取得す
る段階;(2)試料から全RNAまたはmRNAを単離する段階;(3)罹患性および非
罹患性RNAの示差的マイクロアレイ分析を行う段階;(4)疾患特異的転写物の候補を
同定する段階;(5)疾患特異的転写物と関連のあるゲノム配列を同定する段階;(6)
疾患特異的転写物の転写開始部位と予想される部位の上流および下流にあるDNA配列を
取得または合成する段階;(7)段階6による種々の長さのDNAを用いてプロモーター
レポーターベクターを設計および作製する段階;ならびに(8)罹患性および非罹患性の
細胞/組織、さらには無関係な細胞/組織において、プロモーターレポーターベクターを
試験する段階。
遺伝子スイッチ中に挿入されるプロモーターの源は天然性でも合成性でもよく、プロモ
ーターの源が本明細書に記載される本発明の範囲を限定すべきではない。換言すれば、プ
ロモーターを細胞から直接クローニングしてもよく、またはプロモーターが異なる源から
以前にクローニングされていてもよく、またはプロモーターを合成してもよい。
遺伝子スイッチシステム
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任意
の遺伝子スイッチシステムでありうる。1つの態様において、遺伝子スイッチは、遺伝子
発現のレベルが、その中に存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明の遺
伝子スイッチ中に用いうるリガンド依存性転写因子複合体の例には、それぞれのリガンド
(例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン
、ならびにその類似体および模倣物)によって活性化される核内受容体スーパーファミリ
ーのメンバー、およびテトラサイクリンによって活性化されるrTTAが非限定的に含ま
れる。本発明の1つの局面において、遺伝子スイッチはEcRに基づく遺伝子スイッチで
ある。そのようなシステムの例には、米国特許第6,258,603号、第7,045,
315号、米国特許出願公開第2006/0014711号、第2007/016108
6号、およびWO01/70816号に記載されたシステムが非限定的に含まれる。キメ
ラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第7,091,038号、米国特許出願公
開第2002/0110861号、第2004/0033600号、第2004/009
6942号、第2005/0266457号、および第2006/0100416号、な
らびにWO01/70816号、第02/066612号、第02/066613号、第
02/066614号、第02/066615号、第02/29075号、および第20
05/108617号に記載されており、これらはそれぞれその全体が参照により組み入
れられる。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システムの一例は、RheoSwi
tch(登録商標)MammalianInducibleExpressionSys
tem(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)である。本発明
の別の局面において、遺伝子スイッチは、FK506結合タンパク質(FKBP)と、ラ
パマイシンまたはその非免疫抑制性類似体を通じて調節されるFKBPラパマイシン関連
タンパク質(FRAP)とのヘテロ二量体化に基づく。そのようなシステムの例には、A
RGENT(登録商標)TranscriptionalTechnology(ARI
ADPharmaceuticals,Cambridge,MA)、ならびに米国特許
第6,015,709号、第6,117,680号、第6,479,653号、第6,1
87,757号および第6,649,595号に記載されたシステムが非限定的に含まれ
る。
1つの態様において、遺伝子スイッチは、治療用スイッチプロモーターの制御下にある
リガンド依存性転写因子複合体をコードする単一の転写因子配列を含む。転写因子配列は
、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体であるリガンド依存性
転写因子複合体をコードしてよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によっ
て、または複数の異なる転写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の
天然配列が改変されたもののことである。1つの態様において、転写因子はグループH核
内受容体リガンド結合ドメインを含む。1つの態様において、グループH核内受容体リガ
ンド結合ドメインは、エクジソン受容体、ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容体
1(OR−1)、ステロイドホルモン核内受容体1(NER−1)、レチノイドX受容体
相互作用タンパク質−15(RIP−15)、肝臓X受容体β(LXRβ)、ステロイド
ホルモン受容体様タンパク質(RLD−1)、肝臓X受容体(LXR)、肝臓X受容体α
(LXRα)、ファルネソイドX受容体(FXR)、受容体相互作用タンパク質14(R
IP−14)またはファルネソール受容体(HRR−1)からのものである。別の態様に
おいて、グループH核内受容体LBDはエクジソン受容体からのものである。
A.エクジソンに基づく遺伝子スイッチ
EcRおよび他のグループH核内受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーであ
り、これはそのすべてのメンバーが、任意でヘテロ二量体化パートナー(HP)と融合し
てコアクチベーションタンパク質(CAP)を形成するアミノ末端トランス活性化ドメイ
ン(AD、「TA」または「TD」とも互換的に呼ばれる)、DNA結合ドメイン(DB
D)、およびヒンジ領域を介してDBDと融合してリガンド依存性転写因子(LTF)を
形成するLBDの存在によって一般に特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「DNA
結合ドメイン」という用語は、DNA結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するよ
うに機能する限り、最長でDNA結合タンパク質の全長までの、DNA結合タンパク質の
最小のポリペプチド配列を含む。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、以下の4
つまたは5つのドメインの存在によっても特徴付けられる:A/B、C、D、E、および
いくつかのメンバーではF(米国特許第4,981,784号およびEvans, Science 240
:889 (1988)を参照)。「A/B」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「C」
はDNA結合ドメインに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、「E」はリガンド結合ド
メインに対応する。このファミリーのいくつかのメンバーは、「F」に対応するLBDの
カルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有することもある。
以下のポリペプチド配列は、エクジソン受容体(エクジステロイド受容体)(20−ヒ
ドロキシ−エクジソン受容体)(20E受容体)(EcRH)(核内受容体サブファミリ
ー1グループHメンバー1)のポリペプチド配列として報告されており、Genbank
ではアクセッション番号P34021を有する。
キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)由来のエクジソン受容体(878aa)
(SEQ ID NO:5)
DBDは、応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P−ボ
ックスおよびD−ボックスが間にある2つのシステインジンクフィンガーの存在によって
特徴付けられる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパ
ク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。EcRは、核内受容体ファミ
リーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う、あまり詳細には解明されていな
い領域も有する。核内受容体のドメインはモジュール的な性質であるため、LBD、DB
DおよびADを入れ替えてもよい。
別の態様において、転写因子は、AD、その発現をモジュレートしようとする治療用タ
ンパク質または治療用ポリヌクレオチドと連係している応答エレメントを認識するDBD
;およびグループH核内受容体LBDを含む。ある態様において、グループH核内受容体
LBDは置換突然変異を含む。
別の態様において、遺伝子スイッチは、第1の治療用スイッチプロモーター(TSP−
1)の制御下にある第1の転写因子配列、例えばCAP、および第2の治療用スイッチプ
ロモーター(TSP−2)の制御下にある第2の転写因子配列、例えばLTFを含み、前
記第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と前記第2の転写因子配列によっ
てコードされるタンパク質とが相互作用してタンパク質複合体(LDTFC)を形成する
が、すなわちこれは「二重スイッチ」または「ツーハイブリッド」に基づく遺伝子スイッ
チである。第1および第2のTSPは同じでも異なってもよい。この態様においては、遺
伝子スイッチ中に治療用分子の発現のために必要な2つの異なるTSPが存在するため、
治療方法の特異性が高まる(図2参照)。図2はまた、適切なTSPを単に挿入すること
のみにより、任意の疾患、障害または病状を治療するために治療用遺伝子スイッチを改変
しうることも示している。
さらなる態様において、第1および第2の転写因子配列、例えばCAPまたはLTFは
、単一の治療用スイッチプロモーター(例えば、図1中のTSP−1)の制御下にある。
このプロモーターの活性化は、単一のオープンリーディングフレームの下でCAPおよび
LTFの両方を生成させると考えられる。これは、IRES(配列内リボソーム進入部位
)などの転写リンカーの使用によって達成することができる。この態様においては、リガ
ンド依存性転写因子複合体の両方の部分がTSP−1の活性化に応じて合成される。TS
P−1は構成的プロモーターであってもよく、または疾患、障害もしくは病状と関連のあ
る条件下のみにおいて活性化されてもよい。
さらなる態様において、一方の転写因子配列、例えばLTFは、疾患、障害または病状
と関連のある条件下のみにおいて活性化される治療用スイッチプロモーターの制御下にあ
り(例えば、図4中のTSP−2またはTSP−3)、もう一方の転写因子配列、例えば
CAPは、構成的治療用スイッチプロモーター(例えば、図4中のTSP−1)の制御下
にある。この態様において、リガンド依存性転写因子複合体の1つの部分は構成的に存在
し、一方、第2の部分は疾患、障害または病状と関連のある条件下でのみ合成されると考
えられる。
別の態様において、一方の転写因子配列、例えばCAPは、第1のTSP(例えば、図
3中のTSP−1)の制御下にあり、2つまたはそれ以上の異なる第2の転写因子配列は
、例えばLTF−1およびLTF−2は異なるTSP(例えば、図3中のTSP−2およ
びTSP−3)の制御下にある。この態様において、LTFのそれぞれは、異なる因子調
節性プロモーター配列を認識する異なるDBDを有してよい(例えば、DBD−Aは因子
調節性プロモーター−1(FRP−1)と連係している応答エレメントと結合し、DBD
−Bは因子調節性プロモーター−2(FRP−2)と連係している応答エレメントと結合
する。因子調節性プロモーターのそれぞれが異なる治療用遺伝子と機能的に連結されてい
てもよい。この様式では、複数の治療を同時に提供することができる。
1つの態様において、第1の転写因子配列は、AD、その発現をモジュレートしようと
する治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するDBD;およびグループH
核内受容体LBDを含むポリペプチドをコードし、第2の転写因子配列は、脊椎動物レチ
ノイドX受容体(RXR)、無脊椎動物RXR、ウルトラスピラクル(ultraspiracle)
タンパク質(USP)、または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよびUSPから選択
される少なくとも2つの異なる核内受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含む
キメラ核内受容体から選択される核内受容体LBDを含む転写因子をコードする(WO0
1/70816A2号およびUS2004/0096942A1号を参照)。「パートナ
ー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然変異、置換突然変異ま
たは別の修飾をさらに含んでもよい。
別の態様において、遺伝子スイッチは、核内受容体LBDおよびその発現をモジュレー
トしようとする治療用産物配列と連係している応答エレメントを認識するDBDを含む第
1のポリペプチドをコードする第1の転写因子配列、ならびにADおよび核内受容体LB
Dを含む第2のポリペプチドをコードする第2の転写因子配列を含み、ここで核内受容体
LBDの1つはグループH核内受容体LBDである。1つの態様において、第1のポリペ
プチドはADを実質的に含まず、第2のポリペプチドはDBDを実質的に含まない。本発
明において、「実質的に含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性を提供
するのに十分な当該ドメインの配列を含まないことを意味する。
本発明の別の局面において、第1の転写因子配列はヘテロ二量体化パートナーおよびA
Dを含むタンパク質(「CAP」)をコードし、第2の転写因子配列はDBDおよびLB
Dを含むタンパク質(「LTF」)をコードする。
一方の核内受容体LBDだけがグループH LBDである場合、もう一方の核内受容体
LBDは、グループH LBDと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであ
ってよい。例えば、グループH核内受容体LBDがEcR LBDである場合、もう一方
の核内受容体LBD「パートナー」は、EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、ウ
ルトラスピラクルタンパク質(USP)、または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよ
びUSPから選択される少なくとも2つの異なる核内受容体LBDポリペプチド断片を含
むキメラ核内受容体からのものであってよい(WO01/70816A2号、国際特許出
願第PCT/US02/05235号および米国特許第2004/0096942A1号
を参照)。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然
変異、置換突然変異、または別の修飾をさらに含んでもよい。
1つの態様において、脊椎動物RXR LBDは、ヒト(ヒト、Homo sapiens)、マウ
ス(ハツカネズミ、Mus musculus)、ラット(ドブネズミ、Rattus norvegicus)、ニワ
トリ(チャボ、Gallus gallus)、ブタ(ブタ、Sus scrofa domestica)、カエル(アフ
リカツメガエル、Xenopus laevis)、ゼブラフィッシュ(ゼブラダニオ、Danio rerio)
、ホヤ(ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis)、またはクラゲ(ミツデリ
ッポウクラゲ、Tripedalia cysophora)のRXRからのものである。
1つの態様において、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ(ト
ノサマバッタ、Locusta migratoria)ウルトラスピラクルポリペプチド(「LmUSP」
)、マダニ(アムブリオンマ−アメリカヌム、Amblyomma americanum)RXRホモログ1
(「AmaRXR1」)、マダニ(アムブリオンマ−アメリカヌム)RXRホモログ2(
「AmaRXR2」)、シオマネキ(セルカ−プギレーター、Celuca pugilator)RXR
ホモログ(「CpRXR」)、カブトムシ(チャイロコメノゴミムシダマシ、Tenebrio m
olitor)RXRホモログ(「TmRXR」)、ミツバチ(ヨーロッパミツバチ、Apis mel
lifera)RXRホモログ(「AmRXR」)、アブラムシ(モモアカアブラムシ、Myzus
persicae)RXRホモログ(「MpRXR」)、または非双翅目(non-Dipteran)/非鱗
翅目(non-Lepidopteran)RXRホモログからのものである。
1つの態様において、キメラRXR LBDは、脊椎動物種RXRポリペプチド断片、
無脊椎動物種RXRポリペプチド断片、および非双翅目/非鱗翅目無脊椎動物種RXRホ
モログポリペプチド断片から選択される、少なくとも2つのポリペプチド断片を含む。本
発明に用いるためのキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種の
RXRポリペプチド断片を含んでよく、または種が同一である場合、2つまたはそれ以上
の複数のポリペプチド断片はその種のRXRポリペプチド断片の2つまたはそれ以上の異
なるアイソフォームからのものであってよい。このようなキメラRXR LBDは、例え
ば、国際公開第2002/066614号パンフレットに開示されている。
1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動
物種RXRポリペプチド断片および1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片を含む。
別の態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物
種RXRポリペプチド断片および1つの非双翅目/非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログ
ポリペプチド断片を含む。
リガンドは、核内受容体のLBDと組み合わされると、続いてそれが治療用産物配列と
連係しているFRPの応答エレメントと結合することで、治療用産物配列の発現の外部か
らの時間的調節をもたらす。結合の機序、または本発明の様々な構成要素が互いに結合す
る順序、すなわち、例えばリガンドからLBDに、DBDから応答エレメントに、ADか
らプロモーターに、といったことは特に重要ではない。
1つの具体的な例において、グループH核内受容体のLBDおよびその核内受容体LB
Dパートナーに対するリガンドの結合は、治療用産物配列の発現を可能にする。この機序
は、グループH核内受容体(GHNR)またはそのパートナーに対するリガンド結合、お
よびその結果生じる活性ホモ二量体複合体(例えば、GHNR+GHNRまたはパートナ
ー+パートナー)の形成の可能性を否定するものではない。好ましくは、受容体ドメイン
の1つまたは複数を変更して、ハイブリッド遺伝子スイッチを作製する。典型的には、ハ
イブリッド遺伝子およびその結果生じるハイブリッドタンパク質が、選択した宿主細胞ま
たは生物において、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合および特定の応答エレメ
ントの認識に関して最適化されるように、DBD、LBDおよびADという3つのドメイ
ンのうち1つまたは複数を、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。
加えて、応答エレメント自体を、酵母由来のGAL−4タンパク質(Sadowski et al., N
ature 335:563 (1988)を参照)もしくは大腸菌由来のLexAタンパク質(Brent et al.
, Cell 43:729 (1985)を参照)などの他のDNA結合タンパク質ドメインに対する応答エ
レメント、またはそのような特異的相互作用のために設計、修飾および選択されたタンパ
ク質との標的指向性相互作用に対して特異的な合成応答エレメント(例えば、Kim et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照)で修飾または置換して、ハイブ
リッド受容体に適応させることもできる。ツーハイブリッドシステムの別の利点は、それ
らが、所望の最終結果に即した遺伝子発現を駆動するために用いられるプロモーターの選
択を可能にすることである。そのような二重制御は、発現のタイミングならびに発現が起
こる細胞の両方を制御しうるため、遺伝子治療の領域において、特に細胞傷害性タンパク
質が産生される場合に、特に重要であると考えられる。適したプロモーターに連結された
遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発現は本発明のシステムの存在によ
って制御される。プロモーターは、構成的であっても誘導的に調節されてもよく、または
組織特異的(すなわち、特定の型の細胞のみで発現される)であってもその生物のある特
定の発生段階に対して特異的であってもよい。
第1のハイブリッドタンパク質のDNA結合ドメインは、リガンドの存在下または非存
在下で応答エレメントのDNA配列と結合して、この応答エレメントの調節下で、下流遺
伝子の転写を開始させるかまたは抑制する。
機能性LDTFC、例えばEcR複合体は、イムノフィリンなどの別のタンパク質を含
んでもよい。転写因子(DHR38またはβFTZ−1など)として知られるタンパク質
の核内受容体ファミリーの別のメンバーは、EcR、USPおよび/またはRXRのリガ
ンド依存性または非依存性パートナーであってもよい。さらに、一般にコアクチベーター
(アダプターまたはメディエーターとも呼ばれる)として知られるタンパク質などの他の
補因子が必要とされることもある。これらのタンパク質はDNAと配列特異的には結合せ
ず、基本的な転写にも関与しない。それらは、クロマチン構造に影響を及ぼすことにより
、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することにより、アクチベーターの
DNA結合の刺激を含む、様々な機序を通じて転写活性化に対する効果を発揮しうる。そ
のようなコアクチベーターの例には、RIP140、TIF1、RAP46/Bag−1
、ARA70、SRC−1/NCoA−1、TIF2/GRIP/NCoA−2、ACT
R/AIB1/RAC3/pCIP、さらには乱交雑性コアクチベーターC応答エレメン
トB結合タンパク質CBP/p300が含まれる(総説については、Glass et al., Curr
. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)を参照)。また、コリプレッサー(リプレッサー、サ
イレンサーまたはサイレンシングメディエーターとしても知られる)として一般に知られ
ているタンパク質補因子が、リガンドの非存在下における転写活性化を効果的に阻害する
ために必要とされることもある。これらのコリプレッサーは、リガンドが結合していない
EcRと相互作用して、応答エレメントでの活性をサイレンシングさせることができる。
現時点での証拠は、リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、その結果
、コリプレッサーの放出および上記のコアクチベーターの動員が起こり、それにより、そ
れらのサイレンシング活性が消失することを示唆している。コリプレッサーの例には、N
−CoRおよびSMRTが含まれる(総説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol
. 10:1167 (1996)を参照)。これらの補因子は細胞もしくは生物内にある内因性のもので
あってもよく、または調節性もしくは非調節性のいずれかの様式で発現される導入遺伝子
として外因的に添加してもよい。
B.ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチ
本発明はさらに、FK506結合タンパク質をリガンド依存性転写因子複合体として、お
よびラパマイシンをリガンドとして利用する遺伝子スイッチシステムを提供する。1つの
態様において、遺伝子スイッチをコードする構築物は、
(a)ラパマイシンまたはその類似体と結合し、少なくとも1つのFK506結合タンパ
ク質(FKBP)ドメインおよびそれに対して異種性である少なくとも1つのタンパク質
ドメイン異種を含み、FKBPドメインが以下から選択されるペプチド配列を含む、第1
のキメラタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド:
(1)天然に存在するFKBP
(2)最大で10個のアミノ酸残基が欠失している、挿入されている、または置換アミノ
酸によって置き換えられている、天然に存在するFKBPの変異体、および
(3)(1)または(2)のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリダイズ
するDNA配列によってコードされるFKBP;
(b)(a)ラパマイシンまたはラパマイシン類似体および(b)第1のキメラタンパク
質の両方と複合体を形成し、少なくとも1つのFKBP:ラパマイシン結合(FRB)ド
メインおよびそれに対して異種性である少なくとも1つのタンパク質ドメインを含み、F
RBドメインが以下から選択するペプチド配列を含む、第2のキメラタンパク質をコード
する第2のポリヌクレオチド:
(4)天然に存在するFRBドメイン、
(5)最大で10個のアミノ酸残基が欠失している、挿入されている、または置換アミノ
酸によって置き換えられている、天然に存在するFRBドメインの変異体、および
(6)(4)または(5)のFRBをコードするDNA配列と選択的にハイブリダイズす
るDNA配列によってコードされるFRBドメイン、
を含む。
この遺伝子スイッチシステムにおいて、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌク
レオチドのそれぞれは、本明細書中の他の箇所で記載された1つまたは複数の治療用スイ
ッチプロモーターの制御下にある。さらに、ある態様において、第1および第2のキメラ
タンパク質中のFKBPおよび/またはFRBドメインに対して異種性である少なくとも
1つのタンパク質ドメインは、1つまたは複数の「作用」または「エフェクター」ドメイ
ンであってよい。エフェクタードメインは、DNA結合ドメイン、転写活性化ドメイン、
細胞局在化ドメインおよびシグナル伝達ドメイン(すなわち、クラスター化または多量体
化されると細胞成長、増殖、分化、アポトーシス、遺伝子転写などを誘発することのでき
るドメイン)を含む、多岐にわたるタンパク質ドメインから選択されうる。
ある態様において、1つの融合タンパク質は少なくとも1つのDNA結合ドメイン(例
えば、GAL4またはZFHD1DNA結合ドメイン)を含み、別の融合タンパク質は少
なくとも1つの転写活性化ドメイン(例えば、VP16またはp65転写活性化ドメイン
)を含む。リガンドを介した融合タンパク質の会合は転写因子複合体の形成に相当し、融
合タンパク質の一方の上のDNA結合ドメインによって認識される(すなわち、それと結
合することのできる)DNA配列に連結された標的遺伝子の転写の開始を導く。遺伝子発
現システムならびにリガンドに関する情報は、米国特許第6,187,757B1号、第
6,649,595B1号、第6,509,152B1号、第6,479,653B1号
および第6,117,680B1号に開示されている。
他の態様において、本発明は、リガンドの非存在下において自己凝集する2つの融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子スイッチシステムであって、(a)
第1の融合タンパク質が、選択したリガンドと結合する条件的凝集ドメインおよび転写活
性化ドメインを含み、かつ(b)第2の融合タンパク質が、選択したリガンドと結合する
条件的凝集ドメインおよびDNA結合ドメインを含み、かつ(c)リガンドの非存在下に
おいて、細胞が、前記DNA結合ドメインが結合する調節性DNAと機能的に連結された
遺伝子を発現する、遺伝子スイッチシステムを提供する。遺伝子スイッチシステムを含む
改変細胞を、遺伝子のリプレッションのために十分な量のリガンドの存在下で増やす。リ
ガンドの除去は、細胞死を引き起こす、コードされたタンパク質の発現を誘導する。この
2つの融合タンパク質をコードする核酸は、少なくとも1つの条件的プロモーターの制御
下にある。条件的凝集ドメインを利用する遺伝子発現システムは、米国特許出願公開第2
002/0048792号に開示されている。
C.原核生物リプレッサー/オペレーターに基づく遺伝子スイッチシステム
1つの態様において、本発明は、(a)原核生物テトラサイクリン(「tet」)リプレ
ッサーおよび真核生物転写アクチベータータンパク質ドメインを含むトランスアクチベー
ター融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド;ならびに(b)治療用タンパ
ク質または治療用ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、を含む遺伝子スイ
ッチシステムであって、前記第2のポリヌクレオチドが最小プロモーターおよび少なくと
も1つのtetオペレーター配列と機能的に連結されている、遺伝子スイッチシステムを
提供する。トランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド
は、本明細書中の他の箇所で記載された治療用スイッチプロモーターを含みうる。この致
死性タンパク質の発現はテトラサイクリンの非存在下でアップレギュレートされる(例え
ば、Gossen et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.89:5547-5551;Gossen et al.(199
3)TIBS 18:471-475;Furth et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9302-9306;
およびShockett et al.(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. 92:6522-6526を参照)。Te
tO発現システムは、米国特許第5,464,758B1号に開示されている。
別の態様において、遺伝子スイッチシステムは、細菌である大腸菌(Escherichia coli
)由来のラクトース(「Lac」)リプレッサー−オペレーターシステムを含む。本発明
の遺伝子スイッチシステムはまた、(a)原核生物lacIリプレッサーおよび真核生物
転写アクチベータータンパク質ドメインを含むトランスアクチベーター融合タンパク質を
コードする第1のポリヌクレオチド;ならびに(b)治療用タンパク質または治療用ポリ
ペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含んでもよく、ここで前記第2のポリヌ
クレオチドは治療用スイッチプロモーターに機能的に連結されている。このLacシステ
ムにおいて、lacオペロンは、ラクトースまたはイソプロピル−b−D−チオガラクト
シドなどの合成類似体の非存在下では不活性化される。
そのほかの遺伝子スイッチシステムには、以下に記載されたものが含まれる:US7,
091,038号;WO2004078924号;EP1266015号;US2001
0044151号;US20020110861号;US20020119521号;U
S20040033600号;US20040197861号;US200402350
97号;US20060020146号;US20040049437号;US2004
0096942号;US20050228016号;US20050266457号;U
S20060100416号;WO2001/70816号;WO2002/29075
号;WO2002/066612号;WO2002/066613号;WO2002/0
66614号;WO2002/066615号;WO2005/108617号;US6
,258,603号;US20050209283号;US20050228016号;
US20060020146号;EP0965644号;US7,304,162号;U
S7,304,161号;MX234742号;KR10−0563143号;AU76
5306号;AU2002−248500号;およびAU2002−306550号。
D.遺伝子スイッチシステムの組合せ
本発明は、1つまたは複数のリガンドの有効量によって活性化される複数の異なるリガン
ド依存性転写因子複合体を含む2つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムを含み、そ
の2つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムが、1つまたは複数のリガンドと結合す
ると1つまたは複数の治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの発現を選択的
に誘導する第1の遺伝子スイッチおよび第2の遺伝子スイッチを含む、核酸組成物、改変
された細胞およびバイオリアクターを提供する。任意の数の遺伝子スイッチシステムおよ
び/またはその任意の組合せが本発明の範囲内にある。
1つの態様において、本発明は、以下のものを含む核酸組成物を提供する:
a.以下のものを含む第1の遺伝子スイッチシステム:
i.以下のものを含む第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む第1の遺伝子発現カセット:
1.治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイン;お
よび
2.ヘテロ二量体パートナードメイン;
ii.以下のものを含む第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第2の遺伝子発現カセット:
1.治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを認識するDNA結合ドメイン;および
2.リガンド結合ドメイン;ならびに
iii.以下のものを含む、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコード
するポリヌクレオチドを含む第3の遺伝子発現カセット:
1.第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化される因
子調節性プロモーター;および
2.治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、
ならびに
b.以下のものを含む、第2の遺伝子発現システム:
i.以下のものを含む、第1のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第1の遺伝子発現カセット:
1.治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを活性化するトランス活性化ドメイン;お
よび
2.ヘテロ二量体パートナードメイン、
ii.以下のものを含む、第2のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む第2の遺伝子発現カセット:
1.治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと
機能的に連携している因子調節性プロモーターを認識するDNA結合ドメイン;および
2.リガンド結合ドメイン;ならびに
iii.以下のものを含む、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコード
するポリヌクレオチドを含む第3の遺伝子発現カセット:
1.第2のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化される因
子調節性プロモーター;および、
2.治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
この複数の誘導性遺伝子発現システムは、複数の異なる疾患、障害もしくは病状と関連
のある条件下における所与の治療用ポリヌクレオチドもしくは治療用ポリペプチドの発現
、または、同じ疾患障害もしくは病状と関連のある同じ条件下または複数の異なる疾患、
障害もしくは病状と関連のある複数の異なる条件下のいずれかにおいて複数の治療用ポリ
ペプチドもしくは治療用ポリヌクレオチドの発現をもたらす。
ある態様において、2つまたはそれ以上の遺伝子スイッチシステムの組合せは、(1)
二重スイッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子発現システム、および(2)単一スイ
ッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチであってよい。他の態様において、組
合せは、(1)単一スイッチ性または二重スイッチ性のエクジソン受容体に基づく遺伝子
スイッチ、および(2)ラパマイシンに基づく遺伝子スイッチであってよい。または、遺
伝子スイッチシステムの組合せは、2つの同一な、上記に開示されたラパマイシンに基づ
く遺伝子スイッチシステムであってもよい。遺伝子スイッチシステムのあらゆる可能な組
合せが、本発明の範囲内にある。二重スイッチエクジソンシステムの例は、例えば、国際
公開第2002/29075号パンフレットおよび米国特許出願公開第2002/011
0861号明細書に見出すことができる。
リガンド
本明細書で用いる場合、LDTFCに基づく遺伝子スイッチ、例えば、EcD複合体に基
づく遺伝子スイッチに対して適用される「リガンド」という用語は、遺伝子スイッチを活
性化してその中にコードされるポリペプチドの発現を刺激する能力を有する低分子および
可溶性分子を記述している。本発明のリガンド依存性転写因子複合体のリガンドは、リガ
ンド結合ドメイン、ヘテロ二量体パートナードメイン、DNA結合ドメインおよびトラン
ス活性化ドメインのうち1つまたは複数を含むタンパク質複合体と結合する。リガンド依
存性転写因子複合体を活性化するためのリガンドの選択は、利用する遺伝子スイッチの型
に応じて決まる。
リガンドの例には、エクジソン、20−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリ
ステロンAなどのエクジステロイド、9−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似
体、米国特許第6,013,836号;第5,117,057号;第5,530,028
号;および第5,378,726号ならびに米国特許出願公開第2005/020928
3号および第2006/0020146号に開示されたものなどのN,N’−ジアシルヒ
ドラジン;米国特許出願公開第2004/0171651号に記載されているオキサジア
ゾリン;欧州特許出願第461,809号に開示されたものなどのジベンゾイルアルキル
シアノヒドラジン;米国特許第5,225,443号に開示されたものなどのN−アルキ
ル−N,N’−ジアロイルヒドラジン;欧州特許出願第234,994号に開示されたも
のなどのN−アシル−N−アルキルカルボニルヒドラジン;米国特許第4,985,46
1号に記載されたものなどのN−アロイル−N−アルキル−N’−アロイルヒドラジン;
米国特許出願公開第2004/0049037号に記載されたものなどのアミドケトン;
および3,5−ジ−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−N−イソブチル−ベンズアミド
、8−O−アセチルハルパギド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロー
ル、24(S)ヒドロキシコレステロール、25−エポキシコレステロール、T0901
317、5−α−6−α−エポキシコレステロール−3−スルフェート(ECHS)、7
−ケトコレステロール−3−スルフェート、ファメソール、胆汁酸、1,1−ビホスホン
酸エステル、幼若ホルモンIIIなどを含む、他の類似の材料が非限定的に含まれる。本
発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例には、RG−115819(3,5
−ジメチル−安息香酸N−(1−エチル−2,2−ジメチル−プロピル)−N’−(2−
メチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド)、RG−115932((R)−3
,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル
−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド)、およびRG−115830(3,5−ジ
メチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチル−3−メ
トキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド)が含まれる。米国特許出願第12/155,111
号およびPCT/US2008/006757号を参照されたく、これは両方ともその全
体が参照により本明細書に組み入れられる。
例えば、エクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチのリガンドは、任意の適したリガン
ドから選択することができる。天然に存在するエクジソンまたはエクジソン類似体(例え
ば、20−ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、ポナステロンA、ポナステロンB、
ポナステロンC、26−ヨードポナステロンA、イコノステロンまたは26−メシルイコ
ノステロン)および非ステロイド性誘導物資の両方を、本発明の遺伝子スイッチのリガン
ドとして用いることができる。米国特許第6,379,945B1号は、ステロイドおよ
びある種の非ステロイド性誘導物資の両方に応答する遺伝子スイッチとして作用しうる、
ニセアメリカタバコガ(Heliothis virescens)から単離された昆虫ステロイド受容体(
「HEcR」)を記載している。非ステロイド性誘導物資は、ステロイドおよび非ステロ
イド性誘導物資の両方に対して応答するこのシステムおよび多くの他のシステムにおいて
、例えば以下のもの:製造コストがより低いこと、代謝的安定性、昆虫にも植物にも哺乳
動物にも存在しないこと、および環境的受容性を含むいくつかの理由から、ステロイドを
上回る明確な利点を有する。米国特許第6,379,945B1号は、1,2−ジベンゾ
イル−1−tert−ブチル−ヒドラジンおよびテブフェノジド(N−(4−エチルベン
ゾイル)−N’−(3,5−ジメチルベンゾイル)−N’−tert−ブチル−ヒドラジ
ン)という2種のジベンゾイルヒドラジンの、エクジソンに基づく遺伝子スイッチのリガ
ンドとしての有用性を記載している。同じく本発明にリガンドとして含まれるものに、米
国特許第5,117,057B1号に開示されたものなどの他のジベンゾイルヒドラジン
がある。キイロショウジョウバエ由来のエクジソン受容体に対する化学リガンドとしての
テブフェノジドの使用は、米国特許第6,147,282号にも開示されている。エクジ
ソンリガンドのそのほかの非限定的な例には、3,5−ジ−tert−ブチル−4−ヒド
ロキシ−N−イソブチル−ベンズアミド、8−O−アセチルハルパギド、1,2−ジアシ
ルヒドラジン、N’−置換−N,N’−二置換ヒドラジン、ジベンゾイルアルキルシアノ
ヒドラジン、N−置換−N−アルキル−N,N−ジアロイルヒドラジン、N−置換−N−
アシル−N−アルキル、カルボニルヒドラジンまたはN−アロイル−N’−アルキル−N
’−アロイルヒドラジンがある(米国特許第6,723,531号を参照)。
1つの態様において、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムのリガンドは、ジア
シルヒドラジンリガンドまたはキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッ
チシステムに用いられるリガンドは、式I

の化合物、
式中、Aはアルコキシ、アリールアルキルオキシもしくはアリールオキシであり;
Bは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;かつ
およびRは独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシア
ルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル
、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ置換されてもよいアリー
ル、もしくは置換されてもよいヘテロアリールである;
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であって
よい。
別の態様において、リガンドは、式II

の鏡像異性的に濃縮された化合物、
式中、Aはアルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、
置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;
Bは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;かつ
およびRは独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシア
ルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル
、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリ
ール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;
ただし、RはRと等しくはなく;
ここで、RおよびRを有する不斉炭素原子での絶対配置は大部分がSである;
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であって
よい。
ある態様において、リガンドは、式III

の鏡像異性的に濃縮された化合物、
式中、Aはアルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、
置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;
Bは置換されてもよいアリール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;かつ
およびRは独立に、置換されてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシア
ルキル、ハロアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルケニル
、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいヘテロシクロ、置換されてもよいアリ
ール、もしくは置換されてもよいヘテロアリールであり;
ただしRはRと等しくはなく;
ここでRおよびRを有する不斉炭素原子での絶対配置は大部分がRである;
または、それらの薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態もしくは非晶質形態であって
よい。
1つの態様において、リガンドは、鏡像異性体過剰率が少なくとも95%である(R)
−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エ
チル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド、またはその薬学的に許容される塩、水
和物、結晶形態もしくは非晶質形態であってよい。
式Iのジアシルヒドラジンリガンドおよび式IIまたはIIIのキラルジアシルヒドラ
ジンリガンドは、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムに用いた場合、本発明の治
療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの外部からの時間的調節をもたらす。2
008年5月29日に提出された米国特許出願第12/155,111号を参照されたく
、これは参照により本明細書に全面的に組み入れられる。
本発明に用いられるリガンドは、塩を形成してもよい。「塩」という用語は、本明細書
で用いる場合、無機性および/または有機性の酸および塩基によって形成される酸性およ
び/または塩基性塩を表す。加えて、式I、IIまたはIIIの化合物が塩基性モイエテ
ィおよび酸性モイエティの両方を含む場合には、両性イオン(「分子内塩」)が形成され
ることがあり、これは本明細書で用いる「塩」という用語に含まれる。薬学的に許容され
る(すなわち、無毒性で生理的に許容される)塩が用いられるが、他の塩も、例えば、調
製中に用いられる可能性のある単離または精製の段階において有用である。式I、IIま
たはIIIの化合物の塩は、例えば、塩が内部に沈殿するもののような媒質中、または水
性媒質中で、化合物を、ある量の、例えば等量の酸または塩基と反応させ、その後に凍結
乾燥を行うことによって形成させることができる。
塩基性モイエティを含むリガンドは、種々の有機酸および無機酸との塩を形成すること
ができる。例示的な酸付加塩には、酢酸塩(酢酸またはトリハロ酢酸、例えばトリフルオ
ロ酢酸と形成されるものなど)、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アス
パラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ク
エン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、
ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸
塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン塩酸、塩酸塩(塩酸と形成
される)、臭化水素酸塩(臭化水素と形成される)、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエ
タンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩(マレイン酸と形成される)、メタンスルホン
酸塩(メタンスルホン酸と形成される)、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、
硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸
塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩
(硫酸と形成されるものなど)、スルホン酸塩(本明細書中で言及したものなど)、酒石
酸塩、チオシアン酸塩、トシレートなどのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが
含まれる。
酸性モイエティを含むリガンドは、種々の有機塩基および無機塩基と塩を形成すること
ができる。例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム
塩、リチウム塩およびカリウム塩など、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩および
マグネシウム塩など、有機塩基(例えば、有機アミン)との塩、例えば、ベンザチン、ジ
シクロヘキシルアミン、ヒドラバミン(N,N−ビス(デヒドロアビエチル)エチレンジ
アミンと形成される)、N−メチル−D−グルカミン、N−メチル−D−グルカミド、t
−ブチルアミン、およびアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩が含まれる。
FK506結合ドメインを利用する誘導性遺伝子発現システムのリガンドの非限定的な
例には、FK506、シクロスポリンAまたはラパマイシンがある。FK506、ラパマ
イシンおよびそれらの類似体は、米国特許第6,649,595B2号および第6,18
7,757号に開示されている。米国特許第7,276,498号および第7,273,
874号も参照されたい。
本明細書に記載されたリガンドは、単独で、または薬学的に許容される担体を含む薬学
的組成物の一部として投与することができる。1つの態様において、薬学的組成物は、液
剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤および注射用組成物の形態にある。
一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、サイトカイン、免疫モジュレー
ター、凝固因子、抗体もしくは抗体の断片、エタネルセプト(Ertanercept)等の腫瘍壊
死因子受容体(TNFR)、エリスロポエチン、α−1アンチトリプシン、インターフェ
ロン(IFN)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、イン
ターフェロン−β−1a、インターフェロン−β−1b、第VII因子、第VIII因子
、第IX因子、アンチトロンビンIII、B型肝炎ウイルスタンパク質、ホルモン、例え
ば、成長ホルモン(GH)、ヒト成長ホルモン(hGH)、副甲状腺ホルモン(PH)、
甲状腺刺激ホルモン(TSH)、GCSFもしくはその断片またはGM−CSFもしくは
その断片が挙げられるが、これらに限定されないタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドの発現に用いることができる。
一実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、モノクローナル抗体をコ
ードする。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、ワクチンとしての核酸の発
現に用いることができる。本発明は、また、本発明のベクターまたは発現系を含むワクチ
ン組成物を提供する。別の一実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントを含む
遺伝子スイッチに関して、「エクジソン受容体に基づく」という用語は、天然に存在す
るかまたは合成性のエクジソン受容体リガンド結合ドメインの少なくとも機能性部分を含
み、エクジソン受容体リガンド結合ドメインと結合するリガンドに応答して遺伝子発現を
調節する遺伝子スイッチのことを指す。エクジソン応答システムの例は、米国特許第7,
091,038号および第6,258,603号に記載されている。1つの態様において
、システムはRheoSwitch(登録商標)Therapeutic System
(RTS)であり、これは図1に示されているように、構成的プロモーターの下で発現さ
れる、突然変異を誘発させたエクジソン受容体(EcR)のDEFドメインをGal4D
NA結合ドメインと融合させたもの、およびキメラRXRのEFドメインをVP16転写
活性化ドメインと融合させたものという2つの融合タンパク質を含む。
「モジュレートする(modulate)」および「モジュレートする(modulates)」という
用語は、核酸または遺伝子の発現を誘導する、減少させる、または阻害して、その結果、
タンパク質またはポリペプチドの産生のそれぞれ誘導、減少または阻害がもたらされるこ
とを指す。
本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞において遺伝子の発現を駆
動するのに適した少なくとも1つのプロモーターをさらに含んでもよい。
本発明の態様において用いうるエンハンサーには、SV40エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス(CMV)エンハンサー、伸長因子1(EF1)エンハンサー、酵母エンハン
サー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどが非限定的に含まれる。
終結制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列も、好ましい宿主
に対してネイティブ性である様々な遺伝子に由来しうる。任意で、終結部位が必要でない
こともあるが、含まれれば最も好ましい。本発明の1つの態様において、終結制御領域は
、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、SV40後期ポリアデニル化シグナル、SV
40ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル、ウ
イルスターミネーター配列などで構成されるか、またはそれらに由来してよい。
「3’非コード配列」または「3’非翻訳領域(UTR)」という用語は、コード配列
の下流(3’)に位置するDNA配列のことを指し、ポリアデニル化[ポリ(A)]認識
配列、およびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる調節シ
グナルをコードする他の配列を含んでよい。ポリアデニル化シグナルは通常、mRNA前
駆体の3’末端へのポリアデニル酸鎖の付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる
「調節領域」とは、第2の核酸配列の発現を調節する核酸配列のことを指す。調節領域
は、特定の核酸の発現を天然において担う配列(相同領域)を含んでもよく、または異な
るタンパク質もしくはさらには合成タンパク質の発現を担う異なる起源の配列(異種領域
)を含んでもよい。特に、これらの配列は、遺伝子の転写を特異的または非特異的な様式
で、および誘導性または非誘導性の様式で刺激または抑圧する、原核生物、真核生物もし
くはウイルス遺伝子の配列または導き出された配列でありうる。調節領域は、複製起点、
RNAスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、およびポリペプチ
ドを標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列を含む。
「異種性の源」からの調節領域とは、発現される核酸に天然では付随していない調節領
域のことを指す。異種性調節領域に含まれるものには、異なる種からの調節領域、異なる
遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在せずに当業者によっ
て設計された調節配列が含まれる。
「RNA転写物」とは、RNAポリメラーゼにより触媒されるDNA配列の転写の結果
として生じる産物のことを指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである
場合には、それは一次転写物と呼ばれるが、またはこれが一次転写物の転写後プロセシン
グに由来するRNA配列であってもよく、それは成熟RNAと呼ばれる。「メッセンジャ
ーRNA(mRNA)」とは、イントロンを伴わず、細胞によってタンパク質に翻訳され
うるRNAのことを指す。「cDNA」とは、mRNAに対して相補的であり、それに由
来する二本鎖DNAのことを指す。「センス」RNAとは、mRNAを含み、そのため細
胞によってタンパク質に翻訳されうるRNA転写物のことを指す。「アンチセンスRNA
」とは、標的一次転写物またはmRNAの全体または一部に対して相補的であって、標的
遺伝子の発現を阻止するRNA転写物のことを指す。アンチセンスRNAの相補性は、特
定の遺伝子転写物の任意の一部、すなわち、5’非コード配列、3’非コード配列、また
はコード配列におけるものでありうる。「機能性RNA」とは、アンチセンスRNA、リ
ボザイムRNA、または翻訳されないものの細胞過程に影響を及ぼす他のRNAのことを
指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられ、共有結
合したアミノ酸残基で構成される高分子化合物のことを指す。
「単離されたポリペプチド」、「単離されたペプチド」または「単離されたタンパク質
」とは、その天然状態において通常はそれに付随する化合物(例えば、他のタンパク質ま
たはポリペプチド、核酸、糖質、脂質)を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク
質のことを指す。「単離された」は、他の化合物との人工的もしくは合成的な混合物も、
生物活性に干渉せず、かつ例えば、不完全な精製、安定剤の添加または薬学的に許容され
る製剤への調合が原因となって存在する可能性のある不純物の存在も排除しないものとす
る。
「置換突然変異体ポリペプチド」または「置換突然変異体」とは、野生型または天然の
ポリペプチドに比して、少なくとも1つの野生型または天然のアミノ酸の異なるアミノ酸
による置換を含む、突然変異体ポリペプチドを意味することが理解されるであろう。置換
突然変異体ポリペプチドは、1つの野生型または天然のアミノ酸置換のみを含んでもよく
、これは「点突然変異体」または「単一点突然変異体」ポリペプチドと呼ばれることもあ
る。または、置換突然変異体ポリペプチドは、野生型または天然のポリペプチドに比して
、2つまたはそれ以上の野生型または天然のアミノ酸の2つまたはそれ以上のアミノ酸に
よる置換を含んでもよい。本発明によれば、置換突然変異を含むグループH核内受容体リ
ガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然のグループH核内受容体リガンド
結合ドメインポリペプチドに比して、少なくとも1つの野生型または天然のアミノ酸の異
なるアミノ酸による置換を含む。
置換突然変異体ポリペプチドが2つまたはそれ以上の野生型または天然のアミノ酸の置
換を含む場合、この置換は、置換のために欠失した野生型もしくは天然のアミノ酸と同じ
数、すなわち、2つの非野生型もしくは非天然のアミノ酸による2つの野生型もしくは天
然のアミノ酸の置き換えを含んでもよく、または置換のために欠失した野生型アミノ酸と
同じでない数、すなわち、1つの非野生型アミノ酸による2つの野生型アミノ酸の置き換
え(置換+欠失突然変異)、もしくは3つの非野生型アミノ酸による2つの野生型アミノ
酸の置き換え(置換+挿入突然変異)を含んでもよい。
置換突然変異体は、参照ポリペプチド配列内部の置き換えられたアミノ酸残基および数
、ならびに新たな置換されたアミノ酸残基を示すための略記命名法を用いて記述すること
ができる。例えば、ポリペプチドの20番目(20th)のアミノ酸残基が置換されている置
換突然変異体は「x20z」と略記することができ、ここで「x」は置き換えられるアミ
ノ酸であり、「20」はポリペプチド内部のアミノ酸残基の位置または数であり、「z」
は新たな置換されたアミノ酸である。したがって、互換的に「E20A」または「Glu
20Ala」と略記される置換突然変異体は、その変異体が、ポリペプチドの20位にグ
ルタミン酸(当技術分野において一般的には「E」または「Glu」と略記される)の代
わりにアラニン残基(当技術分野において一般的には「A」または「Ala」と略記され
る)を含むことを指し示している。
置換突然変異体は、インビトロ部位指定突然変異誘発法(Hutchinson et al., J. Biol
. Chem. 253:6551 (1978);Zoller et al., DNA 3:479 (1984);Oliphant et al., Gene
44:177 (1986);Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710 (1986))、T
AB(登録商標)リンカー(Pharmacia)の使用、制限エンドヌクレアアーゼ消
化/断片欠失および置換、PCR媒介性/オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などを
非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の突然変異誘発技術によって作製しうる
。PCRに基づく手法が、部位指定突然変異誘発のためには好ましい(Higuchi, 1989, "
Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for D
NA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70を参照)。
ポリペプチドに対して適用される「断片」という用語は、そのアミノ酸配列が参照ポリ
ペプチドの配列よりも短く、かつこれらの参照ポリペプチドの全部分にわたって同一のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドのことを指す。そのような断片は、必要に応じて、それら
がその一部である、より大きなポリペプチドの中に含まれてもよい。本発明によるポリペ
プチドのそのような断片は、長さは少なくとも2、3、4、5、6、8、10、13、1
4、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40
、45、50、100、200、240もしくは300またはそれ以上のアミノ酸であっ
てよい。
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」とは、ポリペプチドまたはタンパク質に由
来し、かつそのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの生物学的特性を保って
いる任意の類似体、断片、誘導体または突然変異体のことを指す。ポリペプチドまたはタ
ンパク質の複数の異なる変異体が天然に存在することもある。これらの変異体は、タンパ
ク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いによって特徴付けられるアレル変
種であってもよく、または差異のあるスプライシング、もしくは翻訳後修飾がかかわって
もよい。当業者であれば、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを
有する変異体を作製することができる。これらの変異体には、いくつか例を挙げると、(
a)1つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸で置換されている
変異体、(b)1つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されて
いる変異体、(c)1つまたは複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、および(d)ポリ
ペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなどの別のポリペプチドと融合されている変
異体が含まれうる。これらの変異体を入手するための手法は、遺伝的(抑制、欠失、突然
変異など)、化学的および酵素的な手法を含め、当業者に公知である。1つの態様におい
て、変異体ポリペプチドは少なくとも約14個のアミノ酸を含む。
「相同性」という用語は、2つのポリヌクレオチドモイエティまたは2つのポリペプチ
ドモイエティの間の一致度(percent of identity)のことを指す。1つのモイエティか
らの配列と別のものからの配列との間の対応性は、当技術分野において公知の技術によっ
て決定することができる。例えば、相同性は、配列情報のアラインメントを行って、容易
に入手しうるコンピュータプログラムを用いることによる、2つのポリペプチド分子間の
配列情報の直接比較によって決定することができる。または、相同性を、相同領域の間で
安定な二重鎖を形成する条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、
その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定によっ
て決定することもできる。
本明細書で用いる場合、「相同な」という用語は、そのすべての文法的形態および綴り
変形物において、スーパーファミリー(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー)か
らのタンパク質および異なる種からの相同タンパク質(例えば、ミオシン軽鎖など)を含
む、「共通の進化的起源」を有するタンパク質の間の関係のことを指す(Reeck et al.,
Cell 50:667 (1987))。そのようなタンパク質(およびそれらをコードする遺伝子)は、
それらの高度の配列類似性に反映されるような配列相同性を有する。しかし、一般的用法
および本出願において、「相同な」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾された場
合には、配列類似性を意味し、共通の進化的起源を意味しないこともある。
すなわち、「配列類似性」という用語は、そのすべての文法的形態において、タンパク
質の核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性または対応性の度合いのことを指し、それ
らは共通の進化的起源を有してもよく、または有しなくてもよい(Reeck et al., Cell 5
0:667 (1987)を参照)。1つの態様において、2つのDNA配列は、ヌクレオチドの少な
くとも約50%(例えば、少なくとも約75%、90%、または95%)が、DNA配列
の規定の長さにわたって一致する場合に、「実質的に相同」または「実質的に類似」であ
る。実質的に相同な配列は、配列を、配列データバンクで入手しうる標準的なソフトウェ
アを用いて、または例えば、その特定の系に対して定められたストリンジェントな条件な
どにおけるサザンハイブリダイゼーション実験において比較することによって、同定する
ことができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当業者の技能の範囲
内にある(例えば、Sambrook et al., 1989、前記を参照)。
本明細書で用いる場合、「実質的に類似」とは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の
変化が、結果として、1つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらすが、そのDNA配列に
よってコードされるタンパク質の機能的特性には影響を及ぼさないような核酸断片のこと
を指す。「実質的に類似」はまた、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、アンチ
センス技術または共抑制技術によって遺伝子発現の改変を媒介する核酸断片の能力に影響
を及ぼさないような核酸断片のことも指す。「実質的に類似」はまた、結果として生じる
転写物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の
欠失または挿入といった本発明の核酸断片の修飾のことも指す。したがって、本発明は具
体的な例示的配列を上回るものを範囲に含むことが分かる。提案されている修飾はそれぞ
れ、当業者の定型的な技能の範囲内に十分に含まれ、コードされる産物の生物活性の保持
の判定についても同様である。
さらに、当業者は、本発明の範囲に含まれる実質的に類似した配列が、本明細書におい
て例示した配列とストリンジェントな条件(0.1×SSC、0.1%SDS、65℃、
その上で2×SSC、0.1%SDSで洗浄し、続いて0.1×SSC、0.1%SDS
で洗浄)下でハイブリダイズする能力によっても規定されることを認識しているであろう
。本発明の実質的に類似した核酸断片は、そのDNA配列が本明細書に報告された核酸断
片のDNA配列と少なくとも約70%、80%、90%または95%同一である核酸断片
である。
2つのアミノ酸配列は、約40%を上回るアミノ酸が同一であるか、または60%を上
回るアミノ酸が類似している(機能的に同一である)場合に、「実施的に相同」または「
実質的に類似」である。好ましくは、類似した配列または相同な配列は、例えば、GCG
(Genetics Computer Group, Program Manual
for the GCG Package, Version 7, Madison
, Wisconsin)パイルアッププログラムを用いるアラインメントによって同定
される。
「対応する」という用語は、本明細書において、類似性または相同性を測定する対象に
なる分子と正確な位置が同一であるかまたは異なるかにかかわらず、類似した配列または
相同な配列を指して用いられる。核酸配列またはアミノ酸配列のアラインメントはスペー
スを含んでもよい。したがって、「対応する」という用語は、配列類似性のことを指し、
アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けのことは指していない。
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手作
業による評価によるか、またはBLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altsc
hul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1993));ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能)
などのアルゴリズムを用いるコンピュータでの自動化された配列比較および同定によるか
のいずれかにより、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペ
プチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、ポリペプチド配
列または核酸配列が公知のタンパク質または遺伝子に対して相同であると推定的に同定す
るためには、10個もしくはそれ以上の連続したアミノ酸または30個もしくはそれ以上
のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、20〜30
個の連続したヌクレオチドを含む遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、配列依
存的な遺伝子同定(例えば、サザンハイブリダイゼーション)および単離(例えば、細菌
コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション)
の方法に用いることもできる。加えて、12〜15塩基の短いオリゴヌクレオチドをPC
Rにおける増幅プライマーとして、そのプライマーを含む特定の核酸断片を入手する目的
で用いることもできる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列
を含む核酸断片を特異的に同定および/または単離するのに十分な配列を含む。
「一致度」という用語は、当技術分野において公知であるように、配列を比較すること
によって決定される、2つもしくはそれ以上のポリペプチド配列間または2つもしくはそ
れ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことを指す。当技術分野において、「同一性」
はまた、ポリペプチドまたポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いのことも指し、
これは場合によってはそのような配列鎖の間の合致によって決定される。「同一性」およ
び「類似性」は、Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford Univers
ity Press, New York (1988);Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith
, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993);Computer Analysis of Sequence Data
, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994
);Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (
1987);およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stoc
kton Press, New York (1991)に記載されたものを非限定的に含む、公知の方法によって
容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、被験配列の間で
最良の合致が得られるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、公
開コンピュータプログラムで体系的に整備されている。配列アラインメントおよび一致度
の計算は、LASERGENE bioinformatics computing
suiteのMegalignプログラム(DNASTAR Inc., Madiso
n, WI)などの配列分析ソフトウェアを用いて行うこともできる。配列の多重アライ
ンメントは、Clustalアラインメント法(Higgins et al., CABIOS. 5:151 (1989)
)をデフォルトパラメーター(GAP PENALTY=10、GAPLENGTHPE
NALTY=10)で用いて行うことができる。Clustal法を用いる対アラインメ
ントのデフォルトパラメーターを選択してもよい:KTUPLE1、GAP PENAL
TY=3、WINDOW=5およびDIAGONALS SAVED=5。
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のた
めに有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムのことを指す
。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでもよく、または独自に開発したものでもよ
い。典型的な配列分析ソフトウェアには、GCGプログラムスイート(Wisconsi
n Package Version 9.0, Genetics Computer
Group (GCG), Madison, WI)、BLASTP、BLASTN
、BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990))、およびDNAS
TAR(DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madis
on, WI 53715 USA)が非限定的に含まれる。本出願の文脈において、配
列分析ソフトウェアを分析に用いる場合には、別に指定しない限り、分析の結果は参照し
たプログラムの「デフォルト値」に基づくことが明らかであろう。本明細書で用いる場合
、「デフォルト値」とは、最初に初期化した時にソフトウェアに最初にロードされた値ま
たはパラメーターの任意のセットを意味するものとする。
DNAの配列に関して「化学的に合成された」とは、構成要素のヌクレオチドがインビ
トロで組み立てられたことを指す。DNAの手作業での化学合成を十分に確立された手順
を用いて行ってもよく、またはいくつかの市販の装置の1つを用いて自動化学合成を行う
こともできる。このようにして、遺伝子を、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレ
オチド配列の最適化に基づき、最適な遺伝子発現となるように調整することができる。当
業者は、コドン使用が宿主によって優先されるコドン側に偏る場合に遺伝子発現が成功す
る確率を評価可能である。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である場合には
、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
本明細書で用いる場合、2つまたはそれ以上の個別に動作可能な遺伝子調節システムは
、a)選択された濃度でのその各々のリガンドによる所与のシステムのそれぞれのモジュ
レーションが、結果として、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定可能な変化をも
たらし、かつb)その変化が、実際のモジュレーションが同時であるかまたは逐次的であ
るかに関係なく、細胞、組織または生物において同時に動作可能な他のすべてのシステム
の発現の変化と統計学的に有意に異なる場合、「オルソゴナル」であるという。好ましく
は、それぞれの個別に動作可能な遺伝子調節システムのモジュレーションは、細胞、組織
または生物における他のすべての動作可能なシステムよりも少なくとも2倍大きい、例え
ば、少なくとも5倍、10倍、100倍、または500倍大きい遺伝子発現の変化を生じ
させる。理想的には、選択された濃度でのその各々のリガンドによる所与のシステムのそ
れぞれのモジュレーションは、結果として、そのシステムの遺伝子の発現の大きさの測定
可能な変化をもたらし、その細胞、組織または生物において動作可能な他のすべてのシス
テムの発現の測定可能な変化はもたらさない。そのような場合、これらの多重誘導性遺伝
子調節システムは「完全にオルソゴナル」であるという。有用なオルソゴナルリガンドお
よびオルソゴナルな受容体に基づく遺伝子発現システムは、US2002/011086
1A1号に記載されている。
「外因性遺伝子」という用語は、その対象にとって外来性である遺伝子、すなわち、形
質転換過程を通じて対象に導入される遺伝子、内因性突然変異遺伝子の非突然変異型のも
の、または内因性非突然変異遺伝子の突然変異型のものを意味する。形質転換の方法は本
発明にとって特に重要ではなく、当業者に公知の、対象に適した任意の方法であってよい
。外因性遺伝子は、DNA、または逆転写酵素などによってDNA中間体を経由して機能
しうるRNAの形態で対象に導入される、天然遺伝子または合成遺伝子のいずれでもあり
うる。そのような遺伝子は、標的細胞に導入すること、対象に直接導入すること、または
対象への形質転換細胞の移入によって間接的に導入することができる。
「治療用産物」という用語は、そのような産物が発現される宿主細胞に対して有益な機
能を付与する治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドのことを指す。治療用ポ
リペプチドには、長さ3アミノ酸ほどの短いペプチド、単鎖または複数鎖タンパク質、お
よび融合タンパク質が非限定的に含まれうる。治療用ポリヌクレオチドには、アンチセン
スオリゴヌクレオチド、短鎖干渉性RNA、リボザイムおよびRNA外部ガイド配列が非
限定的に含まれうる。治療用産物には、天然配列、合成配列、または天然および合成配列
の組合せが含まれうる。
「リガンド依存性転写因子複合体」または「LDTFC」という用語は、1つまたは複
数のタンパク質サブユニットを含む転写因子のことを指し、この複合体は、本明細書で定
義するような「因子調節型プロモーター」によって駆動される遺伝子発現を調節すること
ができる。モデルとなるLDTFCは「エクジソン受容体複合体」であり、これは一般に
、エクジソン受容体(「EcR」)およびウルトラスピラクル(「USP」)タンパク質
という核内受容体ファミリーの少なくとも2つのメンバーを有するヘテロ二量体性タンパ
ク質複合体のことを指す(Yao et al., Nature 366:476 (1993);Yao et al., Cell 71:6
3 (1992)を参照)。EcR複合体などの機能性LDTFCがイムノフィリンなどの別のタ
ンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる核内受容体ファミリーのタンパク質の
別のメンバー(DHR38、βFTZ−1または他の昆虫ホモログなど)が、EcRおよ
び/またはUSPのリガンド依存性または非依存性パートナーであってもよい。EcR複
合体などのLDTFCが、EcRタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動
物ホモログ、レチノイン酸X受容体(「RXR」)タンパク質、またはUSPおよびRX
Rのキメラ体とのヘテロ二量体であってもよい。「LDTFC」および「EcR複合体」
という用語は、EcRタンパク質またはUSPのホモ二量体複合体、さらには同じ機能を
果たす単一のポリペプチドまたは三量体、四量体および他の多量体も範囲に含む。
EcR複合体などのLDTFCは、EcRを含むが複合体の他のタンパク質も除外され
ない複合体のタンパク質の1つと結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガ
ンドによって活性化されうる。EcR複合体などのLDTFCは、すべてのメンバーがア
ミノ末端トランス活性化ドメイン(本明細書において互換的に用いられる「AD」、「T
D」または「TA」)、DNA結合ドメイン(「DBD」)およびリガンド結合ドメイン
(「LBD」)を含む1つまたは複数のポリペプチドサブユニットの存在によって特徴付
けられる、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。ADは「
ヘテロ二量体化パートナー」または「HP」との融合体として存在してもよい。本発明の
ADおよびHPを含む融合タンパク質を、本明細書では「共活性化タンパク質」または「
CAP」と称する。DBDおよびLBDを融合タンパク質として発現させることもでき、
本明細書ではこれを「リガンド誘導性転写因子」(「LTF」)と称する。これらの融合
パートナーは、リンカー、例えばヒンジ領域によって隔てられていてよい。LTFファミ
リーの一部のメンバーが、LBDのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有
してもよい。DBDは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミ
ノ酸モチーフ、P−ボックスおよびD−ボックスが間にある2つのシステインジンクフィ
ンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、ま
たは異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。
外因性遺伝子、応答エレメント、および例えばEcR複合体などのLDTFCを構成す
るDNA配列は、古細菌、原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)もし
くは他の腸内細菌など、または真核細胞、例えば植物細胞もしくは動物細胞などに組み入
れることができる。しかし、遺伝子によって発現されるタンパク質の多くは細菌内では不
正確に処理されるため、真核細胞が好ましい。細胞は単細胞または多細胞生物の形態であ
ってよい。また、外因性遺伝子、応答エレメントおよび受容体複合体のヌクレオチド配列
を、RNA分子として、好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能性ウイルスRNA
の形態で組み入れることもできる。真核細胞の中でも脊椎動物細胞が好ましいが、これは
それらがEcRに対する本発明のリガンドへの応答を付与する分子を天然では持たないた
めである。その結果として、それらは本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」で
ある。したがって、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞または生物体全体に
対して、無視しうる程度の生理学的または他の影響しか及ぼさないと考えられる。このた
め、細胞はリガンド自体の存在によって実質的な影響を受けずに、成長して所望の産物を
発現することができる。
「エクジソン受容体複合体」という用語は一般に、エクジソン受容体(「EcR」)お
よびウルトラスピラクル(「USP」)タンパク質という核内受容体ファミリーの少なく
とも2つのメンバーを有するヘテロ二量体性タンパク質複合体のことを指す(Yao et al.
, Nature 366:476 (1993);Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照)。機能性EcR複合
体がイムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる核内
受容体ファミリーのタンパク質の別のメンバー(DHR38、βFTZ−1または他の昆
虫ホモログなど)が、EcRおよび/またはUSPのリガンド依存性または非依存性パー
トナーであってもよい。EcR複合体が、EcRタンパク質と、ウルトラスピラクルタン
パク質の脊椎動物ホモログ、レチノイン酸X受容体(「RXR」)タンパク質、またはU
SPおよびRXRのキメラ体とのヘテロ二量体であってもよい。EcR複合体という用語
は、EcRタンパク質またはUSPのホモ二量体複合体も範囲に含む。
EcR複合体は、EcRを含むが複合体の他のタンパク質も除外されない複合体のタン
パク質の1つと結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性
化されうる。本明細書で用いる場合、「リガンド」という用語は、EcRに基づく遺伝子
スイッチに適用される場合、遺伝子スイッチを活性化してその中にコードされるポリペプ
チドの発現を刺激する能力を有する可溶性の低分子を記述する。リガンドの例には、エク
ジソン、20−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンA、ムリステロンAなどのエクジス
テロイド、9−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、米国特許第6,013
,836号;第5,117,057号;第5,530,028号;および第5,378,
726号ならびに米国特許出願公開第2005/0209283号および第2006/0
020146号に開示されているものなどのN,N’−ジアシルヒドラジン;米国特許出
願公開第2004/0171651号に記載されているオキサジアゾリン;欧州特許出願
第461,809号に開示されているものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン
;米国特許第5,225,443号に開示されているものなどのN−アルキル−N,N’
−ジアロイルヒドラジン;欧州特許出願第234,994号に開示されているものなどの
N−アシル−N−アルキルカルボニルヒドラジン;米国特許第4,985,461号に記
載されているものなどのN−アロイル−N−アルキル−N’−アロイルヒドラジン;米国
特許出願公開第2004/0049037号に記載されているものなどのアミドケトン;
および3,5−ジ−tert−ブチル−4−ヒドロキシ−N−イソブチル−ベンズアミド
、8−O−アセチルハルパギド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロー
ル、24(S)ヒドロキシコレステロール、25−エポキシコレステロール、T0901
317、5−アルファ−6−アルファ−エポキシコレステロール−3−スルフェート(E
CHS)、7−ケトコレステロール−3−スルフェート、ファメソール、胆汁酸、1,1
−ビホスホン酸エステル、幼若ホルモンIIIなどを含む他の類似の材料が非限定的に含
まれる。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例には、RG−11581
9(3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−エチル−2,2−ジメチル−プロピル)−N
’−(2−メチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド)、RG−115932(
(R)−3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(
2−エチル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド)、およびRG−115830(
3,5−ジメチル−安息香酸N−(1−tert−ブチル−ブチル)−N’−(2−エチ
ル−3−メトキシ−ベンゾイル)−ヒドラジド)が含まれる。本発明の実施において有用
なそのほかのジアシルヒドラジンについては、2008年5月29日に提出された米国特
許出願第12/155,111号、および2008年5月29日に提出されたPCT/U
S2008/006757号を参照されたい。
EcR複合体は、ヒンジ領域によって隔てられた、すべてのメンバーがアミノ末端トラ
ンス活性化ドメイン(「TA」)、DNA結合ドメイン(「DBD」)およびリガンド結
合ドメイン(「LBD」)の存在によって特徴付けられる核内受容体スーパーファミリー
のメンバーであるタンパク質を含む。ファミリーの一部のメンバーが、LBDのカルボキ
シ末端側に別のトランス活性化ドメインを有してもよい。DBDは、エクジソン応答エレ
メントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P−ボックスおよびD−ボッ
クスが間にある2つのシステインジンクフィンガーの存在によって特徴付けられる。これ
らのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパク質の異なるドメイン
のキメラ体のいずれであってもよい。
外因性遺伝子、応答エレメント、およびEcR複合体を構成するDNA配列は、古細菌
、原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)もしくは他の腸内細菌など、
または真核細胞、例えば植物細胞もしくは動物細胞などに組み入れることができる。しか
し、遺伝子によって発現されるタンパク質の多くは細菌内では不正確に処理されるため、
真核細胞が好ましい。細胞は単細胞または多細胞生物の形態であってよい。また、外因性
遺伝子、応答エレメントおよび受容体複合体のヌクレオチド配列を、RNA分子として、
好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能性ウイルスRNAの形態で組み入れること
もできる。真核細胞の中でも脊椎動物細胞が好ましいが、これはそれらがEcRに対する
本発明のリガンドへの応答を付与する分子を天然では持たないためである。その結果とし
て、それらは本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。したがって、本発
明において有用なリガンドは、形質転換細胞または生物体全体に対して、無視しうる程度
の生理学的または他の影響しか及ぼさないと考えられる。このため、細胞はリガンド自体
の存在によって実質的な影響を受けずに、成長して所望の産物を発現することができる。
EcRリガンドは、外因性遺伝子(例えば、IL−12)と連結した応答エレメントと
引き続いて結合するEcR複合体とともに用いると、外因性遺伝子の発現を外部から時間
的に調節する手段を提供する。様々な構成要素が互いに結合する順序、すなわちリガンド
が受容体複合体に、受容体複合体が応答エレメントに、といったことは特に重要ではない
。典型的には、外因性遺伝子の発現のモジュレーションは、EcR複合体の特異的な制御
DNAエレメントまたは調節性DNAエレメントとの結合に応答したものである。EcR
タンパク質は、核内受容体ファミリーの他のメンバーと同様に、少なくとも3つのドメイ
ン、すなわちトランス活性化ドメイン、DNA結合ドメインおよびリガンド結合ドメイン
を有する。この受容体は、核内受容体ファミリーのあるサブセットと同様に、ヘテロ二量
体化特性を担う詳細には解明されていない領域も有する。EcRタンパク質のリガンド結
合ドメインに対するリガンドの結合は、USPまたはRXRタンパク質とヘテロ二量体化
した後、ヘテロ二量体タンパク質のDNA結合ドメインが応答エレメントに活性型で結合
するのを可能にし、そのようにして外因性遺伝子の発現または抑制をもたらす。この機序
は、リガンドがEcRまたはUSPのいずれかと結合し、その結果として活性ホモ二量体
複合体(例えば、EcR+EcRまたはUSP+USP)が形成されるという可能性を否
定するものではない。1つの態様において、受容体ドメインの1つまたは複数を変更して
、キメラ遺伝子スイッチを作製することもできる。典型的には、キメラ受容体が、選択し
た宿主細胞または生物においてトランス活性化特性、リガンドの相補的結合および特異的
な応答エレメントの認識に関して最適化されるように、3つのドメインの1つまたは複数
を他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。加えて、応答エレメント自
体を、酵母由来のGAL−4タンパク質(Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参
照)または大腸菌由来のLexAタンパク質(Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照
)などの他のDNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレメントで修飾または置換し
て、キメラEcR複合体に順応させることもできる。キメラシステムの別の利点は、それ
が、所望の最終結果に応じて、外因性遺伝子を駆動するために用いるプロモーターの選択
を可能にすることである。そのような二重制御は、遺伝子療法の領域において、特に細胞
傷害性タンパク質が産生される場合には、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の
両方を制御しうるため、特に重要である可能性がある。適切なプロモーターに機能的に連
結された外因性遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外因性遺伝子の発現は本発明のリガ
ンドの存在によって制御される。プロモーターは構成的もしくは誘導的に調節されてもよ
く、または組織特異的(すなわち、特定の型の細胞のみにおいて発現される)もしくは生
物のある特定の発生段階に対して特異的であってもよい。
ある態様において、方法の項に記載された治療用スイッチプロモーターは構成的である
。ある態様において、治療用スイッチプロモーターは疾患、障害または病状と関連のある
条件下において活性化され、例えば、プロモーターは、疾患に応答して、特定の生理的、
発生的、分化的もしくは病的条件に応答して、および/または1つもしくは複数の特異的
な生体分子に応答して活性化される;かつ/または、プロモーターは、特定の組織型また
は細胞種において活性化される。ある態様において、疾患、障害または病状は、治療用ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドに対する反応性がある。例えば、ある非限定的な態様
において、治療用ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、疾患、障害または病状を治療
する、予防する、改善する、症状を軽減する、進行を予防する、または治癒させるために
有用であるが、これらの事項のいずれか1つまたはすべてを達成する必要はない。ある態
様においては、第1および第2のポリヌクレオチドを、疾患、障害または病状と関連のあ
る条件下におけるリガンド依存性転写因子複合体の発現が可能になるように導入する。1
つの態様において、治療方法は、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドが発
現し、前記疾患、障害または病状を治療する、改善する、または予防するのに十分なレベ
ルで対象の全体にわたって散布されるように行われる。本明細書で用いる場合、「散布さ
れる」とは、対象における効果または活性を十分に有するように、ポリペプチドが改変細
胞から発現されて放出されることを意味する。散布は全身性、局所性またはその中間の任
意のものでよい。例えば、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドが、血流ま
たはリンパ系を経由して全身性に散布されてもよいであろう。または、治療用ポリペプチ
ドまたは治療用ポリヌクレオチドを、治療しようとする組織もしくは臓器中に局所的に散
布させてもよいであろう。
転写因子およびレポータータンパク質などの種々のポリペプチドをコードする数多くの
ゲノム核酸配列およびcDNA核酸配列が、当技術分野において周知である。当業者は、
事実上すべての公知の遺伝子に関する核酸配列情報にアクセスして、その核酸分子を公的
な寄託機関、その配列を公開した施設から直接入手すること、または定型的な方法を用い
てその分子を調製することのいずれかを行うことができる。例えば、下記の配列アクセッ
ション番号inflaの記載を参照されたい。
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任
意の遺伝子スイッチシステムであってよい。1つの態様において、遺伝子スイッチは、遺
伝子発現のレベルが、その中に存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明
の遺伝子スイッチ中に用いうるリガンド依存性転写因子の例には、その各々のリガンド(
例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、
ならびにその類似体および模倣物)によって活性化される核内受容体スーパーファミリー
のメンバー、およびテトラサイクリンによって活性化されるrTTAが非限定的に含まれ
る。本発明の1つの局面において、遺伝子スイッチはEcRに基づく遺伝子スイッチであ
る。そのようなシステムの例には、米国特許第6,258,603号、第7,045,3
15号、米国特許出願公開第2006/0014711号、第2007/0161086
号、およびWO01/70816号に記載されたシステムが非限定的に含まれる。キメラ
エクジソン受容体システムの例は、米国特許第7,091,038号、米国特許出願公開
第2002/0110861号、第2004/0033600号、第2004/0096
942号、第2005/0266457号、および第2006/0100416号、なら
びにWO01/70816号、第02/066612号、第02/066613号、第0
2/066614号、第02/066615号、第02/29075号、および第200
5/108617号に記載されている。非ステロイド性エクジソンアゴニスト調節システ
ムの一例は、RheoSwitch(登録商標)Mammalian Inducibl
e Expression System(New England Biolabs,
Ipswich, MA)である。
1つの態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター
の制御下にある、リガンド依存性転写因子をコードする単一の転写因子配列を含む。転写
因子配列は、天然に存在するかまたは人工的なリガンド依存性転写因子複合体をコードし
てよい。人工的転写因子とは、例えば、配列の突然変異によって、または複数の異なる転
写因子からのドメインを組み合わせることによって転写因子の天然配列が改変されたもの
のことである。1つの態様において、転写因子はグループH核内受容体リガンド結合ドメ
イン(LBD)を含む。1つの態様において、グループH核内受容体LBDは、EcR、
ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER−1、ステロイドホルモン核内受容体1
、レチノイドX受容体相互作用タンパク質−15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン
受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体
相互作用タンパク質14またはファルネソール受容体からのものである。別の態様におい
て、グループH核内受容体LBDはエクジソン受容体からのものである。
EcRおよび他のグループH核内受容体は核内受容体スーパーファミリーのメンバーで
あり、これはそのすべてのメンバーが、アミノ末端トランス活性化ドメイン(TD)、D
NA結合ドメイン(DBD)、およびヒンジ領域によってDBDから隔てられたLBDの
存在によって一般に特徴付けられる。本明細書で用いる場合、「DNA結合ドメイン」と
いう用語は、DNA結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り
、最長でDNA結合タンパク質の全長までの、DNA結合タンパク質の最小のポリペプチ
ド配列を含む。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、以下の4つまたは5つのド
メインの存在によっても特徴付けられる:A/B、C、D、E、およびいくつかのメンバ
ーではF(米国特許第4,981,784号およびEvans, Science 240:889 (1988)を参
照)。「A/B」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「C」はDNA結合ドメ
インに対応し、「D」はヒンジ領域に対応し、「E」はリガンド結合ドメインに対応する
。このファミリーのいくつかのメンバーは、「F」に対応するLBDのカルボキシ末端側
に別のトランス活性化ドメインを有することもある。
DBDは、応答エレメントに対する特異性を付与する2つのアミノ酸モチーフ、P−ボ
ックスおよびD−ボックスが間にある2つのシステインジンクフィンガーの存在によって
特徴付けられる。これらのドメインは、ネイティブ性、修飾性、または異種受容体タンパ
ク質の異なるドメインのキメラ体のいずれであってもよい。EcRは、核内受容体ファミ
リーのサブセットと同様に、ヘテロ二量体化特性を担う詳細には解明されていない領域も
有する。核内受容体のドメインはモジュール的な性質があるため、LBD、DBDおよび
TDを入れ替えてもよい。
別の態様において、転写因子は、TD、発現をモジュレートしようとする外来性遺伝子
と連係している応答エレメントを認識するDBD;およびグループH核内受容体LBDを
含む。ある態様において、グループH核内受容体LBDは置換突然変異を含む。
別の態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第1のプロモー
ターの制御下にある第1の転写因子配列、および第2のプロモーターの制御下にある第2
の転写因子配列を含み、該第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と該第2
の転写因子配列によってコードされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写
因子として機能するタンパク質複合体、すなわち「二重スイッチ」または「ツーハイブリ
ッド」に基づく遺伝子スイッチを形成する。第1および第2のプロモーターは同じでも異
なってもよい。
ある態様において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、1つのプロモー
ターの制御下にある第1の転写因子配列および第2の転写因子配列を含み、該第1の転写
因子配列によってコードされるタンパク質と該第2の転写因子配列によってコードされる
タンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体
、すなわち「単一遺伝子スイッチ」を形成する。第1の転写因子配列および第2の転写因
子配列は、配列内リボソーム進入部位(IRES)によって連結されていてもよい。IR
ESはEMCVIRESであってもよい。
1つの態様において、第1の転写因子配列は、TD、その発現をモジュレートしようと
する外来性遺伝子と連係している応答エレメントを認識するDBD;およびグループH核
内受容体LBDを含むポリペプチドをコードし、第2の転写因子配列は、脊椎動物RXR
LBD、無脊椎動物RXR LBD、ウルトラスピラクルタンパク質LBD、および2
つのポリペプチド断片を含むキメラLBDから選択される核内受容体LBDを含む転写因
子をコードし、ここで第1のポリペプチド断片は脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物R
XR LBDまたはウルトラスピラクルタンパク質LBDからのものであり、第2のポリ
ペプチド断片は異なる脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBDまたはウルト
ラスピラクルタンパク質LBDからのものである。
別の態様において、遺伝子スイッチは、核内受容体LBDおよびその発現をモジュレー
トしようとする外因性遺伝子と連係している応答エレメントを認識するDBDを含む第1
のポリペプチドをコードする第1の転写因子配列、ならびにTDおよび核内受容体LBD
を含む第2のポリペプチドをコードする第2の転写因子配列を含み、ここで核内受容体L
BDの1つはグループH核内受容体LBDである。1つの態様において、第1のポリペプ
チドはTDを実質的に含まず、第2のポリペプチドはDBDを実質的に含まない。本発明
において、「実質的に含まない」とは、当該タンパク質が活性化または結合活性を提供す
るのに十分な当該ドメインの配列を含まないことを意味する。
本発明の別の局面において、第1の転写因子配列はヘテロ二量体パートナーおよびTD
を含むタンパク質をコードし、第2の転写因子配列はDBDおよびLBDを含むタンパク
質をコードする。
一方の核内受容体LBDだけがグループH LBDである場合、もう一方の核内受容体
LBDは、グループH LBDと二量体を形成する任意の他の核内受容体からのものであ
ってよい。例えば、グループH核内受容体LBDがEcR LBDである場合、もう一方
の核内受容体LBD「パートナー」は、EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、ウ
ルトラスピラクルタンパク質(USP)、または脊椎動物RXR、無脊椎動物RXRおよ
びUSPから選択される少なくとも2つの異なる核内受容体LBDポリペプチド断片を含
むキメラ核内受容体からのものであってよい(WO01/70816A2号、国際特許出
願第PCT/US02/05235号および米国特許第2004/0096942A1号
を参照)。「パートナー」核内受容体リガンド結合ドメインは、短縮突然変異、欠失突然
変異、置換突然変異、または別の修飾をさらに含んでもよい。
1つの態様において、脊椎動物RXR LBDは、ヒト(ヒト、Homo sapiens)、マウ
ス(ハツカネズミ、Mus musculus)、ラット(ドブネズミ、Rattus norvegicus)、ニワ
トリ(チャボ、Gallus gallus)、ブタ(ブタ、Sus scrofa domestica)、カエル(アフ
リカツメガエル、Xenopus laevis)、ゼブラフィッシュ(ゼブラダニオ、Danio rerio)
、ホヤ(ミサキマメイタボヤ、Polyandrocarpa misakiensis)、またはクラゲ(ミツデリ
ッポウクラゲ、Tripedalia cysophora)RXRからのものである。
1つの態様において、無脊椎動物RXRリガンド結合ドメインは、トノサマバッタ(ト
ノサマバッタLocusta migratoria)ウルトラスピラクルポリペプチド(「LmUSP」)
、マダニ(アムブリオンマ−アメリカヌムAmblyomma americanum)RXRホモログ1(「
AmaRXR1」)、マダニ(アムブリオンマ−アメリカヌム)RXRホモログ2(「A
maRXR2」)、シオマネキ(セルカ−プギレーターCeluca pugilator)RXRホモロ
グ(「CpRXR」)、甲虫(チャイロコメノゴミムシダマシTenebrio molitor)RXR
ホモログ(「TmRXR」)、ミツバチ(ヨーロッパミツバチApis mellifera)RXRホ
モログ(「AmRXR」)、アブラムシ(モモアカアブラムシMyzus persicae)RXRホ
モログ(「MpRXR」)、または非双翅目(non-Dipteran)/非鱗翅目(non-Lepidopt
eran)RXRホモログからのものである。
1つの態様において、キメラRXR LBDは、脊椎動物種RXRポリペプチド断片、
無脊椎動物種RXRポリペプチド断片、および非双翅目/非鱗翅目無脊椎動物種RXRホ
モログポリペプチド断片から選択される、少なくとも2つのポリペプチド断片を含む。本
発明に用いるためのキメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも2つの異なる種の
RXRポリペプチド断片を含んでよく、または種が同一である場合、2つまたはそれ以上
の複数のポリペプチド断片はその種のRXRポリペプチド断片の2つまたはそれ以上の異
なるアイソフォームからのものであってよい。
1つの態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動
物種RXRポリペプチド断片および1つの無脊椎動物種RXRポリペプチド断片を含む。
別の態様において、キメラRXRリガンド結合ドメインは、少なくとも1つの脊椎動物
種RXRポリペプチド断片および1つの非双翅目/非鱗翅目無脊椎動物種RXRホモログ
ポリペプチド断片を含む。
リガンドは、核内受容体のLBDと組み合わされると、続いて外来遺伝子と連結してい
る応答エレメントと結合し、外来遺伝子発現の外部からの時間的調節をもたらす。結合の
機序、または本発明の様々な構成要素が互いに結合する順序、すなわち、例えばリガンド
がLBDに、DBDが応答エレメントに、TDがプロモーターに、といったことは特に重
要ではない。
1つの具体的な例において、グループH核内受容体のLBDおよびその核内受容体LB
Dパートナーに対するリガンドの結合は、外来性遺伝子の発現を可能にする。この機序は
、グループH核内受容体(GHNR)またはそのパートナーに対するリガンド結合、およ
びその結果生じる活性ホモ二量体複合体(例えば、GHNR+GHNRまたはパートナー
+パートナー)の形成の可能性を否定するものではない。好ましくは、受容体ドメインの
1つまたは複数を変更して、ハイブリッド遺伝子スイッチを作製する。典型的には、ハイ
ブリッド遺伝子およびその結果生じるハイブリッドタンパク質が、選択した宿主細胞また
は生物において、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合および特定の応答エレメン
トの認識に関して最適化されるように、DBD、LBDおよびTDという3つのドメイン
のうち1つまたは複数を、他のドメインの源とは異なる源から選択することができる。加
えて、応答エレメント自体を、酵母由来のGAL−4タンパク質(Sadowski et al., Nat
ure 335:563 (1988)を参照)もしくは大腸菌由来のLexAタンパク質(Brent et al.,
Cell 43:729 (1985)を参照)などの他のDNA結合タンパク質ドメインに対する応答エレ
メント、またはそのような特異的相互作用のために設計、修飾および選択されたタンパク
質との標的指向性相互作用に対して特異的な合成応答エレメント(例えば、Kim et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照)で修飾または置換して、ハイブリ
ッド受容体に適応させることもできる。
機能性EcR複合体がイムノフィリンなどの別のタンパク質を含んでもよい。転写因子
として知られる核内受容体ファミリーのタンパク質の別のメンバー(DHR38またはβ
FTZ−1など)が、EcR、USP、および/またはRXRのリガンド依存性または非
依存性パートナーであってもよい。さらに、一般にコアクチベーター(アダプターまたは
メディエーターとも呼ばれる)として知られるタンパク質などの他の補因子も必要とされ
ることもある。これらのタンパク質はDNAと配列特異的には結合せず、基本的な転写に
も関与しない。それらは、クロマチン構造に影響を及ぼすことにより、またはアクチベー
ター−開始複合体相互作用を媒介することにより、アクチベーターのDNA結合の刺激を
含む、様々な機序を通じて転写活性化に対する効果を発揮しうる。そのようなコアクチベ
ーターの例には、RIP140、TIF1、RAP46/Bag−1、ARA70、SR
C−1/NCoA−1、TIF2/GRIP/NCoA−2、ACTR/AIB1/RA
C3/pCIP、さらには乱交雑性コアクチベーターC応答エレメントB結合タンパク質
CBP/p300が含まれる(総説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol.
9:222 (1997)を参照)。また、コリプレッサー(リプレッサー、サイレンサーまたはサ
イレンシングメディエーターとしても知られる)として一般に知られているタンパク質補
因子が、リガンドの非存在下における転写活性化を効果的に阻害するために必要とされる
こともある。これらのコリプレッサーは、リガンドが結合していないEcRと相互作用し
て、応答エレメントでの活性をサイレンシングさせることができる。現時点での証拠は、
リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、その結果、コリプレッサーの
放出および上記のコアクチベーターの動員が起こり、それにより、それらのサイレンシン
グ活性が消失することを示唆している。コリプレッサーの例には、N−CoRおよびSM
RTが含まれる(総説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)を
参照)。これらの補因子は細胞もしくは生物内にある内因性のものであってもよく、また
は調節性もしくは非調節性のいずれかの様式で発現される導入遺伝子として外因的に添加
してもよい。
外因性遺伝子は、遺伝子スイッチによってコードされるリガンド依存性転写因子のDB
Dによって認識される少なくとも1つの応答エレメントを含むプロモーターに機能的に連
結されている。1つの態様において、プロモーターは、応答エレメントの1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のコピーを含む。所望の応答エレメントを
含むプロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または当技術分野に
おいて周知の手法、例えば、最小プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数の応
答エレメントを用いて作り出された人工プロモーターであってもよい。
免疫モジュレーター、例えば、IL−12、TNF−α、シグナルペプチドまたは本明
細書における任意の転写因子をコードする遺伝子は、コドン最適化することができる。一
実施形態において、免疫モジュレーター、例えば、IL−12、TNF−α、シグナルペ
プチドまたは転写因子のコード領域は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されてい
る。当業者であれば理解できるように、遺伝暗号の重複性のため、様々な核酸コード領域
が同一ポリペプチドをコードしている。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコ
ドンを含むヌクレオチド配列における偏向は、遺伝子をコードする配列における変動を可
能にする。各コドンは3個のヌクレオチドからなり、DNAを含むヌクレオチドは4種の
特定の塩基に限定されているため、64通りの可能なヌクレオチドの組合せが存在するが
、そのうちの61通りがアミノ酸をコードする(残りの3通りのコドンは、翻訳終結シグ
ナルをコードする)。本明細書において、いずれのコドンがいずれのアミノ酸をコードす
るかを示す「遺伝暗号」の写しを表4に記す。その結果、多くのアミノ酸が、2種以上の
コドンで表されている。例えば、アミノ酸のアラニンおよびプロリンは、4種のトリプレ
ットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは、6種にコードされており、一方、
トリプトファンおよびメチオニンは、ただ1種のトリプレットによってコードされている
。このような縮重によって、DNA塩基組成は、該DNAによってコードされたポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなく広範に変動し得る。
本発明に係るポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、用いられているコ
ドンにかかわらず、本発明の範囲内に含まれることを理解されたし。
多くの生物が、伸長しているポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードす
る特定のコドン使用に対する偏向を提示する。コドンの優先性またはコドンバイアス、生
物間のコドン使用の差は、遺伝暗号の縮重によってもたらされ、多くの生物において十分
に考証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーRNA(mRNA)
の翻訳効率と相関し、また、この効率は、とりわけ、翻訳されているコドンの性質および
特定の転移RNA(tRNA)分子の有効性に依存すると考えられている。細胞における
選択されたtRNAの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に用いられている
コドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき、所定の生物におけ
る最適な遺伝子発現のために目的に合わせて作製することができる。
ポリヌクレオチドは、所定の種の遺伝子における使用に好ましいコドンをDNA配列に
組み入れることによって調製される。
多種多様な動物、植物および微生物種に利用できる数多くの遺伝子配列を考慮すると、
コドン使用の相対的な頻度を計算することができる。コドン使用表は、例えば、http://w
ww.kazusa.or.jp/codon/(2006年5月30日アクセス)にて閲覧できる「コドン使用
データベース」から容易に入手でき、これらの表は、多くの様式において適応することが
できる。Nakamura, Y., et al., "Codon usage tabulated from the international DNA
sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を
参照されたし。GenBank Release 151.0から計算されたヒトのコド
ン使用表の写しを下の表5に記す(http://www.kazusa.or.jp/codon/より、上記参照)。
これらの表はmRNA命名法を用いているため、これらの表は、DNAに存在するチミン
(T)の代わりに、RNAに存在するウラシル(U)を使用している。表は、全64コド
ンではなく各アミノ酸の頻度を計算できるように適応させた。
上の表または類似の表を利用することによって、当業者は、頻度を任意の所定のポリペ
プチド配列に適用し、ポリペプチドをコードするが所定の種に最適なコドンを用いるコド
ン最適化されたコード領域の核酸断片を作製することができる。
当業者にとって公知の標準かつルーチンの分子生物学的操作を用いた、上述の方法のい
ずれかによって設計されたコドン最適化されたコード領域の合成に、多くのオプションを
利用できる。
一実施形態において、本発明のベクターにおける免疫モジュレーター、例えば、TNF
−αをコードするコード領域は、コドン最適化されている。別の一実施形態において、コ
ード領域は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。特定の一実施形態にお
いて、本発明におけるTNF−αは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる
インビボまたはex vivoでポリヌクレオチドを細胞に導入するために、ベクター
を用いることができる。ベクターは、例えば、プラスミドベクターまたは一本鎖もしくは
二本鎖RNAもしくはDNAウイルスベクターとなることができる。このようなベクター
は、DNAおよびRNAを細胞に導入するための公知の技法によって、それを必要とする
対象、例えば、哺乳動物の細胞に導入することができる。ウイルスベクターは複製能を有
してもよく、または複製能を欠損していてもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、
補完性のある宿主細胞のみで起こると考えられる。本明細書で用いる場合、「宿主細胞」
または「宿主」という用語は、1つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを有している
本発明の細胞を意味して用いられる。
したがって、最低限でも、ベクターは本発明のポリヌクレオチドを含まなければならな
い。ベクターの他の構成要素には、選択マーカー、クロマチン修飾ドメイン、ベクター上
に同じく存在しうる他のポリペプチド(例えば、致死性ポリペプチド)の発現を駆動する
別のプロモーター、ゲノム組込み部位、組換え部位、および分子挿入中心点(molecular
insertion pivot)が非限定的に含まれうる。ベクターは、ベクターを所望の治療方法の
具体的な目標に合わせて調整しうるように、ポリヌクレオチドの内部または内部以外のい
ずれかに、任意の数のこれらの追加的なエレメントを含んでよい。
本発明の1つの態様において、細胞に導入されるベクターは、発現された場合に、本発
明の遺伝子スイッチ構築物が宿主細胞のゲノムに組み込まれたことを指し示す「選択マー
カー遺伝子」をさらに含む。このように、選択用遺伝子はゲノム組込みに関する陽性マー
カーとなりうる。本発明の方法にとって特に重要ではないが、選択マーカー遺伝子の存在
は、ベクター構築物が細胞のゲノム中に組み込まれた生細胞の集団を実施者が選択するこ
とを可能にする。したがって、本発明のある態様は、ベクターが首尾良く組み込まれた細
胞を選択することを含む。本明細書で用いる場合、「選択する」という用語またはその変
形物は、細胞とともに用いる場合、特定の遺伝的構成または表現型を有する細胞を選ぶた
めの標準的な周知の方法を意味するものとする。典型的な方法には、細胞をG418、ネ
オマイシンおよびアンピシリンなどの抗生物質の存在下で培養することが非限定的に含ま
れる。選択マーカー遺伝子の他の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン
またはミコフェノール酸に対する耐性を付与する遺伝子が非限定的に含まれる。他の選択
方法には、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼまたはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを選択用物質として用いることを
可能にする選択マーカー遺伝子が非限定的に含まれる。1つまたは複数の抗生物質耐性遺
伝子を含むベクター構築物を含む細胞は、したがって、培養下で抗生物質に耐えることが
できると考えられる。同様に、1つまたは複数の抗生物質耐性遺伝子を含むベクター構築
物を含まない細胞は、培養下で抗生物質に耐えることができないと考えられる。
本明細書で用いる場合、「クロマチン修飾ドメイン」(CMD)は、クロマチン構造の
維持および/または改変に関連する種々のタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列の
ことを指し、これにはDNAインスレーターなどがあるが、それらには限定されない。Ci
avatta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006)を参照。CMDの例
には、ニワトリβ−グロブリンインスレーターおよびニワトリ高感受性部位4(cHS4
)が非限定的に含まれる。1つまたは複数の遺伝子プログラム(すなわち、プロモーター
、コード配列、および3’調節領域)の間に複数の異なるCMD配列を用いることにより
、例えば、これらの差異のあるCMDDNA配列を、様々な微生物またはインビトロのリ
コンビニアリング技術と組み合わせて、既存の複遺伝子および単一遺伝子シャトルベクタ
ーの間で遺伝子プログラムを「交換」するための「ミニ相同性アーム」として用いること
が容易になる。クロマチン修飾ドメインの他の例は、当技術分野において公知であるか、
または容易に同定することができる。
本発明のベクターにおけるポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、免疫モジュレー
ター、例えば、TNF−αの分泌を導く分泌またはシグナルペプチドをコードする追加的
なコード領域に関連し得る。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されたタ
ンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、この配列は、伸長するタ
ンパク質鎖の粗面小胞体を通った輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される。脊
椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、該ポリペプチドのN末端と融合
したシグナルペプチドを有し、このシグナルペプチドは、完全または「全長」ポリペプチ
ドから切断されて、分泌または「成熟」型のポリペプチドを生成する。
一実施形態において、本発明のベクターは、ポリヌクレオチドが、(1)プロモーター
に機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子
配列と、(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的
に連結された、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコード
するポリヌクレオチドとを含み、免疫モジュレーターの機能を有する1つまたは複数のタ
ンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコードする核酸配列
をさらに含む、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む。別の一実施形態に
おいて、シグナルペプチドは、免疫モジュレーターの天然のシグナルペプチド遺伝子、例
えば、TNF−α野生型シグナルペプチド遺伝子を含むベクターと比較して、ベクターに
よってコードされた免疫モジュレーター、例えば、TNF−αの分泌を増加させる。特に
、本発明において用いられるシグナルペプチドは、コドン最適化することができる。特定
の一実施形態において、シグナルペプチドは、IL−2野生型シグナルペプチド遺伝子に
よってコードされる。さらに特定の一実施形態において、シグナルペプチドは、コドン最
適化されたIL−2シグナルペプチド遺伝子によってコードされる。
本発明のベクターは、様々な調節領域、例えば、5’非翻訳領域(5’UTR)、3’
UTRまたはその両方を含むことができる。本発明は、また、分泌、タンパク質翻訳、翻
訳後、mRNA転写または転写後過程の改善を誘導するための様々な調節領域の使用を対
象とする。本明細書において、遺伝子の「5’非翻訳領域」または「5’UTR」は、一
次RNA転写産物(mRNA前駆体)へと転写される、コード配列の上流に位置する遺伝
子の当該部分として理解されたし。一次転写産物は、DNAの転写によって生成される、
イントロンおよびエクソンを含有する初期RNA産物である。多くの一次転写産物は、R
NAプロセシングを行って、生理活性を有するRNA種を生成する必要がある。成熟mR
NAへのプロセシングは、末端のトリミング、イントロンの除去、キャップ形成および/
または個々のrRNA分子のその前駆RNAからの切り出しを含み得る。このように、m
RNAの5’UTRは、タンパク質へと翻訳されず、コード配列の上流に位置するmRN
Aの当該部分である。ゲノム配列において、5’UTRは、通常、転写開始部位と開始コ
ドンとの間の領域として定義される。脊椎動物mRNAの5’非翻訳領域(5’UTR)
は、数十塩基から数百塩基の長さとなり得る(Crowe et al., 2006 BMC Genomics 7:16)
。本明細書における5’UTRは、天然起源のものであっても、天然では近接していない
1つまたは複数の核酸配列を含有するよう改変されていてもよく(キメラ配列)、および
/または置換、挿入および欠失ならびにそれらの組合せを包含していてもよい。一実施形
態において、5’UTR配列は、野生型TNF−α配列または5U2配列に由来する。別
の一実施形態において、5’UTR配列は、5U2の5’UTRである。一部の実施形態
において、5’UTRは、タンパク質発現、例えば、mRNA転写、転写前または転写後
の改善を誘導する。
本発明において用いられる3’非翻訳領域(UTR)は、コード配列の下流(3’)に
位置するDNA配列を意味し、ポリアデニル化[poly(A)]認識配列およびmRN
Aプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列
を含み得る。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデ
ニル酸付加経路に及ぼす影響によって特徴付けられる。合成最適化配列や、BGH(ウシ
成長ホルモン)、ポリオーマウイルス、TK(チミジンキナーゼ)、EBV(エプスタイ
ン・バーウイルス)ならびにヒトパピローマウイルスおよびBPV(ウシパピローマウイ
ルス)等のパピローマウイルスのポリアデニル化配列等、任意の適切なポリアデニル化配
列を用いることができる。特定の一実施形態において、3’調節領域は、SV40e(ヒ
ト肉腫ウイルス−40)ポリアデニル化配列である。別の特定の一実施形態において、3
’調節領域は、ヒト成長ホルモンのポリアデニル化配列である。
特定の実施形態において、シグナルペプチドおよび/または調節領域の単独または組合
せは、シグナルペプチドおよび/または調節領域を含有しない対照と比較して、タンパク
質分泌、転写または翻訳を、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9
倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍または500倍改善し得
る。タンパク質、例えば、TNF−αの分泌レベルは、野生型遺伝子を有するベクターに
よってコードされたタンパク質発現に対して正規化することができる。本発明の別の特定
の一実施形態において、シグナルペプチドおよび/または調節領域の単独または組合せは
、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αの生産性を、約5%〜約10%、約11%〜
約20%、約21%〜約30%、約31%〜約40%、約41%〜約50%、約51%〜
約60%、約61%〜約70%、約71%〜約80%、約81%〜約90%、約91%〜
約100%、約101%〜約149%、約150%〜約199%、約200%〜約299
%、約300%〜約499%または約500%〜約1000%増加させる。特定の一実施
形態において、本発明は、5U2の5’UTRと、IL−2シグナルペプチドをコードす
るコドン最適化された核酸配列と、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αをコードす
るコドン最適化されたコード領域と、SV40eまたはヒト成長ホルモンのポリアデニル
化シグナルとを含む、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αを条件的に発現するベク
ターを含む。
さらに別の一実施形態において、本発明のベクターは、SEQ ID NO:47(ベ
クター43318)、SEQ ID NO:48(ベクター43319)、SEQ ID
NO:49(ベクター43320)、SEQ ID NO:50(ベクター43321
)、SEQ ID NO:51(ベクター43322)、SEQ ID NO:52(ベ
クター43323)、SEQ ID NO:53(ベクター43324)、SEQ ID
NO:54(ベクター43325)、SEQ ID NO:55(ベクター43326
)、SEQ ID NO:56(ベクター43327)、SEQ ID NO:57(ベ
クター43328)およびSEQ ID NO:58(ベクター43329)からなる群
から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の特定の一実施形態において、ベ
クターは、SEQ ID NO:52(ベクター43323)またはSEQ ID NO
:58(ベクター43329)のポリヌクレオチド配列を含む。
本発明とともに用いるための特定のベクターは、タンパク質またはポリヌクレオチドを
コードする発現ベクターである。一般に、そのようなベクターは、発現させようとするポ
リヌクレオチドと機能的に連結された、宿主における発現のために有効なシス作用性制御
領域を含む。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給されるか、補完的ベクター
によって供給されるか、または宿主への導入後にベクター自体によって供給される。
非常に様々な発現ベクターを、タンパク質またはポリヌクレオチドを発現させるために
用いることができる。そのようなベクターには、染色体ベクター、エピソームベクターお
よびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵
母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、
バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベク
ター、ならびにそれらの組合せに由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミド
といったプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するものなどが
含まれる。これらすべてを、本発明のこの局面に従った発現のために用いることができる
。一般に、宿主においてポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持する、増やす、または
発現させるのに適した任意のベクターを、これに関連した発現のために用いることができ
る。
本発明において用いられる適切なウイルスベクターとして、アデノウイルスに基づくベ
クター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)に基づくベクター、
パルボウイルスに基づくベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベク
ターおよびAAV−アデノウイルスキメラベクターが挙げられるが、これらに限定される
ものではない。これらのウイルスベクターは、例えば、Sambrook et al., Molecular Clo
ning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Har
bor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Gr
eene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)に記載さ
れている標準組換えDNA技法を用いて調製することができる。
一実施形態において、本発明のウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。
アデノウイルス(Ad)は、DNAをインビボで様々な異なる標的細胞型へと効率的に導
入する36kb二本鎖DNAウイルスである。アデノウイルスベクターは、高力価で作製
することができ、DNAを複製および非複製細胞へと効率的に導入することができる。ア
デノウイルスベクターゲノムは、任意の種、株、サブタイプまたは種、株もしくはサブタ
イプの混合物またはキメラアデノウイルスをベクターDNAの供給源として用いて生成す
ることができる。アデノウイルスの供給源として利用できるアデノウイルスストックは、
現在、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(A
TCC、バージニア州マナサス)から入手できるアデノウイルス血清型1〜51から、あ
るいはその他の供給源から入手できるその他のアデノウイルス血清型から増幅することが
できる。例えば、アデノウイルスは、サブグループA(例えば、血清型12、18および
31)、サブグループB(例えば、血清型3、7、11、14、16、21、34および
35)、サブグループC(例えば、血清型1、2、5および6)、サブグループD(例え
ば、血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22〜30、32、33、3
6〜39および42〜47)、サブグループE(血清型4)、サブグループF(血清型4
0および41)またはその他のアデノウイルス血清型のものとなることができる。ヒトア
デノウイルス血清型5(Ad5)ゲノムが、完全に配列決定されていることを考慮すると
、本明細書における本発明のアデノウイルスベクターは、Ad5血清型に関して記載され
ている。アデノウイルスベクターは、一部の有意な部分(必ずしも実質的にではないが)
において、アデノウイルスのゲノムに由来するまたはそれに基づく、細胞で増殖できるい
ずれのアデノウイルスベクターであってもよい。アデノウイルスベクターは、任意の適切
な野生型アデノウイルスのゲノムに基づくことができる。特定の実施形態において、アデ
ノウイルスベクターは、特に血清型2または5の、野生型アデノウイルスC群のゲノムに
由来する。アデノウイルスベクターは、本技術分野において公知のものであり、例えば、
米国特許第5,559,099号、第5,712,136号、第5,731,190号、
第5,837,511号、第5,846,782号、第5,851,806号、第5,9
62,311号、第5,965,541号、第5,981,225号、第5,994,1
06号、第6,020,191号および第6,113,913号明細書、国際特許出願の
国際公開第95/34671号パンフレット、国際公開第97/21826号パンフレッ
トおよび国際公開第00/00628号パンフレットならびにVirology, B. N. Fields e
t al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)におけるそれぞれThomas
Shenk, "Adenoviridae and their Replication,"およびM. S. Horwitz, "Adenoviruses,"
Chapters 67 and 68に記載されている。
他の実施形態において、アデノウイルスベクターは、複製欠損である。本明細書におけ
る用語「複製欠損」は、アデノウイルスベクターが、少なくとも1つの複製必須遺伝子機
能を欠くゲノムを含むことを意味する。本明細書において、遺伝子、遺伝子機能または遺
伝子もしくはゲノム領域における欠損は、その核酸配列が全体的または部分的に欠失され
ている、遺伝子の機能を損なうまたは消すのに十分なウイルスゲノム遺伝子材料の欠失と
して定義されている。複製必須遺伝子機能は、複製欠損アデノウイルスベクターの複製(
すなわち、繁殖)に必要とされる遺伝子機能である。複製必須遺伝子機能は、例えば、ア
デノウイルス初期遺伝子領域(early region)(例えば、E1、E2およびE4領域)、
後期遺伝子領域(late region)(例えば、L1〜L5領域)、ウイルスパッケージング
に関与する遺伝子(例えば、IVa2遺伝子)およびウイルス関連のRNA(例えば、V
A−RNA Iおよび/またはVA−RNA II)によってコードされる。さらにまた
他の実施形態において、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの1
つまたは複数の領域(例えば、複数(multiply)複製欠損アデノウイルスベクターのため
のアデノウイルスゲノムの2つ以上の領域)の少なくとも1つの複製必須遺伝子機能にア
デノウイルスゲノム欠損を含む。アデノウイルスゲノムの1つまたは複数の領域は、E1
、E2およびE4領域からなる群から選択される。複製欠損アデノウイルスベクターは、
E1領域の少なくとも1つの複製必須遺伝子機能における欠損(E1欠損アデノウイルス
ベクターと表示)、特に、アデノウイルスE1A領域およびアデノウイルスE1B領域そ
れぞれの複製必須遺伝子機能における欠損を含むことができる。E1領域におけるこのよ
うな欠損に加えて、組換えアデノウイルスも、国際特許出願の国際公開第00/0062
8号パンフレットに記されている通り、主要後期プロモーター(MLP)に変異を有する
ことができる。特定の一実施形態において、ベクターは、E1領域および非必須E3領域
の少なくとも一部(例えば、E3領域のXbaI欠失)の少なくとも1つの複製必須遺伝
子機能が欠損している(E1/E3欠損アデノウイルスベクターと表示)。
特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターが、ア
デノウイルスゲノムの2つ以上の領域のそれぞれにおけるウイルス複製に必要とされる1
つまたは複数の遺伝子機能を欠損していることを意味する「複数欠損」である。例えば、
上述のE1欠損またはE1/E3欠損アデノウイルスベクターは、E4領域の少なくとも
1つの複製必須遺伝子機能をさらに欠損することができる(E1/E4欠損アデノウイル
スベクターと表示)。E4領域全体が欠失したアデノウイルスベクターは、より低い宿主
免疫応答を誘発することができる。
あるいは、アデノウイルスベクターは、E1領域の全体または一部およびE2領域の全
体または一部における複製必須遺伝子機能を欠く(E1/E2欠損アデノウイルスベクタ
ーと表示)。E1領域の全体または一部、E2領域の全体または一部およびE3領域の全
体または一部における複製必須遺伝子機能を欠くアデノウイルスベクターもまた、本明細
書において企図されている。本発明のアデノウイルスベクターが、E2A領域の複製必須
遺伝子機能を欠損している場合、該ベクターは、約230塩基対未満の長さのE2A領域
の完全欠失を含まない。一般に、アデノウイルスのE2A領域は、DNA複製に必要とさ
れるポリペプチドであるDBP(DNA結合タンパク質)をコードする。DBPは、ウイ
ルス血清型に応じた473〜529アミノ酸で構成される。DBPは、Ntドメインが延
長した、球状Ctからなる扁長楕円体として存在する非対称タンパク質であると考えられ
る。研究により、Ctドメインは、DBPの核酸との結合能力、亜鉛との結合能力および
DNA鎖伸長レベルにおけるDNA合成機能に関与することが示された。しかし、Ntド
メインは、後期遺伝子発現の転写および転写後レベルの両方において機能すると考えられ
ており、該タンパク質の効率的な核局在の原因であり、また、それ自身の発現の増強に関
与し得る。Ntドメインのアミノ酸2〜38間における欠失は、該領域が、DBP機能に
重要であることを示した(Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993))。DBPの
Ct領域をコードするE2A領域における欠失は、ウイルス複製に影響しないが、DBP
のNtドメインのアミノ酸2〜38をコードするE2A領域における欠失は、ウイルス複
製を損なう。一実施形態において、複数複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイ
ルスゲノムのE2A領域のこの部分を含有する。特に、例えば、保持されるE2A領域の
所望の部分は、E2A領域の5’末端によって定義されるアデノウイルスゲノムのE2A
領域の部分、具体的には、血清型Ad5のアデノウイルスゲノムのE2A領域のAd5(
23816)〜Ad5(24032)の部分である。
アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期遺伝子領域のみ、アデノウイ
ルスゲノムの後期遺伝子領域のみならびにアデノウイルスゲノムの初期および後期遺伝子
領域両方の複製必須遺伝子機能を欠損することができる。アデノウイルスベクターは、ま
た、基本的に全アデノウイルスゲノムが除去されていてよく、この場合、ウイルス末端逆
位配列(ITR)および1つまたは複数のプロモーターか、ウイルスITRおよびパッケ
ージングシグナルの少なくともどちらかは、インタクトのままである(すなわち、アデノ
ウイルスアンプリコン)。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きいほど、ゲノム
内に挿入できる外来核酸配列部分が大きくなる。例えば、アデノウイルスゲノムが、36
kbであることを考慮すると、ウイルスITRおよび1つまたは複数のプロモーターをイ
ンタクトのままにすることにより、アデノウイルスの外来インサート収容力は、およそ3
5kbである。あるいは、ITRおよびパッケージングシグナルのみを含有する複数欠損
アデノウイルスベクターは、およそ37〜38kbの外来核酸配列を効果的に挿入できる
。当然ながら、欠損アデノウイルス領域のいずれかまたは全体においてスペーサーエレメ
ントを包含すると、大型インサートのためのアデノウイルスベクターの収容力を減少させ
るであろう。複数欠損アデノウイルスベクター等、適切な複製欠損アデノウイルスベクタ
ーは、米国特許第5,851,806号および第5,994,106号明細書ならびに国
際特許出願の国際公開第95/34671号パンフレットおよび国際公開第97/218
26号パンフレットに開示されている。一実施形態において、本発明の方法における使用
のためのベクターは、国際特許出願の国際出願PCT/US01/20536号明細書に
記載されているベクターである。
アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変化させ得るこ
とを理解されたい。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベクターによって生じる
炎症反応を低下させ得る。さらに、アデノウイルスベクターのコートタンパク質は、国際
特許出願の国際公開第98/40509号パンフレットに記載されている通り、野生型コ
ートタンパク質に対し作製された中和抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの
能力または無能力を減少させるよう改変することができる。
アデノウイルスベクターは、特に、E1およびE4領域の複製必須遺伝子機能における
複数複製欠損である場合、スペーサーエレメントを包含して、単数(singly)複製欠損ア
デノウイルスベクター、特に、E1領域における欠損を含むアデノウイルスベクターによ
って達成される増殖と同様に補完的株化細胞におけるウイルス増殖を達成することができ
る。スペーサーエレメントは、所望の長さの任意の配列(単数または複数)を含有するこ
とができる。スペーサーエレメント配列は、アデノウイルスゲノムに関してコードまたは
非コードおよび天然または非天然となることができるが、欠損領域に対する複製必須機能
を回復していない。スペーサーがないと、複数複製欠損アデノウイルスベクターの線維タ
ンパク質の産生および/またはウイルス増殖は、単数複製欠損アデノウイルスベクターと
比較して低下する。しかし、欠損アデノウイルス領域のうち少なくとも1つ、好ましくは
E4領域におけるスペーサーの包含は、この線維タンパク質生産およびウイルス増殖の減
少を相殺し得る。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第5,
851,806号明細書に記載されている。
アデノウイルスベクターの構築は、本技術分野において十分に理解されている。アデノ
ウイルスベクターは、例えば、米国特許第5,965,358号明細書ならびに国際特許
出願の国際公開第98/56937号パンフレット、国際公開第99/15686号パン
フレットおよび国際公開第99/54441号パンフレットに説明されている方法を用い
て構築および/または精製することができる。アデノウイルス遺伝子導入ベクターの作製
は、本技術分野において公知のものであり、例えば、Sambrook et al.(上記参照)、Wa
tson et al.(上記参照)、Ausubel et al.(上記参照)および本明細書において言及
されている他の参考文献のいずれかに記載されている技法等、標準分子生物学的技法の使
用に関与する。
複製欠損アデノウイルスベクターは、通常、高力価のウイルスベクターストックを生じ
るため、適切なレベルで、複製欠損アデノウイルスベクターに存在しないがウイルス繁殖
に必要とされる遺伝子機能を提供する補完的株化細胞において産生される。一実施形態に
おいて、株化細胞は、複製欠損アデノウイルスに存在しない少なくとも1つおよび/また
はすべての複製必須遺伝子機能を補完する。補完的株化細胞は、全アデノウイルス機能等
、初期遺伝子領域、後期遺伝子領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連のRN
A領域またはそれらの組合せ(例えば、末端逆位配列(ITR)およびパッケージングシ
グナルのみ、またはITRおよびアデノウイルスプロモーターのみ等、最小アデノウイル
ス配列を含む、アデノウイルスアンプリコンの繁殖を可能にする領域)によってコードさ
れた少なくとも1つの複製必須遺伝子機能の欠損を補完することができる。別の一実施形
態において、補完的株化細胞は、アデノウイルスゲノムのE1領域の少なくとも1つの複
製必須遺伝子機能(例えば、2つ以上の複製必須遺伝子機能)の欠損、特に、E1Aおよ
びE1B領域それぞれの複製必須遺伝子機能の欠損を補完する。その上、補完的株化細胞
は、アデノウイルスゲノムのE2(特に、アデノウイルスDNAポリメラーゼおよび末端
タンパク質に関して)および/またはE4領域の少なくとも1つの複製必須遺伝子機能の
欠損を補完することができる。望ましくは、E4領域の欠損を補完する細胞は、E4−O
RF6遺伝子配列を含み、E4−ORF6タンパク質を産生する。このような細胞は、望
ましくは、少なくともORF6を含み、アデノウイルスゲノムのE4領域の他のORFを
含まない。株化細胞は、好ましくは、アデノウイルスベクターと非重複様式で補完遺伝子
を含有するという点においてさらに特徴付けられ、このことは、細胞DNAとベクターゲ
ノムの組換えの可能性を最小化、特に排除する。したがって、複製能を有するアデノウイ
ルス(RCA)の存在は、ベクターストックにおいて回避されない場合最小化され、した
がって、これは、特定の治療目的、特に遺伝子治療目的に適している。ベクターストック
におけるRCAの欠如は、非補完的細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を回避す
る。補完的株化細胞の構築は、Sambrook et al.(上記参照)およびAusubel et al.(上
記参照)によって記載された技法等、標準分子生物学的および細胞培養技法に関与する。
遺伝子導入ベクター(例えば、アデノウイルスベクター)を産生するための補完的株化細
胞として、293細胞(例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 (1977)に
記載)、PER.C6細胞(例えば、国際特許出願の国際公開第97/00326号パン
フレットならびに米国特許第5,994,128号および第6,033,908号明細書
に記載)および293−ORF6細胞(例えば、国際特許出願の国際公開第95/346
71号パンフレットおよびBrough et al., J. Virol., 71, 9206-9213 (1997)に記載)が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸配列のアデノウイルスゲノム(例
えば、アデノウイルスゲノムのE1領域)への挿入は、公知の方法、例えば、アデノウイ
ルスゲノムの所定のポジションにおけるユニークな制限部位の導入によって容易となり得
る。
レトロウイルスは、多種多様な宿主細胞に感染することができるRNAウイルスである
。レトロウイルスゲノムは、感染するとその宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、宿主細胞
DNAと共に複製され、これによりウイルスRNAおよびレトロウイルスゲノムに組み込
まれた任意の核酸配列を定常的に産生する。このように、レトロウイルスを用いると治療
因子(複数可)の長期発現を達成することができる。病原性レトロウイルスが存在するが
、遺伝子治療における使用に企図されるレトロウイルスは比較的非病原性である。病原性
レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)またはヒトT細胞リンパ増殖
性ウイルス(HTLV)を利用する場合、宿主に対する毒性を排除するためのウイルスゲ
ノムの変質を慎重に行う必要がある。レトロウイルスベクターは、さらに、ウイルス複製
欠損を付与するよう操作することができる。このように、レトロウイルスベクターは、イ
ンビボにおける安定的な遺伝子導入に特に有用であると考えられる。HIVに基づくベク
ター等、レンチウイルスベクターは、遺伝子送達に用いられるレトロウイルスベクターの
具体例である。レトロウイルスとは異なり、HIVに基づくベクターは、自身のパッセン
ジャー遺伝子を非分裂細胞に組み込むことが知られており、したがって、遷延型の疾患の
治療に役立つ。
HSVに基づくウイルスベクターは、核酸を多数の細胞型に導入するための遺伝子導入
ベクターとしての使用に適している。成熟HSVビリオンは、外被に包まれた正二十面体
カプシドからなり、ウイルスゲノムは、152kbの直鎖状二本鎖DNA分子からなる。
多くの複製欠損HSVベクターは、1つまたは複数の中間型初期遺伝子を除去するための
欠失を含有して、複製を妨げる。HSVベクターの利点は、長期DNA発現をもたらし得
る潜伏期に入るその能力と、最大25kbの外来DNAインサートを収容できるその大型
のウイルスDNAゲノムである。当然ながら、外来タンパク質の長期産生を促進するHS
Vの能力は、短期治療計画の観点からは潜在的に不利である。しかし、当業者であれば、
特定の状況のための適切なベクターの決定に必要な理解を有する。HSVに基づくベクタ
ーは、例えば、米国特許第5,837,532号、第5,846,782号、第5,84
9,572号および第5,804,413号明細書ならびに国際特許出願の国際公開第9
1/02788号パンフレット、国際公開第96/04394号パンフレット、国際公開
第98/15637号パンフレットおよび国際公開第99/06583号パンフレットに
記載されている。
AAVベクターは、遺伝子治療プロトコールにおける使用に関して特に興味深いウイル
スベクターである。AAVは、ヒト疾患の原因となることが知られていないDNAウイル
スである。AAVゲノムは、ウイルスのDNA複製およびパッケージングの認識シグナル
を含有する、末端逆位配列(ITR)に隣接する2種の遺伝子、repおよびcapで構
成される。AAVは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス(すなわち、アデノウイ
ルスまたは単純ヘルペスウイルス)との同時感染またはヘルパー遺伝子の発現を必要とす
る。AAVは、利用されているヘルパーウイルスに応じて、ヒト、サルおよび齧歯類細胞
等、幅広い宿主細胞において繁殖することができる。核酸配列の投与に用いられるAAV
ベクターは、通常、ITRのみが残るようにおよそ96%の親ゲノムが欠失している。こ
のことは、ウイルス遺伝子の発現のため、免疫性または毒性の副作用を排除する。必要に
応じて、AAV repタンパク質は、AAVベクターと同時投与して、AAVベクター
の宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にすることができる。組み込まれたAAVゲノムを含
む宿主細胞は、細胞増殖または形態における変化を示さない(例えば、米国特許第4,7
97,368号明細書を参照)。このように、AAVベクターからの治療因子の延長され
た発現は、遷延性および慢性疾患の治療に有用となり得る。
発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は、例えば、mRNAの転写を導くプロモータ
ーを含む、適切な発現制御配列と機能的に連結されている。そのほかのプロモーターの代
表例には、構成的プロモーターおよび組織特異的または誘導性プロモーターが非限定的に
含まれる。構成的真核生物プロモーターの例には、マウスメタロチオネインI遺伝子のプ
ロモーター(Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen.1:273 (1982));ヘルペスウイルスのT
Kプロモーター(McKnight, Cell 31:355 (1982));SV40初期プロモーター(Benois
t et al., Nature 290:304 (1981));およびワクシニアウイルスプロモーターが非限定
的に含まれる。タンパク質またはポリヌクレオチドの発現を作動させるために用いうると
考えられるプロモーターのそのほかの例には、アルブミンプロモーター(肝細胞)、プロ
インスリンプロモーター(膵臓β細胞)などといった、組織特異的プロモーターおよび特
定のタンパク質に対する他の内因性プロモーターが非限定的に含まれる。一般に、発現構
築物は、転写、開始および終結のための部位、ならびに転写される領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を含むと考えられる。構築物によって発現される成熟転写物のコード部
分は、翻訳されるポリペプチドの始端に翻訳を開始させるAUGを、その末端に適切に配
置された終止コドン(UAA、UGAまたはUAG)を含みうる。
加えて、構築物は発現を調節するとともに発生させる制御領域を含みうる。一般に、そ
のような領域は、いくつか例を挙げるとリプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの
ように、転写を制御することによって動作すると考えられる。
真核生物ベクターの例には、Stratageneから販売されているpW−LNEO
、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;Amersham Pharm
acia Biotechから販売されているpSVK3、pBPV、pMSGおよびp
SVL;ならびにClontechから販売されているpCMVDsRed2−expr
ess、pIRES2−DsRed2、pDsRed2−Mito、およびpCMV−E
GFPが非限定的に含まれる。他にも多くのベクターが周知であり、市販されている。
遺伝子プログラムのエレメントの迅速な挿入および除去のための分子挿入中心点を含む
、特に有用なベクターは、米国特許出願公開第2004/0185556号、米国特許出
願第11/233,246号、ならびに国際公開公報WO2005/040336号およ
びWO2005/116231号に記載されている。そのようなベクターの一例は、WO
2007/038276号に記載されたULTRAVECTOR(商標)Product
ion System(Intrexon Corp., Blacksburg, V
A)である。本明細書で用いる場合、「遺伝子プログラム」は、プロモーター(P)、発
現配列(E)および3’調節配列(3)を含む遺伝子エレメントの組合せのことであり、
このため「PE3」は1つの遺伝子プログラムである。遺伝子プログラム内部のエレメン
トは、遺伝子プログラムのエレメントのそれぞれを挟み込んだ分子中心点の間で容易に交
換することができる。分子中心点とは、本明細書で用いる場合、直鎖状に並んだ少なくと
も2つの非可変性の稀なまたは一般的でない制限部位を含むポリヌクレオチドと定義され
る。1つの態様において、分子中心点は、直鎖状に並んだ少なくとも3つの非可変性の稀
なまたは一般的でない制限部位を含む。典型的には、任意の1つの分子中心点は、同じ遺
伝子プログラム内の任意の他の分子中心点の稀なまたは一般的でない制限部位を含まない
と考えられる。所与の制限酵素が作用する6ヌクレオチドを上回るコグネイト配列は「稀
な」制限部位と呼ばれる。しかし、統計学的に予測されるよりも低い頻度で出現する6b
pの制限部位があり、これらの部位およびそれらを切断するエンドヌクレアーゼは「一般
的でない」制限部位と呼ばれる。稀なまたは一般的でない制限酵素の例には、AsiSI
、PacI、SbfI、FseI、AscI、MluI、SnaBI、NotI、Sal
I、SwaI、RsrII、BSiWI、SfoI、SgrAI、AflIII、Pvu
I、NgoMIV、AseI、FlpI、PmeI、SdaI、SgfI、SrfI、N
ruI、AclI、ClaI、Csp45I、AgeI、Bst1107I、BstBI
、HpaI、AatII、EcoRV、NheI、SpeI、AviII、AvrII、
MfeI、AfeI、FspI、KpnI、ScaI、BspEI、NdeI、BfrI
、XhoI、PmlI、ApaLI、KasI、XmaI、BsrBI、NsiI、Sa
cII、SacI、BlpI、PspoMI、PciI、StuI、SphI、BamH
I、Bsu36I、XbaI、BbvCI、BglII、NcoI、HindIII、E
coRI、BsrGIおよびSse8781Iが非限定的に含まれる。
ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)酵素と呼ばれる第2のクラスの制
限酵素の制限部位を含んでもよい。HE酵素は大きな非対称性制限部位(12〜40塩基
対)を有し、その制限部位は天然では低頻度である。例えば、I−SceIとして知られ
るHEは18bpの制限部位(5’TAGGGATAACAGGGTAAT3’(SEQ
ID NO:28))を有し、これはランダムな配列の7×1010塩基対毎に1回し
か出現しないと予想される。この出現率は、哺乳動物ゲノムの20倍のサイズのゲノム中
でわずか1部位に等しい。HE部位のこの希少性は、HE部位がクローニングベクタープ
ラスミド中の適切な位置に含まれる場合に、遺伝子操作者が、遺伝子プログラムの完全性
を損なうことなしに遺伝子プログラムを切り出せる見込みを大きく高める。
宿主細胞における発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は公知の手順
であり、ベクターの構築および宿主への導入、ならびに宿主におけるその発現のために必
要な手法は、当技術分野において定型的な技能である。
細胞へのポリヌクレオチドの導入は、ベクターの一時的トランスフェクション、安定的
なトランスフェクションであってもよく、または遺伝子座特異的な挿入であってもよい。
宿主細胞へのベクターの一時的および安定的なトランスフェクションは、リン酸カルシウ
ムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン
脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方
法によって生じさせることができる。そのような方法は、Davis et al., Basic Methods
in Molecular Biology (1986);Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185:527-37;Sa
mbrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.などの、多くの標準的な実験マニュアルに記載
されている。これらの安定的な形質転換方法は、細胞のゲノム中へのベクターのランダム
な挿入をもたらす。さらに、ベクターのコピー数および配向も、一般的に言ってランダム
である。
本発明の1つの態様においては、ベクターをゲノム中の生物学的中立部位(bio−n
eutralsite)に挿入する。生物学的中立部位とは、ポリヌクレオチドの挿入が
、細胞の正常な機能に、仮にあるにしても極めてわずかしか干渉しない、ゲノム中の部位
である。生物学的中立部位を、利用可能なバイオインフォマティクスを用いて分析しても
よい。多くの生物学的中立部位が当技術分野において公知であり、これには例えば、RO
SA等価遺伝子座(ROSA-equivalent locus)がある。他の生物学的中立部位を、当技術
分野において周知の定型的な手法を用いて同定することもできる。ゲノム挿入部位の特性
決定は、当技術分野において公知の方法を用いて行われる。ベクターを細胞に導入する際
にポリヌクレオチドの場所、コピー数および/または配向を制御するために、遺伝子座特
異的な挿入の方法を用いてもよい。遺伝子座特異的な挿入の方法は当技術分野において周
知であり、これには相同組換えおよびリコンビナーゼ媒介ゲノム挿入が非限定的に含まれ
る。当然ながら、遺伝子座特異的な挿入方法を本発明の方法に用いる場合には、ベクター
は、この遺伝子座特異的な挿入、例えば限定されるわけではないが相同組換えなどを助け
るエレメントを含んでもよい。例えば、ベクターが、1、2、3、4個またはそれ以上の
ゲノム組込み部位(GIS)を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「ゲノム組込み部
位」は、そのヌクレオチド配列が、ゲノム中へのベクターの挿入を可能にする細胞内のゲ
ノムの部分と同一またはほぼ同一である、ベクター配列の部分と定義される。特に、ベク
ターは、少なくともそのポリヌクレオチドを挟み込む2つのゲノム挿入部位を含みうる。
当然ながら、GISが追加的なエレメントを、またはさらにはベクター上に存在するすべ
てのエレメントを挟み込んでもよい。
別の態様において、遺伝子座特異的な挿入を、リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿入
によって行うこともできる。手短に述べると、限定されるわけではないがPhiC31イ
ンテグラーゼなどの細菌リコンビナーゼ酵素は、ヒトゲノム内部の「偽」組換え部位に対
して作用しうる。これらの偽組換え部位はリコンビナーゼを用いる遺伝子座特異的な挿入
の標的となりうる。リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿入は、Thyagarajan et al., Mo
l. Cell Biol. 21:3926 (2001)に記載されている。リコンビナーゼ部位特異的な遺伝子挿
入に用いうるリコンビナーゼおよびその各々の部位の他の例には、R4およびTP901
−1などのセリンリコンビナーゼならびにWO2006/083253号に記載されたリ
コンビナーゼが非限定的に含まれる。
さらなる態様において、ベクターが、化学療法耐性遺伝子、例えば、多剤耐性遺伝子m
dr1、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはO−アルキルグアニン−DNAアルキルト
ランスフェラーゼを含んでもよい。化学療法耐性遺伝子は、構成的(例えば、CMV)ま
たは誘導性(例えば、RheoSwitch(登録商標))プロモーターの制御下にあっ
てよい。この態様において、対象内部の改変細胞を維持しながら対象の疾患を治療するこ
とが望まれる場合には、医師は罹患細胞を破壊するために化学療法薬を適用することがで
き、その際、改変細胞は適した化学療法耐性遺伝子の発現のために薬剤から防御されると
考えられることから、疾患または障害の治療、改善または予防のために使用を継続するこ
とができる。化学療法耐性遺伝子を誘導性プロモーターの下に配置することにより、化学
療法耐性遺伝子の不必要な発現を避けることができ、それでも、継続治療が必要とされる
場合には依然として利用可能であると考えられる。改変細胞自体が罹患した場合でも、そ
れらは依然として、以下に記載する致死性ポリペプチドの発現を誘導することによって破
壊することができると考えられる。
本発明の方法は、遺伝子スイッチおよび外因性遺伝子をコードするポリヌクレオチドを
対象の細胞に導入することによって行われる。当技術分野において公知である、ポリヌク
レオチドを細胞に導入するための、上記のもののような任意の公知の方法を用いることが
できる。
ポリヌクレオチドを細胞にエクスビボで導入する場合には、生検、擦過および外科的組
織摘出を非限定的に含む、当技術分野において公知の任意の手法によって、対象から細胞
を入手することができる。単離した細胞は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するのに十分
な時間、例えば、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48時間またはそれ
以上にわたって培養することができる。初代細胞を短期間培養するための方法は当技術分
野において周知である。例えば、細胞をプレート(例えば、マイクロウェルプレート)中
で、付着させるか浮遊させて培養することができる。
エクスビボでの治療法のためには、細胞を対象から単離して、ポリヌクレオチドを細胞
に導入するのに適した条件下で培養する。ポリヌクレオチドが細胞にひとたび導入されれ
ば、細胞をリガンド依存性転写因子が発現されるのに十分な期間、例えば、0.5、1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、もしくは24時間またはそれ以上
にわたってインキュベートする。ポリヌクレオチドを細胞に導入した後のある時点(意味
のあるレベルのリガンド依存性転写因子が発現される前または後のいずれか)で、細胞を
対象に再導入する。再導入は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、静脈内注
入または組織もしくは腔への直接注射によって行うことができる。1つの態様においては
、細胞を対象に再導入する前に、細胞におけるポリヌクレオチドの存在を判定する。別の
態様においては、ポリヌクレオチドを含む細胞を選択し(例えば、ポリヌクレオチド中の
選択マーカーの存在に基づいて)、ポリヌクレオチドを含む細胞のみを対象に再導入する
。細胞を対象に再導入した後に、リガンドを対象に投与して、治療用ポリペプチドまたは
治療用ポリヌクレオチドの発現を誘導する。1つの代替的な態様においては、治療用ポリ
ペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドが細胞の再導入前に発現されるように、細胞を対
象に再導入するよりも前にリガンドを細胞に添加してもよい。リガンドは、全身性(例え
ば、経口、静脈内)または局所性(例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、細胞を再導入する
組織もしくは臓器中への直接注射)のいずれかで、任意の適した方法によって投与してよ
い。リガンド投与の最適なタイミングは、定型的な範囲にとどまる手法を用いて、細胞お
よび疾患または障害のそれぞれの種類に対して決定することができる。
本発明のインビボでの治療法は、対象の細胞へのポリヌクレオチド、例えばアデノウイ
ルスベクターの直接的なインビボ導入を伴う。ポリヌクレオチドは対象に全身性または局
所性(例えば、疾患または障害の部位)に導入することができる。ポリヌクレオチドが対
象にひとたび導入されれば、リガンドを投与して、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリ
ヌクレオチドの発現を誘導することができる。リガンドは、全身性(例えば、経口、静脈
内)または局所性(例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が起こっている
組織もしくは臓器中への直接注射)のいずれかで、任意の適した方法によって投与してよ
い。リガンド投与の最適なタイミングは、定型的な範囲にとどまる手法を用いて、細胞お
よび疾患または障害のそれぞれの種類に対して決定することができる。
インビボでの使用のためには、本明細書に記載したリガンドを、例えば、溶液、懸濁液
、錠剤、カプセル、軟膏、エリキシル剤および注射用組成物といった、薬学的に許容され
る担体中に取り入れることができる。薬学的組成物は、リガンドを重量比で0.01%か
ら99%の範囲で含むことができる。組成物は単回投与剤形または多回投与剤形のいずれ
であってもよい。任意の特定の薬学的組成物におけるリガンドの量は、有効用量、すなわ
ち、所望の遺伝子発現または抑制を誘発させるために必要な用量に依存すると考えられる
薬学的製剤の適した投与経路には、経口、直腸、局所(皮膚、口腔内および舌下を含む
)、膣、避腸的(皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む)、
硝子体内および経鼻胃管によるものが含まれる。当業者であれば、投与経路は治療される
病状に依存すると考えられ、レシピエントの状態などの要因によって変化しうることを理
解するであろう。
本明細書で用いる場合、「rAD.RheoIL12」という用語は、活性化リガンド
の存在下でIL−12タンパク質を産生させることのできる、RheoSwitch(登
録商標)Therapeutic System(RTS)の遺伝子スイッチの制御下に
あるIL−12遺伝子を保有するアデノウイルスポリヌクレオチドベクターのことを指す
。本明細書で用いる場合、「rAd.cIL12」という用語は、構成的プロモーターの
制御下にあるIL−12遺伝子を含むアデノウイルスポリヌクレオチド制御ベクターのこ
とを指す。
本明細書で用いる場合、「IL−12p70」という用語は、p40およびp35と一
般的に呼ばれる2つのサブユニットを天然に有するIL−12タンパク質のことを指す。
IL−12p70という用語は、IL−12(p40およびp35)の2つのサブユニッ
トを含む融合タンパク質を範囲に含み、ここで融合タンパク質はサブユニットの間にリン
カーアミノ酸を含んでもよい。
本明細書で用いる場合、「免疫モジュレーターの機能を有するタンパク質」という用語
は、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL−8、IL−
9、IL−10RまたはそのサブユニットDN、IL−15、IL−18、IL−21、
IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、CCL
3(MIP−1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(リ
ンホタクチン)、CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP−3b)
、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF−1)、
CCL21(6Ckine)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70、GIT
RL、LIGHT、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、TNF−
α、dnFADD、BCG、TGF−α、PD−L1、TGFbRIIDN、ICOS−
LおよびS100から選択される免疫モジュレーターの任意の生物活性の少なくとも20
%(例えば、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%
)を有するタンパク質のことを指す。同様に、「IL−12の機能を有するタンパク質」
という用語は、ヒトIL−12の任意の生物活性の少なくとも20%(例えば、少なくと
も30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%)を有するタンパク質
のことを指す。そのような免疫モジュレーターの生物活性は周知である。以下の表を参照
されたい。





IL−12の生物活性も当技術分野において周知であり、これには、ナイーブT細胞の
Th1細胞への分化、T細胞の成長および機能の刺激、T細胞およびナチュラルキラー(
NK)細胞からのインターフェロン−γ(IFN−γ)および腫瘍壊死因子−α(TNF
−α)の産生、IL−4を介したIFN−γ抑制の低下、NK細胞およびCD8細胞傷
害性Tリンパ球の細胞傷害活性の強化、IL−12R−β1およびIL−12R−β2の
発現の刺激、MHCIおよびII分子のアップレギュレーション、ならびに抗血管新生活
性が非限定的に含まれる。「IL−12の機能を有するタンパク質」という用語は、野生
型配列がアミノ酸の付加、欠失または置換のうち1つまたは複数によって改変されている
、野生型IL−12配列の突然変異体、ならびにIL−12の生物活性の1つまたは複数
を模倣する非IL−12タンパク質を範囲に含む。
本明細書で用いる場合、「活性化すること」または「活性化する」という用語は、関心
対象の遺伝子(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7
、IL−8、IL−9、IL−10RまたはそのサブユニットDN、IL−15、IL−
18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、IFN−α、
IFN−γ、CCL3(MIP−1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP
3)、XCL1(リンホタクチン)、CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL1
9(MIP−3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、CXCL1
2(SDF−1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4−1BBL、CD40
、CD70、GITRL、LIGHT、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、I
FN−β、TNF−α、dnFADD、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1
アンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRIIDN、ICOS−LおよびS100か
ら選択される)の発現をもたらす、遺伝子スイッチの細胞活性の何らかの測定可能な増加
のことを指す。
本明細書で用いる場合、疾患を「治療すること」または疾患の「治療」という用語は、
あるプロトコールを遂行することを指し、それは疾患の徴候または症状を改善するための
取り組みにおいて、1つまたは複数の薬物またはインビトロで遺伝子操作された細胞を、
哺乳動物(ヒトまたは非ヒト)に投与することを含みうる。したがって、「治療すること
」または「治療」は、必ずしも徴候または症状の完全な改善が必要であると解釈されるべ
きではなく、治癒を必要とはせず、特に、対象に対してわずかな効果しかないプロトコー
ルも含む。
本明細書で用いる場合、「免疫細胞」には、樹状細胞、マクロファージ、好中球、マス
ト細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞およびリンパ球(例えば、B細胞およ
びT細胞)が含まれる。
本明細書で用いる場合、「樹状細胞」および「DC」という用語は、互換的に用いられ
る。
本明細書で用いる場合、「治療補助細胞」(TSC)という用語は、免疫モジュレータ
ーの機能を有する1つまたは複数のタンパク質、および任意でIL−12の機能を有する
タンパク質を、腫瘍の微小環境に送達するために、本発明のベクターによって改変するこ
と(例えば、トランスフェクトさせること、エレクトロポレーションを行うこと、など)
ができる細胞である。そのようなTSCには、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞およびケラ
チノサイトが非限定的に含まれる。
本明細書で用いる場合、「インビトロで遺伝子操作された免疫細胞」または「インビト
ロで遺伝子操作された免疫細胞の集団」または「遺伝子操作された免疫細胞の集団」また
は「免疫モジュレーターを発現する免疫細胞」または「IL−12を発現する免疫細胞」
という用語は、場合により活性化リガンドによって活性化することができる遺伝子スイッ
チの制御下にある、免疫モジュレーターおよび/またはIL−12を条件的に発現する免
疫細胞、例えば樹状細胞のことを指す。
本明細書で用いる場合、「インビトロで遺伝子操作されたTSC」または「インビトロ
で遺伝子操作されたTSCの集団」または「遺伝子操作されたTSCの集団」または「免
疫モジュレーターを発現するTSC」または「IL−12を発現するTSC」という用語
は、場合により活性化リガンドによって活性化することができる遺伝子スイッチの制御下
にある、免疫モジュレーターおよび/またはIL−12を条件的に発現する治療補助細胞
、例えば幹細胞、繊維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイトのことを指す。
本明細書で用いる場合、「改変細胞」という用語は、トランスフェクション、エレクト
ロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラ
ン法、リン酸カルシウム沈殿およびリポフェクション(リソソーム融合)を非限定的に含
む過程によって改変された細胞のことを指す。
本明細書で用いる場合、「MOI」または「感染多重度」という用語は、特定の実験に
おいて単一細胞を感染させるアデノウイルス粒子(例えば、組換えアデノウイルスまたは
対照アデノウイルス)の平均数のことを指す。
本明細書で用いる場合、「腫瘍」という用語は、前癌性または癌性細胞および/または
組織のいずれかを問わず、インビボまたはインビトロのいずれかにあるすべての良性また
は悪性の細胞成長および増殖のことを指す。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、疾患の治療に用いることが
できる。
別の態様において、本発明のベクターおよび方法を用いて癌の治療をすることができる
。本発明に従って治療することができる癌の非限定的な例には、乳癌、前立腺癌、リンパ
腫、皮膚癌、膵癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳悪性腫瘍、原発性脳癌腫、
頭頸部癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部の癌
腫、乳癌腫、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫
、膀胱癌腫、膵癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道
癌腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪
性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血
症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白
血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリーセル白血
病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、
ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン
血症、および網膜芽細胞腫などが含まれる。別の一実施形態において、本発明のベクター
および方法は、脂質異常症、粥状動脈硬化、インスリン抵抗性、糖尿病(例えば、I型糖
尿病、II型糖尿病、MODYおよび妊娠糖尿病)、肥満、耐糖能障害、アテローム性疾
患、高血圧、心疾患(冠動脈心疾患、発作、心不全、冠不全および高血圧症を含むがこれ
らに限定されない)、高脂血症、ブドウ糖不耐性、インスリン抵抗性、高血糖、高インス
リン血症、メタボリックシンドロームX(またはシンドロームXまたはインスリン抵抗性
症候群またはReaven症候群または代謝性心血管リスク症候群)、高血圧、慢性疲労
、促進老化、変性疾患、加齢に伴う内分泌欠損症、G1ガングリオシドーシス、モルキ
オ−B疾患、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、テイ・サックス病、サンドホフ病
、フコシドーシス、炭水化物代謝障害(例えば、糖原病)、アミノ酸代謝障害(例えば、
フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症1型)、有機酸代謝障害(
例えば、アルカプトン尿症)、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝障害(例えば、中鎖
アシル脱水素酵素欠損症)、ポルフィリン代謝障害(例えば、急性間欠性ポルフィリン症
)、プリンまたはピリミジン代謝障害(例えば、レッシュ・ナイハン症候群)、ステロイ
ド代謝障害(例えば、先天性副腎過形成)、ミトコンドリア機能障害(例えば、カーンズ
・セイヤー症候群)およびペルオキシソーム機能障害(例えば、ツェルウェガー症候群)
からなる群から選択される障害が挙げられるが、これらに限定されない代謝関連の障害の
治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、無酸症自己免疫活動性慢性
肝炎、急性散在性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、ガンマグロブリン血症、
無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗GBM/
TBM腎炎、抗リン脂質症候群、抗シンテターゼ症候群、関節炎、アトピー性アレルギー
、アトピー性皮膚炎、再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性溶血性貧血、自己
免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性末梢神
経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群I、II&III型、自己免疫性プ
ロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性ぶどう膜炎、Balo
病/Balo同心円性硬化症、Bechets症候群、ベルジェ病、ビッカースタッフ型
脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、慢性疲労免疫機能障害症候群
、慢性炎症脱髄性多発ニューロパチー、慢性反復性多巣性骨髄炎(ostomyelitis)、チャ
ーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、セリアック病、コーガン症候群、寒冷凝集素
病、補体成分2欠損症、頭部動脈炎、CREST症候群、クローン病、クッシング症候群
、皮膚白血球破壊性血管炎、デゴス病、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病1型、
びまん性皮膚全身硬化症、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、湿疹、腱付着部
炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグ
ロブリン血症、エヴァンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維筋炎、線維性肺胞炎
(Fibrosing aveolitis)、胃炎、胃腸性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー
症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群(GBS)、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶
血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、ヒューズ症候群(または抗リ
ン脂質症候群)、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症脱髄性疾患、特発性肺線維症、特
発性血小板減少性紫斑病、IgA腎症(またはベルジェ病)、封入体筋炎、ory脱髄性
多発ニューロパチー、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、ランバート・イートン
筋無力症症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状IgA病(LAD)
、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール
病、顕微鏡的多発血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、ムッハ・ハ
ーベルマン病、マックル・ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、重症筋無力症、筋炎、ナルコ
レプシー、視神経脊髄炎(デビック病とも)、眼(Occular)瘢痕性類天疱瘡、Ord甲
状腺炎、回帰性リウマチ、PANDAS(連鎖球菌感染症に伴う小児自己免疫性神経精神
疾患;Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococ
cus)、傍腫瘍性小脳変性症、傍腫瘍性小脳変性症、パリー・ロンベルク症候群、パーソ
ネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲
脳脊髄炎、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、
原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎
、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、
リウマチ熱、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、シェーグレン症候群、
脊椎関節症、血液粘着性(sticky blood)症候群、スチル病、亜急性細菌性心内膜炎(S
BE)、スザック症候群、スイート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、
側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患
、未分化脊椎関節症、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ウィルソン症候群およびウィスコッ
ト・アルドリッチ症候群からなる群から選択される障害が挙げられるが、これらに限定さ
れない自己免疫障害の治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、開放隅角緑内障(例えば、
原発性開放隅角緑内障、色素性緑内障および落屑緑内障、低眼圧緑内障)、閉塞隅角緑内
障(臨床的には、クローズドアングル(closed angle)緑内障、狭隅角緑内障、瞳孔ブロ
ック緑内障および毛様体ブロック緑内障としても知られている)(例えば、急性閉塞隅角
緑内障および慢性閉塞隅角緑内障)、無虹彩(Aniridic)緑内障、先天性緑内障、若年性
緑内障、水晶体原性緑内障、血管新生緑内障(例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)デ
コイ、色素由来増殖因子(PDGF)、エンドスタチン、アンジオスタチンまたはアンジ
オポエチン(Angiopoetin)−1で構成されたベクターを用いる)、外傷後緑内障、ステ
ロイド緑内障、スタージ・ウェーバー症候群緑内障およびぶどう膜炎誘導性緑内障等の緑
内障、糖尿病性網膜症(例えば、VEGFデコイ、PDGF、エンドスタチン、アンジオ
スタチンまたはアンジオポエチン−1で構成されたベクターを用いる)、黄斑変性(例え
ば、VEGFデコイ、PDGF、エンドスタチン、アンジオスタチン、アンジオポエチン
−1、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4で構成されたベクター)、黄斑変
性(例えば、VEGFデコイ、PDGF、エンドスタチン、アンジオスタチン、アンジオ
ポエチン−1、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4で構成されたベクターを
用いる)、脈絡膜血管新生(例えば、VEGFデコイ、PDGF、エンドスタチン、アン
ジオスタチンまたはアンジオポエチン−1で構成されたベクターを用いる)、血液漏出お
よび/または網膜浮腫、細菌性結膜炎、真菌性結膜炎、ウイルス性結膜炎、ぶどう膜炎、
角膜後面沈着物、黄斑浮腫(例えば、VEGFデコイ、PDGF、エンドスタチン、アン
ジオスタチンまたはアンジオポエチン−1で構成されたベクターを用いる)、眼内レンズ
挿入術後の炎症反応、ぶどう膜炎症候群(例えば、慢性虹彩毛様体炎または慢性眼内炎)
、網膜血管炎(例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身エリテマトーデス(er
ythymatosus)、進行性全身硬化症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、側頭(ter
mporal)動脈炎、アダマンティアデス・ベーチェット病、シェーグレン症候群(Sjorgen
)、再発性多発性軟骨炎およびHLA−B27関連性脊椎炎に観察される)、サルコイド
ーシス、イールズ病、急性網膜壊死、フォークト・小柳・原田症候群、眼トキソプラズマ
症、放射線網膜症、増殖性硝子体網膜症、眼内炎、眼性緑内障(例えば、炎症性緑内障)
、視神経炎、虚血性視神経症(例えば、異地性NADH脱水素酵素ユニット4で構成され
たベクター)、甲状腺関連の眼窩疾患、眼窩偽腫瘍、色素散乱症候群(色素性緑内障)、
強膜炎、上強膜炎脈絡膜症(例えば、急性多巣性後部小板状が挙げられるが、これに限定
されない「白点(White-dot)」症候群)、網膜症(例えば、嚢胞状黄斑浮腫、中心性漿
液性脈絡膜症および推定眼ヒストプラスマ症候群(例えば、グリア細胞由来神経栄養因子
、ペリフェリン−2で構成されたベクター))、網膜血管病(例えば、糖尿病性網膜症、
コーツ病および網膜動脈瘤)、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、網膜色素変
性症(例えば、網膜色素特異的65kDaタンパク質で構成されたベクター)、家族性滲
出性硝子体網膜症(FEVR)、特発性ポリープ状脈絡膜血管症、黄斑部網膜上膜ならび
に白内障からなる群から選択される障害が挙げられるがこれらに限定されない眼疾患の治
療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、貧血、出血および凝固障害
(例えば、播種性血管内凝固(DIC)、血友病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(He
noch-Schonlien Purpura)、遺伝性出血性末梢血管拡張症、血小板減少症(ITP、TT
P)、血栓形成傾向、フォン・ヴィルブランド病)、白血病(例えば、急性リンパ球性白
血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病)、リンパ腫(例え
ば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫)、骨髄増殖性障害(例えば、骨髄線維症、
真性多血症、血小板血症)、形質細胞障害(例えば、マクログロブリン血症、意義不明の
モノクローナル高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫(multiple lyeloma))、脾臓障
害、白血球障害(例えば、好塩基球性障害、好酸球性障害、リンパ球減少症、単球障害、
好中球減少症、好中球性白血球増多症)、血栓症、深部静脈血栓症(DVT)、ヘモクロ
マトーシス、月経過多、鎌状赤血球症ならびにサラセミアからなる群から選択される血液
障害が挙げられるがこれらに限定されない血液障害の治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、ゴーシェ病、パーキンソン
病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)、ハンチ
ントン病、フレドリック失調症、軽度認知障害、脳アミロイド血管症、パーキンソニズム
疾患、レビー小体病、前頭側頭型認知症(FTD)多系統萎縮症(MSA)、進行性核上
性麻痺および運動障害(運動失調、脳性麻痺、舞踏病アテトーゼ、ジストニア、トゥレッ
ト症候群、核黄疸等)および振戦障害および白質ジストロフィー(副腎白質ジストロフィ
ー、異染性白質ジストロフィー、カナバン病、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツ
バッヘル病等)、神経セロイドリポフスチン症(neuronal ceroid lipofucsinoses)、毛
細血管拡張性運動失調症(ataxia telangectasia)、レット症候群、α−シヌクレイン病
(例えば、レビー小体病、多系統萎縮症、ハラーホルデン・スパッツ病または前頭側頭型
認知症)、ニーマン・ピック病C型(NPCD)、脊髄小脳失調症1型、2型および3型
ならびに歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRLPA)からなる群から選択される神経障
害が挙げられるがこれらに限定されない神経障害の治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、喘息、無気肺、気管支炎、
COPD(慢性閉塞性肺疾患)、肺気腫、肺癌、中皮腫、肺炎、石綿肺、アスペルギルス
腫、アスペルギルス症、アスペルギルス症−急性侵襲性、気管支拡張症、閉塞性細気管支
炎性器質化肺炎(BOOP)、好酸球性肺炎、壊死性肺炎、胸水(ral effusion)、塵肺
症、気胸、肺放線菌症、肺胞タンパク症(monary alveolar proteinosis)、肺炭疽、肺
動静脈奇形、肺線維症、肺塞栓症、肺組織球増殖症X(好酸球性肉芽腫)、肺高血圧、肺
水腫、肺出血、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞症、リウマチ肺疾患、サルコイドー
シス、放射線線維症、過敏性肺炎、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、乳児呼吸窮迫症候
群、特発性肺線維症、特発性間質性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺ランゲルハンス細胞組織
球症、肺胞タンパク症、副鼻腔炎、扁桃炎、中耳炎、咽頭炎、喉頭炎、肺過誤腫、肺分画
症、先天性嚢胞性腺腫様奇形(CCAM)および嚢胞性線維症からなる群から選択される
肺障害が挙げられるがこれらに限定されない肺障害の治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、全身エリテマトーデス、皮
膚筋炎、強皮症、全身壊死性動脈炎、皮膚壊死性細静脈炎、関節リウマチ、シェーグレン
症候群、レイノー現象、ライター症候群、関節炎、乾癬性関節炎、血清反応陰性脊椎関節
症、シェーグレン症候群、全身硬化症、皮膚筋炎/多発性筋炎、混合性結合組織病および
強直性脊椎炎からなる群から選択されるリウマチ性障害が挙げられるがこれらに限定され
ないリウマチ学的障害の治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、皮膚糸状菌症(例えば、ト
リコフィトン感染症、白癬または白癬感染症)、足白癬、爪囲炎、癜風、紅色陰癬、間擦
疹、真菌性おむつ皮膚炎、カンジダ外陰炎、カンジダ亀頭炎、外耳道炎、カンジダ症(皮
膚および粘膜皮膚)、慢性ムコカンジダ症(mucocandidiasis)(例えば、鵞口瘡および
腟カンジダ症)、クリプトコッカス症、ゲオトリクム症、トリコスポロン症(trichospor
osis)、アスペルギルス症、ペニシリウム症、フサリウム症、接合菌症、スポロトリクム
症、黒色真菌症、コクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、パラコク
シジオイデス症、シュードアレシェリア症(pseudallescheriosis)、菌腫、真菌性角膜
炎、外耳道真菌症、ニューモシスチス症および真菌血症等の真菌性疾患、アシネトバクタ
ー(Acinetobacter)感染症、放線菌症、アフリカ睡眠病、AIDS(後天性免疫不全症
候群)、アメーバ症、アナプラズマ症、炭疽、溶血性アルカノバクテリア感染症、アルゼ
ンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス(atrovirus)感染症、バ
ベシア症、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)感染症、細菌性肺炎、細菌性腟症(
BV)、バクテロイデス感染症、バランチジウム症、アライグマ回虫(Baylisascaris)
感染症、BKウイルス感染症、黒色砂毛症、ブラストシスチス・ホミニス(Blastocystis
hominis)感染症、ボレリア(Borrelia)感染症、ボツリヌス中毒(および乳児ボツリヌ
ス中毒)、ブラジル出血熱、ブルセラ症、バークホルデリア(Burkholderia)感染症、ブ
ルーリ潰瘍、カリシウイルス(Calcivirus)感染症(ノロウイルスおよびサポウイルス)
、カンジダ症、ネコひっかき病、蜂巣炎、シャーガス病(アメリカトリパノソーマ症)、
軟性下疳、水痘、クラミジア、コレラ、黒色分芽菌症、肝吸虫症、クロストリジウム・デ
ィフィシル(Clostridium difficile)、コクシジオイデス症、コロラドダニ熱(CTF
)、感冒(急性ウイルス鼻咽喉炎;急性鼻感冒)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD
)、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症、皮膚幼虫移行症(ous larva migran
s)(CLM)、デング熱、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、裂頭条虫症、メ
ジナ虫症、エボラ出血熱、エキノコックス症、エーリキア症、蟯虫症(蟯虫感染症)、腸
球菌(Enterococcus)感染症、エンテロウイルス感染症、発疹チフス、伝染性紅斑、突発
性発疹、肥大吸虫症、肝蛭症、致死性家族性不眠症(FFI)、フィラリア症、フソバク
テリウム(Fusobacterium)感染症、ガス壊疽(クロストリジウム筋壊死)、ゲオトリク
ム症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、ジアルジア症
鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径肉芽腫(鼠径リンパ肉芽腫症)、A群連鎖球菌感染症、B群
連鎖球菌感染症、インフルエンザ菌(ヘモフィルス(Haemophilus) influenzae)、手足
口病(HFMD)、ハンタウイルス肺症候群(HPS)ヘリコバクター・ピロリ(Helico
bacter pylori)感染症、溶血性尿毒症(ic-uremic)症候群(HUS)、腎症候性出血熱
(HFRS)、A型、B型、C型、D型、E型肝炎、単純ヘルペス、ヒストプラスマ症、
鉤虫感染症、nボカウイルス感染症、ヒトewingiiエーリキア症、ヒト顆粒球性ア
ナプラズマ症(HGA)、ヒト顆粒球性アナプラズマ症(HGA)、ヒト単球性エーリキ
ア症、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染症、ヒトパラインフルエンザウイルス感染
症、膜様条虫症、エプスタイン・バーウイルス感染症単核球症(Mono)、インフルエ
ンザ(flu)、イソスポーラ症、川崎病、角膜炎、キンゲラ・キンゲ(Kingella kinga
e)感染症、クールー病、ラッサ熱、レジオネラ症(在郷軍人病)、レジオネラ症(ポン
ティアック熱)、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスピラ症、リステリア症、ライ
ム病(ライムボレリア症)、リンパ管フィラリア症(象皮症)、リンパ球性脈絡髄膜炎、
マラリア、マールブルグ出血熱(MHF)、麻疹、類鼻疽(ホイットモア病)、髄膜炎、
髄膜炎菌性疾患、横川吸虫症、微胞子虫症、伝染性軟属腫(MC)、ムンプス、発疹熱(
地方病性チフス)、マイコプラズマ肺炎、菌腫、ハエ幼虫症、新生児結膜炎(新生児眼炎
)、(新)変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD、nvCJD)、ノカルジア症
、オンコセルカ症(河川盲目症)、パラコクシジオイデス症(南アメリカブラストミセス
症)、肺吸虫症、パスツレラ症、頭部シラミ寄生症(アタマジラミ)、体部シラミ寄生症
(コロモジラミ)、ケジラミ症(陰部のシラミ、ケジラミ)、骨盤内炎症性疾患(PID
)、百日咳(Pertussis/Whooping cough)、ペスト、肺炎球菌感染症、ニューモシスチス
肺炎(PCP)、肺炎、灰白髄炎、灰白髄炎、プレボテラ(Prevotella)感染症、原発性
アメーバ性髄膜脳炎(mary amoebic meningoencephalitis)(PAM)、進行性多巣性白
質脳症、オウム病、Q熱、狂犬病、鼠咬熱、RSウイルス感染症、リノスポリジウム症、
イノウイルス感染症、リケッチア感染症、リケッチア痘症、リフトバレー熱(RVF)、
ロッキー山紅斑熱(RMSF)、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、SARS(
重症急性呼吸器症候群)、疥癬、住血吸虫症、敗血症、赤痢菌感染症(細菌性赤痢)、帯
状疱疹(Shingles/Herpes zoster)、天然痘(痘瘡)、スポロトリクム症、ブドウ球菌食
中毒、ブドウ球菌感染症、糞線虫症、梅毒、条虫症、tanus(開口障害)、白癬性毛
瘡(かみそり負け)、頭部白癬(頭皮の白癬)、体部白癬(体の白癬)、股部白癬(いん
きんたむし)、手白癬(Tinea manuum)(手の白癬)、黒癬、爪白癬(爪真菌症)、黒な
まず(癜風)、トキソカラ症(内臓幼虫移行症(VLM))、トキソプラズマ症、旋毛虫
症、トリコモナス症、鞭虫症(鞭虫感染症)、結核、野兎病、ウレアプラズマ・ウレアリ
チカム(Ureaplasma urealyticum)感染症、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、ウ
イルス性肺炎、西ナイル熱、白色砂毛(白癬(Tinea blanca))、偽結核菌感染症、エル
シニア感染症、黄熱ならびに接合菌症からなる群から選択される感染症が挙げられるがこ
れらに限定されないヒトにおける感染症の治療に用いることができる。
別の一実施形態において、本発明のベクターおよび方法は、哺乳動物における1つまた
は複数の疾患の治療に用いることができる。一態様において、哺乳動物はヒトである。別
の一態様において、哺乳動物は非ヒト動物である。本発明の教示するところを用いて治療
できる様々な疾患を容易に企図することができる。これらの疾患として、慢性腎疾患、変
形性関節症、腫瘍、ウイルス性上気道感染症、ネコ形質細胞口内炎、ネコ好酸球性肉芽腫
、ネコ白血病ウイルス感染症、イヌジステンパー感染症、全身真菌性感染症、心筋症、ム
コ多糖症VII型および感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一態様において、治療される疾患は、動物における感染症であり、そのような感染症と
して、ウシ呼吸器疾患、ブタ呼吸器疾患、トリインフルエンザ、トリ伝染性気管支炎、ウ
シ海綿状脳症、イヌリーシュマニア症、慢性消耗性疾患、ヒト免疫不全ウイルス(HIV
)、肝炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、ブタコレラ、包虫(Echinococcus)、地方病
性肺炎、FIP、口蹄疫、ヤーグジークテ、マエディビスナ、動物の乳腺炎、ミクロスポ
ルム・カニス(Microsporum canis)、伝染性膿痂疹(Orf)(動物疾患)、小反芻獣疫ウ
イルス、ポックス疾患、オウム類嘴羽毛病(Psittacine beak and feather disease)、
狂犬病、地中海熱(ブルセラ症)またはバング病または波状熱、マルタ熱、感染性流産、
流行性流産、サルモネラ食中毒、腸パラチフス(paratyphosis)、細菌性赤痢、偽性結核
、ペスト、致死性の発熱、結核、ビブリオ(Vibrios)、回旋病、ワイル病(レプトスピ
ラ症)またはカニコラ熱、出血性黄疸(レプトスピラ・イクテロヘモラジア(Leptospira
icterohaemorrhagiae))、酪農従事者熱(dairy worker fever)(L.ハージョ(L. h
ardjo))、回帰熱、ダニ媒介性回帰熱、スピロヘータ熱、放浪者熱(vagabond fever)
、飢餓熱、ライム関節炎、バンワース症候群(ライム(lime)病)、ダニ媒介性髄膜多発
神経炎、慢性遊走性紅斑、ビブリオ症、大腸菌感染症(Colibacteriosis)、大腸菌毒血
症(colitoxemia)、肺結核(white scours)、ブタの腸浮腫、腸パラチフス、ブドウ球
菌食物中毒症、ブドウ球菌胃腸炎、イヌコロナウイルス(CCV)またはイヌパルボウイ
ルス腸炎、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、伝播性胃腸炎(TGE)ウイルス、ハーゲマンレ
ッドマウス(redmouth)病(ERMD)、伝染性造血器壊死症(IHN)、ブタアクチノ
バチルス(Actinobacillus)(ヘモフィルス(Haemophilus))胸膜肺炎、ハンセン病、
ストレプトトリックス症、ヒツジの糸状菌皮膚炎、偽性鼻疽、ホイットモア病、フランシ
ス病、アブ熱(deer-fly fever)、野兎病、オハラ(O'Hara)病、連鎖桿菌熱、ヘーヴァ
ヒル熱、流行性関節炎紅斑症、鼠毒、運送または輸送熱(Shipping or transport fever
)、出血性敗血症、鳥類病、オウム病、クラミジア症、北アメリカブラストミセス症、シ
カゴ病、ギルクリスト病、ネコひっかき病、良性リンパ細網症、良性非細菌性リンパ節炎
、細菌性血管腫症、細菌性肝臓紫斑病、Q熱、バルカンインフルエンザ(influenza/ gri
ppe)、屠殺場熱(abattoir fever)、ダニ媒介熱、肺リケッチア症、アメリカチックチ
フス、ダニ媒介性チフス熱、水疱性リケッチア症、キューガーデンズ紅斑熱、ノミ媒介性
チフス熱、地方病性チフス熱、都市チフス、白癬、皮膚糸状菌症、白癬症、白癬、小胞子
菌症(Microsporosis)、いんきんたむし、足部白癬、スポロトリクス・シェンキィ(Spo
rothrix schenckii)、二形性真菌、クリプトコッカス症およびヒストプラスマ症、良性
上皮性サル痘、BEMP、サルヘルペスウイルス、サルB疾患、ベネズエラウマ脳炎、C
型嗜眠性脳炎、黄熱、黒色嘔吐、ハンタウイルス肺症候群、韓国型出血熱、流行性腎症、
流行性出血熱、出血性糸球体腎炎、リンパ球性脈絡髄膜炎、カリフォルニア脳炎/ラクロ
ス脳炎、アフリカ出血熱、ミドリザルまたはサバンナモンキー疾患、恐水病、リッサ、感
染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、麻疹、はしか、ブタおよびウマインフルエンザ、家
禽ペスト、ニューカッスル病、ピロプラズマ病、トキソプラズマ症、アフリカ睡眠病、ガ
ンビア・トリパノソーマ症、ローデシア・トリパノソーマ症、シャーガス病、シャーガス
・マザ(Chagas-Mazza)病、南アメリカ・トリパノソーマ症、赤痢アメーバ、バランチジ
ウム症、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、皮膚リーシュマニア症:チクレロ潰瘍
、エスプンディア、ピアンボルス(pianbols)、ウタ(uta)および横痃(buba)(アメ
リカ);東洋瘤腫、アレッポ腫(Aleppo boil)(旧世界);バグダッド腫(Bagdad boil
)、デリー腫(Delhi boil)、バウル潰瘍、内臓リーシュマニア症:カラアザール、微胞
子虫症、アニサキス症、旋毛虫症、住血線虫症、好酸球性髄膜炎または髄膜脳炎(広東住
血線虫(A. cantonensis))、腹部住血線虫症(コスタリカ住血線虫(A. costaricensis
))、鉤虫症、アメリカ鉤虫症、鉤虫病、毛細虫症、糸状虫症(Brugiasis)、トキソカ
ラ症、エソファゴストム症、糞線虫症、毛様線虫症、回虫症、裂頭条虫症、孤虫症、包虫
症、包虫病、包虫(Echinococcus)顆粒病、嚢胞性包虫症、条虫感染症、住血吸虫その他
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
同様に、感染性の病原体に起因する悪性疾患の治療も企図される。このような疾患の例
として、骨肉腫、白血病、リンパ腫、EBVに起因するバーキットリンパ腫、ラウスレト
ロウイルスに起因するラウス肉腫、ヘルペスウイルス8型に起因するカポジ肉腫、HTL
V−Iレトロウイルスに起因する成人T細胞白血病またはHTLV−IIに起因するヘア
リー細胞白血病ならびに感染病原体およびウイルスに起因する多くの他の腫瘍および白血
病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態において、上述の疾患のうち1つまたは複数の治療に用いられる1つまたは
複数のタンパク質は、エリスロポエチン、グレリン、オステオプロテジェリン、RANK
L、RANKLデコイ、TNF−αアンタゴニスト、IL−1アンタゴニスト、G−CS
F、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、アンジオスタチン、エンドスタチン、TN
F−α、PP1DCY−LSRLOC、β−グルクロニダーゼおよびIL−12を含むが
これらに限定されない。別の一実施形態において、本発明の1つまたは複数のタンパク質
は、IL−1、IL−2、IL−12、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IL
−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニット、IL−15、IL−18
、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、IFN−α、IF
N−γ、IFN−α1、IFNα2、IL−15−R−α、CCL3(MIP−1a)、
CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(リンホタクチン)、CX
CL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP−3b)、CXCL9(MIG
)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF−1)、CCL21(6Cki
ne)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b
−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、TNF−α、dnFADD、B
CG、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1アンチセンスオリゴヌクレオチド
、TGFbRII DN、ICOS−LおよびS100を含むがこれらに限定されない。
一実施形態において、開示されている疾患のうち1つまたは複数を患う哺乳動物に投与
されるベクターは、アデノウイルスベクターである。一実施形態において、ベクターは、
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む。一態様において、遺伝子スイッチ
は、EcRに基づく遺伝子スイッチである。別の一実施形態において、遺伝子スイッチを
コードするポリヌクレオチドは、第一のプロモーターの制御下にある第一の転写因子配列
と、第二のプロモーターの制御下にある第二の転写因子配列とを含み、前記第一の転写因
子配列および前記第二の転写因子配列によってコードされたタンパク質同士が相互作用し
て、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する。一態様におい
て、リガンドは、ジアシルヒドラジンである。別の一態様において、リガンドは、RG−
115819、RG−115932およびRG−115830から選択される。さらにま
た別の一態様において、リガンドは、アミドケトンまたはオキサジアゾリンである。
別の一実施形態において、本発明は、哺乳動物における1つまたは複数のリソソーム蓄
積症の治療に用いることができる。一態様において、哺乳動物はヒトである。別の一態様
において、哺乳動物は非ヒト動物である。本発明に従って治療することのできるリソソー
ム蓄積症の例として、ポンペ病/糖原病II型、ゴーシェ病(I型、II型、III型)
、ファブリー病、ムコ多糖症II型(ハンター症候群)、ムコ多糖症VI型(マロトー・
ラミー症候群)、ムコ多糖症I型、異染性白質ジストロフィー、神経セロイドリポフスチ
ン症またはCLN6病(非定型遅発型小児性、晩期発症型異型、初期若年性、フィンラン
ド異型遅発型小児性CLN5、ヤンスキー・ビールショースキー病/遅発型小児性CLN
2/TPP1病、クッフス/成人発症型NCL/CLN4病、Northern Epi
lepsy/異型遅発型小児性CLN8、Santavuori−Haltia/小児性
CLN1/PPT病、β−マンノース症)、Batten−Spielmeyer−Vo
gt/若年性NCL/CLN3病、サンフィリポ症候群A型、サンフィリポ症候群B型、
サンフィリポ症候群C型、サンフィリポ症候群D型、MPSIハーラー症候群、ニーマン
・ピック病(A型、B型、C型、D型)、アクチベーター欠乏症/GM2ガングリオシド
ーシス、α−マンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄
積症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシ
ドーシス、ガラクトシアリドーシス(ゴールドバーグ症候群)、GM1ガングリオシドー
シス(小児性、遅発型小児性/若年性、成人/慢性)、I細胞病/ムコリピドーシスII
型、小児性遊離シアル酸蓄積症/ISSD、若年性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、クラッ
ベ病(小児発症型、晩期発症型)、ムコ多糖症障害(偽性ハーラー・ポリジストロフィー
/ムコリピドーシスIIIA型、シャイエ症候群、MPS Iハーラー・シャイエ症候群
、モルキオ症候群A型/MPS IVA、モルキオ症候群B型/MPS IVB、MPS
IXヒアルロニダーゼ欠乏症、スライ症候群(MPS VII)、ムコリピドーシスI
型/シアリドーシス、ムコリピドーシスIIIC型、ムコリピドーシスIV型)、多種ス
ルファターゼ欠損症、濃化異骨症、サンドホフ病/成人発症型/GM2ガングリオシドー
シス、サンドホフ病/GM2ガングリオシドーシス−小児性、サンドホフ病/GM2ガン
グリオシドーシス−若年性、シンドラー病、サラ病、小児性シアル酸蓄積症、テイ・サッ
クス病/GM2ガングリオシドーシス、ウォルマン病、アスパルチルグルコサミン尿症(
Asparylglucosaminuria)およびプロサポシンが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。
サンフィリポ症候群A型は、サンフィリポ症候群A型/MPS IIIAと同義であり
、サンフィリポ症候群B型は、サンフィリポ症候群B型/MPS IIIBと同義であり
、サンフィリポ症候群C型は、サンフィリポ症候群C型/MPS IIICと同義であり
、サンフィリポ症候群D型は、サンフィリポ症候群D型/MPS IIIDと同義である
ことが理解できるであろう。
一実施形態において、上述のリソソーム蓄積症のうち1つまたは複数の治療に用いられ
る本発明のベクターによって発現される1つまたは複数のタンパク質は、a−ガラクトシ
ダーゼA、アリールスルファターゼA、a−グルコシダーゼ、b−グルコシダーゼ、グル
コセレブロシダーゼ、CLN6タンパク質、CLN3を伴う若年性、N−スルホグルコサ
ミンスルホヒドロラーゼ(sulfohyrolase)(SGSH)、a−N−アセチルグルコサミ
ニダーゼ、アセチル−CoA−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチ
ルグルコサミン−6−スルファターゼ、a−L−イズロニダーゼ、アリールスルファター
ゼB、酸性スフィンゴミエリナーゼおよびイズロネート(iuduronate)スルファターゼを
含むがこれらに限定されない。
一実施形態において、開示されているリソソーム蓄積症のうち1つまたは複数を患う哺
乳動物に投与されるベクターは、アデノウイルスベクターである。一実施形態において、
ベクターは、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む。一態様において、遺
伝子スイッチは、EcRに基づく遺伝子スイッチである。別の一実施形態において、遺伝
子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第一のプロモーターの制御下にある第一の
転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下にある第二の転写因子配列とを含み、前記
第一の転写因子配列および前記第二の転写因子配列によってコードされたタンパク質同士
が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する。
一態様において、リガンドは、ジアシルヒドラジンである。別の一態様において、リガン
ドは、RG−115819、RG−115932およびRG−115830から選択され
る。さらにまた別の一態様において、リガンドは、アミドケトンまたはオキサジアゾリン
である。
別の一実施形態において、本発明は、哺乳動物における1つまたは複数の肝疾患の治療
に用いることができる。一態様において、哺乳動物はヒトである。別の一態様において、
哺乳動物は非ヒト動物である。一態様において、肝疾患は、B型肝炎である。別の一態様
において、肝疾患は、C型肝炎である。一実施形態において、本発明のベクターによって
発現されるタンパク質は、IFN−αである。別の一実施形態において、本発明のベクタ
ーによって発現されるタンパク質は、肝疾患が含むセルロプラスミンのうち1つまたは複
数である。
B型およびC型肝炎ウイルスの感染および治療のためのヒト肝臓キメラマウスモデルの
非限定的な例は、Bissig, K.D. et al., J. Clin. Investigation 120: 924 (2010)に開
示されている。ヒト肝細胞モデルの別の非限定的な例は、Yecuris(商標)(オレ
ゴン州ポートランド)によって市販されているヒト化マウスシステムである。
抗ウイルス/抗感染治療の評価に有用な脳炎モデルの非限定的な例は、O'Brien, L. et
al., J. General Virology 90: 874-882 (2009)に開示されている。
抗ウイルス/抗感染治療の評価に有用なインフルエンザモデルの非限定的な例は、Beil
harz, M.W. et al., Biochemical Biophysical Research Communications 355: 740-744
(2007)およびKoerner, I. et al., J. Virology 81: 2025-2030 (2007)に開示されている
一実施形態において、開示されている肝疾患のうち1つまたは複数を患う哺乳動物に投
与されるベクターは、アデノウイルスベクターである。別の一実施形態において、ベクタ
ーは、アデノウイルスベクターではない。別の一実施形態において、ベクターは、プラス
ミドである。一実施形態において、ベクターは、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレ
オチドを含む。一態様において、遺伝子スイッチは、EcRに基づく遺伝子スイッチであ
る。別の一実施形態において、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第一の
プロモーターの制御下にある第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下にある
第二の転写因子配列とを含み、前記第一の転写因子配列および前記第二の転写因子配列に
よってコードされたタンパク質同士が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能
するタンパク質複合体を形成する。一態様において、リガンドは、ジアシルヒドラジンで
ある。別の一態様において、リガンドは、RG−115819、RG−115932およ
びRG−115830から選択される。さらにまた別の一態様において、リガンドは、ア
ミドケトンまたはオキサジアゾリンである。
本発明は、免疫モジュレーターおよび任意でIL−12の機能を有するタンパク質を条
件的に発現させるための細胞、例えば免疫細胞およびTSCの遺伝子操作、ならびに癌ま
たは腫瘍またはその両方の治療のための治療的使用および/または適用を提供する。免疫
モジュレーターおよび任意でIL−12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する、
インビトロで遺伝子操作された免疫細胞およびTSCは、そのタンパク質の構成的産生よ
りも優れている安全な改良物である。加えて、免疫モジュレーターおよび任意でIL−1
2の発現のタイミングおよびレベルを制御することが可能であることは、治療の有効性の
制御の改善をもたらす。このため、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞およびTSC
は、ヒトまたは非ヒト生物における癌または腫瘍の治療のための治療薬として、薬学的組
成物へと製剤化することができる。または、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞、T
SCまたはそのサブセットの集団を、免疫モジュレーターおよび任意でIL−12タンパ
ク質の産生をヒトまたは非ヒト生物の体内の特定の領域(正常組織、癌または腫瘍)に条
件的に送達するための媒体として用いることもできる。免疫細胞は自己性または非自己性
の樹状細胞であってよい。樹状細胞は骨髄から、または末梢血循環から単離することがで
きる。ヒト患者では、樹状細胞の集団を、白血球画分を単離して取り出し、他の血液成分
は患者に再注入する白血球フェレーシス手順を介して単離してもよい。
別の態様において、樹状細胞は、ヒト造血幹細胞に対して、免疫モジュレーターの機能
を有するタンパク質および任意でIL−12の機能を有するタンパク質を発現する本発明
のベクターをトランスフェクトさせ、トランスフェクトされた幹細胞を分化させて樹状細
胞を得ることによって調製することもできる。米国特許第6,734,014号を参照。
1つの態様においては、VP16−RXRおよびGal4−EcRのコード配列がEM
CV配列内リボソーム進入部位(IRES)配列によって隔てられ、アデノウイルスシャ
トルベクター中にヒトユビキチンCプロモーターの制御下にあるように挿入された、遺伝
子スイッチを含む核酸アデノウイルスベクターを提供する。例えば、IRES配列によっ
て隔てられ、合成誘導性プロモーターの制御下に配置された、IL12のp40およびp
35サブユニットのコード配列を、ユビキチンCプロモーターの上流に挿入する。別の例
において、合成誘導性プロモーターの制御下に配置されたTNF−αのコード配列は、ユ
ビキチンCプロモーターの上流に挿入される。
別の態様において、本発明は、大腸菌BJ5183細胞内でアデノウイルス骨格(Ad
Easy1)と組み換えた2つの融合タンパク質の転写単位(VP16−RXRおよびG
al4−EcR)および誘導性IL−12またはTNF−αサブユニットを有するシャト
ルベクターを提供する。組換えクローンを検証した後に、rAd.RheoIL12ゲノ
ムを有するプラスミドをXL10−Gold細胞において増殖させた上で精製し、消化し
てプラスミド骨格から分離させ、HEK293細胞またはCHO細胞へのトランスフェク
ションによってパッケージングする。
濃度を増加させるためのベクター精製は、密度勾配精製(例えば、塩化セシウム(Cs
Cl))またはクロマトグラフィー技法(例えば、カラムまたはバッチクロマトグラフィ
ー)等、任意の適切な方法により達成することができる。例えば、本発明のベクターは、
2または3回のCsCl密度勾配精製段階に付すことができる。ベクター、例えば、複製
欠損アデノウイルスベクターは、望ましくは、アデノウイルスに感染した細胞を溶解する
段階と、ライセートをクロマトグラフィー樹脂にアプライする段階と、クロマトグラフィ
ー樹脂からアデノウイルスを溶出する段階と、アデノウイルスを含有する画分を収集する
段階とを含む方法を用いて、複製欠損アデノウイルスベクターに感染した細胞から精製さ
れる。
1つの特定の態様においては、その結果得られた一次ウイルス株をHEK293細胞ま
たはCHO細胞の再感染によって増幅し、CsCl密度勾配遠心法によって精製する。
1つの態様において、免疫モジュレーター、例えばTNF−αおよび/またはIL−1
2遺伝子は、野生型遺伝子配列である。別の態様において、免疫モジュレーター、例えば
TNF−αおよび/またはIL−12遺伝子は、改変された遺伝子配列、例えば、キメラ
配列または好ましいコドンを用いるように改変された配列である。
1つの態様において、免疫モジュレーター、例えばTNF−αおよび/またはIL−1
2遺伝子は、ヒト野生型配列である。別の態様において、配列は野生型ヒト配列に対して
少なくとも85%同一であり、例えば、野生型ヒト配列に対して少なくとも90%、95
%または99%同一である。さらなる態様において、遺伝子配列はヒトポリペプチドをコ
ードする。別の態様において、遺伝子は、野生型ヒトポリペプチドに対して少なくとも8
5%同一な、例えば、野生型ヒトポリペプチドに対して少なくとも90%、95%または
99%同一なポリペプチドをコードする。
1つの態様において、IL−12遺伝子は野生型マウスIL−12配列である。別の態
様において、配列は野生型マウスIL−12に対して少なくとも85%同一であり、例え
ば、野生型マウスIL−12に対して少なくとも90%、95%または99%同一である
。さらなる態様において、IL−12遺伝子配列はマウスIL−12ポリペプチドをコー
ドする。別の態様において、遺伝子は、野生型マウスIL−12に対して少なくとも85
%同一な、例えば、野生型マウスIL−12に対して少なくとも90%、95%または9
9%同一なポリペプチドをコードする。
DCはヒト、マウスまたは他の哺乳動物由来の骨髄から単離してもよい。樹状細胞をヒ
ト、マウスまたは他の哺乳動物の血液から単離してもよい。ヒト患者では、樹状細胞の集
団を、白血球画分を単離して取り出し、他の血液成分は患者に再注入する、当技術分野で
公知であるような白血球フェレーシス手順を介して単離してもよい。1つの態様において
、DCは以前に記載された通り(Tatsumi et al., 2003)、マウス骨髄由来である。手短
に述べると、野生型マウスまたはEGFPTgマウスの骨髄(BM)を、1000単位/
mlの組換えマウス顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子および組換えmIL−4(
Peprotech, Rocky Hill, NJ)を加えた馴化培地(CM)中で
、加湿した5%COインキュベーター内において37℃で7日間培養する。続いて、C
D11cDCを、例えば、特異的MACSTMビーズを製造元(Miltenyi B
iotec, Auburn, CA)の指示に従って用いて単離する。このようにして
生成されるCD11c+DCは、形態、ならびにCD11b、CD40、CD80とクラ
スIおよびII MHC抗原の共発現に基づくと、95%を上回る純度である。
本発明の1つの態様は、ヒトまたは非ヒト生物における遺伝子療法としての癌または腫
瘍またはその両方の治療のための治療的適用に適している、免疫モジュレーターおよび任
意でIL−12の機能を有するタンパク質を条件的に発現する、遺伝子操作された免疫細
胞およびTSCを提供する。1つの態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含む、遺
伝子操作された免疫細胞およびTSCを提供する。
別の態様において、本発明は、エクジソン受容体の少なくとも一部分を含む、遺伝子操
作された免疫細胞およびTSCを提供する。別の態様において、本発明は、エクジソン受
容体に基づく遺伝子スイッチを含む、遺伝子操作された免疫細胞およびTSCを提供する
。別の態様において、本発明は、RheoSwitchを含む、遺伝子操作された免疫細
胞およびTSCを提供する。別の態様において、本発明は、遺伝子スイッチを含む遺伝子
操作された免疫細胞およびTSC、ならびに遺伝子スイッチをモジュレートするリガンド
を含むキットを提供する。別の態様において、キットはジアシルヒドラジンリガンドをさ
らに含む。別の態様において、キットはRG−115830またはRG−115932を
さらに含む。
1つの態様において、本発明は、遺伝子操作された免疫細胞およびTSCの集団を提供
する。1つの態様においては、第7日の培養DCを、ある範囲にわたる感染多重度(MO
I)で、構成的もしくは誘導性プロモーターによって作動される免疫モジュレーターおよ
び/もしくはIL−12をコードする組換えアデノウイルスで処理するか、またはモック
の対照アデノウイルスベクター(rAdψ5)に感染させる。48時間後に、感染させた
DCを採取し、表現型に関して、ならびに免疫モジュレーターおよび/またはIL−12
の産生に関して、特異的ELISAキット(BD−PharMingen,SanDie
go,CA)を用いて、62.5pg/mlという比較的低い検出レベルで分析する。
別の態様において、本発明は、免疫モジュレーターおよび/またはIL−12の機能を
有するタンパク質を条件的に発現することができる遺伝子スイッチを有するベクター、例
えば、DNAベクターを含み、さらに活性化リガンドを含む、インビトロで遺伝子操作さ
れた免疫細胞およびTSCの集団を提供する。さらなる態様において、本発明は、遺伝子
操作されたDCを患者に投与し、続いてRG−115819、RG−115830または
RG−115932などの活性化リガンドを前記患者に投与することにより、癌、例えば
、黒色腫または神経膠腫を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は
、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αを条件的に発現するポリヌクレオチドを含む
アデノウイルスを投与する段階と、活性化リガンドを投与する段階とを含む、癌、例えば
、メラノーマまたは前立腺癌を治療する方法を対象とする。患者は癌を有するヒトであっ
ても動物であってもよい。これらの治療法ならびに製品、遺伝子操作された細胞、キット
およびリガンドは、ヒトの治療法および獣医学的な動物の治療法における用途を有する。
したがって、これらの製品および方法はヒトおよび獣医学的動物のために用いられること
を想定している。
よって、一実施形態において、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αを発現するポ
リヌクレオチドおよび活性化リガンドは、癌患者に同時投与される。活性化リガンドは、
一般に、例えば、ポリヌクレオチドの投与前後に数日にわたり投与される。免疫モジュレ
ーター、例えば、TNF−αによる全身毒性が生じる場合、副作用を抑えるために、活性
化リガンドの投与を低下またはなくすことができる。
別の一実施形態において、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αを発現するポリヌ
クレオチドおよび活性化リガンドは、1つもしくは複数のリソソーム蓄積症または1つも
しくは複数の肝疾患の患者に同時投与される。活性化リガンドは、一般に、例えば、ポリ
ヌクレオチドの投与前後に数日にわたり投与される。全身毒性が生じる場合、副作用を抑
えるために、活性化リガンドの投与を低下またはなくすことができる。
特定の実施形態において、本発明は、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αを条件
的に発現するポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与する段階と、活性化
リガンドを投与する段階とを含む、腫瘍サイズを低下させる方法を提供する。免疫モジュ
レーター、例えば、TNF−αを条件的に発現するポリヌクレオチドを含むアデノウイル
スベクターを投与する段階と、活性化リガンドを投与する段階とを含む、腫瘍形成を阻止
する方法もまた提供される。一部の実施形態において、本発明は、免疫モジュレーター、
例えば、TNF−αを条件的に発現するポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクター
を投与する段階と、活性化リガンドを投与する段階とを含む、腫瘍性障害の1つまたは複
数の症状を低下または寛解させる方法を提供する。特に、免疫モジュレーターを条件的に
発現するベクター、例えば、アデノウイルスベクターを含む組成物は、免疫モジュレータ
ーを構成的に発現するベクターと比較して、治療されている対象における全身毒性を低下
、予防または寛解することができる。
特定の実施形態において、本発明は、1つまたは複数のタンパク質を条件的に発現する
ポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与する段階と、活性化リガンドを投
与する段階とを含む、哺乳動物における1つもしくは複数の疾患または1つもしくは複数
のリソソーム蓄積症または1つもしくは複数の肝疾患を治療する方法を提供する。一部の
実施形態において、本発明は、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αを条件的に発現
するポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターを投与する段階と、活性化リガンド
を投与する段階とを含む、哺乳動物における1つもしくは複数の疾患または1つもしくは
複数のリソソーム蓄積症または1つもしくは複数の肝疾患の1つまたは複数の症状を低下
または寛解させる方法を提供する。
タンパク質に基づくタグは、効果的な標的化のための高度に特異的な翻訳後修飾の必要
を低下またはなくす。有用なタンパク質に基づくタグとして、IGF2R標的(IGF2
(GILT)/IGF2遺伝子操作)、トランスフェリン受容体標的(トランスフェリン
、TfR標的ペプチド)およびTatタンパク質(細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカ
ン(HSPG)が、Tatの内部移行を媒介する)が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。
タグとして用いることのできるリソソームを標的とする他のタンパク質として、ビタミ
ンD結合タンパク質、葉酸結合タンパク質、ラクトトランスフェリン、性ホルモン結合グ
ロブリン、トランスサイレチン、プロサポシン、レチノール結合タンパク質、Apoリポ
タンパク質B、Apoリポタンパク質E、プロラクチン、受容体関連タンパク質(一実施
形態において、HNEL配列を欠く)、天然のトランスフェリンおよび変異体トランスフ
ェリン(例えば、K225E/R651A変異体またはK225E/K553A変異体)
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態において、発現構築物は、レポーター配列、局在タグ配列および検出タグ配
列のうち1つまたは複数もコードする。本発明の組成物または該組成物を用いる方法は、
腫瘍性細胞または腫瘍のインビボにおける増殖を排除、低下、阻害または制御する化学療
法薬(単数または複数)と組み合わせてよい(例えば、組み合わせた治療計画を提供する
ために)ことをさらに理解できるであろう。本明細書において、用語「化学療法薬」また
は「化学療法」は、インビボで腫瘍増殖を治療または予防するために投与される任意の治
療化合物を意味すると規定される。特に、本発明と適合性の化学療法薬は、悪性細胞の増
殖を低下または遅延させるために用いられる小分子等の「伝統的」化学療法薬と、抗体、
サイトカイン、アンチセンス分子等のより最近開発された生物製剤の両方を含む。
一態様において、本発明は、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αおよび/または
IL−12の機能を有するタンパク質を発現するインビトロで遺伝子操作された免疫細胞
もしくはTSCの集団またはベクター、例えば、アデノウイルスベクターを含む、ヒトま
たは非ヒトへの投与に適した医薬組成物であって、製剤が、腫瘍内投与による投与に適し
た医薬組成物を提供する。別の一実施形態において、組成物、例えば、医薬組成物は、免
疫モジュレーター、例えば、TNF−αを条件的に発現するベクターを含む。一部の実施
形態において、組成物は、約1×10以上の粒子単位(pu)の遺伝子導入ベクターを
含む。「粒子単位」は、単一のベクター粒子である。特定の実施形態において、組成物は
、約1×10粒子単位の遺伝子導入ベクター(例えば、約1×10以上の粒子単位、
約1×10以上の粒子単位または約1×10以上の粒子単位)を含む。他の実施形態
において、組成物は、約1×1010以上のpu、1×1011以上のpu、1×10
以上のpu、1×1013以上のpu、1×1014以上のpuまたは1×1015
上のpuの遺伝子導入ベクター、特に、複製欠損アデノウイルスベクター等のウイルスベ
クターを含む。組成物における遺伝子導入ベクターの粒子単位数は、さらに本明細書に記
載されている通り、遺伝子導入ベクターの標準溶液(すなわち、公知の遺伝子導入ベクタ
ー濃度の溶液)の吸光度と組成物の吸光度を比較することによる等、任意の適切な公知方
法を用いて決定することができる。
本発明はさらに、RG−115819、RG−115830またはRG−115932
などの活性化リガンドを含む薬学的組成物であって、腹腔内、経口または皮下投与による
投与に適している組成物も提供する。
本発明の組成物、例えば、遺伝子操作されたDC、ベクター(例えば、アデノウイルス
ベクター)または活性化リガンドを含む組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む
ことができる。担体は、遺伝子操作された樹状細胞、遺伝子導入ベクターまたは活性化リ
ガンドに適切な任意の担体となることができる。組成物に適切な担体は、米国特許第6,
225,289号明細書に記載されている。担体は、通常、液体であるが、固体または液
体および固体成分の組合せであってもよい。担体は、望ましくは、薬学的に許容される(
例えば、生理的または薬理学的に許容される)担体(例えば、賦形剤または希釈剤)であ
る。薬学的に許容される担体は、公知のものであり、容易に入手できる。担体の選択は、
少なくとも一部には、組成物中の特定の成分および組成物の投与に用いられる特定の方法
によって決定されることになる。組成物は、その他の適切な成分、特に、組成物および/
またはその最終用途の安定性を増強するための成分をさらに含むことができる。したがっ
て、本発明の組成物には多種多様の適切な製剤が存在する。
経口投与に適した製剤は、(a)水、生理食塩水またはオレンジジュース等、希釈剤に
溶解された有効量の有効成分等、液体の溶液、(b)それぞれ、所定量の有効成分を固体
または顆粒として含有するカプセル、小袋または錠剤、(c)適切な液体に懸濁した懸濁
液および(d)適切なエマルジョンを含む。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コ
ーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コ
ロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシ
ウム、ステアリン酸その他の賦形剤、着色料、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料、調味料
および薬理学的に適合性の賦形剤のうち1つまたは複数を含むことができる。トローチ剤
形態は、香味料、通常はショ糖およびアラビアゴムまたはトラガント中に有効成分を含む
ことができ、また、不活性基剤(ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビア
ゴム等)中に有効成分を含む芳香錠ならびに有効成分と共にこのような賦形剤を含有する
エマルジョン、ジェルその他は、本技術分野において公知のものである。
例えば、ベクター、免疫細胞もしくはTSCの集団またはインビトロで遺伝子操作され
た細胞を含む組成物は、緩衝剤、例えば、TRISを含むことができる。一実施形態にお
いて、組成物は、TRISおよび/またはグリセリンを含むことができる。別の一実施形
態において、組成物は、酸性化剤、陰イオン性もしくは非イオン性界面活性物質、適合性
の薬剤および/または希釈剤も含む。
吸入による投与に適した製剤は、エアロゾル製剤を含む。エアロゾル製剤は、ジクロロ
ジフルオロメタン、プロパン、窒素その他等、加圧された許容される噴霧剤中に置くこと
ができる。これは、ネブライザーまたはアトマイザーから送達するための非加圧調製物と
して製剤することもできる。
非経口投与に適した製剤は、製剤に目的レシピエントの血液との等張性を付与する抗酸
化剤、バッファー、静菌薬および溶質を含有し得る水性および非水性の等張性無菌注射溶
液ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤および保存料を含み得る水性および非水性無
菌懸濁液を含む。製剤は、アンプルおよびバイアル等、単位用量または複数用量の密封容
器に存在することができ、使用直前に注射用の無菌液体賦形剤、例えば、水の添加のみを
必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存することができる。即時用の注射溶液
および懸濁液は、前述の種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
経肛門投与に適した製剤は、乳化基剤または水溶性基剤等、様々な基剤と有効成分を混
合することにより、坐剤として調製することができる。経腟投与に適した製剤は、有効成
分と共に、本技術分野において適切であることが公知の担体を含有するペッサリー、タン
ポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡またはスプレー処方として存在することができる
その上、組成物は、追加的な治療または生物活性薬剤を含むことができる。例えば、特
定の徴候の治療において有用な治療因子が存在していてもよい。イブプロフェンまたはス
テロイド等、炎症を制御する因子は、遺伝子導入ベクターのインビボ投与に伴う肥大およ
び炎症ならびに生理的窮迫を低下させるための組成物の一部となることができる。免疫系
サプレッサーは、遺伝子導入ベクターそのものに対するまたは障害に伴う任意の免疫応答
を低下するための組成物方法により投与することができる。あるいは、免疫賦活薬は、疾
患に対する身体の自然防御を上方制御するため、組成物中に含まれ得る。さらに、免疫エ
フェクター細胞を腫瘍部位へと誘引するため、サイトカインを組成物と共に投与すること
ができる。
本明細書に記載された特定の態様において、本発明は、腫瘍を治療するための方法であ
って:
a.インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSCの集団を哺乳動物に腫瘍内投与
する段階;および
b.前記哺乳動物に対して、活性化リガンドの治療的有効量を投与する段階、
を、この順序で含む方法を提供する。
一実施形態において、活性化リガンドは、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞もし
くはTSCまたはベクター、例えば、アデノウイルスベクターを含む組成物と実質的に同
時に、例えば、細胞またはベクター組成物の投与前後の1時間以内に投与される。別の態
様においては、活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSC
またはベクターの投与時または投与後の約24時間未満のうちに投与する。さらに別の態
様においては、活性化リガンドを、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞またはTSC
またはベクターの投与時または投与後の約48時間未満のうちに投与する。別の態様にお
いて、リガンドはRG−115932である。別の態様においては、リガンドを約1〜5
0mg/kg/日の用量で投与する。別の態様においては、リガンドを約30mg/kg
/日の用量で投与する。別の態様においては、リガンドを7〜28日の期間にわたって毎
日投与する。別の態様においては、リガンドを14日の期間にわたって毎日投与する。別
の態様においては、約1×10〜1×10個の細胞を投与する。別の態様においては
、約1×10個の細胞を投与する。
1つの態様においては、IL−2およびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞
を遺伝子操作する。IL−2は、エフェクター細胞ならびに調節性T細胞、NK細胞およ
びNK−T細胞に対して強力な免疫調節作用を発揮する。細胞においてIL−2およびI
L−12を発現させることは、互いの受容体の相互アップレギュレーションをもたらし、
別々のシグナル伝達経路を理由とする補完的な生物学的作用によって異なるものを誘導す
ることが予想される。また、IL−2とIL−12の組合せは、免疫刺激の持続時間を延
長させるとともに細胞の有効用量を減少させることも予想され、これは動物による忍容性
を高めると考えられる。Dietrich 2002, Wigginton 2002, 2001, 1996およびKoyama, 199
7, McDermott and Atkins 2008;Berntsen et al 2008;Tarhini et al 2008;Heemskerk
et al 2008;Horton et al 2008を参照。IL−2のポリヌクレオチド配列は、アクセッ
ション番号U25676(ヒト);NM_008366(マウス);NM_204153
(ニワトリ);およびNM_053836(ラット)で入手可能である。IL−12のポ
リヌクレオチド配列は、アクセッション番号NM_000882(ヒトIL12A);N
M_002187(ヒトIL12B);NM_008351(マウスIL12a);NM
_008352(マウスIL12b);NM_213588(ニワトリIL12A);N
M_213571(ニワトリIL12B);NM_053390(ラットIL12a);
およびNM_022611(ラットIL12b)で入手可能である。SEQ ID NO
:13、15、21および23は、ヒトおよびマウスのIL−12ならびにそれらのサブ
ユニットをコードする。
別の態様においては、IL−18およびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞
を遺伝子操作する。IL−18はIFN−γ産生を誘導し、Tヘルパー細胞の発生および
NK活性化を促進する。加えて、IL−18はGM−CSF産生を増大させ、IL−10
産生を減少させることができる。IL−18およびIL−12を発現させることで、いず
れかのサイトカインのみを投与した場合に観察される限界が克服されると予想される。樹
状細胞におけるIL−12およびIL−18の発現は、樹状細胞にいずれかのサイトカイ
ンのみを形質導入した場合よりも力強い腫瘍抗原特異的Th1応答を刺激すると考えられ
る。
IL−12およびIL−18の両方を分泌するように遺伝子操作されたDCの腫瘍内注
射は、最も高いレベルのINF−γ産生および完全な腫瘍拒絶反応を媒介した(Tatsumi
2003)。Vujanovic, 2006を参照。Coughlin, 1998, Subleski, 206, Tatsumi, 2003、お
よびSabel, 2007;Shiratori et al 2007;Lian et al 2007;Iinuma et al 2006も参照
されたい。IL−12のポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと。IL−18
のポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号U90434(ヒト);NM_0083
60(マウス);EU747333(ニワトリ);およびAY258448(ラット)で
入手可能である。
別の態様においては、IL−15およびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞
を遺伝子操作する。IL−15は一部の生物活性をIL−2と共有しており、そのため、
これは癌に対する治療法に有用な可能性がある。IL−15はNK細胞および活性化T細
胞の増殖を刺激し、エフェクターT細胞の増量を補助する。IL−15提示はIL−12
との相乗作用により、NK細胞によるIFN−γ産生を強化することが報告されている。
Koka, 2004;Basak 2008;Lasek et al 2004。黒色腫モデルにおいてIL−15およびI
L−12の腫瘍内送達は有意な腫瘍退縮を誘導した(Lasek 1999)。IL−12のポリヌ
クレオチド配列については上記を参照のこと。SEQ ID NO:11および19はヒ
トおよびマウスのIL−15をコードする。図2および4は、ヒトおよびマウスのIL−
12およびIL−15に対して用いうるであろう発現システムのプラスミド地図である。
別の態様においては、IL−21およびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞
を遺伝子操作する。IL−21およびその受容体は、IL−2およびIL−15との配列
相同性を有している。IL−21はNK細胞の増量および成熟を促進する。NK細胞をI
L−21で処理するとIL−12受容体の顕著なアップレギュレーションがもたらされる
ため、IL−21の生物学的作用はIL−12と相乗的に作用する可能性がある。加えて
、IL−21はIL−12シグナル伝達を強化し、協調的に作用してIFN−γ産生を増
加させることができる。IL−12のポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと
。IL−21のポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号AF254069(ヒト)
;NM_021782(マウス);NM_001024835(ニワトリ);およびNM
_001108943(ラット)で入手可能である。SEQ ID NO:6、7、8、
9および17は、ヒトおよびマウスのIL−21をコードする。SEQ ID NO:1
および2は、マウスおよびヒトのIL−12およびIL−21をコードするポリヌクレオ
チド構築物である。図7および8は、それぞれヒトおよびマウスのIL−12およびIL
−21を発現させるために用いうるであろう発現システムのプラスミド地図である。
別の態様においては、TNF−αおよびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞
を遺伝子操作する。TNF−αは免疫細胞の強力なアクチベーターであり、抗腫瘍特性を
媒介する。加えて、TNF−αはIL−12と相乗的に作用して、T細胞上のIFN−γ
およびIL−12受容体の発現を強化することができる。ある動物試験において、IL−
12およびTNF−αの両方の適用は、DN8+T細胞による腫瘍浸潤、有意なIFN−
γ産生およびその後の腫瘍退縮をもたらした。Sabel, 2003, 2004, 2007, Taniguchi, 19
98, Lasek, 2000;およびXia et al 2008を参照。IL−12のポリヌクレオチド配列に
ついては上記を参照のこと。TNF−αをコードするポリヌクレオチド配列は、アクセッ
ション番号X02910(ヒト);NM_013693(マウス);およびBC1076
71(ラット)で入手可能である。
別の態様においては、IL−7およびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞を
遺伝子操作する。IL−7はIL−2ファミリーのメンバーであり、T細胞およびB細胞
のリンパ球新生(lympophoiesis)のために重要である。IL−7はナイーブT細胞およ
び記憶CD8+T細胞の生存および増殖のホメオスタシスを調節する。IL−7は腫瘍に
対するCTL生成を強化することが証明されている。加えて、IL−12はCD8+T細
胞に対して作用して、IL−7により媒介される増殖を強化する。さらに、IL−7およ
びIL−12はCD8+T細胞の細胞傷害性を相乗的に強化することが報告されている。
Mehrotra, 1995;Sharma et al 2003;Tirapu et al 2002。このため、IL−7およびI
L−12の共発現はより最適な抗腫瘍応答をもたらすことが予想される。IL−12をコ
ードするポリヌクレオチド配列については上記を参照のこと。IL−7をコードするポリ
ヌクレオチド配列は、アクセッション番号J04156(ヒト);NM_008371(
マウス);NM_001037833(ニワトリ);およびNM_013110(ラット
)で入手可能である。
別の態様においては、GM−CSFおよびIL−12を条件的に発現するように樹状細
胞を遺伝子操作する。GM−CSFは造血始原細胞の分化および増殖を調節し、樹状細胞
などの特化した抗原提示細胞(APC)の成熟において特に重要な役割を果たす。GM−
CSFはまた、樹状細胞が抗原のプロセシングを行って提示する能力も強化する。GM−
CSFはIL−12とは異なるように機能し、動物試験ではいずれも有意な抗腫瘍応答を
誘発している。IL−12(T細胞活性化)とGM−CSF(樹状細胞活性化)の組合せ
は、より強力な抗腫瘍免疫をもたらすと予想される。動物試験において、GM−CSFは
IL−12投与との併用で、複数の癌モデルにおける腫瘍成長を有意に抑制している。Wa
ng, 2001;Chang, 2007;Jean, 2004;Nair, 2006;Hill 2002;Small et al 2007。ヒト
での試験において、GM−CSF+IL−12は黒色腫患者の治療に用いられて成果を上
げているが、この両方のサイトカインの複合作用は流血中B細胞の減少を招いた。Rasmus
sen, 2003;Hansson, 2007;Abdalla, 2007。単一細胞におけるGM−CSFおよびIL
−12の共発現により、流血中B細胞の減少のような望ましくない全身作用は回避される
と考えられる。IL−12をコードするポリヌクレオチド配列については上記を参照のこ
と。GM−CSFのポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号M11734(ヒト)
;NM_009969(マウス);EU520303(ニワトリ);NM_001037
660(ラットCsf2ra);およびNM_133555(ラットCsf2rb)で入
手可能である。
別の態様においては、ケモカイン(例えば、CCL3(MIP−1a)、CCL5(R
ANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(リンホタクチン)、CCL19(MI
P−3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SD
F−1)またはCCL21(6Ckine))およびIL−12を条件的に発現するよう
に樹状細胞を遺伝子操作する。ケモカインは、種々の炎症性および非炎症性の病状におい
て白血球および他の細胞種の輸送および活性化を調節している化学誘引性サイトカインで
ある。炎症性サイトカインは炎症および組織傷害において白血球の動員を制御する。恒常
性ケモカインは、白血球(例えば、樹状細胞)を二次リンパ器官およびその内部に、さら
には造血の際に骨髄内および胸腺内に誘導するといったハウスキーピング機能を遂行する
。動物試験において、IL−12およびCXCL10を発現する2つの別個のアデノウイ
ルスの腫瘍内同時注射は、CT26マウス結腸直腸腺癌細胞株に由来する腫瘍結節の10
0%退縮を招いた。Narvaiza et al., 2000. Emtage et al., 1999は、IL2とXCL1
(リンホタクチン)、またはIL−12とXCL1のいずれかを発現する2種類の二重組
換えアデノウイルスベクターを記載している。マウスにおける乳腺癌腫瘍へのベクターの
腫瘍内注射は強力な抗腫瘍応答を誘発し、防御免疫を生じさせた。他の動物試験において
、IL−12およびCCL27を発現するアデノウイルスベクターの同時形質導入は、腫
瘍退縮および長期的な特異的免疫をもたらした。Gao et al., 2007。このため、本発明に
よるケモカインおよびIL−12の共発現は相乗的な抗腫瘍活性をもたらすことが予想さ
れる。
別の態様においては、抗血管新生サイトカイン(例えば、IP−10およびMig)お
よびIL−12を条件的に発現するように樹状細胞を遺伝子操作する。IP−10および
Migは、T細胞およびNK細胞の化学誘引物質であり、それらが血管新生を阻害する能
力はNK細胞に依存する。動物試験により、一方がIP10を発現し、もう一方がIL−
12を発現する2種類のアデノウイルスによる併用療法は顕著な抗腫瘍相乗効果をもたら
すことが示されている。Narvaiza et al., 2000。他の試験では、IP10またはMIG
および/またはIL−12を発現するアデノウイルスベクターが乳腺癌および線維肉腫の
マウスモデルに腫瘍内投与されている。IP−10またはMIGとIL−12との併用投
与は、IP10、MIG、IL−12のみ、または対照を投与した動物と比較して担癌動
物の大幅な腫瘍退縮および生存期間をもたらし、IP−10、IL12の併用が最も有効
であったことが見出された。Palmer, 2001。Mazzolini, 2003;およびHuang 2004も参照
。このため、抗血管新生サイトカインおよびIL−12の共発現は相乗的な抗腫瘍活性を
もたらすことが予想される。
IL−12を介した遺伝子治療が有効なことを実証するためには、腫瘍内注射後の様々
な時点で免疫細胞またはTSCによる免疫モジュレーターおよび/またはIL−12の産
生を作動させることを可能にする条件的cDNA発現システムを用いる。C57BL/6
マウスにおける高侵襲性B16黒色腫モデルでの結果に基づき、以下の結論が下されてい
る:1)活性化リガンドRG−115830の存在下ではDC.RheoIL12から高
レベルのIL−12が分泌されるが、リガンドの非存在下ではそうではない;2)腫瘍内
のDC.RheoIL12に基づく治療法は、処置を行う動物にDC注射から24時間以
内にRG−115830を投与する限り、腫瘍内のDC.cIL12に基づく治療法と同
等に有効である(リガンド供給からそれ以後の時点では、RG−115830療法は奏効
しない);3)DCにおけるIL−12発現は、腫瘍の微小環境におけるこれらの細胞の
生存を延長させるように思われ、腫瘍所属リンパ節に移動する腫瘍内注射したDCの数の
多さと関連している;および、4)治療法の成績と相関する最も強い免疫は、治療法によ
ってクロスプライミングを受けた腫瘍特異的CD8T細胞のレベルであり、腫瘍の微小
環境に維持される注入したDCの数ではない。全体として、これらのデータは、DC.I
L12に基づく治療法が、1型CD8T細胞エフェクターのアフェレント事象(クロス
プライミング)に対するその正の影響に基づいて奏効しており、注入したDCによって媒
介される抗腫瘍T細胞の腫瘍の微小環境への動員といった、後に起こるエフェレント事象
に対する影響によるものではない可能性が高いことを示唆している。
腫瘍内注射の前に、細胞(免疫細胞またはTSC)を、細胞の活性を刺激する因子によ
って処理してもよい。例えば、細胞を、OX40L、4−1BBL、CD40、CD40
L、GITRL、CD70、LIGHTもしくはICOS−Lを含む正の共刺激分子、ま
たは抗CTLA4、抗PD−L1もしくは抗PD−L2抗体などの負の共刺激分子などの
共刺激分子で処理してもよい。例えば、細胞(例えば、免疫細胞またはTSC)を、1つ
または複数の共刺激分子を発現する細胞、例えば、CD40リガンド分子を発現するJ5
88リンパ腫細胞とともにインキュベートしてもよい。別の態様において、細胞(免疫細
胞またはTSC)を、抗TGF−β抗体(微小環境内のTGFシグナル伝達を阻害するた
め)、抗IL10抗体、TGFbRIIDN(遺伝子改変細胞内のTGFシグナル伝達を
阻害するため)、IL−10RDN、dnFADD(細胞内の細胞死経路を阻害するため
)、抗SOCS1抗体、siRNAもしくはデコイ(細胞内の抑制性サイトカインシグナ
ル伝達を阻害するため)、または抗TGFa抗体といった、対抗性免疫抑制分子(counte
r immune suppre ssantmolecule)(寛容阻害因子(tolerance inhibitor))で処理して
もよい。
図1〜8に示されたポリヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルスを作製する。
例えば、hIL−21は、左ITRの上流の部位での制限消化によって直鎖状にしたhI
L−21発現ベクターと、HEK293細胞などの許容性細胞株内にある適切な(例えば
E3を欠失した)アデノウイルス骨格とのコトランスフェクションによって産生される。
マウス治療モデルに用いるためのマウス樹状細胞またはTSCの形質導入には、マウスの
免疫調節性遺伝子を有するアデノウイルスベクターを用いる。ヒトへの治療的適用のため
には、免疫調節性遺伝子のヒトホモログをコードするポリヌクレオチドを適切なベクター
中に挿入する。ヒトへの治療的適用のためのアデノウイルスベクターはGMP条件下で作
製する。ステージIII/IV黒色腫患者に対する治療の概要(臨床試験)の例は以下の
通りである:この場合における治療は、アデノウイルスを形質導入した樹状細胞の腫瘍内
注射、およびアクチベーター薬(リガンド)の14回の毎日の経口投与を伴う。臨床試験
の30日〜1週間前に対象のスクリーニングを行う。いかなる手順を開始する前にも、各
対象にインフォームドコンセントへの署名を求める。治験担当者はすべての対象に対して
、治験の性質、目的、継続期間、起こりうる危険、および治験中に行われる手順、ならび
に彼らの診療録がFDAによって審査される可能性があることを伝える。対象(合計16
〜20人)を4つのコホートに無作為にグループ分けする。すべてのコホートに対して、
リガンドの初回経口投与からおよそ3時間後に、最大で5×10個の形質導入樹状細胞
の腫瘍内注射を行う。4つのコホートは、投与されるリガンドの1日経口投与量に違いが
ある:例えば、コホート1=0.01mg/kg;コホート2=0.3mg/kg;コホ
ート3=1mg/kg;コホート4=3mg/kg。治療の過程では、アクチベーター薬
およびその主要な代謝産物の単回投与後および定常状態の薬物動態の評価のために、指定
された時間間隔で採血する。同じく、ウイルスベクター、RTS構成要素および腫瘍に対
する体液性および細胞性免疫応答の評価のために、指定された時点で採血する。血清生化
学検査、尿分析および血液学的検査(安全性プロフィール)のために特定の時点で尿を収
集し、血液を採取する。導入遺伝子の発現および治療法の結果としての腫瘍に対する免疫
応答について評価するために、腫瘍および/または所属リンパ節の生検標本を指定された
時点で採取する。有害事象の場合に備えて患者の早期中止に関する基準を策定し、有害事
象は記録する。有害事象および治療成績に関する患者の経過観察を1、2、3および4カ
月の時点で行う。
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、(a)免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与し、および/または(b)免疫モジュレーター、例えば本
明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するベクターを対象
に腫瘍内注射する。1つの態様においては、樹状細胞を、Ad−免疫モジュレーターベク
ター、特にAd−RTS−免疫モジュレーターベクターを発現するように遺伝子操作する
。別の態様において、対象に腫瘍内注射するベクターは、Ad−免疫モジュレーターベク
ター、特にAd−RTS−免疫モジュレーターベクターである。
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、(a)IL−12を構成的また
は条件的に発現するように遺伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ(b)IL−12を
構成的または条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注射する。1つの態様においては
、樹状細胞を、Ad−IL−12ベクター、特にAd−RTS−IL−12ベクターを発
現するように遺伝子操作する。別の態様において、対象に腫瘍内注射するベクターは、A
d−IL−12ベクター、特にAd−RTS−IL−12ベクターである。
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、(a)IL−12を構成的また
は条件的に発現するように遺伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ(b)その対象に1
つまたは複数の抗癌化学療法薬を投与する。1つの態様において、遺伝子操作された樹状
細胞は、Ad−IL−12ベクター、特にAd−RTS−IL−12ベクターを発現する
ように遺伝子操作されている。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹
状細胞を投与する前、遺伝子操作された樹状細胞を投与した後、または遺伝子操作された
樹状細胞の投与と同時に投与することができる。別の態様において、抗癌化学療法薬は、
パクリタキセル、パクリタキセルの誘導体もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミド
の誘導体もしくは類似体、スニチニブ、スニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビ
ン、またはゲムシタビンの誘導体もしくは類似体である。
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、(a)IL−12を構成的また
は条件的に発現するように遺伝子操作された樹状細胞を投与して、(b)IL−12を構
成的または条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注射し、かつ(c)対象に1つまた
は複数の抗癌化学療法薬を投与する。1つの態様においては、樹状細胞を、Ad−IL−
12ベクター、特にAd−RTS−IL−12ベクターを発現するように遺伝子操作する
。別の態様において、対象に腫瘍内注射するベクターはAd−IL−12ベクター、特に
Ad−RTS−IL−12ベクターである。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子
操作された樹状細胞およびIL−12を発現するベクターを投与する前、遺伝子操作され
た樹状細胞およびIL−12を発現するベクターを投与した後、または遺伝子操作された
樹状細胞およびIL−12を発現するベクターの投与と同時に投与することができる。1
つの態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタキセル、パクリタキセルの誘導体もしく
は類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体もしくは類似体、スニチニブ、スニチニ
ブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、またはゲムシタビンの誘導体もしくは類似体
である。
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、(a)免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与し、かつ(b)対象に1つまたは複数の抗癌化学療法薬を
投与する。1つの態様において、遺伝子操作された樹状細胞は、Ad−免疫モジュレータ
ーベクター、特にAd−RTS−免疫モジュレーターベクターを発現するように遺伝子操
作されている。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹状細胞を投与す
る前、遺伝子操作された樹状細胞を投与した後、または遺伝子操作された樹状細胞の投与
と同時に投与することができる。1つの態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタキセ
ル、パクリタキセルの誘導体もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体もし
くは類似体、スニチニブ、スニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、またはゲ
ムシタビンの誘導体もしくは類似体である。
別の態様においては、腫瘍の治療を必要とする対象に、(a)免疫モジュレーター、例
えば本明細書で開示された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するように遺
伝子操作された樹状細胞を投与して、(b)免疫モジュレーター、例えば本明細書で開示
された免疫モジュレーターを構成的または条件的に発現するベクターを対象に腫瘍内注射
し、かつ(c)対象に1つまたは複数の抗癌化学療法薬を投与する。1つの態様において
は、樹状細胞を、Ad−免疫モジュレーターベクター、特にAd−RTS−免疫モジュレ
ーターベクターを発現するように遺伝子操作する。別の態様において、対象に腫瘍内注射
するベクターは、Ad−免疫モジュレーターベクター、特にAd−RTS−免疫モジュレ
ーターベクターである。1つまたは複数の抗癌化学療法薬は、遺伝子操作された樹状細胞
および免疫モジュレーターを発現するベクターを投与する前、遺伝子操作された樹状細胞
および免疫モジュレーターを発現するベクターを投与した後、または遺伝子操作された樹
状細胞および免疫モジュレーターを発現するベクターの投与と同時に投与することができ
る。1つの態様において、抗癌化学療法薬は、パクリタキセル、パクリタキセルの誘導体
もしくは類似体、テモゾロミド、テモゾロミドの誘導体もしくは類似体、スニチニブ、ス
ニチニブの誘導体もしくは類似体、ゲムシタビン、またはゲムシタビンの誘導体もしくは
類似体である。
本発明の方法の任意のものにおいて、疾患または障害は、本出願において開示された疾
患または障害であってよい。1つの態様において、疾患または障害は、本明細書中の表1
に列記された疾患または障害である。別の態様において、疾患または障害は、本明細書中
の表3に列記された疾患または障害である。
本発明の方法の任意のものにおいて、癌または腫瘍は、本出願において開示された疾患
または障害であってよい。1つの態様において、癌または腫瘍は、本明細書中の表1に列
記された癌または腫瘍である。別の態様において、癌または腫瘍は、本明細書中の表3に
列記された癌または腫瘍である。
細胞の集団に対する免疫モジュレーターおよび/またはIL−12の発現の効果は、患
者からの生体試料におけるTh1/Tc1型サイトカイン、IFN−γの発現または活性
のレベルを測定することにより、測定することが可能である。
本発明の目的のため、本発明は、以下の段階を含む、インビトロで遺伝子操作された免
疫細胞またはTSCに基づく治療レジメンの、癌患者における有効性を判定するための方
法を提供する:
a.インビトロで遺伝子操作された細胞、例えば免疫細胞またはTSCの投与の前にヒト
患者から入手した第1の生体試料におけるインターフェロン−γ(IFN−γ)の発現の
レベルまたは活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって対照レベルを求める段
階;
b.前記患者に対して、インビトロで遺伝子操作された細胞を腫瘍内投与する段階;
c.前記患者に対して、活性化リガンドの有効量を投与する段階;
d.前記活性化リガンドの投与後の時点で前記患者から入手した第2の生体試料における
IFN−γの発現のレベルまたは活性のレベルまたはその両方を測定し、それによって試
験レベルに関するデータを求める段階;および
e.IFN−γの対照レベルを試験レベルと比較する段階であって、対照レベルに比して
の試験レベルにおけるIFN−γの発現、活性またはその両方のレベルの増加を示すデー
タにより、その治療的治療レジメンが前記患者において有効であることが指し示される段
階、を含む方法を提供する。本発明はまた、任意で、
f.生検試料を採取して、腫瘍内浸潤リンパ球(TIL)を算定する段階、および/また

g.治療に反応した腫瘍退縮を観察する段階。
「対象」という用語は、完全な昆虫、植物または動物のことを意味する。また、対象が
真菌または酵母である場合にも、リガンドは同等に働くものと予期される。本発明ととも
に用いるための動物には、脊椎動物、例えばヒト、齧歯類、サルなどの哺乳動物、および
他の動物が非限定的に含まれるが、ヒトおよびマウスがより好ましい。他の動物には、イ
ヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの獣医学的動物が含まれる。
本発明は、免疫モジュレーターを条件的に発現するベクター、例えば、複製欠損アデノ
ウイルスベクターに1つまたは複数の調節配列および必要に応じてシグナルペプチドをコ
ードする核酸を導入することにより、免疫モジュレーター、例えば、TNF−αの発現を
増加させる方法をさらに提供する。本明細書において、用語「タンパク質発現」は、転写
、転写後、翻訳および/または翻訳後を限定することなく含む。TNF−αを条件的に発
現する、前記TNF−αをコードするポリヌクレオチド配列に連結した1つまたは複数の
調節配列をさらに含むベクターを生成する段階と、活性化リガンドを添加し、これにより
免疫モジュレーターの発現を誘導する段階とを含む、免疫モジュレーター、例えば、TN
F−αのmRNAまたはタンパク質発現を増加させる方法であって、前記1つまたは複数
の調節配列および/またはシグナルペプチドが、前記TNF−αの発現を改善する方法も
また本発明に含まれる。5’非翻訳領域(5’UTR)、3’UTRまたはその両方を含
むがこれらに限定されない本発明の様々な調節領域が記載されている。一実施形態におい
て、5’UTRは、5U2である。5U2は、5’末端に隣接したエクソン2スプライス
ドナーおよび3’末端に隣接したエクソン3スプライスアクセプターに、ウシカゼイン5
’UTRの一部が続く、イヌSERCA2イントロン2と変異型推定コンセンサスpol
y−A部位との融合体である。別の一実施形態において、3’調節領域は、SV40また
はhGHのポリアデニル化シグナルである。
特定の実施形態において、本発明の方法は、また、シグナルペプチドをさらに含む、T
NF−αを条件的に発現するベクターを作製して、これによりTNF−αの天然のシグナ
ルペプチド遺伝子、例えば、TNF−α野生型シグナルペプチドを含むベクターと比較し
てTNF−αの分泌を増加させることによる、TNF−α分泌の改善を対象とする。特に
、本発明において用いられるシグナルペプチドは、コドン最適化されている。特定の一実
施形態において、シグナルペプチドは、IL−2野生型シグナルペプチド遺伝子によって
コードされる。さらに特定の一実施形態において、シグナルペプチドは、コドン最適化さ
れたIL−2シグナルペプチド遺伝子によってコードされる。
理論に拘束されることは望まないが、本発明は、一次試験エンドポイントとして客観的
な臨床反応に注目し、二次試験エンドポイントとしてクロスプライミングを受けた抗腫瘍
CD8T細胞(IFN−γを産生する)に注目した上で、インビトロで遺伝子操作され
て腫瘍内注入された免疫細胞およびTSCに基づく遺伝子療法の臨床状況における使用を
裏づけるものと考えられる。インビボでの免疫モジュレーターおよび/またはIL−12
の発現のオンおよびオフの切り替えが可能であることは、タンパク質発現のタイミングお
よびレベルの両方をリガンドの投与によって制御しうるという点、ならびに、さらに免疫
モジュレーターおよび/またはIL−12の発現のタイミングはこの方法の治療的有効性
にとって決定的に重要であると予想されるという点で、この治療に安全性および治療的制
御の要素を加えるものである。
本発明はさらに、関心対象の遺伝子が条件的に発現されるインビトロで遺伝子操作され
た細胞の、ヒトの疾患の有効かつ効率的な治療のための革新的アプローチとしての治療的
適用の裏づけともなる。
本発明は、また、細胞内に含有されていない、1つまたは複数の免疫モジュレーターの
機能(複数可)を有するタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターが、腫
瘍微小環境へと腫瘍内投与される、それを必要とする哺乳動物における腫瘍を治療、腫瘍
サイズを低下または腫瘍形成を阻止するための方法を提供する。本実施形態において、ベ
クターは、免疫細胞またはTSC等、細胞にパッケージングされることなく腫瘍に投与さ
れる。本発明はまた、細胞内に含有されていない、1つまたは複数の免疫モジュレーター
の機能(複数可)を有するタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターが、
哺乳動物に投与される、それを必要とする哺乳動物における疾患を治療するための方法を
提供する。本実施形態において、ベクターは、免疫細胞またはTSC等、細胞にパッケー
ジングされることなく腫瘍に投与される。
一実施形態において、免疫細胞、TSC、樹状細胞または骨髄樹状細胞は、ベクターと
共に腫瘍内投与されない。
別の一実施形態において、細胞内に含有されていない本発明のベクターは、腫瘍内投与
される免疫細胞、TSC、樹状細胞または骨髄樹状細胞と同時、その前またはその後に腫
瘍内投与される。
一実施形態において、細胞内に含有されていない本発明のベクターは、免疫細胞または
TSCが投与された病変と同じ病変に腫瘍内投与される。別の一実施形態において、細胞
内に含有されていない本発明のベクターは、免疫細胞またはTSCが投与された病変とは
異なる病変に腫瘍内投与される。
一実施形態において、ベクターは、各投与サイクルにおいて同一病変(複数可)に投与
される。別の一実施形態において、投与されるベクターは、各投与サイクルにおいて同一
病変(複数可)に投与されない。
一実施形態において、腫瘍は、本明細書の、例えば、表1および3に列挙されている癌
のうちいずれかの腫瘍である。別の一実施形態において、腫瘍は、メラノーマ腫瘍、結腸
直腸腫瘍、膵臓腫瘍、乳腺腫瘍、肺腫瘍または腎腫瘍である。別の一実施形態において、
腫瘍は、悪性メラノーマである。別の一実施形態において、腫瘍は、第IIIC期または
第IV期悪性メラノーマである。
一実施形態において、腫瘍内投薬量は、ベクター投与1サイクル当たり少なくとも約1
.0×10ウイルス粒子である。別の一実施形態において、腫瘍内投薬量は、ベクター
投与1サイクル当たり少なくとも約1.0×1010ウイルス粒子である。別の一実施形
態において、腫瘍内投薬量は、ベクター投与1サイクル当たり約1.0×10〜約1.
0×1013ウイルス粒子である。別の一実施形態において、腫瘍内投薬量は、ベクター
投与1サイクル当たり約1.0×1010〜約1.0×1013ウイルス粒子である。別
の一実施形態において、瘍内投薬量は、ベクター投与1サイクル当たり約1.0×10
、約1.0×1011、約1.0×1012または約1.0×1013ウイルス粒子で
ある。一実施形態において、ベクターは、AD−RTS−IL−12である。
別の一実施形態において、本発明は、細胞内に含有されていない、タンパク質(複数可
)を条件的に発現するためのベクターが哺乳動物に投与される、それを必要とする哺乳動
物における肝疾患を治療するための方法をさらに提供する。
別の一実施形態において、本発明は、細胞内に含有されていない、タンパク質(複数可
)を条件的に発現するためのベクターが哺乳動物に投与される、それを必要とする哺乳動
物におけるリソソーム蓄積症を治療するための方法をさらに提供する。
別の一実施形態において、本発明は、細胞内に含有されていない、タンパク質(複数可
)を条件的に発現するためのベクターが哺乳動物に投与される、それを必要とする非ヒト
哺乳動物における疾患を治療するための方法をさらに提供する。
活性化リガンドの投薬量は、約5〜100mg/日、例えば、約5、10、15、20
、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95または100mg/日である。一実施形態において、活性化リガンドは、少な
くとも1日1回投与される。別の一実施形態において、活性化リガンドは、1日1回で約
14日間投与される。
一実施形態において、少なくとも2通りのベクター投薬量(例えば、約1×1011
よび1×1012)が、少なくとも3通りの異なる投薬量レベルの活性化リガンド(例え
ば、約5mg/日〜約100mg/日)と組み合わせて用いられる。
当業者であれば、様々な程度の活性化リガンド活性化に対するベクターの有効血漿レベ
ルの範囲を得るため、投薬量を最適化できるであろう。
一実施形態において、対象に投与される活性化リガンドの投薬量は、腫瘍内ベクター投
与サイクル内の活性化リガンドの投与期間にわたって変化する。別の一実施形態において
、対象に投与される活性化リガンドの投薬量は、腫瘍内ベクター投与サイクル内の活性化
リガンドの投与期間にわたって減少する。別の一実施形態において、対象に投与される活
性化リガンドの投薬量は、腫瘍内ベクター投与サイクル内の活性化リガンドの投与期間に
わたって増加(増大)する。
一実施形態において、対象は、2、3、4、5、6、7、8、9または10サイクルの
腫瘍内ベクター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、3〜7サイク
ルの腫瘍内ベクター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、4〜6サ
イクルの腫瘍内ベクター投与により治療される。別の一実施形態において、対象は、5ま
たは6サイクルの腫瘍内ベクター投与により治療される。別の一実施形態において、対象
は、6サイクルの腫瘍内ベクター投与により治療される。
一実施形態において、腫瘍内ベクター投与の各サイクルは、1、2、3、4、5、6、
7、8、9または10週間間隔で実施される。別の一実施形態において、腫瘍内ベクター
投与の各サイクルは、4週間間隔で実施される。
一実施形態において、ベクターの投薬量は、腫瘍内ベクター投与の続くサイクルのそれ
ぞれにおいて変化する。別の一実施形態において、ベクターの投薬量は、腫瘍内ベクター
投与の続くサイクルのそれぞれにおいて減少する。別の一実施形態において、ベクターの
投薬量は、腫瘍内ベクター投与の続くサイクルのそれぞれにおいて増加する。
一実施形態において、ベクターおよび活性化リガンドの投薬量、腫瘍内ベクター投与サ
イクルの数および長さ、ベクター投与の頻度ならびに活性化リガンド投与の頻度は、本明
細書における実施例11の表8に説明されている。
一実施形態において、本発明は、また、薬学的に許容される担体と、細胞内に含有され
ていない本発明のベクターとを含む医薬組成物を提供する。適切な担体として、生理食塩
水、蒸留水、塩化ナトリウム溶液、塩化ナトリウムおよび無機塩の混合物またはその類似
の混合物、マンニトール、ラクトース、デキストランおよびグルコース等の材料の溶液、
グリシンおよびアルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液およびグルコース
溶液の混合物、製剤に等張性を付与する抗酸化剤、キレート化剤、バッファー、静菌薬お
よび溶質を含有し得る水性および非水性の等張性無菌注射溶液ならびに懸濁剤、溶解剤、
増粘剤、安定剤および保存料を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられるが、
これらに限定されるものではない。製剤は、アンプルおよびバイアル等、単位用量または
複数用量の密封容器に存在することができ、使用直前に注射用の無菌液体担体、例えば、
水の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存することができる。
本明細書において引用された任意の参照文献の任意の教示または示唆と本明細書との間
に矛盾がある場合は、本発明においては後者が優先するものとする。
本明細書において引用された特許、特許出願および刊行物はすべて、それらの全体が参
照により全面的に組み入れられる。
前述した態様および例示は本発明の範囲を限定することを全く意図していないこと、な
らびに、本明細書中に提示された特許請求の範囲は、すべての態様および例示を、本明細
書中に明示的に提示されているか否かにかかわらず範囲に含むことを意図していることが
理解されるべきである。
2008年10月8日に提出された、「遺伝子操作された樹状細胞および癌の治療のた
めの使用」と題する米国特許出願第12/247,738号は、その全体が参照により本
明細書に組み入れられる。2008年9月29日に提出された、「生物治療用分子の発現
のための治療用遺伝子−スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにそれらの使用
」と題する米国特許出願第12/241,018号も、その全体が参照により本明細書に
組み入れられる。
Renca腎細胞癌腫瘍モデルにおいて腫瘍特異的な免疫応答および抗腫瘍活性を誘導す
ることのできる樹状細胞の用量および最も有効なサイトカインを判定するための試験に取
り組む。
この試験には、2種類の腫瘍細胞株:RencaおよびRenca−HAを用いる。後
者の細胞株は、インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)によるRenca細胞のトラ
ンスフェクションによって作製される。Renca−HAモデルの利点は、抗原特異的T
細胞を追跡する能力である。CD8特異的とCD4特異的HA由来エピトープの両方が知
られており、使用されているからである。
具体的目標−樹状細胞の腫瘍内投与後のHA特異的免疫応答の誘導について判定する。
Renca−HA腫瘍をBALB/cマウスにおいて皮下に定着させる。腫瘍が触知可
能になった時点で、樹状細胞を腫瘍内に注射する。樹状細胞の投与を7日間隔で2回繰り
返し、合計3回の投与を行う。
以下のマウス群を用いる(各群はマウス3匹を含む):
1.非処置マウス;
2.対照プラスミドを形質導入した5×10個の樹状細胞を投与したマウス;
3.対照プラスミドを形質導入した10個の樹状細胞を投与したマウス;
4.対照プラスミドを形質導入した5×10個の樹状細胞を投与したマウス;
5.群2〜4と同じ、ただしIL−12を形質導入した樹状細胞を用いる;
6.群2〜4と同じ、ただしIL−15を形質導入した樹状細胞を用いる;および
7.群2〜4と同じ、ただしIL−21を形質導入した樹状細胞を用いる。
異なるサイトカインの組合せの影響を試験するために、
8.IL−12を形質導入した5×10個の樹状細胞とIL−15を形質導入した5×
10個の樹状細胞、
9.IL−12を形質導入した5×10個の樹状細胞とIL−21を形質導入した5×
10個の樹状細胞、および
10.IL−15を形質導入した5×10個の樹状細胞とIL−21を形質導入した5
×10個の樹状細胞
で同時にマウスを治療する。
最終投与から4日後に担癌マウスのリンパ節を収集し、細胞を、MHCクラスI適合ペ
プチド(CD8T細胞応答を検出するため)またはMHCクラスII適合ペプチド(C
D4T細胞応答を検出するため)のいずれかで刺激する。
以下のアッセイを使用する:
1.ELISPOT IFN−γおよびIL−2、
2.T細胞増殖、
3.リンパ節細胞によるTNFα、IL−10、IL−4、およびGM−CSF放出の
検出。
加えて、リンパ節細胞のNK活性を、YAC細胞を標的として評価する。
平行して、細胞を抗CD3/CD28抗体で刺激して、T細胞の非特異的応答を評価す
る。
抗原特異的な免疫応答を誘導することのできる樹状細胞の最も有効な用量を判定する。
具体的目標2−サイトカイン遺伝子を形質導入した樹状細胞の抗腫瘍活性を評価する。
サイトカインを形質導入した樹状細胞のうち、免疫応答の統計学的に有意な誘導が実証
されたもののみを以降の実験に用いる。
Renca−HA担癌マウスの処置を、具体的目標1に記載した通りに行う。以前の実
験で特異的活性を示した、サイトカインを形質導入したDCの1回分の用量を用いる。対
照として、対照アデノウイルスを形質導入した樹状細胞を用いる。統計学的有意性が達成
されるように、各群にはマウス10匹を含める。
腫瘍成長を評価する。Renca−HA腫瘍は、抗腫瘍効果の免疫学的モニタリングお
よび初期試験のために有用な免疫原性エピトープを含む。しかし、治療の抗腫瘍活性を検
証するためには、トランスフェクトされていない腫瘍細胞を用いる必要がある。このため
、上記の実験を、Renca腫瘍モデルを用いて再度行う。
ステージIIIおよびIVの黒色腫を有する患者における、RTSの制御下でhIL−1
2および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された、
アデノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の腫瘍内注射の安全性、忍容性、導入遺伝子
の機能、および免疫学的効果を、以下のような手順を通じて評価する。
ステージIIIおよびIVの黒色腫を有する試験対象が参加する試験を対象の4つのコ
ホート(群)で行い、各対象に対して、ヒトインターロイキン−12(hIL−12)お
よび1つまたは複数の他の免疫モジュレーターを発現するように遺伝子操作された、アデ
ノウイルスを形質導入した自己(それらを取り出した同じ対象に再挿入する)樹状細胞(
DC)の5×10個の用量での単回腫瘍内注射(黒色腫内)を、アクチベーター薬(活
性化リガンド)の毎日の経口投与と組み合わせて行う。この試験は、ヒトIL−12およ
び1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの誘導性発現のためのアデノウイルスベクタ
ーによりエクスビボで(細胞を対象から取り出した後に)形質導入した樹状細胞の注射を
用いる。注射したDCからの、IL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレータ
ーの産生は、アクチベーター薬(RG−115932)の経口投与によるRTSの活性化
を通じて「オンに切り替わる」(誘導される)。安全性および忍容性は、身体診察(EC
OGパフォーマンスステータスを含む)、バイタルサイン測定、血清生化学検査、尿分析
、血液学的検査、有害事象「副作用」、ならびにアデノウイルス、RTSの構成要素、お
よびアクチベーター薬に対する抗体および細胞性免疫応答を通じて評価する。経過を評価
するために、アクチベーター薬およびその主要な代謝産物の単回投与後および定常状態の
薬物動態/ADME、標的腫瘍、所属リンパ節および末梢循環の生検試料におけるhIL
−12レベルおよび細胞性免疫応答(T細胞)の分析、ならびに血清サイトカインプロフ
ァイルの測定を行う。
例えば、ステージIIIおよびIVの黒色腫を有する対象16人を4つのコホートに分
け、コホート1および2には3人を含め、コホート3および4には5人を含める。すべて
の対象に、RTSの制御下でヒトIL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレー
ターをコードするアデノウイルスベクターを形質導入した5×10個の自己DCの単回
腫瘍内注射を行う。例えば、対象に、RTSの制御下にあるヒトIL−12、およびIL
−15またはIL−21などの免疫モジュレーターをコードするアデノウイルスを形質導
入した自己DCの腫瘍内注射による投与を行う。
対象には、初回投与を第1日のDC注射のおよそ3時間前に開始し、さらに連続13日
間にわたって継続する、アクチベーター薬の1日1回経口投与(コホート1:0.01m
g/kg、コホート2:0.1mg/kg;コホート3:1.0mg/kgまたはコホー
ト4:3mg/kg)を行う。アデノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の追加注射を
、アクチベーター薬の14回の毎日の単回(1回)経口投与と組み合わせて、再治療の基
準を満たす適格対象に投与してもよい。コホート1の各群のすべての対象について、安全
性、忍容性、および樹状細胞の機能を、インビトロで遺伝子操作された樹状細胞の注射後
から最長1カ月後まで評価し、その後に対象をアクチベーター薬の次に最も高い用量を投
与するように組み入れる。安全性評価は、すべての対象において、遺伝子操作された樹状
細胞の初回注射から3カ月間にわたって継続し、毒性が観察されるか、または対象が樹状
細胞の追加注射を受ける場合には、対象の安全性をモニターするために経過観察期間を合
計6カ月間まで延長する可能性を想定しておく。
そのような試験は、黒色腫を有する対象における、経口アクチベーター薬と組み合わせ
た、アデノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の単回または多回腫瘍内注射の安全性お
よび忍容性を示す。この試験は、経口アクチベーター薬の定常状態での薬物動態/ADM
Eを与える。この試験は、アクチベーター薬の経口投与によるRTSの活性化に応答した
、標的腫瘍および/または所属リンパ節におけるアデノウイルスを形質導入した自己樹状
細胞のhIL−12の発現および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現を測定
することにより、対象におけるRTSの機能性を示す。さらに、この試験は、アクチベー
ター薬の経口投与後の、標的腫瘍、所属リンパ節および末梢循環における細胞性免疫応答
に関する、アデノウイルスを形質導入した自己樹状細胞の免疫学的効果も示す。
特にメラノーマに関して、メラノーマは例示的な癌として選択される。特に固形腫瘍中
のメラノーマは免疫治療手法に応答することが示されており、メラノーマ腫瘍には腫瘍内
注射および生検が容易に利用可能である。試験に含まれる対象は、切除不能なステージI
IIまたはIVの黒色腫を有し、それは少なくとも0.5cmの直径、任意の厚みの腫瘍
、任意の数の波及リンパ節、移行段階にある転移、または遠隔転移を有する。
RheoSwitch治療システム、hIL−12および1つまたは複数の他の免疫モ
ジュレーターを含むアデノウイルスの調製
組換えDNAを、エクスビボでのアデノウイルスベクター形質導入により、樹状細胞(
DC)に移入する。組換えDNAを用いて、腫瘍内に注射した未熟樹状細胞からヒトIL
−12(p70)および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターを発現させ、腫瘍の微
小環境におけるDCの生存を付与するとともにその成熟を刺激し、その結果、その後にそ
れらの所属リンパ節への移動をもたらす。これはTヘルパー細胞のTh1型への分化の偏
りを招くとともに、腫瘍抗原とのクロスプライミングによる腫瘍特異的細胞傷害性T細胞
の活性化も招く。
組換えアデノウイルスベクターとして用いる組換えDNAは、RheoSwitch(
登録商標)Therapeutic System(RTS)の制御下でのヒトIL−1
2および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現を可能にする。RTSはヒトユ
ビキチンCプロモーターから発現されるバイシストロン性メッセージを含み、2つの融合
タンパク質:Gal4−EcRおよびVP16−RXRをコードする。Gal4−EcR
は、酵母Gal4のDNA結合ドメイン(アミノ酸1〜147)と昆虫トウヒシントメハ
マキ(Choristoneura fumiferana)由来のエクジソン受容体のDFFドメインとの間の融
合物である。別の態様において、RTSはヒトユビキチンCプロモーターから発現される
バイシストロン性メッセージからなり、2つの融合タンパク質:Gal4−EcRおよび
VP16−RXRをコードする。Gal4−EcRは、酵母Gal4のDNA結合ドメイ
ン(アミノ酸1〜147)と昆虫コリストネウラ・フミフェラナ(Choristoneura fumife
rana)由来のエクジソン受容体のDEFドメインの間の融合体である。VP16−RXR
は、HSV−VP16の転写活性化ドメインとヒトおよびイナゴ配列由来のキメラRXR
のEFドメインの間の融合体である。これらのGal4−EcRおよびVP16−RXR
配列は、EMCV由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)によって隔てられている
。これらの2つの融合タンパク質は、Gal4−EcRが低分子薬(RG−115932
)と結合すると二量体化し、6つのGal4結合部位および合成最小プロモーターを含む
Gal4応答性プロモーターからのhIL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュ
レーターの転写を活性化する。上記のRTS転写単位はhIL−12および1つまたは複
数の他の免疫モジュレーターの転写単位の下流に位置する。この完全なRTS−hIL1
2−免疫モジュレーターカセットを、アデノウイルス5ゲノム中、E1領域が欠失してい
る部位に取り込ませる。アデノウイルス骨格はE3遺伝子も欠けている。アデノウイルス
ベクターAd−RTS−hIL−12に関するマップはUS2009/0123441A
1の図8中に示される。
この試験で用いられる組換えアデノウイルスベクターは、ウイルスベクター配列に加え
て、以下の例示的な調節エレメントを含む:ヒトユビキチンCプロモーター、EMCV由
来の配列内リボソーム進入部位、Gal4結合部位の6つのコピーを含む誘導性プロモー
ター、SP−1結合部位の3つのコピー、および合成最小プロモーター配列、SV40ポ
リアデニル化部位、ならびにヒトα−グロビン遺伝子由来の転写終結配列。他の調節エレ
メントを代替物として用いることも可能と考えられることが理解されるべきである。
例示的な組換えアデノウイルスベクターAd−RTS−hIL−12−免疫モジュレー
ターは、以下の様式で作製される。EMCV−IRES(配列内リボソーム進入部位)に
よって隔てられた受容体融合タンパク質、VP16−RXRおよびGal4−EcRのコ
ード配列を、ヒトユビキチンCプロモーター(構成的プロモーター)の制御下にあるよう
にアデノウイルスシャトルベクターに挿入する。引き続いて、IRESによって隔てられ
たhIL−12のp40およびp35サブユニット、ならびに1つまたは複数の他の免疫
モジュレーターのコード配列を、Gal4結合部位の6つのコピーを含む合成誘導性プロ
モーターの制御下にあるように配置し、ユビキチンCプロモーターおよび受容体配列の上
流に挿入する。このシャトルベクターは、左端から地図単位16(mu16)までにアデ
ノウイルス血清型5配列を含み、それからはE1配列が欠失し、RTS、IL−12およ
び1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの配列によって置き換えられている(RTS
−hIL−12)。RTS−hIL−12−免疫モジュレーターを有するシャトルベクタ
ーを、HT−1080細胞における一時的トランスフェクションにより、アクチベーター
薬依存的なIL−12および他の免疫モジュレーターの発現に関して検討する。続いて、
このシャトルベクターを、HEK293細胞内へのコトランスフェクションにより、アデ
ノウイルス骨格と組み換えて、組換えアデノウイルスAd−RTS−hIL−12−免疫
モジュレーターを得る。アデノウイルス骨格は、ゲノムの左端およびE3遺伝子にmu0
〜9.2の配列欠失を含む。このシャトルベクターおよびアデノウイルス骨格は、mu9
.2からmu16までに、それらの間の組換えおよび組換えアデノウイルスベクターの作
製を可能にする部分的に重複する配列を含む。この組換えアデノウイルスベクターはE1
およびE3領域が欠損しているため、このウイルスは正常な哺乳動物細胞における複製能
に欠損がある。しかしながら、アデノウイルス−5E1領域を含み、したがってE1機能
をトランスでもたらすHEK293細胞において、ウイルスは複製することができる。
例示的な組換えアデノウイルスベクターは以下の様式で作製される:ヒトIL12およ
び1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの誘導性発現のためのDNAエレメントを有
する直鎖状にしたシャトルベクター、ならびにアデノウイルス骨格を、HEK293細胞
にコトランスフェクトする。シャトルベクター上およびウイルス骨格上の部分的に重複す
る配列間の組換えは組換えアデノウイルスの作製をもたらし、それはHEK293細胞内
でウイルス粒子へとパッケージングされる。このHEK293細胞を、ウシ胎仔血清を含
むDMEM中で増殖させる。
提案した試験に用いるためのウイルスをCsCl密度勾配遠心法によって精製した。組
換えアデノウイルスを2回のプラーク精製に供し、その結果得られた種株を用いて、詳細
に特徴付けられたマスター細胞バンクからのHEK293細胞内での増幅により、マスタ
ーウイルスバンク(MVB)を作製する。MVBは、自己複製能型アデノウイルス(RC
A)、繁殖不能状態、マイコプラズマ、外来ウイルス、レトロウイルス、ヒトウイルスH
IV1/2、HTLV1/2、HAV、HBV、HCV、EBV、B19、CMV、HH
V−6、7および8、ウシおよびブタウイルスを含めた広範囲のcGMP/GLP遊離試
験、ヒト細胞系におけるIL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターのA
D誘導型発現による完全ベクター配列決定および機能性試験を経験している。
MVB由来のウイルスはcGMP施設で精製ウイルスの生産のために用いることができ
、これを再び、同一性、RCA、無菌性、マイコプラズマ、外来ウイルス、ウイルス粒子
と感染単位との比、宿主細胞DNA、エンドトキシンおよびタンパク質の混入、ならびに
ヒト細胞株におけるAD誘導性のIL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレー
ターの発現による機能試験を含む出荷試験に供することができる。
組換えアデノウイルスを生成するのに適した方法は、Anderson,R.D.,Gene Therapy 7:
1034-1038(2000)中にも記載されている。
宿主細胞中への組換えアデノウイルスに適した方法は、Komita,H. et al.,Cancer Gene
Therapy16: 883-891(2009)中に記載されている。
hIL−12導入遺伝子および1つまたは複数の他の免疫モジュレーター、ならびにR
heoSwitch(登録商標)Therapeutic System(RTS)を含
むアデノウイルスによる自己樹状細胞の形質導入
ヒト対象由来の樹状細胞にエクスビボで形質導入を行い、腫瘍内に注射する。このDC
を、ウイルス形質導入の前に、生存度、純度(典型的には80%を上回る細胞がDC表現
型を示す)、無菌性、マイコプラズマおよびエンドトキシンに関して特徴付ける。ウイル
ス形質導入の後に、細胞を繰り返し洗浄して、吸収されなかったウイルスをすべて除去す
る。最後の洗浄による上清を、残留ウイルスの含有量に関してPCRによって検査する。
これらのDCはエクスビボでアデノウイルスベクター(非組込み型ベクター)によって形
質導入されており、腫瘍内注射およびその後の所属リンパ節への移動後のDCの寿命は短
いため、ウイルスDNAが任意の非標的細胞内に取り込まれるとは考えられない。DCの
アデノウイルス形質導入に用いられるプロトコールは80〜90%の形質導入を生じさせ
ると予想され、極めて効率が高いと考えられる。
白血球フェレーシスによるPBMCの収集:対象に、UPCI外来のアフェレーシス部
門で標準的な90〜120分の白血球フェレーシスを行う。白血球フェレーシス手順は、
一方の腕の静脈から血液を取り出し;血液を遠心分離機(血球分離機)に通して、ここで
その成分を分離し、1つまたは複数の成分を除去し;かつ、残りの成分を対象の同じ腕ま
たは他方の腕の静脈に戻すことを含む。血液を血球分離装置によって処理する場合、1回
に対象の全血液量の15%を超えて抜き取ることはしない。血球分離機内で、血液は血漿
、血小板、白血球および赤血球に分離される。白血球(WBC)を除去し、他の成分をす
べて対象の循環中に戻す。この手順のために2つの末梢IVラインを用いるように最善を
尽くす。それが不可能であれば、中心ラインが必要になることもある。対象は医師により
、白血球フェレーシスを行うための清拭を受けなければならず、手順の前にはバイタルサ
イン(血圧を含む)について定型的なスクリーニングを受ける。
処理:収集後に、ロイカパック(leukapack)を手渡しでCPLに搬送し、直ちにEL
UTRA(商標)での遠心エルトリエーションによって処理する。これは臨床使用の妥当
性が確認された閉鎖系である。単球画分を回収し、細胞の回収および生存度を確認した後
に、それらをAastromカートリッジに移して、IL−4およびGM−CSFの存在
下で6日間培養する。すべての処理および洗浄手順を無菌条件下で行う。
初期プレーティング:1つのロイカパックから回収した単球を、トリパンブルー色素の
存在下で算定して、生細胞の数を求める。フローサイトメトリーにより単球の純度を評価
する。単球を、SOP−CPL−0166に従い、1,000IU/mLのIL−4およ
び1,000IU/mLのGM−CSFを含む無血清かつ抗生物質非含有のCellGe
nix培地中に5〜10×106個/mLで再懸濁させ、Aarstromカートリッジ
に入れる。カセット接種のためには、50mlという最小ローディング量および最小限の
細胞数が必要である。
培養:Aastromカートリッジを、未熟DC生成のための完全に閉鎖されたcGM
P適合自動培養装置であるReplicell Systemのインキュベーターに入れ
る。
未熟DCの収集:第6日目に、Aastromカートリッジをインキュベーターから取
り出し、未熟DCを収集する。細胞を1,500rpmでの遠心によって回収し、Cel
lGenix培地で洗浄し、トリパンブルー色素の存在下で算定し、形態学的および表現
型上の特徴を調べる。
生存能力:これは、トリパンブルーの存在下での血球計算盤を用いた細胞計数によって
決定する。一般に、95%を超える採取細胞は生存能力がある、すなわちトリパンブルー
色素を排除する。生存能力が70%未満である場合、未熟なDCは廃棄する。
表現型決定:培養中に生じた細胞を、顕微鏡下での血球計算盤の観察によって計数し、
仮の白血球百分率(DCとリンパ球)はトリパンブルー色素を使用して得る。白血球百分
率の確認は、フローサイトメトリー、DCとリンパ球の分離、ならびにそれらの同定の基
準としての未熟なDCの高前方および側方散乱性の使用によって行う。未熟なDCは通常
80%を超える樹状細胞形態を有する細胞を含有し、DCの表現型を有する。
IL−12p70効能アッセイ:成熟DC(mDC)が自然に、または内在性免疫シグ
ナル(例えばLPS)の添加有りもしくは無しでのCD40Lによる活性化時に、IL−
12p70を産生する能力を有することは確定している。標準IL−12p70産生アッ
セイが近年確立され、様々な条件下で作製されたDCワクチンの小サンプルまたは大ロッ
トに適用可能である。本発明の効能アッセイは、2つの異なる段階からなり、第一の段階
は、刺激物質としてのヒトCD40リガンド遺伝子で安定的にトランスフェクトしたJ5
88リンパ腫細胞とレスポンダーDCの同時インキュベーションを含む。第二の段階は、
Luminex系においてJ558/CD40L+/−LPSで刺激したDCによって分
泌されたIL−12p70のレベルに関して、これらの同時培養物由来の上清を試験する
ことを含む。この効能アッセイは18.5%のアッセイ間CV(n=30)および広いダ
イナミックレンジを有し、これは非常に異なるレベルのIL−12p70産生によって特
徴付けられる様々なDC産物の評価を容易にする。13の正常ドナーの単球から生成した
DC産物を使用して確定したアッセイの正常範囲は8〜999pg/mLであり、平均は
270pg/mLであった。
樹状細胞に関する産生および放出の基準
インビトロ生成した樹状細胞の各ロットを、微生物汚染(好気性および嫌気性細菌、真
菌およびマイコプラズマ)、およびエンドトキシンの存在に関して試験し、表現型的およ
び機能的に特徴付ける。対象に注射するすべての樹状細胞は新鮮であり、低温保存は施さ
ない。
DCの品質保証試験:前に記載したように生成したDCを、繁殖不能状態、生存能力、
純度、効能および安定性に関して評価する。細胞産物の放出に関する基準を確立し厳密に
従う。
生存能力:培養中に生じた細胞を、顕微鏡下での血球計算盤の観察によって計数し、白
血球百分率(DCとリンパ球)はトリパンブルー色素を使用して得る。この数が試験した
培養物中の生存能力のある細胞の割合となる。トリパンブルー排除による70%を超える
細胞生存能力、および単球由来DCマーカーとしてHLA−DRおよびCD86を発現す
る70%以上の細胞が放出基準を通過するのに必要とされる。DCの成熟状態を評価する
ためのCD83およびCCR7、ならびにリンパ球汚染を評価するためのCD3およびC
D19など、他のマーカーを探査分析に含めることができる。
純度:FITC−およびPE−結合mAbで染色した細胞の2色フローサイトメトリー
分析を使用して、形態的に同定したDC集団はDCに関して定義される表面抗原を発現し
、単球ならびにTおよびB細胞系抗原を欠くことを決定する。ワクチン調製のため、生成
したDCはHLA−DRおよびCD86を発現しなければならず、CD3、CD19、ま
たはCD14は発現しないはずである。mDCとして考えるために、細胞はCD83+お
よびCCR7+を発現しなければならない。
効能:DCに関する効能の指標を定義するために、本発明者らは、前に記載したように
IL−12p70を産生するそれらの能力を決定する。
繁殖不能状態:University of Pittsburgh Medical
Center Microbiology LaboratoryにおけるBD Ba
ctecシステム(Becton Dickinson Co.、Sparks、MD)
を使用して、細菌(好気性および嫌気性)および真菌培養によりDCを試験する。微生物
培養の最終結果は14日以内に入手可能である。ワクチン用途のDCの放出前に、グラム
染色を実施し、微生物の存在に関して陰性でなければならない。
核酸ハイブリダイゼーション技術に基づくGen−Probe Mycoplasma
Tissue Culture Rapid Detection System (
Gen−Probe、Inc.San Diego、CA)の使用によるマイコプラズマ
のIMCPL試験。エンドキシン試験は、Limulus Amoebocyte Ly
sate Pyrogen Plusアッセイ(Bio Whittaker、Inc.
、Walkerville、MD)を使用して実施する。エンドキシン試験は、最終産物
の採取時および放出前に細胞培養において実施する。許容可能なエンドキシンレベルは5
EU/体重1kg未満である。非形質導入および形質導入樹状細胞をさらなる分析用に低
温保存する。
すべての形質導入細胞が、導入遺伝子を発現し得ることは予想される。80%を超える
DCが形質導入されると予想される。導入遺伝子において天然コード配列が維持されるの
で、産物は生物学的活性がある。腫瘍に注射したウイルス形質導入DCは未熟なDCの表
現型であり、それらが成熟状態になるまでIL−12および1つまたは複数の他の免疫モ
ジュレーターを発現せず、したがってこの段階では、IL−12および1つまたは複数の
他の免疫モジュレーターの発現は、大部分は導入遺伝子からである。IL−12および1
つまたは複数の他の免疫モジュレーター導入遺伝子の発現は、用量依存式に小分子活性化
薬剤RG−115932によって誘導されるので、形質導入DC中の導入遺伝子発現のレ
ベルは望ましいレベルに調節することができる。ヒト対象への投与用に調製した形質導入
DCのわずか一部分を、IL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発
現の活性化薬剤依存性誘導に関してインビトロで試験することができる。IL−12およ
び1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの発現は、4ng/mlの感度でELISA
によりアッセイすることができる。
示した試験中で使用したベクターにより形質導入した細胞からの、IL−12および1
つまたは複数の他の免疫モジュレーターのインビトロ誘導は、ELISAにより測定して
、24時間で細胞10個当たり約500ngのIL−12および1つまたは複数の他の
免疫モジュレーターをもたらすことは予想される。メラノーマのマウスモデルを使用した
前臨床試験では、10個以上の形質導入DCの腫瘍内注射は効果を示す。しかしながら
、必要とされる腫瘍内注射は、これより少ない量のレベルで効果を示す可能性があり、し
たがって、5×10個の形質導入DCの注射を、より少量または多量が必要とされるか
どうか決定するための出発点として利用することができることは予想される。
例えばインビトロでは、IL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターに
関して遺伝子を有する組換えアデノウイルスベクターを形質導入したヒトおよびマウス細
胞系および初代樹状細胞は、用量依存式に活性化薬剤に応答したIL12発現の誘導を示
す。
6.3.活性化薬剤の製剤化
本明細書で使用する活性化薬剤は、以下の製剤のいずれか1つに製剤化する:
(1)100%ラブラゾール、
(2)(a)メンソール、(b)チモール、(c)ユーカリプトール、(d)アスパル
テーム、(e)サッカリンナトリウム、(f)クエン酸、(g)ペパーミントフレーバー
(peppermint flavor)、(h)クリームフレーバー(cream flavor)、(i)ラブラゾ
ールを含むリステリンフレーバーラブラゾール(Listerine flavored Labrasol)(La
titude Pharmaceuticals Inc.、USA)、
(3)ミグリオール812およびホスホリポン90G(Latitude Pharm
aceuticals Inc.、USA)、または
(4)ミグリオール812、ホスホリポン90GおよびビタミンEトコフェリルポリエ
チレングリコールサクシネート(Latitude Pharmaceuticals
Inc.、USA)。
送達
様々な濃度および特異的プロトコールを考えることはできるが、患者を治療するための
一例は、経口活性化薬剤(RG−115932)と組み合わせたRTSの制御下での、h
IL−12(ヒトインターロイキン12)および1つまたは複数の他の免疫モジュレータ
ーを発現するように操作した、滅菌生理食塩水中に5×10個の濃度に縣濁した形質導
入自己樹状細胞(AdDC)の(1回または複数回の)腫瘍内注射を受ける患者を含み得
る。
初回治療
第1日目の入院患者視察:第1日目に、(生命兆候、体重、およびECOG状態を含め
た)基本的身体検査を実施する。基本的な血清の化学的分析、尿分析、および血液検査(
安全性プロファイル)用に、尿を回収し血液を採取する。インビトロで操作した樹状細胞
の腫瘍内注射の約3時間前に、それぞれの対象に、食事の直後に活性化薬剤(コホート1
−0.01mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、および3mg/kg)を
投与する。一回用量の活性化薬剤およびその主要代謝物の薬物動態を評価するために第1
日目に指定の時間間隔(投与前、AD投与後0.5、1、1.5、2、4、6、8、12
、16、および24時間)で血液を採取する。それぞれの対象に、RTSの制御下で、h
IL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターを発現するように操作したア
デノウイルス形質導入自己樹状細胞を、5×10個の細胞の濃度で一回腫瘍内注射する
。局所注射部位の反応および/または超過敏反応に関して対象を注意深くモニタリングす
る。第2〜14日目の入院患者視察:第2〜14日目に、それぞれの対象に、食事の直後
に活性化薬剤を投与する。第2〜14日目に、生命兆候および有害事象を1日1回まとめ
る。第4日±24時間で、腫瘍および/または排出リンパ節の生検を、hIL−12およ
び細胞免疫応答を測定するために約50%の対象から除去する。第8日に、体重を測定す
る。第8日±24時間で、腫瘍および/または排出リンパ節の生検を、hIL−12およ
び1つまたは複数の他の免疫モジュレーターおよび細胞免疫応答を測定するために第4日
に実施した生検を有していなかった対象から除去する。アデノウイルスおよび/またはR
TS構成要素に対する潜在的抗体および細胞免疫応答をアッセイするために、第4日±2
4時間および第8日±24時間で血液を採取する。血清中サイトカインプロファイルも、
hIL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーター導入遺伝子を用いた処理に
よって、他のサイトカインの発現が影響を受けるかどうか決定するために得る。第8日に
、基本的な血清の化学的分析、尿分析、および血液検査(安全性プロファイル)用に、尿
を回収し血液を採取する。第8日に、活性化薬剤およびその主要代謝物の定常の薬物動態
/ADMEを評価するために指定の時間間隔(投与前、AD投与後0.5、1、2、4、
6、8、12、16、および24時間)で血液を採取する。
第14日目の入院患者視察:第14日目に、それぞれの対象に、食事の直後に活性化薬
剤を投与する。それぞれの対象に、(生命兆候、身長、体重およびECOG状態を含めた
)身体検査を施す。血清の化学的分析、尿分析、および血液検査(安全性プロファイル)
用に、尿を回収し血液を採取する。アデノウイルスおよび/またはRTS構成要素に対す
る潜在的抗体および細胞免疫応答をアッセイするために、第14日±24時間で血液を採
取する。血清中サイトカインプロファイルも、他のサイトカインの発現が影響を受けるか
どうか決定するために得る。
指定の入院患者および外来患者視察時に対象から血液を回収して、アデノウイルスおよ
びRTS構成要素に対する潜在的抗体および細胞免疫応答を測定する。ベースラインの血
清中サイトカインプロファイル用に血液を得る。AdVeGFP感染遮断型アッセイを使
用して、アデノウイルスベクターに対する抗体応答を検出する(Gambotto,Robins et al.
2004)。RTS構成要素に対する抗体応答は、患者由来の血清および発現ベクターから産
生したRTSタンパク質を使用してウエスタンブロットおよび/またはELISAによっ
て評価する。さらに、複合サイトカイン試験を、IL−12、IFN−γ、IP−10、
およびIL−2、TNF−α、IL−4、IL−5、およびIL−10などの他のTh1
/Th2サイトカインに関してLuminexにより血清において実施する。これらの抗
体およびサイトカインアッセイは、約10mlの血液を必要とする。
アデノウイルスおよび/またはRTS構成要素に対する潜在的抗体および細胞免疫応答
:指定の入院患者および外来患者視察時に対象から血液を回収して、アデノウイルスおよ
びRTS構成要素および腫瘍抗原に対する潜在的抗体および細胞免疫応答を評価する。A
dVeGFP感染遮断型アッセイを使用して、アデノウイルスベクターに対する抗体応答
を検出する(Nwanegbo,et al.2004)。RTS構成要素に対する抗体応答は、対象由来の
血清および発現ベクターから産生したRTSタンパク質を使用してウエスタンブロットお
よび/またはELISAによって評価する。さらに、複合サイトカイン試験を、IL−1
2、IFN−γ、IP−10、およびIL−2、TNFa、IL−4、IL−5、および
IL−10などの他のTh1/Th2サイトカインに関してLuminexにより血清に
おいて実施する。これらの抗体およびサイトカインアッセイは、約10mlの血液を必要
とする。
細胞免疫応答アッセイは約50〜60mlの血液を使用し、CD4およびCD8T細胞
サブセットはそこから分離する。分離したT細胞は、存在する場合AdV−およびRTS
−由来抗原によって活性化されるT細胞によるIFN−γ産生に関するELISPOTア
ッセイにおいて、空AdVベクター、AdV−RTS、またはAdV−RTS−hIL1
2−免疫モジュレーター(1つまたは複数)ベクターで形質導入した自己DCと混合する
。同様のアッセイを、腫瘍細胞などおよび/または共通メラノーマ抗原を発現するDCを
使用し実施して、腫瘍に対する初期免疫応答を評価する。必要に応じて他のアッセイを実
施することもできる。
妊娠検査:妊娠の可能性のある女性に、スクリーニング視察時および第一回目の再治療
期の入院患者視察前に、尿による妊娠検査を施す。試験は初回治療と全再治療期の両方で
活性化薬剤の投与の少なくとも72、48、24、または12時間前に実施する。尿によ
る妊娠検査が陽性である場合、したがって血清による妊娠検査によって確認を得る。妊娠
を確認した場合、対象に臨床試験を施す、または再治療期を続けることはできない。妊娠
検査は必要に応じて多数回、再度実施することができる。
併用処方薬決定:スクリーニング時、および第一回目の再治療期の入院患者視察前に、
それぞれの対象を問診して併用処方薬の一覧を与え、臨床試験およびフォローアップ期中
に起こる有害事象とのあらゆる考えられる関係を決定する。
再治療基準:限定的である有害反応なしでAdDC接種前に対象に耐性があり、考えら
れる再治療時に疾患の進行を示さない、または症状の低下を示す場合、それらに再治療を
考える。主任研究員、および治療する医師の意見において、14日連続で活性化薬剤(コ
ホート1からの最大耐性量)と併用したAdDCのさらなる(1回または複数回の)腫瘍
内注射に関する、考えられる臨床上の利点が存在する場合、以下の基準を満たす条件で対
象に再治療を与える:
1.制限毒性がない、
2.対象の疾患が安定状態である、または臨床的もしくは主観的な兆候改善を示す、お
よび
3.RheoSwitch(登録商標)Therapeutic Systemのアデ
ノウイルス構成要素に対する抗体または細胞免疫応答の痕跡がない。
導入遺伝子の機能および免疫学的効果の評価:腫瘍および関連排出リンパ節のパンチま
たは切除生検を、インビボでのhIL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレー
ターの導入遺伝子発現、および細胞免疫応答を評価するために、スクリーニング中(第−
12日〜第−7日)、臨床試験の第4日、第8日および第14日、および1カ月のフォロ
ーアップで回収する。腫瘍および関連排出リンパ節の微細針吸引生検を、インビボでのh
IL−12および1つまたは複数の他の免疫モジュレーターの導入遺伝子発現、および細
胞免疫応答を評価するために、再治療期の第−12日〜第−7日および第14日で回収す
る。生検は標準光学顕微鏡および免疫組織化学法によって評価し、腫瘍および排出リンパ
節へのT細胞の細胞浸潤を評価する。生検切片は試験の主な背景を知らない病理学者によ
って調べる。腫瘍および排出リンパ節中のDCによる内因性と誘導型IL−12発現を区
別するために、適切に設計されたプライマーを用いてRNAにおいてRT−PCRを使用
する。スクリーニング時、臨床試験の第4日、第8日および第14日、1カ月のフォロー
アップ、および再治療期の第−12日〜第−7日、第8日および第14日で、血清中サイ
トカインプロファイル用に血液を採取する。血清中サイトカインプロファイルを得て、他
のサイトカインの発現がhIL−12導入遺伝子を用いた処理によって影響を受けるかど
うか決定する。複合サイトカイン試験を、IL−12、IFN−γ、IP−10、および
IL−2、TNFa、IL−4、IL−5、およびIL−10などの他のTh1/Th2
サイトカインに関してLuminexにより血清において実施する。これらの抗体および
サイトカインアッセイは、約10mlの血液を必要とする。
活性化薬剤の一回量および定常の薬物動態:一回量薬物動態を評価するために臨床試験
の第1日目に、および活性化薬剤およびその主要代謝物の定常の薬物動態/ADMEを測
定するために臨床試験の第8日目に、指定の時間間隔(投与前、早朝投与後0.5、1、
1.5、2、4、6、8、12、16、および24時間)で血液を採取する。血漿はHP
LCによって評価して、活性化薬剤および主要代謝物の以下の定常の薬物動態終点、Cm
ax(観察した血漿濃度の最大値)、Tmax(観察した血漿濃度の最大値までの時間)
、Ctrough(0および24時間での濃度の平均として計算した、観察した血漿濃度
の最小値)、C24h(24時間での血漿濃度)、AUC24h(時間0〜24時間の血
漿濃度−時間曲線下領域)、Ke(みかけの排出速度)、およびT112(みかけの半減
期)を得る。
前述した態様および例示は本発明の範囲を限定することを全く意図していないこと、な
らびに、本明細書中に提示された特許請求の範囲は、すべての態様および例示を、本明細
書中に明示的に提示されているか否かにかかわらず範囲に含むことを意図していることが
理解されるべきである。
合理的に選択した、モジュラー遺伝子構成要素のマトリックスは、ULTRAVECT
OR(登録商標)などの組合せ導入遺伝子技術の適用によってDNA発現構築物に迅速に
構築することができる。転写、転写後、翻訳、および翻訳後プロセスに個別に影響を与え
る構築遺伝子構成要素が、遺伝子発現レベルに一緒に影響を与えることができることを実
証するために、RheoSwitch技術を、場合によっては人工5’UTR、様々な3
’Reg+ポリ(A)シグナル(SV40およびhGH)、シグナルペプチド(TNF−
αおよびIL−2)、およびコドン最適化(+/−)スキームと組み合わせて使用して、
転写増大、TNF−αを産生および分泌する細胞の能力を調節した。図11は使用したモ
ジュラーエレメントを例示し、独自の制限部位と隣接するそれぞれのモジュラーエレメン
トを図中に表して、モジュラーの組合せの正確な構築のための方法を与える。
モジュラー構築は、合成遺伝子を受け入れるように設計したDNA骨格の状態で実施し
た。アデノウイルスパッケージング用に操作したULTRAVECTOR(登録商標)骨
格の一例は図12中に示す。組合せモジュラー設計はアデノウイルスによる治療剤送達と
うまく組み合わせる。それは、本来見られる配列より短い可能性がある簡潔な制御配列の
使用を可能にするからである。
ベクターをHEK293T細胞系に一過的にトランスフェクトして、どのモジュラーの
組合せが増大したTNF−α産生をもたらすか評価した。TNF−αの発現を誘導するた
め、リガンドまたは賦形剤対照を細胞に投与した。上清を回収し、TNF−αのレベルは
ELISAによって測定した。野生型に近いベースラインを設定するために、ベクター4
3318は、UV適合野生型TNF−α5’UTR、シグナルペプチド、コード配列、お
よびSV40pA3’Regを含有する。個々に、モジュールのTNF−αシグナルペプ
チドまたは成熟タンパク質コード配列のOpt(1,2)コドン最適化の変化は、タンパ
ク質分泌の漸増的増加をもたらす(ベクター43319、43320)。TNF−野生型
5’UTRと5U25’UTRの他のモジュール置換は、分泌レベルをさらに高める(ベ
クター43322、43323)。野生型5’UTR、シグナルペプチド、およびコード
配列モジュールを、それぞれの5U2、IL2、およびTNFOptUVモジュールと置
換するとき、TNF−αの最高分泌を得る(ベクター43329)。
TNF−αの増大した分泌は細胞型依存性ではないこと実証するため、11個の実験ベ
クターをCHO−K1細胞にトランスフェクトし、2個の対照ベクターを加えた(図27
参照)。ベクター43534(図26)およびベクター43533(図25))は野生型
TNF−αモジュールを含有し、対照として働く。ベクター43534は野生型TNF−
α配列で構成され、ULTRAVECTOR(登録商標)アセンブリピボットは存在しな
い。特にULTRAVECTOR(登録商標)アセンブリピボットの存在が、TNF−α
の産生および分泌に悪影響を与えることはない。このデータセットにおいて、本発明者ら
は、SV40eまたはhGH含有ポリAモジュールのいずれかとTNF−α野生型3’R
egの置換が、TNF−α分泌の増大をもたらすことも実証する。最大TNF−α産生は
、5U2、IL2シグナルペプチド、TNFOptUV、およびhGHpAの組合せで得
た。CHO−K1細胞からのデータは、5’UTR、IL−2シグナルペプチド、および
TNFOptUVコード配列における5U2の各モジュール置換による漸増的増加の同じ
傾向を示す。興味深いことに、増加の程度は2個の細胞系で若干異なる。これは、モジュ
ールはそれぞれの細胞系において同様に機能を果たすが、特異的細胞または組織型におけ
る生理的差異が、モジュール置換効果の程度に影響を与える可能性があることを示す。各
領域中により多くのモジュールを含めるための組合せマトリックスの増大は、試験する細
胞型または組織に応じてより優れた組合せの同定を可能にする。より大きなマトリックス
中に含めることが可能な他のモジュールの例は、配列番号41〜46として含める。
動物モデルにおける治療候補の評価
癌、例えば前立腺癌または頭頸部癌を治療するための誘導性最適化TNF−α構築物の
有効性を実証するために、この疾患の頭頸部癌マウスモデルを利用することができる。悪
性ヒト頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の自然発症モデルを与えるために、Smad4の
一遺伝子ノックアウトが実証されている(PMID:19841536)。
このようなマウス系統の不在下では、ヒト由来HNSCC腫瘍細胞をヌードマウスに移
植することができる。腫瘍樹立後、最適化TNF−α構築物をアデノウイルスと共に腫瘍
内に導入することができる。様々な用量のリガンドをマウスに投与して、生成した最適化
TNF−αのレベルを制御することができる。腫瘍量を測定し、腫瘍壊死を評価して最適
化TNF−α構築物から潜在的治療候補を同定する。
治療の実施形態の実施例
操作したTNF−α□(TNF-a□lpha)導入遺伝子を、非複製アデノウイルスDNAベ
クターの腫瘍内注射によって患者に投与する。この遺伝子プログラムは、IL−2のコド
ン最適化シグナルペプチドと融合した哺乳動物コドン最適化成熟サイトカインをコードす
る。次に、導入遺伝子cds(IL−2SP+TNF−α)は野生型TNF−α5’UT
RおよびSV403’Reg+ポリ(A)シグナルと隣接し、およびその発現は注意深く
「調節した」用量の活性化剤リガンド(すなわち、ベクターVVN−43320において
具体化したDNA、図15参照)の投与によるRheoSwitch技術によって制御さ
れる。予備データは、DNAエレメントのこの組合せは、その発現の「厳重」および「非
漏出型」制御を依然与えながら、分泌TNF−αの最も考えられる誘導をもたらすことを
示す。すなわち、非誘導型、基礎レベルの発現はこの導入遺伝子形状では低い状態であり
、患者に対して制御不能な、オフターゲット効果を発揮する可能性は低い。
本発明の別の実施形態では、操作したTNF−α□(TNF-a□lpha)導入遺伝子を、高
い基礎発現と最高導入遺伝子発現の両方を示すベクターVVN−43329(図24参照
)と類似したモジュラーDNA形状で、アデノウイルスによって患者に投与する。このD
NAは、人的操作した5’U2およびhGHポリ(A)シグナル、ならびに完全哺乳動物
コドン最適化およびIL−2シグナルペプチドを利用する。患者中の全身毒性の制御は、
腫瘍内注射における低いアデノウイルスMOIの使用によって実施する。低い程度で、発
現レベルと時間制御もRheoSwitch活性化剤リガンドによって調節される。この
遺伝子産物の分布の他の制御は、急所中でのオフターゲット発現を妨げる可能性がある組
織特異的miRNA応答エレメントの組込みによって、または高い向性のアデノウイルス
カプシドを人的操作することによって実施可能である。
本発明の他の実施形態では、操作したTNF−α□(TNF-alpha□)導入遺伝子はVV
N−43328におけるDNAと同様であり(図23)、これは5’U2エレメントを介
して人工mRNAに高い安定性を与えると仮定される。しかしながら、この構築物は高分
泌にIL−2シグナルペプチドを利用せず、それはTNF−αのN’末端をコードするD
NA由来の野生型配列を保持する。理由は不明であるが、人工TNF−α□の高レベルの
分泌は、状況とは関係なく患者の状態に有害であることを十分証明することができ、一方
メタロプロテイナーゼによる「サイトカイン発散」の本来のメカニズムは、その腫瘍環境
に対する因子を限定することによって患者の毒性を制限することができる。外因性TNF
−α□の自然な発散がオフターゲット効果をさらに示す場合、その外部ドメイン部分が突
然変異により切断され天然プロテアーゼによる可溶化を妨げる可能性があり、この因子は
事実上のII型膜貫通タンパク質として細胞間接触によって活性を増強し得る。あるいは
、ベクターVVN−43328により記載される構築物と類似した導入遺伝子は、構成的
に発現されるTNF−α□および外因性プロテアーゼの切断部位を含有する突然変異した
外部ドメイン部分をコードする可能性がある。この外因性プロテアーゼは、したがって、
RheoSwitch技術制御プロモーターエレメント下で、活性化剤リガンドの存在下
でのみ発現され得る。したがって、TNF−α□の切断およびインビボ可溶性(ただし表
面発現ではない)は、モジュラー導入遺伝子エレメントによって制御される。
Ad−RTS−IL−12の抗腫瘍活性
Ad−RTS−IL−12の抗腫瘍効果を、メラノーマ、結腸直腸、膵臓、乳、肺およ
び腎臓癌の一連のマウス腫瘍モデルにおいて評価した。例示的な用量応答実験は以下に示
す。免疫応答性メスC57bl/6マウス(6〜8週齢)に、B16F0マウスメラノー
マ癌細胞を皮下接種した。腫瘍細胞接種後11日、顕微鏡で見た腫瘍節が明らかになった
ときに(腫瘍体積の平均約40mm)、マウスをそれぞれ5匹の動物の群に分けた。生
理食塩水で治療した対照、活性化剤リガンドで治療した群、Ad−RTS−mIL12(
1ee10vp)のみで治療した群、ならびに異なる用量のベクターAd−RTS−mI
L−12(1e7、1e8、1e9、5e9、1e10、5e10ウイルス粒子)および
活性化剤リガンドで治療した6群を含む9群が存在した。+リガンド群中のマウスには、
ベクター投与の1日前に、100mg/kgの活性化剤リガンド、2018 Tekla
d Global 18% Protein Rodent Diet (Harlan
Laboratories)食餌(リガンド1000mg/餌1kg)中を与えた。対
照群中のマウスには、2018 Teklad Global 18% Protein
Rodent Diet食餌を与えた。100ulのPBSに溶かした一回投与量のA
d−RTS−mIL12を、第12日に腫瘍に注射した。腫瘍体積および体重は、カリパ
ーおよび計量器を使用して2〜3日毎に測定し、対照が2000mmに達するまで動物
を追跡した。Study Log動物実験用ソフトウェアにデータをアップロードした。
図31中に示すように、1ee8vpを超えるAd−RTS−IL−12用量で相当な
抗腫瘍効果を観察した(範囲73〜99%)。試験した低用量のAd−RTS−IL−1
2、1ee7vpは抗腫瘍効果を示さなかった。活性化剤リガンドの不在下では、1ee
10vpでの高用量のAd−RTS−IL−12は効果を示さず、Ad−RTS−IL−
12と活性化剤リガンドの両方の組合せに関する要件を例証する。リガンドの治療自体は
効果を示さなかった。したがって、この試験は、活性化剤リガンドと併用しAd−RTS
−IL−12によって仲介される強力な抗腫瘍効果を例証する。
体重分析は図32中に表す。最高用量レベル(5ee10vp)のAd−RTS−IL
−12で治療した動物は第19日に一時的な体重減少を示したが、第26日までに回復し
た。他の治療群中の動物はいかなる明らかな用量応答関係も示さず、体重増加のごくわず
かな変化を観察した。
ルイス肺癌モデルにおけるAd−RTS−IL−12の有効性
メスの、6〜8週齢のC57b/6免疫応答性マウスに、マウスルイス肺癌細胞(LL
C)を皮下(s.c.)接種した。細胞接種後5日で、マウスをランダムに分類し、治療
群と対照群(n=5)、全4群、未治療(対照)、活性化剤(RG−115932)のみ
、Ad−RTS−mIL12のみ、およびAd−RTS−mIL12と活性化剤に割り当
てた。活性化剤(L)を与えたコホートには、自由に食餌(2018 Teklad G
lobal 18% Protein Rodent Diet(Harlan Lab
oratories)、活性化剤を配合した餌(1000mg/餌1kg)を与えた。A
d−RTS−mIL12のみの治療を与えたコホートまたは未治療コホートには、通常食
を与え続けた。腫瘍が28±6mmに達したときに治療を開始した。Ad−RTS−m
IL12(1e10vp/100ul、PBS中)は、腫瘍細胞接種後第6日、9日およ
び13日に腫瘍内(i.t.)注射を介してマウスに与えた。活性化剤を配合した餌(L
)は、ベクター投与の24時間前にマウスに与え始めた。それぞれのマウスの腫瘍の大き
さおよび体重は、実験の最後までカリパーおよび計量器を使用して、週に3回モニタリン
グした。マウスの腫瘍の大きさが1200mmを超えたとき実験を終了した。Stud
y Log動物実験用ソフトウェアにデータをアップロードした。
治療後の腫瘍体積は図33A中に示す。対照群と活性化剤(L)のみの群中のルイス肺
腫瘍を有するマウスは、ほぼ同様の腫瘍増殖動態を示した。3つの用量のAd−RTS−
mIL12のみが中間的な腫瘍増殖をもたらした。重要なことに、Ad−RTS−mIL
12および活性化剤(L)は、対照群と比較して顕著な腫瘍増殖阻害(78%)をもたら
した。このデータは、活性化剤の存在下においてAd−RTS−mIL12は、ルイス肺
腫瘍の増殖を阻害することを示唆する。体重は毒性の指標としてモニタリングした。実験
の過程中、大幅な体重の減少は見られなかった。
メラノーマモデルにおけるAd−RTS−IL−12の抗腫瘍活性
メスの、6〜8週齢のC57b/6免疫応答性マウスに、マウスメラノーマ癌細胞(B
16F0)を皮下(s.c.)接種した。細胞接種後10日で、マウスを治療群と対照群
(n=5)、全9群、未治療(対照)、活性化剤(L)(RG−115932)のみ、お
よびAd−RTS−mIL12のみ、ならびにAd−RTS−mIL12および異なる活
性化用量(50、100、250、500および1000mg/kg)のリガンドにラン
ダムに割り当てた。活性化剤(L)を与えたコホートには、自由にげっ歯類用食餌201
8 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet、
活性化剤を配合した餌(1000mg/餌1kg)を与えた。Ad−RTS−mIL12
のみの治療を与えたコホートまたは未治療コホートには、通常食の2018 Tekla
d Global 18% Protein Rodent Diet食餌を与え続けた
。腫瘍が56±18mmに達したときに治療を開始した。一回量のAd−RTS−mI
L12(1e10vp/100ul、PBS中)は、腫瘍細胞接種後第13日に腫瘍内(
i.t.)注射を介してマウスに与えた。活性化剤を配合した餌(L)は、ベクター注射
の24時間前にマウスに与えた。それぞれのマウスの腫瘍の大きさおよび体重は、実験の
最後までカリパーおよび計量器を使用して、週に3回モニタリングした。腫瘍の大きさが
2000mmを超えたとき実験を終了した。Study Log動物実験用ソフトウェ
アにデータをアップロードした。
治療後の腫瘍体積および体重の変化を、図34Aおよび34B中に示す。対照群と活性
化剤(L)のみの群中のメラノーマ腫瘍を有するマウスは、同様の侵襲性腫瘍増殖を示し
た。腫瘍増殖動態は、活性化剤を配合した餌には抗腫瘍活性がなかったことを示した。リ
ガンドを含まない一回量のAd−RTS−mIL12(1e10vp)を動物に与えると
、第26日にわずかな腫瘍増殖阻害(12%)を観察した。Ad−RTS−mIL12お
よび活性化剤(L)を用いた治療は、対照マウスと比較して腫瘍増殖阻害(73〜98%
)をもたらした。一回量のAd−RTS−mIL12および50mg/kgの活性化剤(
L)は、対照腫瘍と比較して有意な腫瘍減少をもたらした。特に、50mg/kgの活性
化剤を配合した餌と比較して活性化剤を配合した餌の用量が100〜1000mg/kg
から増大したとき、有意な抗腫瘍活性(90〜98%)が明らかであった。このデータは
、Ad−RTS−mIL12はメラノーマモデルにおいて活性があり、広い治療活性化剤
リガンド用量範囲を示すことを明らかに示す。体重は毒性の指標としてモニタリングした
。第13日および17日に、一時的でわずかな体重変化(<5%)が1000mg/kg
の活性化剤用量で見られた。実験の残りの過程中、大幅な体重の減少は見られなかった。
体重変化と関係がある活性化剤用量応答は見られなかった。異なる用量下でのAdRTS
−mIL12を用いた治療は、いかなる毒性のいかなる兆候もなく十分許容可能であった
結腸癌モデルにおけるAd−RTS−IL−12の抗腫瘍活性
メスの、6〜8週齢のBalb/C免疫応答性マウスに、ルシフェラーゼを発現する安
定状態のマウス結腸癌細胞(CT26Luc)を皮下(s.c.)接種した。細胞接種後
10日で、マウスを治療群と対照群(n=5)、全3群、未治療(対照)、活性化剤(L
)(RG−115932)のみ、およびAd−RTS−mIL12と活性化剤にランダム
に割り当てた。活性化剤(L)を与えたコホートには、自由に食餌2018 Tekla
d Global 18% Protein Rodent Diet(Harlan
Laboratories)、活性化剤を配合した餌(1000mg/餌1kg)を与え
た。未治療コホートには、2018 Teklad Global 18% Prote
in Rodent Diet食餌を与え続けた。腫瘍が40±17mmに達したとき
に治療を開始した。Ad−RTS−mIL12(1e10vp/100ul、PBS中)
は、腫瘍細胞接種後第11日および18日に腫瘍内(i.t.)注射を介してマウスに与
えた。活性化剤を配合した餌(L)は、ベクター注射の24時間前にマウスに与えた。そ
れぞれのマウスの腫瘍の大きさおよび体重は、実験の最後までカリパーおよび計量器を使
用して、週に3回モニタリングした。マウスの腫瘍の大きさが2000mmを超えたと
き実験を終了した。Study Log動物実験用ソフトウェアにデータをアップロード
した。
治療後の腫瘍体積および体重の変化を、図35Aおよび35B中に示す。対照群と活性
化剤(L)のみの群中の結腸癌を有するマウスは、同様の侵襲性腫瘍増殖を示した。腫瘍
増殖動態は、活性化剤を配合した餌は腫瘍増殖を阻害しなかったことを示した。2用量の
Ad−RTS−mIL12と活性化剤(L)のみは、対照マウスと比較して完全退縮およ
び腫瘍増殖阻害(100%)をもたらした。特に、5匹の動物中5匹が、Ad−RTS−
mIL12治療の結果として完全に腫瘍がなかった。Ad−RTS−mIL12治療後に
腫瘍を含まない状態になったマウスは、親CT26Luc細胞で再度攻撃した。5匹の非
投薬Balb/c動物にも、対照群としてCT26Lucを皮下接種した。対照動物は予
想通り腫瘍節を発症した。重要なことに、再攻撃後4週間で、すべての再攻撃動物におい
て腫瘍は発症しなかった。この試験は、Ad−RTS−mIL12両方によって、侵襲性
結腸癌モデルに対して強い抗腫瘍免疫性が示されたことを示す。体重は毒性の指標として
モニタリングした。実験の過程中、大幅な体重の減少は見られなかった。
膵臓癌モデルにおけるAd−RTS−IL−12の抗腫瘍活性
メスの、6〜8週齢のC57b/6免疫応答性マウスに、同系PAN02膵臓癌細胞(
ATCC)を皮下(s.c.)接種した。細胞接種後6日で、マウスを、それぞれ5匹の
動物群、4群、未治療、活性化剤(RG−115932)のみ、Ad−RTS−mIL1
2のみ、およびAd−RTS−mIL12と活性化剤にランダムに分類した。活性化剤リ
ガンドを与えたコホートには、自由に食餌2018 Teklad Global 18
% Protein Rodent Diet(Harlan Laboratorie
s)、活性化剤を配合した餌(1000mg/餌1kg)を与えた。Ad−RTS−mI
L12のみの治療を与えたコホートまたは未治療コホートには、2018 Teklad
Global 18% Protein Rodent Diet食餌を与え続けた。
マウスには、腫瘍細胞移植後第7日および14日に、1e10vp/100ul、PBS
中の用量レベルでのAd−RTS−mIL12の一回腫瘍内(i.t.)注射による治療
を施した。腫瘍の大きさは、ベクター治療の開始時にSTGTmmに平均化した。
それぞれのマウスの腫瘍の大きさおよび体重は、実験の最後まで週に3回モニタリング
した。マウスの腫瘍の大きさが600mmを超えたとき実験を終了した。膵臓腫瘍が非
常にゆっくりと増殖したので、本発明者らは実験の終了として定義した。未治療マウスに
おける腫瘍の増殖は通常通りであった。
この腫瘍モデルでは、わずかな腫瘍増殖の遅れが、活性化剤のみまたはAd−RTS−
mIL12のみのいずれかで治療したマウスにおいて示された。対照的に、すべてのAd
−RTS−mIL12治療マウスにおける腫瘍増殖は、治療を施さなかった対照マウスに
おけるそれと比較して劇的に阻害された(97%)。カリパーおよび計量器を使用し毒性
の指標として、実験を通じて体重を測定した。Ad−RTS−mIL12を注射した動物
の体重は、第12〜13日における一時的な体重減少(<5%)以外、投与後に有意な体
重減少を示さなかった。さらに、病理学的挙動(無気力、被毛の乱れ、跛行、脱水、猫背
など)はいずれの動物でも観察されなかった。対照動物を屠殺した第37日まで腫瘍退縮
が保たれた。Study Log動物実験用ソフトウェアにデータをアップロードした。
結果は図36Aおよび36B中に示す。
乳癌モデルにおけるAd−RTS−IL−12の抗腫瘍活性
この試験の目的は、マウス乳癌モデルにおけるその有効性および毒性に関して、Ad−
RTS−mIL12を用いた腫瘍内治療を評価することであった。
6〜8週齢のメスBalbCマウスをCharles River Laborato
ries or Harlan(USA)から購入した。動物のケアおよび実験手順はI
ntrexonのInstitutional Animal Care and Us
e Committeeガイドラインに従い実施した。
マウス乳癌(4T1)細胞系をATCC(Manassas、VA)から購入した。4
T1細胞はRoswell Park Memorial Institute培地(R
PMI)1640(ATCC、Manassas、VA)中で増殖させた。この培地には
、熱不活化ウシ胎児血清(FCS)10%v/v、2−mMのL−グルタミン(Atla
nta Biologicals、Inc、Lawrenceville、GA)、10
0IU/mlのペニシリンG、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充した
。細胞は5%CO2中で37℃において増殖させた。すべての細胞系を通常通り試験し、
マイコプラズマを含まないことが分かった。
メスの、6〜8週齢のBALB/c免疫応答性マウスに、同系乳癌(4T1)細胞、1
e5細胞/50ulを皮下(s.c.)接種した。細胞接種後8日で、マウスを、それぞ
れ5匹の動物群、4群、未治療、活性化剤のみ、Ad−RTS−mIL12のみ、および
Ad−RTS−mIL12と活性化剤にランダムに分類した。活性化剤リガンドを与えた
コホートには、自由に活性化剤を配合したげっ歯類用の餌(1000mg/1kg)を与
えた。Ad−RTS−mIL12のみの治療を与えたコホートまたは未治療コホートには
、標準的な食餌(Harlan Laboratories、USA)を与え続けた。活
性化剤リガンドは、対照動物に投与する1Kgの同じ食餌に1000mgの活性化剤リガ
ンドを配合した、Harlan Tekladから作製された特注品の食餌(Harla
nの特注品部門の食餌)によって投与する。マウスには、腫瘍細胞移植後第9、12およ
び14日に、1e10vp/100ul、PBS中の用量レベルでのAd−RTS−mI
L12の一回腫瘍内(i.t.)注射による治療を施した。平均的な腫瘍の大きさ体積は
ベクター治療の開始時に36mmであった。それぞれのマウスの腫瘍の大きさおよび体
重は、実験の最後まで週に3回モニタリングした。マウスの腫瘍の大きさが1000mm
を超えたとき実験を終了した。
乳癌4T1細胞の接種後8日で、以下の表中に示すように、マウスをランダムに分類し
、治療群と対照群(n=5/群)、全4群、未治療(対照)、活性化剤のみ(L)、Ad
−RTS−mIL12のみ、およびAd−RTS−mIL12と活性化剤に割り当てた。
腫瘍が36mmの平均体積に達したときに治療を開始した。治療後の腫瘍体積は図3
9A中に示す。対照、Ad−RTS−IL−12治療および活性化剤リガンド(L)のみ
の群中の4T1腫瘍を有するマウスは、第26日にそれぞれ約20%と35%の腫瘍増殖
阻害を示した(図39A)。重要なことに、3用量のAd−RTS−mIL12および活
性化剤リガンドは、対照群と比較して顕著な腫瘍増殖阻害(82%)をもたらした(p<
0.005)。このデータは、活性化剤の存在下でのAd−RTS−mIL12は、乳癌
(4T1)モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示すことを示唆する。体重は毒性の指標と
してモニタリングした。実験の過程中、大幅な体重の減少または死は見られなかった(図
39B)。
これらの結果は、Ad−RTS−mIL12および活性化剤リガンドの直接腫瘍内注射
は腫瘍退縮を誘導するのに非常に有効であり、乳癌モデルにおいて安全であることを実証
する。抗腫瘍活性はこのモデルにおいて有意であった(p<0.005)。
免疫細胞を含まないAd−RTS−IL−12ベクターの投与に関する臨床プロトコー

以下は、切除不能段階IIICまたはIVの悪性メラノーマを治療するためにAd−R
TS−IL−12ベクターの投与の形で、本発明を実施するために使用することができる
臨床プロトコールである。
この相1b臨床試験の目的は、14日経口用量の活性化剤リガンドと併用した6治療サ
イクルのAd−RTS−IL−12の腫瘍内注射の、安全性および奏効率、腫瘍応答率、
ならびに免疫学的および他の生物活性を評価することである。Ad−RTS−IL−12
用量は最初に(第一サイクルで)、5mg/1日用量の活性化剤リガンドと共に1×10
11ウイルス粒子(vp)で投与する。次いでウイルス粒子と活性化剤リガンドの両方の
用量を、前の治療サイクルが患者によって許容されたという条件で、固定スケジュール(
表8)に従いそれぞれの反復治療サイクルに関して漸増させる。
この相1b試験の目的は以下の通りである:
1.切除不能段階IIICまたはIVの悪性メラノーマを有する患者における漸増用量
の活性化剤リガンドと併用した、患者内漸増用量でのAD−RTS−IL−12の腫瘍内
注射の反復治療サイクルの安全性および耐性の評価。
2.診断CTスキャン(固形腫瘍における応答評価基準(RECIST1.1)基準)
、PETスキャンおよび写真(該当する場合)を使用することによって有効性指標を得る
こと。
3.(1つまたは複数の)注射標的腫瘍、排出リンパ節を含む腫瘍(アクセス可能な場
合)および末梢循環における、細胞免疫応答(特にIL−12および他のサイトカインの
遺伝子発現、細胞毒性Tリンパ球およびTregsの頻度)および他の生物活性(例えば
、アポトーシスおよび免疫細胞浸潤)の点で、活性化剤リガンドと併用してAD−RTS
−IL−12の免疫学的影響を評価することによる、患者におけるRheoSwitch
Therapeutic System(商標)(RTS(商標))の機能性の評価、
免疫学的および他の生物学的パラメーターの変化と前の活性化リガンド用量および腫瘍応
答を関連付けること。
4.腫瘍細胞ならびに腫瘍中の樹状細胞およびマクロファージへのAD−RTS−IL
−12の取り込みの程度を評価して、どの細胞がウイルスを取り込むか、取り込みの程度
がAD−RTS−IL−12用量に依存するかを決定すること。腫瘍、腫瘍を含む排出リ
ンパ節(アクセス可能な場合)および末梢循環における、炎症応答および免疫応答(細胞
毒性リンパ球およびTregsなどの細胞性、およびサイトカインの誘導)を決定するこ
と。免疫学的および他の生物学的パラメーターの変化は、AD−RTS−IL−12およ
び活性化リガンド用量および腫瘍応答と関連付ける。
5.患者の部分集合中の第8〜9日における、各サイクル内の定常中の薬物動態プロフ
ァイルの評価。
6.PK評価を受ける患者におけるHolterモニタリングによって得られる、EC
GにおけるQT/QTc間隔の評価。
指標:
切除不能段階IIIC(一過性)、段階IV(M1a、M1bまたはM1c(LDH≦
2×ULN)悪性メラノーマおよび少なくとも4個のアクセス可能な病巣。
試験設計:
それぞれ28日間続き、それぞれ14日間1日1回の、経口用量の活性化剤リガンドを
併用したAd−RTS−IL−12の腫瘍内注射による6治療サイクルの、相1b、非盲
検、単一群試験、多施設における安全性、耐性、腫瘍応答(RECIST1.1)、およ
び免疫学的および他の生物学的影響の評価。AD−RTS−IL−12と活性化剤リガン
ドの両方の用量を、前の治療サイクルを許容したすべての患者に関して図1および表1に
従い漸増させる。
試験集団:
腫瘍内注射または生検用の、少なくとも4個のアクセス可能な病巣(最長径≦3cm、
最短径≧1cm)または触知可能な腫瘍を含むリンパ節(最長径≦5cm、最短径≧1.
5cm)を有しており、切除不能段階IIICまたはIVの悪性メラノーマおよび0〜1
のECOG性能状態を有する、18才以上の全種のオスおよびメス。
サンプルサイズ:
段階IIICまたはIVのメラノーマを有する、少なくとも12および最大28の患者
をこの試験に登録する。このプロトコール中のすべての患者は、前の治療サイクルが十分
許容されたという条件で、図1および表1に従うそれぞれの反復治療サイクルで、AD−
RTS−IL−12および活性化剤リガンドの患者間用量漸増で単一群試験に登録する。
製品検査:
それぞれのサイクル中、活性化剤リガンドに対する用量依存性応答で誘導性hIL−1
2を発現するように操作した遺伝子療法剤(Ad−RTS−IL−12)の腫瘍内注射と
経口活性化剤リガンドの組合せで、患者を治療する。AD−RTS−IL−12は主要製
造所で調製され、次いで凍結され、適切な臨床現場に送られる。すべての患者に、AD−
RTS−IL−12(注射当たり約1.0×1011および1.0×1012全ウイルス
粒子)の腫瘍内注射(最大6サイクルのサイクル当たり一回、4週間間隔)を施す。患者
には、それぞれのサイクル中14日連続で1日1回の経口用量の活性化剤リガンドも与え
る。AD−RTS−IL−12および/または活性化剤リガンドの用量は、前の治療サイ
クルが許容されたすべての患者において、サイクル2〜6の開始時に患者間で漸増する(
表8参照)。AD−RTS−IL−12はそれぞれのサイクルで異なる病巣に注射し、病
巣の数が限られる場合、連続ローテーションで注射を実施する。4個のアクセス可能な病
巣の少なくとも1個は注射せず、その病巣を使用してAD−RTS−IL−12の全身効
果を評価する。患者への投与は少なくとも24時間間隔で交互に行う。それぞれの腫瘍内
注射は、活性化剤リガンドの初回投与後約3時間(±30分)でサイクル中一回行う。
用量:
活性化剤リガンド:最小用量/1日:5mg、中間用量/1日:20mg、最大用量/
1日:100mg。活性化剤リガンドは、各サイクルの最初の14日間投与する。
Ad−RTS−IL−12:用量:合計体積0.5mlの滅菌溶液に縣濁した注射当た
り約1.0×1011または1.0×1012のウイルス粒子/腫瘍、病巣全体、特に腫
瘍辺縁領域に分布した注射体積。
前の治療の安全性および認容性が確認されるまで、次に高い用量レベルを用いた治療結
果は良性ではない。MTDが定義される場合、さらなる漸増は行わない。
投与の経路:
活性化剤リガンド:食事の30分以内に経口摂取する軟質ゼラチンカプセル中の溶液。
AD−RTS−IL−12:
1個のアクセス可能な腫瘍病巣、または必要時には(触知可能な)腫瘍を含む排出リン
パ節に、それぞれのサイクルの第1日に注射。
患者割り当ての方法:
すべての患者には表8に従った治療を施し、単一群試験に登録する。それぞれの治療サ
イクルの最中および後に、安全性および認容性をすべての患者に関して厳格に評価する。
前の治療サイクルが許容された場合のみ、用量漸増を実施することができる。
臨床試験期間:
この試験はスクリーニング後約28週間それぞれの患者に続ける。
スクリーニング評価のための最大23日(第−30日から−7日)の期間後、試験への
参加に関して患者を承認する。第−6日から−2日にベースライン生検を実施し、第0日
に、Holterモニタリングを使用した心臓機能のベースライン評価を、PKに関して
評価する患者に行う。それぞれのサイクルの第1日に、承認した患者に、実験治療を施し
始める(1つはAD−RTS−IL−12の腫瘍内注射および1つは活性化剤リガンドの
経口投与)。それぞれのサイクルにおける活性化剤リガンド治療は合計14日間続け、1
4日間のウォッシュアウトおよび安全性の観察を続ける。試験治療は6サイクルからなり
、それぞれ14日間のフォローアップを含めて合計28日間続ける。注射後のフォローア
ップ評価は、最後の注射後6週間(活性化剤リガンドの最後の投与後4週間)で実施する
。血液中のウイルスDNAを測定する。最後の注射後6週間でウイルスDNAが存在する
場合、さらなるウイルスDNA評価を続ける。しかしながら、それぞれの供給源に関して
Q−PCRによる2回の連続した陰性の結果が実証される場合、それ以上の試験は必要と
されない。
主要評価項目:
安全性および認容性を、(ECOG性能状態を含めた)身体検査、ECG中(PK患者
中)のQT/QTc間隔、生命兆候、血清の化学的分析、尿分析、血液検査によって、お
よび何らかの有害事象がある患者の報告によって評価する。CTスキャンによって評価し
た奏効率および応答率。
副次的評価項目:
8患者の部分集合における活性化剤リガンドの定常の薬物動態(AD−RTS−IL−
12用量レベル当たり4)。
b.治療の結果としての、腫瘍、腫瘍を含む排出リンパ節(アクセス可能な場合)およ
び末梢循環における、炎症応答および免疫応答(細胞毒性リンパ球およびTregsなど
の細胞性、およびサイトカインの誘導)の程度。
c.免疫学的および他の生物学的パラメーターの変化と、AD−RTS−IL−12お
よび活性化リガンド用量および腫瘍応答の関連付け。
d.PETスキャンおよび写真によってさらに評価される有効性。
e.長期のフォローアップを最大5年間行う。患者には年に一回調査員によりコンタク
トをとる。
組み入れ基準:
a.18才以上の全種の男性または女性。
b.任意の腫瘍厚の原発性皮膚、粘膜、または爪下メラノーマに起因する、または未知
の原発性部位に起因する、切除不能段階IIIC(一過性)または段階IVメラノーマ(
M1a、M1b、M1c、LDH≦2×ULN)。
c.腫瘍内注射または生検用の、少なくとも4個のアクセス可能な非内臓病巣(最長径
≦3cm、最短径≧1cm)または触知可能な腫瘍を含むリンパ節(最長径≦5cm、最
短径≧1.5cm)。少なくとも1個の病巣には注射しない。
d.0または1のECOG性能状態。
e.スクリーニング時または試験登録前30日以内に造影MRIスキャンにより評価し
て、目に見える脳転移がない患者。
f.治療および試験治療前および反復治療サイクル前30日以内の実験値、および活性
化リガンド用量漸増によって評価される、以下のような適切なベースライン血液および臓
器機能:ヘモグロビン≧10g/L、顆粒球>2500/mm、リンパ球>1000/
mm、血小板>100,000/mm、血清中クレアチニン<1.5×ULN、AS
T、ALT、アルカリホスファターゼ<2.5×ULN、LDH≦2×ULN、血清中ビ
リルビン<1.5×ULN、好中球絶対数>500/mm
g.(主に性能状態で評価した)調査者の意見における少なくとも約6カ月の予想生存
期間。
h.女性は閉経後または手術による不妊状態でなければならず、または有効な避妊法を
実施しなければならず、手術による不妊状態ではない男性、かつ閉経後または手術による
不妊状態ではないそのパートナーは有効な避妊法を実施しなければならない。
i.PT/PTTによって測定した正常な凝固パラメーター。
j.サイン済みの、IRBに承認された自発的インフォームドコンセント。
除外基準:
a.特定療法を必要とする、活性、急性ウイルス、細菌、または真菌感染。
b.有効な免疫応答を高める能力に関する懸念が原因のHIV感染。
c.ステロイド(>10mgのプレドニゾロンまたは同等)または他の免疫抑制療法を
必要とする活発な自己免疫疾患。
d.造影MRIスキャンにより評価して、スクリーニング時(または試験登録前30日
以内)に検出可能な脳転移がある患者。
e.病巣>3cm(LD)または触知可能な腫瘍を含むリンパ節>5cm(LD)を有
する患者。
f.10g/L未満のヘモグロビンを有する患者。
g.段階IVの内臓転移またはLDH>2×ULNの場合他の遠隔転移の存在。
h.AD−RTS−IL−12または活性化剤リガンドで事前に治療された患者。
i.腫瘍内遺伝子療法で事前に治療された患者。
J.臓器同種移植片のレシピエント。
k.他の皮膚癌以外の、併発する他の臨床活性がある悪性疾患。
l.前の化学療法、ホルモン療法、放射線療法、免疫療法、または任意の第一選択療法
の終了から、(試験薬の最初の投与前に)30日未満が経過している。
m.臨床的に重大な脳血管疾患。
n.併発する重度の心不全(ニューヨーク心臓協会のクラスIIIまたはIV)または
冠動脈疾患の病歴。
o.許容されない麻酔または手術リスクと考えることができる、虚血心または肺疾患な
どの急を要する医学的状態。
p.出血または凝固障害の病歴が現在あること。
q.コルチコステロイド(>10mgプレドニゾロンまたは同等物)およびシクロスポ
リンAなどの併用免疫抑制療法。
r.(試験薬の最初の投与前の)過去30日以内の、併用被験治療、または任意の被験
治療剤を用いた治療。
s.CYP4503A4経路によって代謝される併用薬。
t.授乳期または妊娠期の女性。
u.製品の何らかの構成成分、例えば活性化剤リガンドと関係がありうる2つのベンゼ
ン環を含有する安息香酸と、関係がある可能性がある過敏症の病歴を有する患者。
v.調査者の意見において、提案する治療剤の安全性または送達を許容できないほど低
減し得る、または自発的インフォームドコンセントの入試を妨げ得る、任意の医学的また
は精神状態。
統計的手法:
奏効率(CR+PR)は、[固形がんの治療効果判定のための新ガイドライン(REC
IST1.1)を利用した]CTスキャンによる、(1つまたは複数の)注射および非注
射腫瘍病巣ならびに触知可能な腫瘍を含むリンパ節の大きさの変化に基づく。PETスキ
ャンおよび/または写真を使用して、それぞれ代謝活性または大きさ(皮膚病巣)の変化
を評価する。
OSおよびORRの主たる解析は信頼区間を含み、サンプルサイズが12、16、20
、24患者に達したとき、および最後の患者の治療後6週間で実施する。
人工統計学的、免疫学的および生物学的活性測定値、ならびに有害事象率および実験値
を含めた安全性パラメーターを、フォローアップの最後に記述的に解析する。これらの結
果は表、グラフおよび患者毎の列挙において要約する。
平均値、メジアン、標準偏差およびヒストグラムを含めた記述統計を使用して、連続測
定を要約する。客観的腫瘍縮小効果を含めたカテゴリー変数に度数を使用する。免疫学的
および生物学的活性は抗腫瘍効果と関連付ける。これらの統計値は階層によって与えられ
る(腫瘍病巣の大きさ≦1cmの最長径[LD]、>1cmLD、関連DLNの大きさ≦
3cmのLD、>3cmのLD、病巣の位置、内臓、非内臓、病巣の注射状態、注射、非
注射)。統計はそれぞれの治療サイクルの最後および全体で実施する。総合解析用に、観
察結果はサイクル中ではなく階層中で組み合わせる。
コンプライアンス:
臨床試験は、医薬品の臨床試験の実施に関する基準(cGCP)に準じて実施する。
(参考文献)
平均値、メジアン、標準偏差およびヒストグラムを含めた記述統計を使用して、連続測
定を要約する。客観的腫瘍縮小効果を含めたカテゴリー変数に度数を使用する。免疫学的
および生物学的活性は抗腫瘍効果と関連付ける。これらの統計値は階層によって与えられ
る(腫瘍病巣の大きさ≦1cmの最長径[LD]、>1cmLD、関連DLNの大きさ≦
3cmのLD、>3cmのLD、病巣の位置、内臓、非内臓、病巣の注射状態、注射、非
注射)。統計はそれぞれの治療サイクルの最後および全体で実施する。総合解析用に、観
察結果はサイクル中ではなく階層中で組み合わせる。

本発明は、以下の態様を含み得る。
[1]
遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の治療タンパク
質の機能(複数可)を有するタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターで
あって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド
依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、(2)前記リガンド依存
性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、治療タンパク質の
機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、ベク
ター。
[2]
治療タンパク質が、エリスロポエチン(erythropoetin)、グレリン、オステオプロテ
ゲリン、RANKL、RANKLデコイ、TNF−αアンタゴニスト、IL−1アンタゴ
ニスト、G−CSF、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、アンジオスタチン、エン
ドスタチン、TNF−α、PP1DCY−LSRLOC、β−グルクロニダーゼ、IL−
12、a−ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼA、a−グルコシダーゼ、b−
グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、CLN6タンパク質、CLN3関連の若年性
、N−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ(sulfoglucosamine sulfohyrolase)(S
GSH)、a−N−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−CoA−グルコサミニドア
セチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン−6−スルファターゼ、a−L−
イズロニダーゼ、アリールスルファターゼB、酸性スフィンゴミエリナーゼ、イズロネー
ト(iuduronate)スルファターゼおよびセルロプラスミンからなる群から選択される、請
求項1に記載のベクター。
[3]
治療タンパク質が、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、
IL−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニット、IL−15、IL−
18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、IFN−α、
IFN−γ、IFN−α1、IFNα2、IL−15−R−α、CCL3(MIP−1a
)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(リンホタクチン)、
CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP−3b)、CXCL9(M
IG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF−1)、CCL21(6C
kine)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT
、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、TNF−α、dnFADD
、BCG、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1アンチセンスオリゴヌクレオ
チド、TGFbRII DN、ICOS−L、S100、CD40L、p53、サバイビ
ン、p53−サバイビン融合体、MAGE3、PSAおよびPSMAからなる群から選択
される1つまたは複数の免疫モジュレーターである、請求項1に記載のベクター。
[4]
プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイル
ス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バ
ーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、カリモウイルス、リポソーム、荷電脂
質(サイトフェクチン)、DNA−タンパク質複合体およびバイオポリマーからなる群か
ら選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のベクター。
[5]
アデノウイルスベクターである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベクター。
[6]
IL−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請
求項1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
[7]
免疫モジュレーターの機能を有する前記1つまたは複数のタンパク質をコードする前記
ポリヌクレオチド、およびIL−12の機能を有する前記タンパク質をコードする前記ポ
リヌクレオチドが、前記遺伝子スイッチの調節性プロモーターの制御下にある、請求項6
に記載のベクター。
[8]
前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体(EcR)に基づく遺伝子スイッチである、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のベクター。
[9]
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下に
ある第1の転写因子配列と、第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを
含み、前記第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と、前記第2の転写因子
配列によってコードされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として
機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のベクター。
[10]
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下に
ある第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、前記第一の転写因子配列およ
び前記第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依
存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1〜9のいずれか一項
に記載のベクター。
[11]
前記第1の転写因子配列および前記第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進
入部位(IRES)によって連結されている、請求項10に記載のベクター。
[12]
治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌク
レオチドが、ヒトタンパク質(複数可)をコードする、請求項1〜11のいずれか一項に
記載のベクター。
[13]
IL−12の機能を有するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、ヒトIL
−12をコードする、請求項5〜12のいずれか一項に記載のベクター。
[14]
前記免疫モジュレーターが、TNF−αである、請求項3〜13のいずれか一項に記載
のベクター。
[15]
前記免疫モジュレーターが、ヒトTNF−αである、請求項14に記載のベクター。
[16]
前記免疫モジュレーターが、SEQ ID NO:37(ヒトTNF−α)に対し少な
くとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100
%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項3〜15のいずれか一項に記載のベクター。
[17]
治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌク
レオチドが、コドン最適化されている、請求項1〜16のいずれか一項に記載のベクター

[18]
治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌク
レオチドが、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項17に記載の
ベクター。
[19]
シグナルペプチドをコードする核酸配列が、コドン最適化されている、請求項18に記
載のベクター。
[20]
前記シグナルペプチドが、TNFOptUVおよびIL−2optUVからなる群から
選択される、請求項19に記載のベクター。
[21]
前記シグナルペプチドが、野生型TNF−αシグナルペプチド遺伝子によってコードさ
れるペプチド配列と比べて、TNF−αタンパク質分泌の改善を誘導する、請求項18〜
20のいずれか一項に記載のベクター。
[22]
5’非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のベク
ター。
[23]
前記5’UTRが、TNF野生型または5U2に由来する、請求項22に記載のベクタ
ー。
[24]
前記5’UTRが、TNF−αをコードするmRNAのレベル、TNF−αタンパク質
の発現またはその両方の改善を誘導する、請求項22または請求項23に記載のベクター

[25]
3’調節領域をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載のベクター。
[26]
前記3’調節領域が、SV40eまたはヒト成長ホルモン(hGH)に由来するポリア
デニル化シグナルである、請求項25に記載のベクター。
[27]
前記3’調節領域が、TNF−αをコードするmRNAのレベル、TNF−αタンパク
質の発現またはその両方の改善を誘導する、請求項25または請求項26に記載のベクタ
ー。
[28]
5U2に由来する5’UTRと、コドン最適化されたIL−2シグナルペプチド(IL
−2optUV)と、コドン最適化された核酸配列によってコードされるTNF−αと、
hGHに由来する3’調節領域とを含む、請求項27に記載のベクター。
[29]
ベクター43318、ベクター43319、ベクター43320、ベクター43321
、ベクター43322、ベクター43322、ベクター43323、ベクター43324
、ベクター43325、ベクター43326、ベクター43327およびベクター433
29からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の
ベクター。
[30]
治療タンパク質を条件的に発現するための前記ベクターが、腫瘍内または腫瘍近傍へと
直接注射される、請求項1〜29のいずれか一項に記載のベクター。
[31]
前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されていない、請求項1〜30のいず
れか一項に記載のベクター。
[32]
請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターを用いて免疫細胞を改変する段階を含
む、1つまたは複数の治療タンパク質の機能を有するタンパク質(複数可)を発現する免
疫細胞または治療補助細胞(TSC)の集団を作製する方法。
[33]
前記細胞がヒト樹状細胞である、請求項32に記載の方法。
[34]
前記樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項33に記載の方法。
[35]
請求項1〜34のいずれか一項に記載のベクターを含む、1つまたは複数の治療タンパ
ク質の機能を有するタンパク質(複数可)を発現する免疫細胞またはTSCの集団。
[36]
前記細胞がヒト樹状細胞である、請求項35に記載の免疫細胞またはTSCの集団。
[37]
請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターを含む、インビトロで遺伝子操作され
た免疫細胞またはTSC。
[38]
前記免疫細胞またはTSCがヒト樹状細胞である、請求項37に記載のインビトロで遺
伝子操作された免疫細胞またはTSC。
[39]
請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれか一項に
記載の免疫細胞もしくはTSCの集団、請求項37〜38のいずれか一項に記載のインビ
トロで遺伝子操作された免疫細胞もしくはTSCまたはそれらの任意の組合せを含む医薬
組成物。
[40]
請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターのうち2つ以上、請求項35〜36の
いずれか一項に記載の免疫細胞もしくはTSCの集団のうち2つ以上、請求項37〜38
のいずれか一項に記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞もしくはTSCのうち2
つ以上またはそれらの任意の組合せを含む組成物。
[41]
請求項39または請求項40に記載の組成物と、薬学的に許容される担体。
[42]
緩衝剤をさらに含む、請求項39〜41のいずれか一項に記載の組成物。
[43]
前記緩衝剤がTRISである、請求項42に記載の組成物。
[44]
グリセリンをさらに含む、請求項39〜43のいずれか一項に記載の組成物。
[45]
経口、硝子体内、腫瘍内、腹腔内または皮下投与に適した、請求項39〜44のいずれ
か一項に記載の組成物。
[46]
前記細胞集団が、少なくとも10 個の細胞を含む、請求項39〜45のいずれか一項
に記載の組成物。
[47]
前記細胞集団が、少なくとも10 個の細胞を含む、請求項39〜46のいずれか一項
に記載の組成物。
[48]
組成物および活性化リガンドが、それを必要とする哺乳動物へと同時にまたはいずれか
の順序で投与されると、腫瘍サイズを縮小させる、あるいは腫瘍形成を阻止する、請求項
39〜47のいずれか一項に記載の組成物。
[49]
組成物および活性化リガンドが、それを必要とする哺乳動物へと同時にまたはいずれか
の順序で投与されると、腫瘍を治療する、請求項39〜48のいずれか一項に記載の組成
物。
[50]
それを必要とする哺乳動物における疾患または障害を治療するための薬物の製造におけ
る、(1)請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれ
か一項に記載の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載のインビトロで遺伝子操作
された免疫細胞もしくはTSCまたは請求項39〜49のいずれか一項に記載の組成物、
および(2)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガンドの使用。
[51]
前記疾患または障害が、前記哺乳動物における腫瘍である、請求項50に記載の使用。
[52]
前記治療が、前記哺乳動物における腫瘍サイズの縮小または腫瘍の阻止である、請求項
50または請求項51に記載の使用。
[53]
それを必要とする哺乳動物におけるTNF−αの全身毒性を低下、排除または制御する
ための薬物の製造における、(1)請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請
求項35〜36のいずれか一項に記載の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載の
インビトロで遺伝子操作された免疫細胞もしくはTSCまたは請求項39〜49のいずれ
か一項に記載の医薬組成物、および(2)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガン
ドの使用であって、前記リガンドが、前記ベクターまたは組成物の投与と同時、その前ま
たはその後に投与され、そのタイミングの活性化リガンド投与が全身毒性を低下、排除ま
たは制御させる、使用。
[54]
前記活性化リガンド投与が、前記哺乳動物が副作用を示すと停止される、請求項50〜
53のいずれか一項に記載の使用。
[55]
前記リガンドが、前記ベクター、前記集団、前記インビトロで遺伝子操作された免疫細
胞もしくはTSCまたは前記組成物の前または後の1時間未満のうちに投与される、請求
項50〜54のいずれか一項に記載の使用。
[56]
前記リガンドが、前記ベクターまたは前記組成物の後の24時間未満のうちに投与され
る、請求項50〜55のいずれか一項に記載の使用。
[57]
前記リガンドが、前記ベクターまたは前記組成物の後の48時間未満のうちに投与され
る、請求項50〜55のいずれか一項に記載の使用。
[58]
前記ベクターが、細胞内に含有されておらず、前記哺乳動物における腫瘍環境に腫瘍内
投与される、請求項50〜57のいずれか一項に記載の使用。
[59]
免疫細胞またはTSCが、前記ベクターにより腫瘍内投与されない、請求項58に記載
の使用。
[60]
前記腫瘍が良性腫瘍である、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用。
[61]
前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用。
[62]
前記腫瘍がメラノーマである、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用。
[63]
前記腫瘍が悪性メラノーマ皮膚癌である、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使
用。
[64]
前記リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項50〜63のいずれか一項に記載の
使用。
[65]
前記リガンドが、RG−115819、RG−115932およびRG−115830
から選択される、請求項50〜64のいずれか一項に記載の使用。
[66]
前記リガンドが、アミドケトン(amidoketone)またはオキサジアゾリンである、請求
項50〜63のいずれか一項に記載の使用。
[67]
前記リガンドが、前記ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作さ
れた免疫細胞または組成物の前または後の1時間未満のうちに投与される、請求項50〜
66のいずれか一項に記載の使用。
[68]
前記リガンドが、前記ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作さ
れた免疫細胞または組成物の後の24時間未満のうちに投与される、請求項50〜66の
いずれか一項に記載の使用。
[69]
前記リガンドが、ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作された
免疫細胞または組成物の後の48時間未満のうちに投与される、請求項50〜66のいず
れか一項に記載の使用。
[70]
(a)ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞ま
たは組成物の投与前に、それを必要とする患者から得られた第一の生物試料におけるイン
ターフェロン−γ(IFN−γ)の発現レベルもしくは活性レベルまたはその両方を測定
して、これにより対照レベルを得る段階と、
(b)それを必要とする患者に、請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請
求項35〜36のいずれか一項に記載のTSCの免疫細胞の集団、請求項35〜38のい
ずれか一項に記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞または請求項39〜49のい
ずれか一項に記載の組成物を投与する段階と、
(c)それを必要とする前記患者に有効量の活性化リガンドを投与する段階と、
(d)ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞お
よび活性化リガンドの投与後に、それを必要とする前記患者から得られた第二の生物試料
におけるIFN−γの発現レベルもしくは活性レベルまたはその両方を測定して、これに
より検査レベルを得る段階と、
(e)IFN−γの対照レベルと検査レベルとを比較する段階であって、IFN−γの
発現、活性またはその両方の検査レベルの、対照レベルと比べた増加が、それを必要とす
る前記患者において治療レジメンが有効であることを示す段階と、
を含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれ
か一項に記載のTSCの免疫細胞の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載のイン
ビトロで遺伝子操作された免疫細胞または請求項39〜49のいずれか一項に記載の組成
物に基づく患者における治療レジメンの効力を決定するための方法。
[71]
(a)請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれか
一項に記載のTSCの免疫細胞の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載のインビ
トロで遺伝子操作された免疫細胞または請求項39〜47のいずれか一項に記載の組成物
と、(b)遺伝子スイッチを活性化させるリガンドとを含むキット。
[72]
リガンドがRG−115819、RG−115830またはRG−115932である
、請求項71に記載のキット。
[73]
(1)前記免疫モジュレーターが、TNF−αであり、免疫モジュレーターの機能を有
する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数
の調節配列をさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターを生成する段
階と、(2)活性化リガンドを加える段階とを含み、前記1つまたは複数の調節配列が、
前記TNF−αの発現を改善する、TNF−αmRNA発現またはTNF−αタンパク質
発現を増加させる方法。
[74]
それを必要とする哺乳動物における疾患または障害を治療するための薬物の製造におけ
る、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可)
を条件的に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活性
化リガンドの使用であって、
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
くとも1つの転写因子配列と、
(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
前記ベクターが、細胞内に含有されておらず、
前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
発現を誘導し、前記疾患を治療する、使用。
[75]
疾患が、慢性腎疾患、変形性関節症、腫瘍、ウイルス性上気道感染症、ネコ形質細胞口
内炎、ネコ好酸球性肉芽腫、ネコ白血病ウイルス感染症、イヌジステンパー感染症、全身
性真菌感染症、心筋症、ムコ多糖症VII型および感染症からなる群から選択される、請
求項74に記載の使用。
[76]
感染症が、ウシ呼吸器疾患、ブタ呼吸器疾患、トリインフルエンザ、トリ伝染性気管支
炎、ウシ海綿状脳症、イヌリーシュマニア症、慢性消耗性疾患、ブタコレラ、包虫(Echi
nococcus)、流行性肺炎、FIP、口蹄疫、ヤーグジークテ、マエディビスナ、動物にお
ける乳腺炎、イヌ小胞子菌、伝染性膿痂疹(Orf)(動物疾患)、小反芻獣疫、Pox
疾患、オウム類嘴羽毛病、狂犬病、地中海熱(ブルセラ症)またはバング病または波状熱
、マルタ熱、感染性流産、家畜流行性流産、サルモネラ食中毒、腸パラチフス(enteric
paratyphosis)、細菌性赤痢、偽結核症、ペスト、伝染性熱(pestilential fever)、結
核、ビブリオ(Vibrios)、リステリア症、ワイル病(レプトスピラ症)またはカニコラ
熱、出血性黄疸(黄疸出血病レプトスピラ)、酪農従事者熱(dairy worker fever)(L
・ハージョ(L. hardjo))、回帰熱、マダニ媒介回帰熱、スピロヘータ性熱、放浪者熱
(vagabond fever)、飢餓熱、ライム関節炎、バンワース症候群(ライム病(lime disea
se))、マダニ媒介髄膜多発神経炎、慢性遊走性紅斑、ビブリオ症、大腸菌症(Colibact
eriosis)、大腸菌毒血症(colitoxemia)、肺結核(white scours)、ブタの腸浮腫、腸
パラチフス、ブドウ球菌性食物中毒症、ブドウ球菌性胃腸炎、イヌコロナウイルス(CC
V)またはイヌパルボウイルス腸炎、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、伝播性胃腸炎(TGE
)ウイルス、ハーゲルマンレッドマウス(Hagerman redmouth)病(ERMD)、感染性
造血器壊死症(IHN)、ブタアクチノバチルス(ヘモフィルス)・プルロニューモニア
(Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumonia)、ハンセン病、ストレプトトリッ
クス症、ヒツジの真菌性皮膚炎、偽腺状(Pseudoglanders)、ホイットモア(Whitmore)
病、フランシス(Francis)病、アブ熱(deer-fly fever)、野兎病(rabbit fever)、
オハラ(O'Hara)病、ストレプトバシラス熱 、ハヴェリル熱、流行性関節炎紅斑症、鼠
毒、運送または輸送熱(shipping or transport fever)、出血性敗血症、鳥類病、オウ
ム病、クラミジア症、北アメリカブラストミセス症、シカゴ病、ギルクリスト病、ネコひ
っかき病、良性リンパ細網症、良性非細菌性リンパ節炎、細菌性血管腫症、細菌性肝臓紫
斑病、Q熱、バルカンインフルエンザ(influenza/grippe)、屠殺場熱、マダニ媒介熱、
肺リケッチア症(pneumorickettsiosis)、アメリカチックチフス、マダニ媒介チフス熱
、水疱性リケッチア症、キューガーデンズ紅斑熱、ノミ媒介性チフス熱、地方病性チフス
熱、都市チフス、白癬、皮膚糸状菌症、白癬症、トリコフィトン感染症、小胞子菌症(Mi
crosporosis)、いんきんたむし、足部白癬、スポロトリクス・シェンキィ(Sporothrix
schenckii)、二形性真菌、クリプトコッカス症およびヒストプラスマ症、良性上皮性サ
ル痘、BEMP、サルヘルペスウイルス、サルB疾患、C型嗜眠性脳炎、黄熱、黒色嘔吐
、ハンタウイルス肺症候群(pulmonary syndrome)、韓国型出血熱、流行性腎症、流行性
出血熱、出血性糸球体腎炎、リンパ性脈絡髄膜炎、ベネズエラウマ脳炎、カリフォルニア
脳炎/ラクロス脳炎、アフリカ出血熱、ミドリザルまたはサバンナモンキー疾患、恐水病
、リッサウイルス、感染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、麻疹、はしか、ブタおよびウ
マインフルエンザ、家禽ペスト、ニューカッスル病、ピロプラズマ病、トキソプラズマ症
、アフリカ睡眠病、ガンビア・トリパノソーマ症、ローデシア・トリパノソーマ症、シャ
ーガス病、シャーガス・マザ(Chagas-Mazza)病、南アメリカ・トリパノソーマ症、赤痢
アメーバ、バランチジウム症、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、皮膚リーシュマ
ニア症:チクレロ潰瘍、エスプンディア、ピアンボルス(pianbols)、ウタ(uta)およ
び横痃(buba)(アメリカ);東洋瘤腫、アレッポ腫(Aleppo boil)(旧世界);バグ
ダッド腫(Bagdad boil)、デリー腫(Delhi boil)、バウル潰瘍、内臓リーシュマニア
症:カラアザール、微胞子虫症、アニサキス症、旋毛虫症、住血線虫症、好酸球性髄膜炎
または髄膜脳炎(広東住血線虫(A. cantonensis))、腹部住血線虫症(コスタリカ住血
線虫(A. costaricensis))、鉤虫症、アメリカ鉤虫症、鉤虫病、毛細虫症、糸状虫症(
Brugiasis)、トキソカラ症、エソファゴストム症、糞線虫症、毛様線虫症、回虫症、裂
頭条虫症、孤虫症、包虫症(Hydatidosis)、包虫症(Hydatid disease)、包虫(Echino
coccus)顆粒病、嚢胞性包虫症、条虫感染症、住血吸虫、EBVに起因するバーキットリ
ンパ腫、ラウスレトロウイルスに起因するラウス肉腫、ヘルペスウイルス8型に起因する
カポジ肉腫、HTLV−Iレトロウイルスに起因する成人T細胞白血病ならびにHTLV
−IIに起因するヘアリー細胞白血病からなる群から選択される、請求項75に記載の使
用。
[77]
感染症が、ウシ呼吸器疾患、ブタ呼吸器疾患およびトリインフルエンザからなる群から
選択される、請求項75に記載の使用。
[78]
腫瘍が、骨肉腫、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項75に記載
の使用。
[79]
1つまたは複数のタンパク質が、エリスロポエチン、グレリン、オステオプロテゲリン
、RANKL、RANKLデコイ、TNF−αアンタゴニスト、IL−1アンタゴニスト
、G−CSF、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、アンジオスタチン、エンドスタ
チン、TNF−α、PP1DCY−LSRLOC、β−グルクロニダーゼおよびIL−1
2からなる群から選択される、請求項74〜78のいずれか一項に記載の使用。
[80]
1つまたは複数のタンパク質が、IL−1、IL−2、IL−12、IL−3、IL−
4、IL−5、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニ
ット、IL−15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、G
M−CSF、IFN−α、IFN−γ、IFN−α1、IFNα2、IL−15−R−α
、CCL3(MIP−1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XC
L1(リンホタクチン)、CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP
−3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF
−1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70
、GITRL、LIGHT、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、
TNF−α、dnFADD、BCG、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS−L、S100、CD
40L、p53、サバイビン、p53−サバイビン融合体、MAGE3、PSAおよびP
SMAからなる群から選択される、請求項74〜79のいずれか一項に記載の使用。
[81]
それを必要とする哺乳動物におけるリソソーム蓄積症を治療するための薬物の製造にお
ける、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可
)を条件的に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活
性化リガンドの使用であって、
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
くとも1つの転写因子配列と、
(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されておらず、
前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
発現を誘導し、前記リソソーム蓄積症を治療する使用。
[82]
リソソーム蓄積症が、ポンペ病/糖原病II型、ゴーシェ病(I型、II型、III型
)、ファブリー病、ムコ多糖症II型(ハンター症候群)、ムコ多糖症VI型(マロトー
・ラミー症候群)、ムコ多糖症I型、異染性白質ジストロフィー、神経セロイドリポフス
チン症またはCLN6病(非定型遅発型小児性、晩期発症型異型、初期若年性、フィンラ
ンド異型遅発型小児性CLN5、ヤンスキー・ビールショースキー病/遅発型小児性CL
N2/TPP1病、クッフス/成人発症型NCL/CLN4病、Northern Ep

ilepsy/異型遅発型小児性CLN8、Santavuori−Haltia/小児
性CLN1/PPT病、β−マンノース症)、Batten−Spielmeyer−V
ogt/若年性NCL/CLN3病、サンフィリポ症候群A型、サンフィリポ症候群B型
、サンフィリポ症候群C型、サンフィリポ症候群D型、MPSIハーラー症候群、ニーマ
ン・ピック病(A型、B型、C型、D型)、アクチβー欠乏症/GM2ガングリオシドー
シス、α−マンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積
症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシド
ーシス、ガラクトシアリドーシス(ゴールドバーグ症候群)、GM1ガングリオシドーシ
ス(小児性、遅発型小児性/若年性、成人/慢性)、I細胞病/ムコリピドーシスII、
小児性遊離シアル酸蓄積症/ISSD、若年性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、クラッベ病
(小児発症型、晩期発症型)、ムコ多糖症障害(偽性ハーラー・ポリジストロフィー/ム
コリピドーシスIIIA、シャイエ症候群、MPSIハーラー・シャイエ症候群、モルキ
オ症候群A型/MPS IVA、モルキオ症候群B型/MPS IVB、MPS IXヒ
アルロニダーゼ欠乏症、スライ症候群(MPS VII)、ムコリピドーシスI/シアリ
ドーシス、ムコリピドーシスIIIC、ムコリピドーシスIV型)、多種スルファターゼ
欠乏症、濃化異骨症、サンドホフ病/成人発症型/GM2ガングリオシドーシス、サンド
ホフ病/GM2ガングリオシドーシス小児性、サンドホフ病/GM2ガングリオシドーシ
ス若年性、シンドラー病、サラ病、小児性シアル酸蓄積症、テイ・サックス病/GM2ガ
ングリオシドーシス、ウォルマン病、アスパルチルグルコサミン尿症(Asparylglucosami
nuria)およびプロサポシンからなる群から選択される、請求項81に記載の使用。
[83]
リソソーム蓄積症が、ポンペ病/糖原病II型、ゴーシェ病(I型、II型、III型
)、ファブリー病、ムコ多糖症II型(ハンター症候群)、ムコ多糖症VI型(マロトー
・ラミー症候群)、ムコ多糖症I型および異染性白質ジストロフィーからなる群から選択
される、請求項81または請求項82に記載の使用。
[84]
1つまたは複数のタンパク質が、a−ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼA
、a−グルコシダーゼ、b−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、CLN6タンパ
ク質、CLN3関連の若年性、N−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ(SGSH)
、a−N−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−CoA−グルコサミニドアセチルト
ランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン−6−スルファターゼ、a−L−イズロニ
ダーゼ、アリールスルファターゼB、酸性スフィンゴミエリナーゼおよびイズロネートス
ルファターゼからなる群から選択される、請求項81〜83のいずれか一項に記載の使用

[85]
それを必要とする哺乳動物における肝疾患を治療するための薬物の製造における、(a
)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可)を条件的
に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガン
ドの使用であって、
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
くとも1つの転写因子配列と、
(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
を含み、
前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されておらず、
前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
発現を誘導し、前記肝疾患を治療する、使用。
[86]
肝疾患がB型肝炎である、請求項85に記載の方法。
[87]
肝疾患がC型肝炎である、請求項85に記載の方法。
[88]
タンパク質がIFN−αによるものである、請求項85〜87のいずれか一項に記載の
方法。
[89]
タンパク質がセルロプラスミンである、請求項85〜87のいずれか一項に記載の方法

[90]
それを必要とする哺乳動物における眼疾患を治療するための薬物の製造における、(a
)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可)を条件的
に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガン
ドの使用であって、
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
くとも1つの転写因子配列と、
(2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
を含み、
前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されておらず、
前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
発現を誘導し、前記眼疾患を治療する使用。
[91]
前記眼疾患が、緑内障、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、無虹彩(Aniridic)緑内障
、先天性緑内障、若年性緑内障、水晶体原性緑内障、血管新生緑内障、外傷後緑内障、ス
テロイド緑内障、スタージ・ウェーバー症候群緑内障およびぶどう膜炎誘導性緑内障、糖
尿病性網膜症、黄斑変性症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、血液漏出および/または網膜
浮腫、細菌性結膜炎、真菌性結膜炎、ウイルス性結膜炎、ぶどう膜炎、角膜後面沈着物、
黄斑浮腫、眼内レンズ挿入術後の炎症応答、ぶどう膜炎症候群、網膜血管炎、サルコイド
ーシス、イールズ病、急性網膜壊死、フォークト・小柳・原田症候群、眼(occular)ト
キソプラズマ症、放射線網膜症、増殖性硝子体網膜症、眼内炎、眼緑内障、虚血性視神経
症、甲状腺眼窩疾患、眼窩偽腫瘍、色素散乱症候群(色素性緑内障)、強膜炎、上強膜炎
脈絡膜症、網膜症(例えば、嚢胞状黄斑浮腫、中心性漿液性網脈絡膜症および推定眼ヒス
トプラスマ症症候群、網膜血管障害、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、
網膜色素変性症、家族性滲出性硝子体網膜症(FEVR)、特発性ポリープ状脈絡膜血管
症、黄斑部網膜上膜ならびに白内障からなる群から選択される、請求項90に記載の使用

[92]
前記ベクターが、硝子体内投与される、請求項90または請求項91に記載の使用。
[93]
前記哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト動物である、請求項74〜92のいずれか一項に記
載の使用。
[94]
前記ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス
、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、カリモウイルス、リ
ポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA−タンパク質複合体およびバイオポリ
マーからなる群から選択される、請求項74〜93のいずれか一項に記載の使用。
[95]
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項74〜94のいずれか一項に
記載の使用。
[96]
前記遺伝子スイッチが、EcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項74〜95のい
ずれか一項に記載の使用。
[97]
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下に
ある第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下にある第二の転写因子配列とを
含み、前記第一の転写因子配列および前記第二の転写因子配列によってコードされるタン
パク質が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成
する、請求項74〜96のいずれか一項に記載の使用。
[98]
遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下に
ある第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、前記第一の転写因子配列およ
び前記第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依
存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項74〜97のいずれか
一項に記載の使用。
[99]
前記第1の転写因子配列および前記第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進
入部位(IRES)によって連結されている、請求項98に記載のベクター。
[100]
前記リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項74〜99のいずれか一項に記載の
使用。
[101]
前記リガンドが、RG−115819、RG−115932およびRG−115830
から選択される、請求項74〜99のいずれか一項に記載の使用。
[102]
前記リガンドが、アミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項74〜99のい
ずれか一項に記載の使用。

Claims (102)

  1. 遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の治療タンパク
    質の機能(複数可)を有するタンパク質(複数可)を条件的に発現するためのベクターで
    あって、前記ポリヌクレオチドが、(1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド
    依存性転写因子をコードする少なくとも1つの転写因子配列と、(2)前記リガンド依存
    性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結された、治療タンパク質の
    機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、ベク
    ター。
  2. 治療タンパク質が、エリスロポエチン(erythropoetin)、グレリン、オステオプロテ
    ゲリン、RANKL、RANKLデコイ、TNF−αアンタゴニスト、IL−1アンタゴ
    ニスト、G−CSF、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、アンジオスタチン、エン
    ドスタチン、TNF−α、PP1DCY−LSRLOC、β−グルクロニダーゼ、IL−
    12、a−ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼA、a−グルコシダーゼ、b−
    グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、CLN6タンパク質、CLN3関連の若年性
    、N−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ(sulfoglucosamine sulfohyrolase)(S
    GSH)、a−N−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−CoA−グルコサミニドア
    セチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン−6−スルファターゼ、a−L−
    イズロニダーゼ、アリールスルファターゼB、酸性スフィンゴミエリナーゼ、イズロネー
    ト(iuduronate)スルファターゼおよびセルロプラスミンからなる群から選択される、請
    求項1に記載のベクター。
  3. 治療タンパク質が、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、
    IL−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニット、IL−15、IL−
    18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、GM−CSF、IFN−α、
    IFN−γ、IFN−α1、IFNα2、IL−15−R−α、CCL3(MIP−1a
    )、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(リンホタクチン)、
    CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP−3b)、CXCL9(M
    IG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF−1)、CCL21(6C
    kine)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT
    、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、TNF−α、dnFADD
    、BCG、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1アンチセンスオリゴヌクレオ
    チド、TGFbRII DN、ICOS−L、S100、CD40L、p53、サバイビ
    ン、p53−サバイビン融合体、MAGE3、PSAおよびPSMAからなる群から選択
    される1つまたは複数の免疫モジュレーターである、請求項1に記載のベクター。
  4. プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイル
    ス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バ
    ーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、カリモウイルス、リポソーム、荷電脂
    質(サイトフェクチン)、DNA−タンパク質複合体およびバイオポリマーからなる群か
    ら選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のベクター。
  5. アデノウイルスベクターである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベクター。
  6. IL−12の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請
    求項1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
  7. 免疫モジュレーターの機能を有する前記1つまたは複数のタンパク質をコードする前記
    ポリヌクレオチド、およびIL−12の機能を有する前記タンパク質をコードする前記ポ
    リヌクレオチドが、前記遺伝子スイッチの調節性プロモーターの制御下にある、請求項6
    に記載のベクター。
  8. 前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体(EcR)に基づく遺伝子スイッチである、
    請求項1〜7のいずれか一項に記載のベクター。
  9. 遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、第1のプロモーターの制御下に
    ある第1の転写因子配列と、第2のプロモーターの制御下にある第2の転写因子配列とを
    含み、前記第1の転写因子配列によってコードされるタンパク質と、前記第2の転写因子
    配列によってコードされるタンパク質とが相互作用して、リガンド依存性転写因子として
    機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のベクター。
  10. 遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下に
    ある第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、前記第一の転写因子配列およ
    び前記第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依
    存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項1〜9のいずれか一項
    に記載のベクター。
  11. 前記第1の転写因子配列および前記第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進
    入部位(IRES)によって連結されている、請求項10に記載のベクター。
  12. 治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌク
    レオチドが、ヒトタンパク質(複数可)をコードする、請求項1〜11のいずれか一項に
    記載のベクター。
  13. IL−12の機能を有するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、ヒトIL
    −12をコードする、請求項5〜12のいずれか一項に記載のベクター。
  14. 前記免疫モジュレーターが、TNF−αである、請求項3〜13のいずれか一項に記載
    のベクター。
  15. 前記免疫モジュレーターが、ヒトTNF−αである、請求項14に記載のベクター。
  16. 前記免疫モジュレーターが、SEQ ID NO:37(ヒトTNF−α)に対し少な
    くとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100
    %同一であるアミノ酸配列を含む、請求項3〜15のいずれか一項に記載のベクター。
  17. 治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌク
    レオチドが、コドン最適化されている、請求項1〜16のいずれか一項に記載のベクター
  18. 治療タンパク質の機能を有する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌク
    レオチドが、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項17に記載の
    ベクター。
  19. シグナルペプチドをコードする核酸配列が、コドン最適化されている、請求項18に記
    載のベクター。
  20. 前記シグナルペプチドが、TNFOptUVおよびIL−2optUVからなる群から
    選択される、請求項19に記載のベクター。
  21. 前記シグナルペプチドが、野生型TNF−αシグナルペプチド遺伝子によってコードさ
    れるペプチド配列と比べて、TNF−αタンパク質分泌の改善を誘導する、請求項18〜
    20のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 5’非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のベク
    ター。
  23. 前記5’UTRが、TNF野生型または5U2に由来する、請求項22に記載のベクタ
    ー。
  24. 前記5’UTRが、TNF−αをコードするmRNAのレベル、TNF−αタンパク質
    の発現またはその両方の改善を誘導する、請求項22または請求項23に記載のベクター
  25. 3’調節領域をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載のベクター。
  26. 前記3’調節領域が、SV40eまたはヒト成長ホルモン(hGH)に由来するポリア
    デニル化シグナルである、請求項25に記載のベクター。
  27. 前記3’調節領域が、TNF−αをコードするmRNAのレベル、TNF−αタンパク
    質の発現またはその両方の改善を誘導する、請求項25または請求項26に記載のベクタ
    ー。
  28. 5U2に由来する5’UTRと、コドン最適化されたIL−2シグナルペプチド(IL
    −2optUV)と、コドン最適化された核酸配列によってコードされるTNF−αと、
    hGHに由来する3’調節領域とを含む、請求項27に記載のベクター。
  29. ベクター43318、ベクター43319、ベクター43320、ベクター43321
    、ベクター43322、ベクター43322、ベクター43323、ベクター43324
    、ベクター43325、ベクター43326、ベクター43327およびベクター433
    29からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の
    ベクター。
  30. 治療タンパク質を条件的に発現するための前記ベクターが、腫瘍内または腫瘍近傍へと
    直接注射される、請求項1〜29のいずれか一項に記載のベクター。
  31. 前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されていない、請求項1〜30のいず
    れか一項に記載のベクター。
  32. 請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターを用いて免疫細胞を改変する段階を含
    む、1つまたは複数の治療タンパク質の機能を有するタンパク質(複数可)を発現する免
    疫細胞または治療補助細胞(TSC)の集団を作製する方法。
  33. 前記細胞がヒト樹状細胞である、請求項32に記載の方法。
  34. 前記樹状細胞が骨髄樹状細胞である、請求項33に記載の方法。
  35. 請求項1〜34のいずれか一項に記載のベクターを含む、1つまたは複数の治療タンパ
    ク質の機能を有するタンパク質(複数可)を発現する免疫細胞またはTSCの集団。
  36. 前記細胞がヒト樹状細胞である、請求項35に記載の免疫細胞またはTSCの集団。
  37. 請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターを含む、インビトロで遺伝子操作され
    た免疫細胞またはTSC。
  38. 前記免疫細胞またはTSCがヒト樹状細胞である、請求項37に記載のインビトロで遺
    伝子操作された免疫細胞またはTSC。
  39. 請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれか一項に
    記載の免疫細胞もしくはTSCの集団、請求項37〜38のいずれか一項に記載のインビ
    トロで遺伝子操作された免疫細胞もしくはTSCまたはそれらの任意の組合せを含む医薬
    組成物。
  40. 請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターのうち2つ以上、請求項35〜36の
    いずれか一項に記載の免疫細胞もしくはTSCの集団のうち2つ以上、請求項37〜38
    のいずれか一項に記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞もしくはTSCのうち2
    つ以上またはそれらの任意の組合せを含む組成物。
  41. 請求項39または請求項40に記載の組成物と、薬学的に許容される担体。
  42. 緩衝剤をさらに含む、請求項39〜41のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記緩衝剤がTRISである、請求項42に記載の組成物。
  44. グリセリンをさらに含む、請求項39〜43のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 経口、硝子体内、腫瘍内、腹腔内または皮下投与に適した、請求項39〜44のいずれ
    か一項に記載の組成物。
  46. 前記細胞集団が、少なくとも10個の細胞を含む、請求項39〜45のいずれか一項
    に記載の組成物。
  47. 前記細胞集団が、少なくとも10個の細胞を含む、請求項39〜46のいずれか一項
    に記載の組成物。
  48. 組成物および活性化リガンドが、それを必要とする哺乳動物へと同時にまたはいずれか
    の順序で投与されると、腫瘍サイズを縮小させる、あるいは腫瘍形成を阻止する、請求項
    39〜47のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 組成物および活性化リガンドが、それを必要とする哺乳動物へと同時にまたはいずれか
    の順序で投与されると、腫瘍を治療する、請求項39〜48のいずれか一項に記載の組成
    物。
  50. それを必要とする哺乳動物における疾患または障害を治療するための薬物の製造におけ
    る、(1)請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれ
    か一項に記載の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載のインビトロで遺伝子操作
    された免疫細胞もしくはTSCまたは請求項39〜49のいずれか一項に記載の組成物、
    および(2)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガンドの使用。
  51. 前記疾患または障害が、前記哺乳動物における腫瘍である、請求項50に記載の使用。
  52. 前記治療が、前記哺乳動物における腫瘍サイズの縮小または腫瘍の阻止である、請求項
    50または請求項51に記載の使用。
  53. それを必要とする哺乳動物におけるTNF−αの全身毒性を低下、排除または制御する
    ための薬物の製造における、(1)請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請
    求項35〜36のいずれか一項に記載の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載の
    インビトロで遺伝子操作された免疫細胞もしくはTSCまたは請求項39〜49のいずれ
    か一項に記載の医薬組成物、および(2)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガン
    ドの使用であって、前記リガンドが、前記ベクターまたは組成物の投与と同時、その前ま
    たはその後に投与され、そのタイミングの活性化リガンド投与が全身毒性を低下、排除ま
    たは制御させる、使用。
  54. 前記活性化リガンド投与が、前記哺乳動物が副作用を示すと停止される、請求項50〜
    53のいずれか一項に記載の使用。
  55. 前記リガンドが、前記ベクター、前記集団、前記インビトロで遺伝子操作された免疫細
    胞もしくはTSCまたは前記組成物の前または後の1時間未満のうちに投与される、請求
    項50〜54のいずれか一項に記載の使用。
  56. 前記リガンドが、前記ベクターまたは前記組成物の後の24時間未満のうちに投与され
    る、請求項50〜55のいずれか一項に記載の使用。
  57. 前記リガンドが、前記ベクターまたは前記組成物の後の48時間未満のうちに投与され
    る、請求項50〜55のいずれか一項に記載の使用。
  58. 前記ベクターが、細胞内に含有されておらず、前記哺乳動物における腫瘍環境に腫瘍内
    投与される、請求項50〜57のいずれか一項に記載の使用。
  59. 免疫細胞またはTSCが、前記ベクターにより腫瘍内投与されない、請求項58に記載
    の使用。
  60. 前記腫瘍が良性腫瘍である、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用。
  61. 前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用。
  62. 前記腫瘍がメラノーマである、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使用。
  63. 前記腫瘍が悪性メラノーマ皮膚癌である、請求項50〜59のいずれか一項に記載の使
    用。
  64. 前記リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項50〜63のいずれか一項に記載の
    使用。
  65. 前記リガンドが、RG−115819、RG−115932およびRG−115830
    から選択される、請求項50〜64のいずれか一項に記載の使用。
  66. 前記リガンドが、アミドケトン(amidoketone)またはオキサジアゾリンである、請求
    項50〜63のいずれか一項に記載の使用。
  67. 前記リガンドが、前記ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作さ
    れた免疫細胞または組成物の前または後の1時間未満のうちに投与される、請求項50〜
    66のいずれか一項に記載の使用。
  68. 前記リガンドが、前記ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作さ
    れた免疫細胞または組成物の後の24時間未満のうちに投与される、請求項50〜66の
    いずれか一項に記載の使用。
  69. 前記リガンドが、ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作された
    免疫細胞または組成物の後の48時間未満のうちに投与される、請求項50〜66のいず
    れか一項に記載の使用。
  70. (a)ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞ま
    たは組成物の投与前に、それを必要とする患者から得られた第一の生物試料におけるイン
    ターフェロン−γ(IFN−γ)の発現レベルもしくは活性レベルまたはその両方を測定
    して、これにより対照レベルを得る段階と、
    (b)それを必要とする患者に、請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請
    求項35〜36のいずれか一項に記載のTSCの免疫細胞の集団、請求項35〜38のい
    ずれか一項に記載のインビトロで遺伝子操作された免疫細胞または請求項39〜49のい
    ずれか一項に記載の組成物を投与する段階と、
    (c)それを必要とする前記患者に有効量の活性化リガンドを投与する段階と、
    (d)ベクター、TSCの免疫細胞の集団、インビトロで遺伝子操作された免疫細胞お
    よび活性化リガンドの投与後に、それを必要とする前記患者から得られた第二の生物試料
    におけるIFN−γの発現レベルもしくは活性レベルまたはその両方を測定して、これに
    より検査レベルを得る段階と、
    (e)IFN−γの対照レベルと検査レベルとを比較する段階であって、IFN−γの
    発現、活性またはその両方の検査レベルの、対照レベルと比べた増加が、それを必要とす
    る前記患者において治療レジメンが有効であることを示す段階と、
    を含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれ
    か一項に記載のTSCの免疫細胞の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載のイン
    ビトロで遺伝子操作された免疫細胞または請求項39〜49のいずれか一項に記載の組成
    物に基づく患者における治療レジメンの効力を決定するための方法。
  71. (a)請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクター、請求項35〜36のいずれか
    一項に記載のTSCの免疫細胞の集団、請求項35〜38のいずれか一項に記載のインビ
    トロで遺伝子操作された免疫細胞または請求項39〜47のいずれか一項に記載の組成物
    と、(b)遺伝子スイッチを活性化させるリガンドとを含むキット。
  72. リガンドがRG−115819、RG−115830またはRG−115932である
    、請求項71に記載のキット。
  73. (1)前記免疫モジュレーターが、TNF−αであり、免疫モジュレーターの機能を有
    する1つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、1つまたは複数
    の調節配列をさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のベクターを生成する段
    階と、(2)活性化リガンドを加える段階とを含み、前記1つまたは複数の調節配列が、
    前記TNF−αの発現を改善する、TNF−αmRNA発現またはTNF−αタンパク質
    発現を増加させる方法。
  74. それを必要とする哺乳動物における疾患または障害を治療するための薬物の製造におけ
    る、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可)
    を条件的に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活性
    化リガンドの使用であって、
    遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
    (1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
    くとも1つの転写因子配列と、
    (2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
    された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
    を含み、
    前記ベクターが、細胞内に含有されておらず、
    前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
    発現を誘導し、前記疾患を治療する、使用。
  75. 疾患が、慢性腎疾患、変形性関節症、腫瘍、ウイルス性上気道感染症、ネコ形質細胞口
    内炎、ネコ好酸球性肉芽腫、ネコ白血病ウイルス感染症、イヌジステンパー感染症、全身
    性真菌感染症、心筋症、ムコ多糖症VII型および感染症からなる群から選択される、請
    求項74に記載の使用。
  76. 感染症が、ウシ呼吸器疾患、ブタ呼吸器疾患、トリインフルエンザ、トリ伝染性気管支
    炎、ウシ海綿状脳症、イヌリーシュマニア症、慢性消耗性疾患、ブタコレラ、包虫(Echi
    nococcus)、流行性肺炎、FIP、口蹄疫、ヤーグジークテ、マエディビスナ、動物にお
    ける乳腺炎、イヌ小胞子菌、伝染性膿痂疹(Orf)(動物疾患)、小反芻獣疫、Pox
    疾患、オウム類嘴羽毛病、狂犬病、地中海熱(ブルセラ症)またはバング病または波状熱
    、マルタ熱、感染性流産、家畜流行性流産、サルモネラ食中毒、腸パラチフス(enteric
    paratyphosis)、細菌性赤痢、偽結核症、ペスト、伝染性熱(pestilential fever)、結
    核、ビブリオ(Vibrios)、リステリア症、ワイル病(レプトスピラ症)またはカニコラ
    熱、出血性黄疸(黄疸出血病レプトスピラ)、酪農従事者熱(dairy worker fever)(L
    ・ハージョ(L. hardjo))、回帰熱、マダニ媒介回帰熱、スピロヘータ性熱、放浪者熱
    (vagabond fever)、飢餓熱、ライム関節炎、バンワース症候群(ライム病(lime disea
    se))、マダニ媒介髄膜多発神経炎、慢性遊走性紅斑、ビブリオ症、大腸菌症(Colibact
    eriosis)、大腸菌毒血症(colitoxemia)、肺結核(white scours)、ブタの腸浮腫、腸
    パラチフス、ブドウ球菌性食物中毒症、ブドウ球菌性胃腸炎、イヌコロナウイルス(CC
    V)またはイヌパルボウイルス腸炎、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、伝播性胃腸炎(TGE
    )ウイルス、ハーゲルマンレッドマウス(Hagerman redmouth)病(ERMD)、感染性
    造血器壊死症(IHN)、ブタアクチノバチルス(ヘモフィルス)・プルロニューモニア
    (Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumonia)、ハンセン病、ストレプトトリッ
    クス症、ヒツジの真菌性皮膚炎、偽腺状(Pseudoglanders)、ホイットモア(Whitmore)
    病、フランシス(Francis)病、アブ熱(deer-fly fever)、野兎病(rabbit fever)、
    オハラ(O'Hara)病、ストレプトバシラス熱 、ハヴェリル熱、流行性関節炎紅斑症、鼠
    毒、運送または輸送熱(shipping or transport fever)、出血性敗血症、鳥類病、オウ
    ム病、クラミジア症、北アメリカブラストミセス症、シカゴ病、ギルクリスト病、ネコひ
    っかき病、良性リンパ細網症、良性非細菌性リンパ節炎、細菌性血管腫症、細菌性肝臓紫
    斑病、Q熱、バルカンインフルエンザ(influenza/grippe)、屠殺場熱、マダニ媒介熱、
    肺リケッチア症(pneumorickettsiosis)、アメリカチックチフス、マダニ媒介チフス熱
    、水疱性リケッチア症、キューガーデンズ紅斑熱、ノミ媒介性チフス熱、地方病性チフス
    熱、都市チフス、白癬、皮膚糸状菌症、白癬症、トリコフィトン感染症、小胞子菌症(Mi
    crosporosis)、いんきんたむし、足部白癬、スポロトリクス・シェンキィ(Sporothrix
    schenckii)、二形性真菌、クリプトコッカス症およびヒストプラスマ症、良性上皮性サ
    ル痘、BEMP、サルヘルペスウイルス、サルB疾患、C型嗜眠性脳炎、黄熱、黒色嘔吐
    、ハンタウイルス肺症候群(pulmonary syndrome)、韓国型出血熱、流行性腎症、流行性
    出血熱、出血性糸球体腎炎、リンパ性脈絡髄膜炎、ベネズエラウマ脳炎、カリフォルニア
    脳炎/ラクロス脳炎、アフリカ出血熱、ミドリザルまたはサバンナモンキー疾患、恐水病
    、リッサウイルス、感染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、麻疹、はしか、ブタおよびウ
    マインフルエンザ、家禽ペスト、ニューカッスル病、ピロプラズマ病、トキソプラズマ症
    、アフリカ睡眠病、ガンビア・トリパノソーマ症、ローデシア・トリパノソーマ症、シャ
    ーガス病、シャーガス・マザ(Chagas-Mazza)病、南アメリカ・トリパノソーマ症、赤痢
    アメーバ、バランチジウム症、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、皮膚リーシュマ
    ニア症:チクレロ潰瘍、エスプンディア、ピアンボルス(pianbols)、ウタ(uta)およ
    び横痃(buba)(アメリカ);東洋瘤腫、アレッポ腫(Aleppo boil)(旧世界);バグ
    ダッド腫(Bagdad boil)、デリー腫(Delhi boil)、バウル潰瘍、内臓リーシュマニア
    症:カラアザール、微胞子虫症、アニサキス症、旋毛虫症、住血線虫症、好酸球性髄膜炎
    または髄膜脳炎(広東住血線虫(A. cantonensis))、腹部住血線虫症(コスタリカ住血
    線虫(A. costaricensis))、鉤虫症、アメリカ鉤虫症、鉤虫病、毛細虫症、糸状虫症(
    Brugiasis)、トキソカラ症、エソファゴストム症、糞線虫症、毛様線虫症、回虫症、裂
    頭条虫症、孤虫症、包虫症(Hydatidosis)、包虫症(Hydatid disease)、包虫(Echino
    coccus)顆粒病、嚢胞性包虫症、条虫感染症、住血吸虫、EBVに起因するバーキットリ
    ンパ腫、ラウスレトロウイルスに起因するラウス肉腫、ヘルペスウイルス8型に起因する
    カポジ肉腫、HTLV−Iレトロウイルスに起因する成人T細胞白血病ならびにHTLV
    −IIに起因するヘアリー細胞白血病からなる群から選択される、請求項75に記載の使
    用。
  77. 感染症が、ウシ呼吸器疾患、ブタ呼吸器疾患およびトリインフルエンザからなる群から
    選択される、請求項75に記載の使用。
  78. 腫瘍が、骨肉腫、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、請求項75に記載
    の使用。
  79. 1つまたは複数のタンパク質が、エリスロポエチン、グレリン、オステオプロテゲリン
    、RANKL、RANKLデコイ、TNF−αアンタゴニスト、IL−1アンタゴニスト
    、G−CSF、GM−CSF、IFN−α、IFN−γ、アンジオスタチン、エンドスタ
    チン、TNF−α、PP1DCY−LSRLOC、β−グルクロニダーゼおよびIL−1
    2からなる群から選択される、請求項74〜78のいずれか一項に記載の使用。
  80. 1つまたは複数のタンパク質が、IL−1、IL−2、IL−12、IL−3、IL−
    4、IL−5、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10R DNまたはそのサブユニ
    ット、IL−15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−24、IL−27、G
    M−CSF、IFN−α、IFN−γ、IFN−α1、IFNα2、IL−15−R−α
    、CCL3(MIP−1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XC
    L1(リンホタクチン)、CXCL1(MGSA−α)、CCR7、CCL19(MIP
    −3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、CXCL12(SDF
    −1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4−1BBL、CD40、CD70
    、GITRL、LIGHT、b−デフェンシン、HMGB1、Flt3L、IFN−β、
    TNF−α、dnFADD、BCG、TGF−α、PD−L1 RNAi、PD−L1ア
    ンチセンスオリゴヌクレオチド、TGFbRII DN、ICOS−L、S100、CD
    40L、p53、サバイビン、p53−サバイビン融合体、MAGE3、PSAおよびP
    SMAからなる群から選択される、請求項74〜79のいずれか一項に記載の使用。
  81. それを必要とする哺乳動物におけるリソソーム蓄積症を治療するための薬物の製造にお
    ける、(a)遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可
    )を条件的に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活
    性化リガンドの使用であって、
    遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
    (1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
    くとも1つの転写因子配列と、
    (2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
    された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
    を含み、
    前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されておらず、
    前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
    発現を誘導し、前記リソソーム蓄積症を治療する使用。
  82. リソソーム蓄積症が、ポンペ病/糖原病II型、ゴーシェ病(I型、II型、III型
    )、ファブリー病、ムコ多糖症II型(ハンター症候群)、ムコ多糖症VI型(マロトー
    ・ラミー症候群)、ムコ多糖症I型、異染性白質ジストロフィー、神経セロイドリポフス
    チン症またはCLN6病(非定型遅発型小児性、晩期発症型異型、初期若年性、フィンラ
    ンド異型遅発型小児性CLN5、ヤンスキー・ビールショースキー病/遅発型小児性CL
    N2/TPP1病、クッフス/成人発症型NCL/CLN4病、Northern Ep
    ilepsy/異型遅発型小児性CLN8、Santavuori−Haltia/小児
    性CLN1/PPT病、β−マンノース症)、Batten−Spielmeyer−V
    ogt/若年性NCL/CLN3病、サンフィリポ症候群A型、サンフィリポ症候群B型
    、サンフィリポ症候群C型、サンフィリポ症候群D型、MPSIハーラー症候群、ニーマ
    ン・ピック病(A型、B型、C型、D型)、アクチβー欠乏症/GM2ガングリオシドー
    シス、α−マンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積
    症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシド
    ーシス、ガラクトシアリドーシス(ゴールドバーグ症候群)、GM1ガングリオシドーシ
    ス(小児性、遅発型小児性/若年性、成人/慢性)、I細胞病/ムコリピドーシスII、
    小児性遊離シアル酸蓄積症/ISSD、若年性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、クラッベ病
    (小児発症型、晩期発症型)、ムコ多糖症障害(偽性ハーラー・ポリジストロフィー/ム
    コリピドーシスIIIA、シャイエ症候群、MPSIハーラー・シャイエ症候群、モルキ
    オ症候群A型/MPS IVA、モルキオ症候群B型/MPS IVB、MPS IXヒ
    アルロニダーゼ欠乏症、スライ症候群(MPS VII)、ムコリピドーシスI/シアリ
    ドーシス、ムコリピドーシスIIIC、ムコリピドーシスIV型)、多種スルファターゼ
    欠乏症、濃化異骨症、サンドホフ病/成人発症型/GM2ガングリオシドーシス、サンド
    ホフ病/GM2ガングリオシドーシス小児性、サンドホフ病/GM2ガングリオシドーシ
    ス若年性、シンドラー病、サラ病、小児性シアル酸蓄積症、テイ・サックス病/GM2ガ
    ングリオシドーシス、ウォルマン病、アスパルチルグルコサミン尿症(Asparylglucosami
    nuria)およびプロサポシンからなる群から選択される、請求項81に記載の使用。
  83. リソソーム蓄積症が、ポンペ病/糖原病II型、ゴーシェ病(I型、II型、III型
    )、ファブリー病、ムコ多糖症II型(ハンター症候群)、ムコ多糖症VI型(マロトー
    ・ラミー症候群)、ムコ多糖症I型および異染性白質ジストロフィーからなる群から選択
    される、請求項81または請求項82に記載の使用。
  84. 1つまたは複数のタンパク質が、a−ガラクトシダーゼA、アリールスルファターゼA
    、a−グルコシダーゼ、b−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、CLN6タンパ
    ク質、CLN3関連の若年性、N−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ(SGSH)
    、a−N−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−CoA−グルコサミニドアセチルト
    ランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン−6−スルファターゼ、a−L−イズロニ
    ダーゼ、アリールスルファターゼB、酸性スフィンゴミエリナーゼおよびイズロネートス
    ルファターゼからなる群から選択される、請求項81〜83のいずれか一項に記載の使用
  85. それを必要とする哺乳動物における肝疾患を治療するための薬物の製造における、(a
    )遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可)を条件的
    に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガン
    ドの使用であって、
    遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
    (1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
    くとも1つの転写因子配列と、
    (2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
    された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
    を含み、
    前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されておらず、
    前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
    発現を誘導し、前記肝疾患を治療する、使用。
  86. 肝疾患がB型肝炎である、請求項85に記載の方法。
  87. 肝疾患がC型肝炎である、請求項85に記載の方法。
  88. タンパク質がIFN−αによるものである、請求項85〜87のいずれか一項に記載の
    方法。
  89. タンパク質がセルロプラスミンである、請求項85〜87のいずれか一項に記載の方法
  90. それを必要とする哺乳動物における眼疾患を治療するための薬物の製造における、(a
    )遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質(複数可)を条件的
    に発現するためのベクター、および(b)治療上有効量の1つまたは複数の活性化リガン
    ドの使用であって、
    遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、
    (1)プロモーターに機能的に連結された、リガンド依存性転写因子をコードする少な
    くとも1つの転写因子配列と、
    (2)前記リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに機能的に連結
    された、1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
    を含み、
    前記ベクターが、インビボ投与前に細胞内に含有されておらず、
    前記リガンドが、投与されると、前記哺乳動物における1つまたは複数のタンパク質の
    発現を誘導し、前記眼疾患を治療する使用。
  91. 前記眼疾患が、緑内障、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、無虹彩(Aniridic)緑内障
    、先天性緑内障、若年性緑内障、水晶体原性緑内障、血管新生緑内障、外傷後緑内障、ス
    テロイド緑内障、スタージ・ウェーバー症候群緑内障およびぶどう膜炎誘導性緑内障、糖
    尿病性網膜症、黄斑変性症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、血液漏出および/または網膜
    浮腫、細菌性結膜炎、真菌性結膜炎、ウイルス性結膜炎、ぶどう膜炎、角膜後面沈着物、
    黄斑浮腫、眼内レンズ挿入術後の炎症応答、ぶどう膜炎症候群、網膜血管炎、サルコイド
    ーシス、イールズ病、急性網膜壊死、フォークト・小柳・原田症候群、眼(occular)ト
    キソプラズマ症、放射線網膜症、増殖性硝子体網膜症、眼内炎、眼緑内障、虚血性視神経
    症、甲状腺眼窩疾患、眼窩偽腫瘍、色素散乱症候群(色素性緑内障)、強膜炎、上強膜炎
    脈絡膜症、網膜症(例えば、嚢胞状黄斑浮腫、中心性漿液性網脈絡膜症および推定眼ヒス
    トプラスマ症症候群、網膜血管障害、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、
    網膜色素変性症、家族性滲出性硝子体網膜症(FEVR)、特発性ポリープ状脈絡膜血管
    症、黄斑部網膜上膜ならびに白内障からなる群から選択される、請求項90に記載の使用
  92. 前記ベクターが、硝子体内投与される、請求項90または請求項91に記載の使用。
  93. 前記哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト動物である、請求項74〜92のいずれか一項に記
    載の使用。
  94. 前記ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス
    、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、
    エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、カリモウイルス、リ
    ポソーム、荷電脂質(サイトフェクチン)、DNA−タンパク質複合体およびバイオポリ
    マーからなる群から選択される、請求項74〜93のいずれか一項に記載の使用。
  95. 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項74〜94のいずれか一項に
    記載の使用。
  96. 前記遺伝子スイッチが、EcRに基づく遺伝子スイッチである、請求項74〜95のい
    ずれか一項に記載の使用。
  97. 遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、第一のプロモーターの制御下に
    ある第一の転写因子配列と、第二のプロモーターの制御下にある第二の転写因子配列とを
    含み、前記第一の転写因子配列および前記第二の転写因子配列によってコードされるタン
    パク質が相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成
    する、請求項74〜96のいずれか一項に記載の使用。
  98. 遺伝子スイッチをコードする前記ポリヌクレオチドが、1つのプロモーターの制御下に
    ある第一の転写因子配列および第二の転写因子配列を含み、前記第一の転写因子配列およ
    び前記第二の転写因子配列によってコードされるタンパク質が相互作用して、リガンド依
    存性転写因子として機能するタンパク質複合体を形成する、請求項74〜97のいずれか
    一項に記載の使用。
  99. 前記第1の転写因子配列および前記第2の転写因子配列がEMCV配列内リボソーム進
    入部位(IRES)によって連結されている、請求項98に記載のベクター。
  100. 前記リガンドがジアシルヒドラジンである、請求項74〜99のいずれか一項に記載の
    使用。
  101. 前記リガンドが、RG−115819、RG−115932およびRG−115830
    から選択される、請求項74〜99のいずれか一項に記載の使用。
  102. 前記リガンドが、アミドケトンまたはオキサジアゾリンである、請求項74〜99のい
    ずれか一項に記載の使用。
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